CN103012595B - 稳定的NT-proBNP校准品及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种稳定的NT-proBNP校准品及应用，属于生物检测试剂。其特征在于：所述NT-proBNP校准品为多肽，其线性结构为：NT-proBNP捕获抗体表位肽段－连接肽－NT-proBNP检测抗体表位肽段。基于该结构，发明人提供了一序列经试验验证具有较好稳定性、溶解性的校准品。可作为检测NT-proBNP和proBNP蛋白的试剂盒中的校准品。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测试剂，特别是一种NT-proBNP校准品及其制备方法与应用。
技术背景
1988年，日本学者Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，命名为脑钠肽或称钠尿肽（Brain Natriuretic Peptide，BNP）。此后的研究表明，在生物进化的过程中逐渐发展产生包括BNP在内的一组多肽ANP、BNP、CNP、DNP、VNP等，称为利钠肽家族，其功能是维持循环系统的容量、渗透压和压力的稳态。BNP主要存在于心室隔膜颗粒中，其分泌依赖于心室的容积扩张和压力负荷增加。作为心功能紊乱最敏感和最特异的指标，BNP具有重要的临床意义。最早在ESC《慢性心力衰竭指南(2001)》，继而在美国ACC/AHA《慢性心力衰竭指南(2005)》中推荐将血液BNP水平测定作为心力衰竭的诊断和预后指标。2008年ESC《急性和慢性心力衰竭指南》和2009年AHA《心力衰竭指南》对此作了进一步的推荐。
当心肌细胞受刺激后，会产生含134个氨基酸的Ｂ型利钠肽原前体（pre-proBNP），随后在相关酶的作用下切掉N端的信号肽序列，形成含108个氨基酸的BNP前体（proBNP），后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的N端产物N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）和含有32个氨基酸有活性的C端产物B型利钠肽（BNP）。BNP的清除主要通过与BNP清除受体结合，而NT-proBNP则主要由肾小球滤过，因此，其血浓度受肾功能影响大于BNP。BNP半衰期短（22min），体外稳定性差，而NT-proBNP半衰期较长（120min），体外稳定性强，在心力衰竭患者中的浓度较BNP高，在有些情况下更有利于心力衰竭的诊断。美国在2004年和2008年分别发表了BNP临床应用专家共识和国际NT-proBNP专家共识，系统阐述了BNP和NT-proBNP的生物学和临床应用。
BNP和NT-proBNP检测在21世纪初先后进入我国，10年来已经被各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断和评估十分有用的生物标志物。我国2007年《慢性心力衰竭诊断治疗指南》和2010年《急性心力衰竭诊断治疗指南》也推荐将NT-proBNP和BNP用于心力衰竭的诊断和预后判断。但是在试剂盒开发和使用过程中，定标液的稳定性较差，尤其对于基于板式酶免平台的诊断试剂，由于其每次测定均需同时定标，所以对试剂盒校准品的稳定性要求较高。
NT-proBNP是由76个氨基酸组成的蛋白，生产商在试剂盒和开发过程中，多采用重组蛋白作为校准品。但是大量的研究发现，由于原核重组表达的蛋白缺乏糖基化，其稳定性较天然蛋白更差。目前没有见到稳定性优良的NT-proBNP校准品。
发明内容
本发明根据上述领域存在的需求和空白，提供一种稳定的NT-proBNP校准品，技术方案如下：
一种NT-proBNP校准品，其特征在于：所述NT-proBNP校准品为多肽，其线性结构为：NT-proBNP捕获抗体表位肽段－连接肽－NT-proBNP检测抗体表位肽段。
所述线性结构为从氨基端到羧基端为：NT-proBNP捕获抗体表位肽段－连接肽－NT-proBNP检测抗体表位肽段。
所述连接肽为4～10个亲水氨基酸残基构成的短肽。
所述连接肽中不含有易形成转角和α-螺旋的氨基酸或多肽序列。
所述连接肽段的氨基酸序列如Seq ID No.2、3和8~13任一所示。
所述NT-proBNP校准品的NT-proBNP捕获抗体表位肽段氨基酸序列如Seq ID No.15、No.17任一所示。
所述NT-proBNP校准品的NT-proBNP检测抗体表位肽段氨基酸序列如Seq ID No.14、No.16任一所示。
所述NT-proBNP校准品,其氨基酸序列如Seq ID No.18~25任一所示。
上述任一NT-proBNP校准品在检测NT-proBNP和proBNP蛋白的试剂盒中的作为校准品的用途。
本发明提供一种人工设计的NT-proBNP校准品，其包含一对通过人工设计的连接肽连接的稳定的NT-proBNP抗原表位。
为了提高本发明的NT-proBNP校准品的稳定性，本发明中设计的连接肽为4～10个氨基酸组成。
为了防止多肽二聚体形成、线性序列的空间折叠及合成多肽的溶解性，试验进一步优化了linker的大小、氨基酸序列组成及其空间特性，设计获得如表1中Seq ID No.2所示的连接肽，实验证明采用这些连接肽的本发明获得的校准品具有更好的溶解性。
为防止二聚体的形成，linker的设计过程中剔除了半胱氨酸的选择；为了保持多肽的线性，linker选择剔除了脯氨酸等易形成转角的氨基酸，根据此设计出如。如表1中Seq ID No.2所示的连接肽，实验证明采用这些连接肽的本发明获得的校准品具有更好的溶解性和稳定性。
据文献报道，NT-proBNP中表位EP1（5-12）和表位EP2（67-76）较为稳定且无糖基化位点，这样不仅可以防止表位降解，而且可以保持制备的表位与天然的表位相一致，因此本发明的一个实施例中，选择表位EP1和表位EP2作为定量分析的抗体识别表位，如表2中SeqID No.14、No.15。
本发明的一个优选实施例中，为了降低linker及其他因素对抗体-表位识别的影响，试验优化选择表位EP1’（4-13）、表位EP2’（66-76）作为定量分析抗体识别表位，如表2中SeqID No.16、No.17。
综上，本发明提供的校准品，由于具有NT-proBNP的表位，所以可以与其相应的抗体结合。同时，由于剔除了NT-proBNP不稳定的氨基酸序列，选择较为稳定的表位，并用稳定的多肽linker将两个表位连接，所以由此制备的校准品更加稳定。
本发明提供的校准品可用于NT-proBNP和proBNP不稳定蛋白试剂盒的校准品。
本发明提供的校准品由于都是短肽，优选采用人工合成的方法制备。
术语解释：
NT-proBNP捕获抗体表位：指NT-proBNP中，抗NT-proBNP抗体对其起捕获作用的区域，是由一段氨基酸序列构成。
NT-proBNP检测抗体表位：指NT-proBNP中，抗NT-proBNP抗体对其起检测作用的区域，是由一段氨基酸序列构成。
连接肽，指人工设计的短肽，本发明中主要起到提高由NT-proBNP捕获抗体表位和NT-proBNP检测抗体表位构成的校准品的稳定性，实现两个人工合成的表位的空间结构使其发挥对抗体的捕获及检测功能。
P／N：即阳性/阴性，指阳性（P，positive）读值与阴性（N，negative）读值的比值，此比值越高代表试剂盒区分阴阳性的能力越强。
附图说明
图1.标准曲线，
图2.方法学比较结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式说明本发明的技术方案及其效果。
试验所需溶液和试剂：
1．10mM PB：
称取称取0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)（国药，10017608）、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)（国药，100203008）、1mL Proclin300（Sigma，48914-U）于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH至7.4，然后用容量瓶定容至1L。
2．10mM PBS：
称取0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)（国药，10017608）、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)（国药，100203008），8g氯化钠(NaCl)（国药，10019308）、0.2g氯化钾(KCl)（国药，10016308）、1mL Proclin300（Sigma，48914-U）于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH至7.4，然后用容量瓶定容至1L。
3．0.5%BSA 10mM PBS：
含有0.5%（W/V）BSA牛血清白蛋白（amresco，0332）的10mM PBS溶液。
4．洗涤液：
含有0.05%（V/V）Tween-20（sigma，44112）的10mM PBS溶液。
5．合成多肽：本发明中表3所列的多肽均由上海生工生物合成。
6．NT-proBNP抗体4NT1-29D12、4NT1-24E11均购于Hytest。
7．重组NT-proBNP（1-76氨基酸，8NT2）蛋白购于Hytest。
8．底物A和底物B（Thermo，34080）
表1本发明中设计的连接肽
| 序列号 | 连接肽氨基酸序列 |
| Seq ID No.1 | STQNG |
| Seq ID No.2 | QNQQASNQNQ |
| Seq ID No.3 | PVPFLPMFVP |
| Seq ID No.4 | VDIRFPIYMF |
| Seq ID No.5 | Q |
| Seq ID No.6 | QN |
| Seq ID No.7 | QNQ |
| Seq ID No.8 | QNQQ |
| Seq ID No.9 | QNQQA |
| Seq ID No.10 | QNQQAS |
| Seq ID No.11 | QNQQASN |
| Seq ID No.12 | QNQQASNQ |
| Seq IDNo.13 | QNQQASNQN |
表2本发明中选用的多肽表位
| 序列号 | 氨基酸序列 | 序列号 | |
| EP1序列：Seq ID No.14 | SPGSASDL | EP’1序列Seq ID No.16 | GSPGSASDLE |
| EP2序列：Seq ID No.15 | MVLYTLRAPR | EP’2序列:Seq ID No.17 | KMVLYTLRAPR |
表3本发明优选出的NT-proBNP校准品的氨基酸序列
| 序列号 | 合成NT-proBNP校准品的氨基酸序列 |
| Seq ID No.18 | GSPGSASDLEQNQQKMVLYTLRAPR |
| Seq ID No.19 | GSPGSASDLEQNQQAKMVLYTLRAPR |
| Seq ID No.20 | GSPGSASDLEQNQQASKMVLYTLRAPR |
| Seq ID No.21 | GSPGSASDLEQNQQASNKMVLYTLRAPR |
| Seq ID No.22 | GSPGSASDLEQNQQASNQKMVLYTLRAPR |
| Seq ID No.23 | GSPGSASDLEQNQQASNQNKMVLYTLRAPR |
| Seq ID No.24 | GSPGSASDLEQNQQASNQNQKMVLYTLRAPR |
| Seq ID No.25 | GSPGSASDLE PVPFLPMFVP KMVLYTLRAPR |
实施例1、NT-ProBNP抗体的选择
据文献报道，NT-p roBNP抗原N端和C端的序列较为稳定，因此，选择Hytest公司提供的4NT1-29D12（氨基酸序列5-12）、4NT1-24E11（氨基酸序列67-76）作为双抗夹心法的抗体对。
实施例2、合成多肽表位的选择
将合成EP1-STQNG-EP2、EP1’-STQNG-EP2’、重组NT-proBNP抗原（Hytest，8NT2）配制高值（H，15000pg/ml）、中值（M，5000pg/ml）、低值（L，100pg/ml）梯度样本，测定方法同实施例6，并计算P/N。
试验结果显示，EP1’-STQNG-EP2’合成多肽表位与重组NT-proBNP抗原的P/N（H/N、M/N、L/N）均高于EP1-STQNG-EP2合成多肽表位，表明为获得与重组抗原一致的反应特性，合成多肽抗原表位应较抗体的识别表位的N端和C端至少各多含一个氨基酸。
表4不同校准品P/N差异
实施例3、linker长度选择
用合成的多肽抗原（EP1’-linker-EP2’）配制高值（H，15000pg/ml）、中值（M，5000pg/ml）、低值（L，100pg/ml）梯度样本，测定方法同实施例6，并计算P/N。
试验结果显示，Linker长度大于4个氨基酸序列的合成多肽表位的P/N（H/N、M/N、L/N）明显高于其它Linker的多肽，表明Linker的长度对影响表位与抗体的结合，其可能的原因是空间位阻效应，因此试验建议选择含4-10氨基酸的linker的多肽序列作为试剂盒的校准品。
表5 linker氨基酸序列
注：non-无linker，即将EP1’与EP2’直接连接。
表6不同linker制备的校准品P/N差异
注：non-无linker，即将EP1’与EP2’直接连接。
实施例4、linker氨基酸组成
用合成的多肽抗原（EP1’-linker-EP2’）配制高值（H，15000pg/ml）、中值（M，5000pg/ml）、低值（L，100pg/ml）梯度样本，测定方法同实施例6，并计算P/N。
试验结果显示，由亲水氨基酸组成Linker 10-1(SEQ ID No.2)的合成多肽表位的P/N（H/N、M/N、L/N）高于由疏水氨基酸组成Linker 10-2(SEQ ID No.3)的多肽，表明Linker的氨基酸组成影响表位与抗体的结合，其可能的原因是疏水氨基酸含量过高影响合成多肽的溶解性。此外，由于Linker 10-3(SEQ ID No.4)的合成多肽中含有大量的折叠因素，因此其P/N明显低于含Linker10-1、10-2的合成多肽表位。因此试验选择含亲水性氨基酸较高的、空间的linker的多肽序列作为试剂盒的校准品。
表7 linker氨基酸序列
注：a.DNAman软件二级结构预测。
表8 linker氨基酸序列
实施例5、校准品稳定性测定
用合成的多肽抗原（EP1’-QNQQASNQNQ-EP2’）和重组NT-proBNP（Hytest，8NT2）抗原配制高值（H，15000pg/ml）、中值（M，5000pg/ml）、低值（L，100pg/ml）梯度样本，然后分别置于4℃和37℃放置6d。
测定方法同实施例6，计算P/N。
结果表明，合成的多肽抗原在37℃放置3d、6d的稳定性（37℃/4℃）显著高于重组抗原（见表9）。
表9校准品稳定性-1
表10校准品稳定性-2
实施例6、NT-proBNP检测试剂盒（化学发光法）制备：
1）包被：配制1μg/mL 24E11抗体（hytest，4NT1）10mM PB溶液，加入微孔发光板中，100μL/孔，37℃孵育2h；
2）封闭：将微孔板中包被液甩干，加入5%BSA 10mM PB溶液，200μL/孔，37℃，孵育1h；
3）抗原：将微孔板中封闭液甩干，加入100μL/孔抗原，37℃，孵育30min；
4）酶标抗体：将微孔板用洗涤液洗涤3次并甩干，加入100μL/孔HRP标记的29D12抗体（Hytest，4NT1）（HRP-29D12），37℃，孵育30min；
5）底物：将微孔板用洗涤液洗涤5次并甩干，分别加入50μL/孔底物A和底物B（Thermo，34080），避光反应5min，测定发光值。
6）发光强度与样本中抗原的浓度成线性关系（四参数拟合）。
实施例7、校准品临床检测应用：
收集178例临床样本（年龄在18-75岁和75岁以上人群，包括正常人和疑似心力衰竭病人）的血清。选用Roche脑利钠肽前体诊断试剂盒（电化学发光法）（国食药监械(进)字2011第2402335号）进行方法学比较。
测定步骤：
1）用制备的合成校准品配制15000pg/ml、5000pg/ml、500pg/ml、200pg/ml、100pg/ml校准点，作标准曲线；
2）测定方法同实施例6.
试剂盒标准曲线见图1，相关系数r2=0.99
试剂盒测定结果（附表1）与Roche脑利钠肽前体诊断试剂盒（电化学发光法）进行方法学比较，相关系数r2=0.9188。见图2
附表1：临床样本测定结果
Claims (5)
1.一种NT-proBNP校准品，其特征在于：所述NT-proBNP校准品为多肽，其线性结构为：NT-proBNP捕获抗体表位肽段－连接肽－NT-proBNP检测抗体表位肽段，
所述连接肽为4～10个亲水氨基酸残基构成的短肽，所述连接肽的氨基酸序列如Seq IDNo.2、3和8～13任一所示。
2.根据权利要求1所述的NT-proBNP校准品，所述连接肽中不含有易形成转角和α-螺旋的氨基酸或多肽序列。
3.根据权利要求1或2所述的NT-proBNP校准品,所述NT-proBNP校准品的NT-proBNP捕获抗体表位肽段氨基酸序列如Seq ID No.17所示。
4.根据权利要求3所述的NT-proBNP校准品,所述NT-proBNP校准品的NT-proBNP检测抗体表位肽段氨基酸序列如Seq ID No.16所示。
5.根据权利要求4所述的NT-proBNP校准品,其氨基酸序列如Seq ID No.18～25任一所示。
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