CN102989002A - 具有抗肿瘤耐药性的dox-p胶束及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有抗肿瘤耐药性的泊洛沙姆-阿霉素偶联物(DOX-P)胶束及其制备方法。DOX-P的合成过程为：首先通过泊洛沙姆与丁二酸酐反应获得末端含羧基的高分子聚合物，然后该聚合物中末端羧基与阿霉素中的伯氨基以酰胺键形式直接连接。DOX-P具有形成胶束的能力，与阿霉素原料药相比，DOX-P胶束中共价结合的阿霉素，保持了阿霉素的抗肿瘤活性，克服肿瘤的耐药性，稳定性好于泊洛沙姆胶束。

Description

具有抗肿瘤耐药性的DOX-P胶束及其制备方法

【技术领域】

本发明属于药物制剂领域，涉及一种具有抗肿瘤耐药性的DOX-P胶束及其制备方法。

【背景技术】

在肿瘤化学药物治疗中发现，90％以上的化疗药物会被正常组织吸收，毒副作用大，而且肿瘤细胞会对多数化疗药产生耐药性。

阿霉素是一种蒽环类抗生素，具有广谱抗肿瘤作用，临床用于治疗白血病、淋巴癌和实体瘤等。然而，由于其具有较强的心脏毒性，同时肿瘤细胞容易对其产生耐药性，使其应用受到了限制。

高分子-药物偶联物是一种很有效的增加药物水溶性、提高载药量的方式，其将小分子药物接入大分子载体，制成高分子前药，特别是纳米级聚合粒子由于其小尺寸效应和表面、界面效应，其突出优势在于：被动靶向和缓控释作用；避免被肾脏快速清除，延长药物血浆半衰期。从而提高药效、减轻不良反应，方便患者使用。

泊洛沙姆(Poloxamer)结构为聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)组成的三嵌段共聚物，其结构通式为HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH，其中PEO段为聚氧乙烯，PPO段为聚氧丙烯。泊洛沙姆124、188、237、338和407已收载在美国国家处方集中，泊洛沙姆188收载于英国药典。泊洛沙姆188静脉注射毒理学研究表明其系统毒性很低，小鼠静脉注射的LD50为3g/kg以上，狗可以耐受连续3天以500mg/(kg·h)的速度输注。近些年研究发现，泊洛沙姆能够有效的克服肿瘤多药耐药性。

已有一些高分子-药物偶联物陆续进入临床试验阶段，还有部分高分子-药物偶联物已批准上市，但主要集中为聚乙二醇(PEG)-抗肿瘤药物偶联物，但是聚乙二醇体内不能降解，长期应用会产生蓄积，存在着潜在安全性问题。而泊洛沙姆安全性较高，但尚未见应用泊洛沙姆与抗肿瘤药物阿霉素形成偶联物克服肿瘤耐药作用的研究报道。

【发明内容】

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种具有克服肿瘤耐药性的DOX-P。其特征在于：所述DOX-P结构通式为I所示，通过将末端为羧基的泊洛沙姆聚合物的羧基与阿霉素的伯氨基以酰胺键形式连接，其中R-NH2表示阿霉素。

优选的，所述DOX-P按照每1ml水中加入3-30mg的DOX-P的比例，可以自组装形成DOX-P胶束。

优选的，所述DOX-P胶束通过高压均质、机械过滤或强力超声处理，可得到粒径范围均一的纳米级胶束，所述纳米级胶束的粒径分布于50-300nm范围内。

优选的，所述DOX-P胶束粒径分布于100-200nm范围内。

优选的，所述DOX-P胶束可以采用药学公知的制剂技术制成供口服、黏膜、注射或外用的制剂。

DOX-P保持了阿霉素的抗肿瘤活性，降低肿瘤细胞的耐药性，同时具有自组装形成胶束的性质，临界胶束浓度低于泊洛沙姆，具有较好的稳定性和针对肿瘤部位的被动靶向作用。

本发明的另一个目的是提供具有抗肿瘤耐药性的DOX-P的制备方法。所述DOX-P的制备方法包括以下步骤：

a、将泊洛沙姆溶解于二氧六环中至泊洛沙姆浓度为0.1-5mol/L，加入与泊洛沙姆物质的量比为2-3的丁二酸酐，与泊洛沙姆物质的量比为0.5-10的催化剂4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，与泊洛沙姆物质的量比为1-10的缚酸剂三乙胺，进行缩合反应，，得到末端含羧基的高聚物，将反应液倒入截留分子量为7kD的透析袋透析，真空冷冻干燥即得末端为羧基的高聚物，备用；

b、将经过步骤a所得的末端含羧基的高聚物溶于有机溶剂中至浓度为0.1-10mol/L，加入与该高聚物物质的量比为0.5-10的催化剂a和b反应，加入与该高聚物物质的量比为2-3的阿霉素反应；

c、将经过步骤b所得反应液转移至截留分子量为7kD的透析袋，使用步骤b中所述有机溶剂作为透析介质进行透析；然后换用超纯水作为透析介质进行透析，透析液真空冷冻干燥，即得DOX-P。

优选的，所述的催化剂a选自：二环己基碳化二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、叠氮磷酸二苯酸(DPPA)、对甲苯磺酰叠氮或2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮；所述催化剂b选自：羧基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4酮(DEPBT)或N-羟基苯并三氮唑(HOBT)。

优选的，所述的催化剂a选自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；所述催化剂b选自羧基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)。

优选的，所述的有机溶剂选自：N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲氯呋喃、二甲基亚砜或二氧六环。

优选的，所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。

依照本发明制备的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P胶束具有以下优点：(1)在含羟基的泊洛沙姆分子链上引入疏水药物阿霉素，增强其两亲性，使其在水介质中可自组装成稳定的纳米胶束，相对疏水的药物聚集成内核，泊洛沙姆分子的PEO链段形成高度亲水性外壳，具有稳定胶束、有效躲避生物体网状内皮系统的捕捉和蛋白质吸附的作用。(2)DOX-P胶束临界胶束浓度低于泊洛沙姆，具有自组装形成胶束的性质，稳定性好于泊洛沙姆。(3)DOX-P胶束中阿霉素与洛沙姆为共价键联接，因此阿霉素载药量和包封率较高，并且可以实现定量控制。(4)DOX-P胶束粒径可控，通过高压均质、机械过滤或强力超声处理，得到粒径范围均一的纳米级胶束。

【附图说明】

图1为胶束微观形态图(a：泊洛沙姆188胶束；b：泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束；c：泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束)；

图2为泊洛沙姆188和泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的芘荧光强度(I339/I333)曲线图；

图3为阿霉素与泊洛沙姆188-阿霉素胶束对A549/DOX生存率的影响图；

图4为阿霉素(a)与泊洛沙姆188-阿霉素胶束(b)作用A549/DOX的细胞荧光显微镜图；

图5为用DOX-P胶束(c)作用于A549/DOX细胞的流式细胞数荧光吸收图，其中a为空白对照，b为游离DOX。

【具体实施方式】

现结合下列实施例来进一步描述本发明。实施例1泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成：取10mmol泊洛沙姆188、25mmol丁二酸酐、20mmolDMAP、20mmol乙二胺，以30ml二氧六环为有机溶剂，室温搅拌反应24h，反应结束后将反应液转移至截留分子量为7kD透析袋中，于使用二氧六环作为透析介质透析48小时，冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合物；取10mmol末端为羧基的泊洛沙姆聚合物、20mmol阿霉素、15mmol EDC(或DCC或EDC·HCL或DIC或DPPA或对甲苯磺酰叠氮或2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮)、15mmol NHS(或sulfo-NHS或DEPBT或HOBT)，溶解在30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，DMF也可以更换为二氯甲烷、甲氯呋喃、二甲基亚砜或二氧六环等其他有机溶剂，优选为DMF。接着避光、氮气保护下，室温搅拌反应24h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，使用1000mlDMF作为透析介质，透析24小时，透析过程中每6小时换一次透析介质；然后换用1000ml超纯水作为透析介质，透析过程中每6小时换一次透析介质，透析48小时；透析液真空冷冻干燥48小时，即得泊洛沙姆188-阿霉素偶联物。

实施例2泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物的合成：取10mmol泊洛沙姆188、25mmol丁二酸酐、20mmolDMAP、20mmol乙二胺，以30ml二氧六环为有机溶剂，室温搅拌反应24h，反应结束后将反应液转移至截留分子量为7kD透析袋中，于使用二氧六环作为透析介质透析48小时，冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合物；取10mmol末端为羧基的泊洛沙姆聚合物、30mmol阿霉素、15mmol EDC、15mmol NHS，溶解在30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，避光、氮气保护下，室温搅拌反应24h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，使用1000mlDMF作为透析介质，透析24小时，透析过程中每6小时换一次透析介质；然后换用1000ml超纯水作为透析介质，透析过程中每6小时换一次透析介质，透析48小时；透析液真空冷冻干燥48小时，即得泊洛沙姆188-阿霉素偶联物。

实施例3泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备和表征

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束制备：以实施例1得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物100mg溶解于10ml水中，冰浴下高压均质循环2次，0.22μm滤膜过滤，得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束。

表征观察：采用透射电镜(TEM，Hitachi，H-7500，Japan)观察泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束，记录胶束的形态及粒径，通过高效液相法测定阿霉素含药量，观察微观性状和含药量等指标随时间的变化，通过纳米粒度及动电位测定仪(马尔文Nano ZS90)测定胶束粒径及电位的变化。

表1泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的表征观察结果

结果如表1和图1所示，泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束(图1b)相对于泊洛沙姆188胶束(图1a)，形态更圆整，粒径更小且分布均匀，并能保持长时间稳定，表面电位和含药量随时间变化量小，说明泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束稳定性好，适于作为药物的载体。

实施例4泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束制备：以实施例1得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物30mg溶解于10ml水中，冰浴下高压均质循环2次，0.22μm滤膜过滤，得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束。

实施例5泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束制备：以实施例1得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物300mg溶解于10ml水中，冰浴下高压均质循环2次，0.22μm滤膜过滤，得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束。

实施例6泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束的制备

泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束制备：以实施例1得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物300mg溶解于10ml水中，探头超声30min，0.22μm滤膜过滤，得到泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束。

实施例7泊洛沙姆407-阿霉素偶联物的合成

泊洛沙姆407-阿霉素偶联物的合成：取10mmol泊洛沙姆407、25mmmol丁二酸酐、20mmolDMAP、20mmol乙二胺，以30ml二氧六环为有机溶剂，室温搅拌反应24h，反应结束后将反应液转移至透析袋中，于二氧六环中透析2天，冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合物；取10mmol末端为羧基的泊洛沙姆聚合物、20mmol阿霉素、15mmol EDC、15mmol NHS，溶解在30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，避光、氮气保护下，室温搅拌反应24h；反应结束后将反应液转移至截留分子量为7kD透析袋中，于使用二氧六环作为透析介质透析48小时，冷冻干燥，得末端为羧基的泊洛沙姆聚合物；取10mmol末端为羧基的泊洛沙姆聚合物、20mmol阿霉素、15mmol EDC、15mmol NHS，溶解在30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，避光、氮气保护下，室温搅拌反应24h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，使用1000mlDMF作为透析介质，透析24小时，透析过程中每6小时换一次透析介质；然后换用1000ml超纯水作为透析介质，透析过程中每6小时换一次透析介质，透析48小时；透析液真空冷冻干燥48小时，即得泊洛沙姆407-阿霉素偶联物。

实施例8泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束的制备和表征

泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束的制备：以实施例7得到泊洛沙姆407-阿霉素偶联物100mg溶解于10ml水中，冰浴下高压均质循环2次，然后用0.22μm滤膜挤压过滤，即得泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束。

表征观察：按照实施例4所用方法采用透射电镜(TEM，Hitachi，H-7500，Japan)观察泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束，记录胶束的形态及粒径随时间变化的结果。

结果见图1：相对于泊洛沙姆188胶束(图1a)，泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束(图1c)微观形态圆整，粒径分布均匀，平均粒径为60.4nm，在64h观察期内保持形态和粒径的稳定，说明泊洛沙姆407-阿霉素偶联物胶束稳定性好，适于作为药物的载体。

实施例9泊洛沙姆188-阿霉素偶联物(DOX-P)临界胶束浓度的测定

以实施例1中所得的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物(DOX-P)为对象，以泊洛沙姆作为对照，采用以下方法测定偶联物的临界胶束浓度(CMC)。

临界胶束浓度(CMC)测定：以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC时，胶束形成，芘向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光光谱在可以观察到一系列变化：荧光强度增加，激光光谱(0，0)波段红移。因此，通过以芘的激发光谱中I339/I333比(激发光谱中波长分别为339nm和333nm的荧光强度比)对两亲性分子的浓度作图，其线性关系在某一浓度点发生突跃，该点对应浓度为两亲性分子的表观CMC。

结果见图2，通过对线性关系分析找到突跃点，求出对应浓度，对比泊洛沙姆188，实施例1中所得的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物(DOX-P)的CMC与泊洛沙姆188的CMC相比，由0.340mg/mL变为0.050mg/mL，表明泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束保持了泊洛沙姆188胶束的自组装性能，在应用环境中不容易因溶液稀释而影响胶束形态，具有更好的稳定性。

实施例10泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束抗肿瘤实验考察

以实施例3中所得的泊洛沙姆188-阿霉素偶联物(DOX-P)胶束为对象，应用MTT法，以人肺癌细胞A549为模型观察其抗肿瘤活性。以阿霉素为对照组。

抗肿瘤实验：将调好浓度的A549细胞以4×10³个/孔的数量接种于96孔细胞培养板，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养24h。采用MTT细胞毒性检测试剂盒(凯基生物)检测细胞生存率，使用酶标仪(Spectramax M2，MD，美国)在570nm测定吸光度，细胞生存率(％)＝(加药细胞吸光值/空白对照细胞吸光值)×100，将游离DOX及实施例3所得的DOX-P胶束中DOX浓度与细胞生存率作图，计算得到IC50。

结果：泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束对A549细胞的IC50为10.7μg/ml，阿霉素对A549细胞的IC50为12.8μg/ml，表明泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束仍具有较好的抗肿瘤细胞的活性。

实施例11泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束克服A549/DOX细胞耐药性的MTT实验

肿瘤细胞A549/DOX耐药性实验：为了保持人肺腺癌细胞A549/DOX细胞的耐药性，需培养在含1μg/ml的培养液中，MTT试验前1周脱药培养。细胞毒性检测采用MTT法，将调好浓度的A549/DOX细胞以4×10³个/孔的数量接种于96孔细胞培养板，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养24h。采用MTT细胞毒性检测试剂盒(凯基生物)检测细胞生存率，使用酶标仪(Spectramax M2，MD，美国)在570nm测定吸光度，细胞生存率(％)＝(加药细胞吸光值/空白对照细胞吸光值)×100，将游离DOX及实施例3所得的DOX-P胶束中DOX浓度与细胞生存率作图，计算得到IC50。

结果见图3：泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束对A549/DOX细胞的IC50为44.5μg/ml，而阿霉素对A549/DOX细胞的IC50为550.1μg/ml，由此可见，泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束提高肿瘤细胞对于阿霉素的敏感性，克服肿瘤细胞对阿霉素的耐药性。

实施例12泊洛沙姆188-阿霉素偶联物胶束克服A549/DOX细胞耐药性的荧光显微镜及流式细胞术实验

利用流式细胞仪(FACS Calibur，NJ)来比较细胞对游离阿霉素和实施例3所得DOX-P的吸收差异，同时用荧光显微镜直观地观察细胞摄取情况。以A549/DOX细胞作为模型肿瘤细胞，按5×10-3/ml细胞密度接种到100mm的培养基，24h之后分别将DOX-P胶束溶液和DOX水溶液加到培养液中，每组都含有相同浓度的DOX(10μg/ml)，DOX-P胶束中DOX的浓度是通过DOX的装载量计算。2h之后，培养皿中的细胞用PBS缓冲液彻底清洗三次，再用荧光显微镜观察。确定细胞中DOX的摄取量需要收集细胞并利用流式细胞仪分析(FL2)，对DOX-P胶束培养的A549/DOX细胞进行相同的操作，相对荧光强度是以游离DOX作用的细胞作为对照来计算的。

结果见图4和图5：用DOX-P(图4b)作用A549/DOX的细胞比用游离DOX(图4a)作用的细胞株发射更强烈的荧光。流式细胞仪的检测也证实了DOX-P促进了A549/DOX对药物的摄取，如图5所示，图5a为空白对照，用DOX-P胶束(图5c)作用的A549/DOX细胞发出荧光强度高于用游离DOX(图5b)的作用。因此，对比DOX-P胶束和游离DOX，A549/DOX细胞对DOX-P有更大程度的吸收。

在上述实施例中，仅对本发明进行了示范性描述，但是本领域技术人员在阅读本专利申请后可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行各种修改。

Claims (10)

1.一种具有抗肿瘤耐药性的泊洛沙姆-阿霉素偶联物(DOX-P)，其特征在于：所述DOX-P结构通式为I所示，通过将末端为羧基的泊洛沙姆聚合物的羧基与阿霉素的伯氨基以酰胺键形式连接，其中R-NH₂表示阿霉素。

2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P，其特征在于：所述DOX-P按照每1ml水中加入3-30mg的DOX-P的比例，可以自组装形成DOX-P胶束。

3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P，其特征在于：所述DOX-P胶束通过高压均质、机械过滤或强力超声处理，可得到粒径范围均一的纳米级胶束，所述纳米级胶束的粒径分布于50-300nm范围内。

4.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P，其特征在于：所述DOX-P胶束粒径分布于100-200nm范围内。

5.根据权利要求1-4中任一所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P，其特征在于：所述DOX-P胶束可以采用药学公知的制剂技术制成供口服、黏膜、注射或外用的制剂。

6.一种如权利要求1所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P的制备方法，其特征在于：所述DOX-P的制备方法包括以下步骤：

a、将泊洛沙姆溶解于二氧六环中至泊洛沙姆浓度为0.1-5mol/L，加入与泊洛沙姆物质的量比为2-3的丁二酸酐，与泊洛沙姆物质的量比为0.5-10的催化剂4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，与泊洛沙姆物质的量比为1-10的缚酸剂三乙胺，进行缩合反应，，得到末端含羧基的高聚物，将反应液倒入截留分子量为7kD的透析袋透析，真空冷冻干燥即得末端为羧基的高聚物，备用；

b、将经过步骤a所得的末端含羧基的高聚物溶于有机溶剂中至浓度为0.1-10mol/L，加入与该高聚物物质的量比为0.5-10的催化剂a和b反应，加入与该高聚物物质的量比为2-3的阿霉素反应；

c、将经过步骤b所得反应液转移至截留分子量为7kD的透析袋，使用步骤b中所述有机溶剂作为透析介质进行透析；然后换用超纯水作为透析介质进行透析，透析液真空冷冻干燥，即得DOX-P。

7.根据权利要求6所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P的制备方法，其特征在于：所述的催化剂a选自：二环己基碳化二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、叠氮磷酸二苯酸(DPPA)、对甲苯磺酰叠氮或2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮；所述催化剂b选自：羧基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4酮(DEPBT)或N-羟基苯并三氮唑(HOBT)。

8.根据权利要求7所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P的制备方法，其特征在于：所述的催化剂a选自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；所述催化剂b选自羧基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)。

9.根据权利要求6所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂选自：N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲氯呋喃、二甲基亚砜或二氧六环。

10.根据权利要求9所述的具有抗肿瘤耐药性的DOX-P的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。

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