CN102988965A - 泛素蛋白酶体系统用于制备抗晶状体混浊产品的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及泛素蛋白酶体系统及其组合物用于治疗晶状体浑浊的新用途。泛素蛋白酶体系统主要是防止受损蛋白质的聚集沉淀,进而在晶状体受到氧化应激的损伤时混浊变性具有一定的保护作用,为白内障药物防治提供了一种新的药物来源和应用剂型,对其它年龄相关性眼部疾病的防治也有重要的参考价值。本发明安全价廉,疗效显著,性质稳定,适于医药、试剂等工业和行业的大规模生产和商业应用,易推广应用,具有良好应用前景,具有显著的社会效益、经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及医药、食品、饮料和试剂等技术领域,具体地说是涉及一种降解蛋白质试剂的新用途,更具体地说是涉及泛素蛋白酶体系统的一种新用途,再具体地说是涉及泛素蛋白酶体系统能够用于制备抗晶状体浑浊产品的新用途。
背景技术
(一)泛素-蛋白酶体通路的研究进展
泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,简称:UPP)是Hershko(Hershko A,Ciechanover A,Varshavsky A.The ubiquitin system[J].Nature Med,2000,10:1073-1081.)等于2004年发现的一个高效蛋白质降解系统,是细胞内依赖ATP的、非溶酶体途径的能够选择性降解受损或者修饰的蛋白质的通路,此外,它还可以降解转录因子、细胞周期蛋白等,使得细胞内各种蛋白质的含量得到精准调控,维持细胞正常的功能,特别是在细胞周期的调控方面起了重要作用。研究发现该通路介导的细胞降解是非常复杂缜密的调控过程,通过降解细胞内的各种通路的抑制或者激活因子来行使上调下调的作用进而调控机体内许多重要的生理功能。目前世界各国对UPP的研究主要集中在肿瘤的发病机制和治疗方面(Orlowski RZ,Dees EC.The role of the ubiquitination-proteasome pathway in breast cancer:applying drugs that affect the ubiquitin-proteasome pathway to the therapy of breast cancer[J].Breast Cancer Res,2003,5:5-7.)。它涉及了DNA的修复、蛋白折叠的质量控制、细胞周期的调控、凋亡、增殖、炎症、信号转导及转录活性的调节等。
1、泛素蛋白酶体系统的组成
它主要是由泛素(ubiquitin)、泛素连接酶和26s蛋白水解酶复合体(proteasome)三个部分组成。
1.1 泛素 泛素是一个由76个氨基酸残基组成的广泛分布在真核细胞中的高度保守的小分子球状蛋白质,游离存在与细胞内或共价结合到各种胞浆、胞核及细胞膜蛋白上。UPP可以识别、标记进而降解细胞内已经被泛素化的蛋白质,这一过程需要依赖ATP。其降解蛋白质的过程包括两个连续但相对独立的过程:
1)靶蛋白的泛素化,即多聚泛素链与靶蛋白的结合,对其进行标记,具体过程是泛素的C-末端Gly与靶蛋白的Lys侧链相互连接形成多聚泛素化链(CiechanoverA,OrianA,Schwartz AL.Ubiquitin-protolysis:biological regulation via destruction[J].Bioessays,2000,22(5):442-451.);
2)泛素化靶蛋白被26s蛋白水解酶复合体识别并降解重新释放利用泛素。
缩略词表
英文缩写 | 英文全称 | 中文名称 |
HMW | High molecular weight | 高分子聚合状态 |
PTM | Post translational modification | 翻译后修饰 |
RSL | Reactive site loop | 环状结构区 |
Ts | Tosyl | 对甲苯磺酰基 |
DTT | Dithiothreitol | 二硫苏糖醇 |
TAB | Tert-butyl alcohol | 叔丁醇 |
Ts | Tosyl | 对甲基磺酰基 |
UPP | Ubiquitin-proteasome pathway | 泛素蛋白酶体途径 |
PTM | Post translational modification | 翻译后修饰 |
LEC | Lens epithelial cells | 晶状体上皮细胞 |
PBS | Phosphate-Bufer-Solution | 磷酸盐缓冲液 |
GO | Glucose oxidase | 葡萄糖氧化酶 |
OS | Oxidase Stress | 氧化应激 |
ROS | Reactive oxygen species | 活性氧 |
RNS | Reactive ntrogen species | 活性氮 |
G3PD | Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 |
NOS | Reactive Ntrogen Species | 活性氮自由基 |
TTase | Thioltransferase | 硫醇转移酶 |
Trx | Thioredoxin | 硫氧还蛋白 |
TR | Thioredoxin reductase | 硫氧还蛋白还原酶 |
Tr | Tris HCL-Bufer-Solution | Tris HCL缓冲液 |
GR | Glutathione reductase | 谷胱甘肽还原酶 |
Cys | Cysteine | 半胱氨酸 |
EB | Ethidium bromide | 溴化乙锭 |
CF | Cystic fibrosis | 囊性纤维化 |
TEMED | Tetramethylethylenediamine | N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 |
DMSO | Dimethyl sulfoxide | 二甲基亚枫 |
[0011]
CK-19 | Cytokeratin-19 | 细胞角蛋白19 |
dsRNA | Double-stranded RNA | 双链RNA |
siRNA | Small interfering RNA | 小干扰RNA |
NC | Negative control | 阴性对照 |
RT | Reverse transcription | 逆转录 |
FBS | Fetal bovine serum | 胎牛血清 |
FAM | Carboxyfluorescein | 羧基荧光素 |
Abs | Absorption wavelength | 吸收波长 |
Em | Emission wavelength | 发射波长 |
靶蛋白只有被多聚泛素链标记后,才能被26s蛋白酶体识别和结合,并最终水解成多肽,而多聚泛素链在泛素在循环酶的作用下分解成单个泛素分子又被重新利用,这样就完成了泛素-蛋白酶体途径的循环。
1.2 泛素连接酶 泛素连接酶的主要作用是将泛素链接到胞内靶蛋白上。主要包括了泛素激活酶(E1)、泛素转运酶或泛素聚合酶(E2)以及泛素靶蛋白连接酶(E3)。
泛素化的过程基本包括:
1)E1利用ATP活化泛素,与泛素的羧基末端之间形成了高能硫脂键从而激活了泛素;
2)活化的泛素从E1通过转酰基的作用转移给E2的活性部位半胱氨酸第194位位点,形成一种中间体泛素-E2中间体;
3)在E3的催化作用下,泛素的羧基末端与底物蛋白的赖氨酸残基的ε-氨酸以一个酰胺异构体肽键连接,形成泛素化蛋白。
在真核细胞内,以往认为只有一种泛素激活酶E1且广泛存在于各种组织内,但是2007年Pelzer(Pelzer C,Kassner I,Matentzoglu K.UBE1L2,A novel Elenzyme specific for ubiquitin[J].J Biol Chem,2007,282(5):23010-23014.)等发现了一种新的泛素激活酶,并把它命名为UBE1L2,证实其具有活化泛素的功能,而且这种新型的泛素激活酶特异性只表达于睾丸组织。关于泛素聚合酶E2目前已经证实共有35个成员,它们具有高度保守的泛素连接域,是决定蛋白是否被降解的关键蛋白酶之一(van Wijk SJ,Timmer HT.The family of ubiquitin-conjugating enzymes(E2):deciding between life and death of protein[J].FASEB,2010,24:981-993.)。泛素靶蛋白连接酶E3是泛素与蛋白质底物结合所需的第三个酶。它对靶蛋白的特异性识别的特性决定了靶蛋白的泛素化修饰具有高度的选择性。根据E3与底物蛋白的比例可以将底物单泛素化和多聚化修饰,而只有被多聚化修饰的的蛋白才能进入下一步被蛋白酶体降解;与此同时,通过但泛素化和多泛素化修饰作用于某些膜受体,使其进入溶酶体进行降解(Melikova MS,Filatova MM,Komilova ES.Cbl-a polyfunctional regulator of cellular processes[J].Tsitologiia,2003,45(11):1134-1148.)。在该溶酶体途径中,E3是一类直接或间接 结合特定底物蛋白并促进泛素与底物蛋白结合的酶,这也决定了底物蛋白的多样性和选择性。
我们根据E3识别底物蛋白信号以及蛋白序列的不同将其分为三个家族:
1)HECT结构域(homologous to E6 carboxylterminus)家族的泛素靶蛋白连接酶E3s,HECT E3s有一个保守的HECT结构域,在这个结构域中的半胱氨酸残基可通过硫脂键与泛素连接形成中间体,进行下一步的直接催化底物蛋白的泛素化。
2)环指(RING-finger)结构域的泛素靶蛋白连接酶E3s,其中心具备锌指结构域(Fang S,Lorick KL,Jensen JD.RINGER finger ubiquitin protein ligases:Implications for tumorigenesis metastasis and for molecular targets in cancer[J].Semin Cancer Biol,2003,13(1):5-14.),RING-finger E3s仅仅起到受体的作用而不能通过硫脂键与泛素连接形成中间体(Petroski MD,Dehshaies RJ.Function and regulation of cullin-RING ubiquitin ligases[J].Nat Rev Mol Cell Biol,.2005,6(1):9-20.)。具有典型的环指结构包括c-Cbl、APC/C、VCB和SCF等均属于该亚类E3。Arkadia是一种存在于细胞内及核内的蛋白质,其羧基末端包含了环指结构域,因此被认为是环指家族成员之一。有研究发现Arkadia不仅在胚胎组织中广泛表达,而且在成体组织中分布极广泛,肺脏、胰脏、脾脏、睾丸、肾脏、心脏等组织中均有表达(Daizo K,MasahikoA,Akioshi K.Arkadia amplifies TGF-βsuperfamily signaling through degradation of Smad[J].EMBO,2003,302(24):6458-6470.)。Arkadia基因缺失的小鼠不能形成结节及其前结构(Li Xiao-zhao,Liu Fu-you.Ubiquitin-proteasome pathway having an influence on Smad signaling pathway[J].Int J Patholo CM,2006,26(2):181-184.)。
3)另一类与RING-finger相似结构的U-boxE3s是近年来被鉴定出的一类家族。其通过分子间氢键的连接形成隙状结构(Ohi MD,Vander kool CW,Rosenberg JA.Structural insights into the U-box a domain associated with multiubiquitination[J].Nature Struct Biol,2003,10(4):250-255.),这类泛素靶蛋白连接酶家族的作用可能是参与介导底物蛋白被其它E3泛素化后多聚泛素链的组装。
1.3 26s蛋白水解酶复合体 26s蛋白水解酶复合体是由一个20s圆柱形蛋白水解酶核心的连接催化基团和两个两端19s帽状识别亚基的调节基团组成(Komitzer D,Ciechanover A.Model of regulation of ubiquitin-mediated protein degradation [J].Cell Physiol,2000,182(1):1-11.)。19s调节基团具有ATP酶的活性,泛素聚合酶E2催化靶蛋白与多聚泛素链结合后被20s蛋白水解酶复合体的催化基团识别并降解为短肽片段。到此也是泛素介导蛋白水解过程的最后一步。
1.4 去泛素化酶家族(deubiquitinating enzymes,简称:DUB) 去泛素化酶是一类数量庞大的蛋白酶体家族,主要通过水解泛素羧基末端的酯键、肽键或者异肽键,使泛素分子特异性从泛素化蛋白或者前体蛋白上水解下来。迄今为止去泛素化酶分为以泛素羧基末端水解酶家族和泛素特异性蛋白酶体家族为主的5个类型。去泛素化酶在泛素依赖的蛋白质水解过程中具有以下功能:加工作用—将新和成的泛素分子加工成具有活性的泛素分子;降解作用—将多聚化泛素链降解成单个泛素分子重新利用;纠正作用—识别错误结合到蛋白质底物 上的泛素分子,并将蛋白释放出去。已经有研究证实了去泛素化酶可能参与细胞的生长发育、细胞周期调控、细胞信号转导通路等过程(LIU Qian,XU Wei-guo.Ubiquitin-proteasome system and their implication to the muscle atrophy in chronic obsturctive pulmory disease[J].Int J Respir,2010,30(19):1180-1183.),引起了越来越多学者的关注。
2、泛素蛋白酶体系统的生理病理功能
2.1 介导抗原提呈的作用 机体细胞内的抗原分子被泛素化后被26s蛋白水解酶体复合体降解成多肽片段,然后以抗原/MHC分子复合物的形式由组织相容性复合物MHC I类分子识别并提呈到细胞表面。
2.2 参与DNA损伤修复过程 ATM和ATR属于磷脂酰肌醇3-激酶(简称:PIKK)家族,是DNA损伤检查点的主要成员,它们在DNA遭受不同类型的损伤时被激活,通过磷酸化相应的下游蛋白Chk1和Chk2等,调节细胞周期各个检查点,引起细胞周期的停滞,使DNA损伤得到修复间歇。在DNA双链断裂位置的调节蛋白和与染色质相连蛋白在此过程中的ATM依赖的磷酸化促进了核小体的泛素化过程,因此可以提取DNA损伤部位修复复合物的招募信号(A Dams J.The proteasome:a suitable antineoplastic target[J].Nat Rev Cancer,2004,4(5):349-360.)。
2.3 调节细胞周期 细胞周期因子首先能被泛素化,然后由26s蛋白水解酶复合体降解,导致周期因子依赖的激酶失活,从而使细胞有丝分裂停滞,此外,细胞周期因子/周期因子依赖的激酶有它们特异性的抑制因子使其失活,而这些因子也是由UPP途径代谢的。
2.4 参与转录因子NF-κB代谢 NF-κB是一个多亚基组成的转录因子,κB磷酸化后可以被26s蛋白水解酶复合体降解,这一过程激活了NF-κB,使得其具有活性。κB的降解也需要泛素和26s蛋白水解酶复合体。
2.5 肿瘤发生的调控 目前世界各国对于UPP的研究主要集中在肿瘤的发病机制和治疗方面,已经有研究报道将蛋白酶体抑制剂用于肿瘤治疗并且取得了一定的成效(Orlowski RZ,Dees EC.The role of the ubiquitination-proteasome pathway in breast cancer:applying drugs that affect the ubiquitin-proteasome pathway to the therapy of breast cancer[J].Breast Cancer Res,2003,5:5-7.)。P53是一种抗癌基因,因为编码一种分子量为53kDa的蛋白质而得名。其表达产物为基因调节蛋白(P53蛋白),当DNA受到损伤时表达产物急剧增加,可以抑制细胞周期进一步运转。一旦P53基因发生突变,P53蛋白失活,细胞分裂失去控制便会发生癌变,人类癌症中大概50%是因为P53基因的突变失活。而另一方面,肿瘤细胞的发生于UPP对P53的异常降解有关。例如在高危因素人乳头状瘤状病毒(简称:HPV)引起宫颈癌中P53蛋白表达水平明显降低,这是因为16型或18型HPV编码的癌蛋白E6能够促进含有HECT结构域的泛素靶蛋白连接酶E6-AP与P53结合,导致P53更容易被UPP所降解(Stewart D,Ghosh A,Matlashewski G.Involvement of nuclear export in human papillomavirus type 18 E6-mediated ubiquitination and degradation of P53[J].J Virol,2005,79(14):8773-8783.)。另外一种癌蛋白MDM2也具有促进P53快速降解的作用,但是在肿瘤发生中不是主要的(Traidej M, Chen L,Yu D.The roles of E6-AP and MDM2 in P53 regulation in human papillomavirus-positive cervical cancer cells[J].Antisense Nucleic Acid Drug Dev,2000,10(1):17-27.)。丝氨酸/苏氨酸激酶或糖原合成酶3(简称:GSK3)激活后可以促进β-catenin经过UPP降解,如果细胞内聚集了大量的β-catenin,进一步结合到T细胞转录因子上并使其活化,从而导致了靶基因持续性激活,癌变的发生。
2.6 慢性阻塞性肺疾病患者骨骼肌萎缩的关系 DUB在最近的研究中发现参与了骨骼肌萎缩的过程。骨骼肌细胞内表达了多种去泛素化酶,其中有一些属于特异性表达(Quesada V,Diaz-Perales A,Gutierrez-Fernandez A.Cloning and enzymatic analysis of 22 novel human ubiquitin-specific proteases[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,314:54-62.)。Urso(Urso ML,Scrimgeour AG,Chen YW.Analysis of human skeletal muscle after 48h immobilization reveals alterations in mRNA and protein for extracellular matrix components[J].Appl Physiol,2006,101:1136-1148.)发现人骨骼肌细胞在完全制动48小时后USP-6mRNA表达明显升高。Qian(LIU Qian,XU Wei-guo.Ubiquitin-proteasome system and their implication to the muscle atrophy in chronic obstructive pulmory disease[J].Int J Respir,2010,30(10):1180-1183.)等最新研究烟熏诱导慢性阻塞性肺疾病(简称:COPD)大鼠模型,结果显示骨骼肌组织内的USP-31/USP-48表达显著增高,并具有剂量依赖性特征,而骨骼肌一种特异性表达的泛素特异性蛋白酶USP-47表达未见明显变化。对于骨骼肌特异性的泛素连接酶的作用和调节机制研究已经取得了令人鼓舞的进展,部分成果已经向临床预防治疗转化,而最新发现去泛素化酶参与骨骼肌萎缩过程也发挥了复杂多样的作用。
2.7 糖尿病视网膜病变的关系 机体病理状态下常伴有泛素-蛋白酶体途径活动的异常,反之亦然。Yuanjie(LIU Yuanjie,Chen Guoqing,Lu Chen,Zhou Hongying,Mei Yan,Yang Huijun.Expression of ubiquitin-protesome system in retina of alloxan-induced diabetic rat[J].Chin J Anatomy,2010,30(10):1180-1183.)等运用生物信息学方法,在正常和8周糖尿病大鼠视网膜基因的表达谱中,初步确定了泛素蛋白酶系统中与糖尿病视网膜病变(简称:DR)的相关基因UBE3A、PSMD8和PSMD11,并进一步通过免疫组织化学和半定量PCR技术正是了这三种DR相关基因在正常对赵大鼠视网膜为低表达或者不表达,而在糖尿病大鼠视网膜中均高表达。UBE3A是E3家族,具有识别并降解底物的功能,它的特异性底物是P53(Scheffner M,Huibregtse JM,Vierstra RD.The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of P53[J].Cell,1993,75(3):495-505.)。PSMD8和PSMD11为26s蛋白酶体中的组成部分,也就是26s蛋白酶体亚单位D8和D11。在DR早起泛素蛋白酶体途径DR相关基因PSMD8和PSMD11以及UBE3A的表达保护性增加,通过降解细胞内过多的P53使得细胞凋亡得到一定的控制,因此对于延缓DR具有重要的意义。Adachi Uehara(Chen Jing-bo.UPP and metabolic abnormalities with II type diabetes and vascular complications[J].Prac Med,2008,24(3):488-490.)等研究发现在糖尿病大鼠和II型糖尿病视网膜病患者中氧化磷酸化相关基因表达增加,同时UPP中泛素表达增加,这些变化可能提示在DR中存在蛋白转录 后的调节异常。
2.8UPP和白内障 泛素蛋白酶体途径已证实(Xinyu Zhang,Edward J.Dudek,Bingfen Liu,Linlin Ding,Alexandre F.Fernandes,Jack J.Liang,Josepb Horwitz,Allen Taylor,Fu Sbang.Degradationof C-terminal truncated αA-crystallins by the ubiquitin-proteasome pathway[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(9):4200-4208.)是晶状体中重要的蛋白质质量控制体系,在晶状体上皮细胞(简称:LEC)中含有泛素蛋白酶体系统的所有组成部分,大约40%~50%的LEC的胞浆蛋白是通过UPP降解的(Pereira P,Shang F,Girao H,Taylor A.Lens fibers have a fully functional ubiquitin-proteasome pathway[J].Exp Eye Res,2003,76:623-631.;Girao H,Pereira P,Taylor A,Shang F.Subcellular redistribution of components of the ubiquitin-proteasome pathway during lens differentiation and maturation[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46:1386-1392.)。它可以选择性地降解晶状体中受损的蛋白质,包括变性、氧化、脱酰胺化、谷胱甘肽化和钙蛋白酶截短的晶状体蛋白(Xinyu Zhang,Edward J.Dudek,Bingfen Liu,Linlin Ding,Alexandre F.Fernandes,Jack J.Liang,Josepb Horwitz,Allen Taylor,Fu Sbang.Degradationof C-terminal truncated αA-crystallins by the ubiquitin-proteasome pathway[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(9):4200-4208.;Dudek EJ,Shang F,Valverde P,Liu Q,Hobbs M,Taylor A.Seletivity of the ubiquitin pathway for oxidatively modified proteins:relevance to protein precipitation diseases[J].Faseb J,2005,19:1707-1709.;Marques C,Pereira P,Taylor A,Liang JN,Reddy VN,Szweda LI,Shang F.Ubiquitin-dependent lysosomal degradation of the HNE-modified proteins in lens epithelial cells[J].Faseb J,2004,18:1424-1426.;Zetterberg M,Zhang X,Taylor A,Liu B,Liang JJ,Shang F.Glutathiolation enhances the degradation of γC crystallin in lens and reticulocyte lysates,partially via the ubiquitin-proteasome pathway[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,47:3467-3473.;Tsirigotis M,Zhang M,Chiu RK,Wouters BG,Gray DA.Sensitivity of mammalian cells expressing mutant ubiquitin to protein damaging agents[J].Biol Chem,2001,11:11-15.)。和晶状体中其它的酶一样,UPP的活性会随着年龄的增长而降低(Zetterberg M,Petersen A,Sjostrand J,Karlsson J.Proteasome activity in human lens nuclei and correlation with age,gender and severity of cataract[J].Curr Eye Res,2003,27:45-53.),蛋白酶体自身的氧化损伤可能是其中的主要原因(Zhou X,Zhou J,Fernandes AF,Sparrow JR,Pereira P,Taylor A,Shang F.The proteasome is a target of oxidative damage in cultured human retina pigment epithelial cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49:3622-3630.)。UPP活性的年龄相关性降低可能是受损蛋白质在晶状体中蓄积沉淀而形成白内障的主要因素。在研究中表明在晶状体上皮细胞中应用化学性蛋白酶体抑制剂后会使得受损蛋白质的水平提高(Dudek EJ,Shang F,Valverde P,Liu Q,Hobbs M,Taylor A.Seletivity of the ubiquitin pathway for oxidatively modified proteins:relevance to protein precipitation diseases[J].Faseb J,2005,19:1707-1709.)。Zhang等的研究显示(Xinyu Zhang,Edward J.Dudek,Bingfen Liu,Linlin Ding,Alexandre F.Fernandes,Jack J.Liang,Josepb Horwitz,Allen Taylor,Fu Sbang.Degradationof C-terminal truncated αA-crystallins by the ubiquitin-proteasome pathway[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(9):4200-4208.)C-末端截 短的α晶状体蛋白不仅在形态上有所改变,而且其热稳定性,受到泛素蛋白酶体系统降解的易感性也都发生了变化,这种由于UPP对遭受损伤的α晶状体蛋白的快速降解可能对阻止变性蛋白质在晶状体的聚集起到了一定的作用,也就是说UPP的存在有助于防止白内障的产生。晶状体中蛋白质的聚集是导致晶状体产生混浊的主要原因之一,研究提示晶状体蛋白的钙依赖性裂解酶在晶状体蛋白的凝集方面起到了重要的作用(Azuma M,David LL,Shearer TR.Cysteine protease inhibitor e64 reduces the rate of formation of selenite cataract in the whole animal[J].Curr Eye Res,1991,10:657-666.;;Azuma M,Fukiage C,David LL,Shearer TR.Activation of calpain lens:a neview and proposed mechanism[J].Exp Eye Res,1997,64:529-538.;Qian W,Shichi H.Cataract formation by a semiquinone metabolite of acetaminophen in mice:possible involvement of ca(2+)and calpain activation[J].Exp Eye Res,2000,71:567-574.)。这种不被调节的裂解晶状体蛋白的方式导致了β晶状体蛋白、晶状体中的支架蛋白(David LL,Dickey BM,Shearer TR.Origin of urea soluble protein in the selenite cataract:role of β-crystallin proteolysis and caloain ii.[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1987,28:1148-1156.;Yoshida H,Murachi T,Tsukahara I.Degradation of actin and vimentin by calpain II,a ca2+-dependent cysteine proteinase,in bovine lens[J].FEBS Lett,1984,170:259-262.;Shih M,David LL,Lampi KJ.Proteolysis by m-calpain enhances in vitro light scattering by crystallins from human and bovine lenses[J].Curr Eye Res,2001,22:458-469.)的聚集以及α晶状体蛋白的分子伴侣(Kelley MJ,David LL,Iwasaki N,Wright J,Shearer TR.A-crystallin chaperone activity is reduced by calpain II in vitro and in selenite cataract[J].Biol Chem,1993,268:18844-18849.)的作用,这些钙调蛋白酶属于结构相关的钙依赖性半胱氨酸家族的蛋白酶。一些钙调蛋白酶是由泛素所表达的,有些是组织特异性的。UPP是一种可以选择性降解晶状体中修饰过或者损伤的蛋白质,有研究已经证实了晶状体中,包括晶状体上皮细胞和晶状体纤维细胞中具备全部功能的泛素蛋白酶体系统(Pereira P,Shang F,Girao H,Taylor A.Lens fibers have a fully functional ubiquitin-proteasome pathway[J].Exp Eye Res,2003,76:623-631.),UPP可以优先降解晶状体中受损的蛋白质,包括氧化损伤,谷胱甘肽化和热变性损伤的蛋白质。Edward[23]等的研究了UPP在C-末端截短的α晶状体蛋白的降解易感性,结果提示这种收到损伤后的晶状体蛋白改变了对UPP介导的蛋白质降解的效率,更容易被其降解。
(二)白内障的研究概况
1、概述
白内障是目前世界上影响人类健康的常见病,是严重影响人类健康的常见病、多发病,也是最常见的致盲原因之一,位列中国第一位致盲的疾病,其发病机制尚不十分清楚。
白内障临床研究表明,在各类白内障病例中,由老化所引起的老年性白内障占有绝大部分的比例。老年性白内障为双眼病,但两眼发病可有先后。根据白内障开始形成的部位,老年性白内障分为皮质性白内障(corticsal cataract)、核性白内障(nuclear cataract)和囊性白内障(subcapsular cataract),其中皮质性白内障是老年性白内障最常见的类型。
老年性白内障是老年人视力下降的主要原因,该病主要表现为在晶体老化过程中逐渐出现变性浑浊,又称变性白内障。在美国85岁以上的老年人中,患病率约占95%。
全世界特别是中国,面临人口快速增长的巨大压力及老龄化趋势加重的严峻局面,更加需要大力加强对白内障发病机理及影响因素的研究,以努力控制和减缓由此带来的白内障发病率上升的趋势。
2、白内障的形成原理及其病因学研究进展
白内障的发生与多种因素有关,是多种因素综合作用的结果。比如晶状体蛋白的基因突变、晶状体遭受氧化损伤、辐射损伤、老化变性、葡萄糖过度刺激、半乳糖等代谢障碍、脂质过氧化损伤等均可对晶状体的正常功能造成不同程度的损伤,结果导致晶状体发生混浊,影响晶状体对光的透射和折射,从而造成视物不清。
晶状体的功能是将光线聚焦到视网膜上产生视觉。晶状体的主要成分是水和蛋白质,晶状体干重的80%~90%是蛋白质,每种蛋白质的结构和它们彼此之间的相互作用是维持晶状体透明性的分子基础,所述的蛋白质包括α、β及γ三大族晶体蛋白。
晶状体的透明度是由恒定的水分含量、高浓度的蛋白质以及复杂的新陈代谢来保持的,即每种蛋白质的结构和它们彼此之间的相互作用是维持晶状体透明性的分子基础;也就是说,晶体蛋白的有序排列是维持晶状体空间结构的物质基础,即如果晶体蛋白组成发生改变,则会影响、破坏此种正常结构。
晶状体的透光性主要是取决于晶状体中水溶性蛋白组分的质和量,尤其是几种主要的结构蛋白如βB2(定义可参见文献:Aarts HJ,Lubsen NH,Schoenmakers JG..Crystallin gene expression during rat lens development.Eur J Biochem,1989,183(1):31-36)、γ5,6(γC,γD)、γ1,4、γ2,3和伴侣蛋白αA2及αB2。水溶性晶体蛋白的质和量的改变,直接影响晶体的透光性以及白内障的形成,以βB2为代表的高含量的晶体结构蛋白亦对晶状体的结构及其正常透光性起着举足轻重的作用。
α族晶体蛋白具有特殊的分子伴侣(Molecular Chaperone)作用,对于维持晶状体的正常结构起着关键作用;α族晶体蛋白的含量在老化过程中变化趋势,直接影响其分子伴侣活性的改变;随着老化进程,通常α族晶体蛋白分子伴侣作用减弱,而在白内障晶体中,则显现大量α族晶体蛋白转变为非水溶性的高分子量交联聚合物。
所谓分子伴侣,是指一类能够介导其它蛋白质的正确折叠和装配,以保护该蛋白质的活性,但它本身却不是有功能的最终装配产物的组成成分。但是,α族晶体蛋白是一种特殊的具有分子伴侣作用的蛋白,它不仅具有分子伴侣活性,而且也是晶体中最重要的结构蛋白之一。
晶体的透光性不仅需要足够量的水溶性成份来维持,而且还需要考虑晶状体的特殊代谢方式:晶体蛋白自生成之日起,不断被后生成的晶体蛋白向晶体的核心部挤压,并储存在不同的晶体结构层。因此,无论水溶性蛋白组分还是水不溶性组分,均无法代谢到体外。不过水溶性成份的积累有助于构建晶体从内到外层的正常结构;而水不溶性成份的渐次积累,则会逐渐增 大晶体的光散射,不利于透光性,也就是说,它是老年性白内障形成的物质基础。
哺乳动物自出生后,由于晶体暴露在外,在晶状体发育成长过程中,晶体蛋白受机体自身自然老化及诸多外界因素的影响,易受体内外多种因素的影响而发生变异,会发生不同的修饰变性。晶体蛋白的质和量会发生改变,水溶性成份不断转变为水不溶性成分,影响其水溶性,进而影响晶状体的正常结构和透光性,最终导致老年性白内障的形成。也就是说,在人体衰老的过程中,一旦晶状体中的蛋白质结构受到破坏,则晶状体由清澈透明变为混浊不透明,进而影响晶状体的正常结构及透光性,并逐步演变为老年性白内障。
综合文献相关晶体蛋白的结构特点,研究发现影响其蛋白结构的主要因素为翻译后修饰(posttranslational modification,简称:PTM),即许多晶体蛋白在翻译后可通过酶的催化或在酶控制下反应而发生的修饰,其主要包括糖基化、氧化、氨甲酰化、磷酸化、乙酰化、羟基化、脱酰胺、消旋和切除作用等。晶状体蛋白质周围存在许多活性分子,包括糖、来源于尿中的氰酸盐、糖皮质激素和具有活性的其他代谢产物等,这些均可在非酶环境下攻击蛋白质。
因此,维持晶状体的透光性,一方面,需保持晶状体中足够的水溶性蛋白的量,这主要取决于机体内部晶体蛋白的基因不遭受突变,能够实施正常表达即可,如需要某种晶体蛋白进行高表达或低表达,则可采用基因工程方法,激活或抑制相应的基因;另一方面,需要尽力遏制、减缓晶体蛋白由水溶性蛋白向水不溶性蛋白的转变。
3、白内障的治疗现状
白内障是世界性致盲性疾病。临床诊疗方面,目前对于白内障的唯一有效治疗手段是外科手术。尽管白内障手术已日臻完善,但不可避免的手术并发症和社会经济问题仍十分严重,如手术后数年内后发性白内障、继发性青光眼或角膜损伤等发生率较高,通常难以根除。
寻找有效的预防和药物治疗方法,早期控制白内障,仍然是该领域的研究热点。预防和药物治疗白内障主要有两种途径,即减少白内障发病的危险因素和应用抗白内障药物。
与白内障发病相关的主要危险因素有糖尿病、青光眼、近视、长期应用皮质类固醇、严重腹泻、紫外线辐射、大量饮酒和吸烟等。Taylor等总结为6个“D”,即阳光辐射、饮食、药物、糖尿病、脱水和原因不明。减少这些可能的危险因素是一种积极的预防手段。
在药物应用方面,现已研制出数十种药物用于临床,用于维持晶体的透光性延缓或治疗白内障。由于缺乏对于白内障生成机理的完善依据,研制并仍在使用的诸多药物,仍存在不少的缺陷,例如有效率较低、针对性差等。因此,虽然名目繁多的抗白内障药物在世界各国广泛应用,但是尚存在很多问题。白内障的药物治疗仍然面临着严峻的挑战:尽管有数十种抗白内障药物已被广泛临床使用,但证明其有效性的直接证据甚少。
由于白内障的发生是各种因素综合的结果,其发病原因还没有定论。当前,各科研组织多是针对某一发病因素,或是对抗发病过程中眼的某些生理生化变化进行抗白内障药物的研究开发。如今已经用于白内障治疗的药物主要有以下几类:
①醛糖还原酶抑制剂(简称:ARlS)是第一类被系统地研究并进行临床实验的抗白内障 药物,使用该药物是基于1962年提出的渗透压学说和早期糖尿病性大鼠晶状体以及高糖孵育环境下,晶状体中大量的山梨醇沉积的证据。
代表药物有卡他林(Catalin)和法可立辛(Phacolysin),通过抑制晶状体中多元醇的积累,起到缓解糖性白内障的作用,同时二者与晶体蛋白的结合力都很强,可保护晶体蛋白不受因色氨酸代谢异常而产生的醌亚氨酸的损伤;但临床应用及实验室验证表明,ARIS治疗糖性白内障并非有效,而且ARIS的副作用严重,其药物机制“名不符实”。
②针对白内障发生的自由基氧化学说而开发的抗氧化药物抗氧化的药物品种很多,包括谷胱甘肽、牛磺酸、维生素E、维生素C、β胡萝卜素,以及带有还原性琉基的各类化合物等。
谷胱甘肽和药物前体:随着老化和白内障的形成,晶状体中谷胱甘肽的水平降低,故增加谷胱甘肽会有益于治疗白内障。谷胱甘肽是一种三肽(γ谷氨酰胺、半胱氨酸、氨基乙酸),它在晶状体中的水平将会被三肽自身、或者一种药物前体如酯、或者被氨基酸组分激活。谷胱甘肽可抑制糖基化。许多实验采用谷胱甘肽的酯和它的二肽前体,抑制各种实验性白内障的形成,但一般要比诱发白内障的因子同时或提前使用,可能的原因是简单地减少诱发因子的攻击或影响该因子的吸收。例如,谷胱甘肽单异丙基酯或提前一小时应用谷胱甘肽和γ谷氨酰胺半胱氨酸酯,可抑制Buthionine Sulphonimine诱导的白内障的发生;较亚硒酸钠提前30分钟应用谷胱甘肽和单异丙基酯,可减少硒性白内障的发生;在X射线辐射大鼠前注射半胱氨酸、硫脲、谷胱甘肽和半胱胺可减少辐射的副作用;X射线辐射大鼠一天后,谷胱甘肽单异丙基酯能保护X射线辐射诱导的白内障形成。
半胱氨酸是谷胱甘肽限制性底物,故使用半胱氨酸(或药物前体)可抑制白内障,如果能减少硫基或双硫基团,双硫化合物是较好的抗白内障药物。但目前临床试验甚少。
牛磺酸:牛磺酸可抑制半乳糖性白内障,阻止晶状体蛋白的糖基化和氧化。若饮食中增加牛磺酸替代品,可减少由于晶状体细胞的损害导致的γ晶体蛋白向玻璃体的渗漏,被认为是一种较好的抗氧化剂和抗白内障药物。
牛磺酸是一种磺基氨基酸,在人体中大量存在,其具有抗氧化作用,能保护细胞和组织免受氧化损伤。晶状体具有蓄积牛磺酸的能力,在晶状体中牛磺酸约占非蛋白质水解氨基酸的50%,是晶状体中重要的氨基酸。随着白内障病程的发展,晶状体中午磺酸的含量显著降低。世界各国的一些研究小组近年来进行了一系列系统研究,发现牛磺酸对亚硒酸钠性白内障的抑制作用与其抗氧化特性有关,而牛磺酸能够预防或延缓糖尿病性白内障的作用机制主要为:抗氧化作用;膜稳定作用;降血糖作用;渗透压调节作用。牛磺酸的抗氧化作用和渗透压调节作用对白内障的防治具有一定的可行性。
由美国国家眼科研究所资助的大规模年龄相关性眼病研究(简称:AREDS),对5000例进行为期5~10年的随访调查,目的是揭示大剂量抗氧化剂和锌添加剂的摄入对年龄相关性眼病包括白内障的防治作用。最近的报道对年龄55~80岁的3640例,长期服用维生素类药 物的情况进行调查,平均随访6.3年,结果建议55岁以上有可疑年龄相关性黄斑变性,应服用抗氧化剂,如维生素C、维生素E、β胡萝卜素和锌,但大量摄入营养仅可提供很有限的抗白内障作用。
抗氧化剂越来越多的试验证实了,在白内障发生发展中,氧化损伤作用是各个层次上生理生化变化的枢纽,所以对各种抗氧化剂的研究成为抗白内障药物开发的焦点。日本学者研究了一系列还原性硫醇衍生物,发现它们可与游离基快速反应,阻断谷胱甘肽被氧化,恢复晶状体的正常状态。其中,双硫伦(Disulfiram,简称:DSF)是这类药物中具有较高活性的一种前体药物,脂溶性的DSF透过角膜上皮后,可以转化为其单体二乙二硫氨甲酸(Diethyldithjocarbamateacid,简称:DDC)发挥抗白内障作用,对于急性硒性大鼠白内障模型具有明显的延缓白内障发生发展的作用,并能减轻氧化造成的损伤。
但是,单纯应用维生素类对于抗氧化剂的预防和治疗白内障的作用有限,临床资料缺乏可比性。
③针对因眼组织能量新陈代谢失调,特别是制造不足而导致的白内障而开发的能量补充剂,主要含有维生素B1、B2、B6、烟酰氨、腺嘌呤核苷、琥珀酸、遍多酸、维生素C、维生素E、ATP、儿茶酚、细胞色素C等成分。
④针对钙离子过多引起的白内障而应用于白内障治疗的Ca离子拮抗剂维拉帕米,能够阻断细胞钙离子的内流,降低白内障眼组织中的钙离子的浓度。
⑤针对Mallard反应为发病机理的药物,如布洛芬、DETAPAC等。
⑥中草药制剂,如八味地黄丸、珍珠明日液及雪叶莲挤压汁和美国金缕梅的浸出液等;
⑦氨基酸制剂Phakan,含有谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、肌醇、盐酸吡哆醛等。
⑧阿司匹林
阿司匹林是二十世纪最伟大的发明之一,作为治疗药物不断有新的用途出现。研究表明,阿斯匹林也具有抗白内障的作用。通过动物实验研究阿司匹林的作用机理,认为阿司匹林抗白内障机制有4种:(A)抑制非酶性蛋白质糖基化,即阿司匹林与晶体蛋白中赖氨酸残基结合,阻止葡萄糖与赖氨酸的非酶性糖基化反应,并可防止晶体蛋白聚合物形成;(B)抑制晶体蛋白的氨基甲酰化,阿司匹林的乙酰基与晶体蛋白的氨基酸基团结合,阻断了氨基酸残基甲酰化反应,使蛋白分子表面的正常电荷配布免遭破坏,从而维持了晶体蛋白的正常结构;(C)抑制脂质过氧化,阿司匹林的乙酰基可优先夺取晶体蛋白的活性氨基位点,避免了脂质过氧化给晶体带来的损害;(D)阿司匹林通过抑制膜上的环氧化酶使晶体细胞膜上的钙通道失活,从而防止晶体蛋白多肽链的聚合反应。
阿司匹林类药物廉价方便,副作用较少,有潜在的治疗老年性白内障的临床应用价值,但该药物适应症甚广,有部分病人对该药有依赖性,长期较大剂量的口服亦会有副作用,如临床个案发现,长期大剂量应用阿司匹林会导致胃出血。
⑨糖基化抑制剂
蛋白质糖基化学说—糖基化反应。此学说的核心是还原糖醛基与蛋白质中自由氨基(赖氨酸或精氨酸的。NH2或蛋白质分子的N端游离的-NH2)发生非酶性糖基化反应(Maillard反应),生成含Schiff氏碱基对的中间产物,在经过一系列缓慢的Amadori结构重排后,形成有酮胺结构特征的各种Amadori产物,再经脱水和分子重排后,最终形成有荧光和蛋白质交联特性的各种糖基化终产物(简称:AGE)。
糖基化抑制剂——氨基胍:氨基胍(aminoguanidine)是一种亲核肼的衍生物,70年代认为可抑制糖基化末端产物的形成以及抑制二胺氧化酶、一氧化氮合成酶和过氧化氢酶活性。近年的研究表明,氨基胍、1,3-二氨基胍和甲基氨基胍可抑制醛糖还原酶。但在半乳糖性白内障模型中,这3种化合物并无醛糖还原酶抑制剂的作用。氨基胍是糖基化抑制剂,被用于糖尿病并发症的治疗,包括白内障,它能够与糖基化的化合物结合,在糖基化各个时期抑制早期和晚期糖基化产物。氨基胍可抑制轻度糖尿病性大鼠晶状体的混浊,可降低链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠主动脉、肾小球和肾小管血液中荧光值,减少尿中白蛋白的分泌,但不能降低肾皮质已升高的山梨醇水平。氨基胍的主要作用是抑制糖基化,而不是改变生物化学过程。氨基胍还可抑制钙依赖的Calpain(内肽酶)蛋白水解酶介导的晶状体蛋白质的水解,阻止遗传性Shumiya大鼠白内障。该药物已用于临床试验,其衍生物和清除糖基化交联因子正在研究中。
⑩Calpain抑制剂
硒性白内障是快速、有效和重复性良好的白内障模型,已广泛应用于白内障发病机制和评价抗白内障药物的研究。蛋白质水解酶诱导的晶体蛋白的切除作用,特别是钙依赖的Calpain蛋白水解酶LP82和M Calpain的激活,在该白内障发病中起重要作用。Calpain蛋白水解酶抑制剂E64可延迟大鼠硒性白内障的形成,但必须在亚硒酸钠应用前;E64在离体孵育晶状体中可抑制晶状体的混浊,其它还包括E64D和SJ A6017等。但重要的问题是在白内障晶状体中尚未发现Calpain诱导的局部晶体蛋白的水解。钙依赖的Calpain蛋白水解酶在幼鼠晶状体中的含量远远超过了人的含量,所以它与人白内障的发病存在不同的机制。Calpain抑制剂主要是实验室研究结果,尚无临床资料。
糖基化抑制剂、谷胱甘肽和药物前体、相分离抑制剂和Calpain抑制剂等的研究虽有较大进展,但仍需要临床研究的进一步验证。此外,还有许多有希望成为抗白内障的药物正在开发和研制中。
4、白内障治疗药物研究的发展趋势
目前,手术是白内障的最直接、最有效的治疗方法。尽管白内障手术已较成熟,但不可避免的有相应的手术并发症,而且患者需要选择最佳的手术时期,过了最佳手术期便不会有太好的效果。因此,研究白内障的致病因素,发病机制,和有效的抗白内障药物极其重要。
一般认为,自由基损伤是引起各种致白内障因素作用的共同途径,晶状体上皮细胞过度凋亡及晶状体蛋白损伤也是白内障发生机制中的重要因素。随着对白内障发病机制的深入研 究,越来越多的研究者认识到虽然不同的损伤因子导致白内障的途径和机制各不相同,但他们大多通过一个共同的最终产物——高分子量物质(High molecular weight,简称:HMW)而导致晶状体混浊。多年来人们对白内障的病因和发生机制进行了大量研究,针对不同的病因学说应用不同的药物治疗白内障,尽管目前在世界范围内有近40多种抗白内障的药物在临床上广泛应用,但其疗效不十分确切,手术治疗仍然是各种白内障的主要手段。因此研究新型抗白内障药物的疗效,探讨其干预的机制是白内障研究领域的重要内容。
白内障的发生是多因素共同作用而导致的综合结果,其病理变化是多水平多层次的。随着研究手段的不断提高,对白内障发病机理的研究也将日益深入,同时对治疗白内障药物的开发针对性也就越强。理想的白内障治疗药物应该能够恢复晶体的正常代谢和促进晶体混浊的吸收,但至今为止尚无一个药能够达到上述要求,尽管如此,任何有希望的抑制白内障发病的措施都显示出研究的价值,而世界医学的传统宝库还有待发明人去开发。
现临床上多种用于治疗白内障的药物,由于缺乏对于白内障生成机理的完善依据,使仍在广泛使用的诸多药物存在不少缺陷:有些效率较低、针对性差,有些还有较大的副作用。为此,亟待进一步探明白内障发病机理、找出影响晶体透光性的易感蛋白,作为治疗和预防白内障的有效靶点,设计有针对性的药物,以达延缓晶体老化和预防、治疗白内障的目的。
随着白内障发病机理的研究不断趋于完善,也一定会产生更多相关的应用思路和切实可行的方法服务于临床治疗,同时也为研究防治晶状体浑浊提供了一条新的策略。
因此,寻找新型、成分明确、疗效确切、不良反应小的抗晶状体浑浊产品仍然势在必行,特别是药物,意义重大,并具有显著的社会效益和经济效益。经文献检索等,迄今为止,尚未发现利用泛素蛋白酶体系统作为抗晶状体浑浊产品尤其是抗晶状体浑浊药物的报道。
发明内容
本发现所需要解决的技术问题是公开了一种降解蛋白质试剂的新用途,即泛素蛋白酶体系统具有抗晶状体浑浊作用的新用途,能够用于制备抗晶状体浑浊产品,以克服现有技术存在的上述缺陷。
也就是说,本发明针对现有技术的不足,通过实验研究和理论探索,目的意在泛素蛋白酶体系统的用途,即提供含有上述药物或其组合物作为抗晶状体浑浊产品方面的应用。
本发明所述的抗晶状体浑浊产品是指医药等技术领域中,一种直接或者间接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的产品;
优选直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的产品,所述的晶状体混浊疾病包括各类晶状体混浊疾病中的一种或多种。
所述的抗晶状体浑浊产品是包括药物、试剂等中的一种或多种,优选药物。
一、技术构思
自主开发研发创新药物是中国目前的一项紧迫任务,中国医药学具有悠久的历史,在预 防和治疗疾病方面也积累了丰富的经验,寻找有效的活性成分或其组合物,发现新药物、已有药物的新组合或新用途等均是有效的快捷途径,特别是拓展现有化合物或已有药物的新用途更是高效、快捷、经济的手段,也是中国创新药物研制的优势之所在。
晶状体浑浊的防治是近年来的一个研究热点,然而有关白内障的病因学研究,尚远远滞后于临床需要。在白内障疾病的病因学研究方面,特别是以往在有关晶体蛋白受不同外界因素影响的研究方面,对晶体蛋白发生质和量的改变,大多不作细分,如宏观描述β晶体蛋白。但是,发明人认为,晶体蛋白随老化进程,不同组分应该有不同的表达趋势、消长规律不一,不细分落实到具体蛋白,则难以定向研究各自晶体蛋白的特性。
晶状体的老化是一种不可避免的自然生理进程,即随着年龄的增长,晶状体逐渐老化。但是,发明人仍然可以通过探讨老年性白内障的形成机理,采用合理的控制方法或治疗手段,延缓晶状体的老化进程。但是,晶状体浑浊的机制复杂,是多种因素相互、共同作用的结果,而单一机制的研究往往不能达到满意的效果,因此多种机制的、多药物联合运用的综合性研究有待进一步开展。
氧化应激是由活性氧(简称:ROS)诱导的一种与老化密切相关的损伤类型,与老年性白内障的形成有关,被认为是白内障的始发因素。晶状体产生的主要活性氧分子包括超氧负离子、羟自由基和H2O2;内源性产生的活性氧的结构包括NADPH氧化酶,线粒体和过氧化物酶体,两种主要产生内源性活性氧的途径是紫外线和离子辐射。晶状体中通过这些途径产生的ROS分子可以经由抗氧化剂和氧化防御系统中和,因此晶状体中具备这两大修复系统来重塑损伤分子或者减轻损伤程度。硫醇转移酶(thioltransferase,简称:TTase)、硫氧还蛋白(thioredoxin,简称:Trx)和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,简称:TR)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,简称:GR)系统被认为是哺乳动物组织中强有力的蛋白修复系统。近年的研究显示TTase/GR和Trx/TR均存在于晶状体中,对保持晶状体的透明性有重要的作用。
晶体蛋白的翻译后修饰(简称:PTM)是白内障发病的主要诱因。晶状体是一种结构极为特殊的器官:透明、缺乏血供,晶体蛋白缺乏转化更新、形成后即伴随终生。使晶体蛋白遭受PTM的可能性远较其它类蛋白大。PTM对晶体蛋白的主要影响是:极易引发晶体蛋白去折叠、改变蛋白原有构象;二硫键形成、晶体蛋白之间非特异交联,蛋白水溶性下降;聚集增强形成高分子量物质(High molecular weight,简称:HMW),当HMW聚集达到1×107Da以上时,即可发生光散射,晶体失去透明性、发生白内障。
泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,简称:UPP)是Hershko等发现的一个高效率蛋白质降解系统,目前世界各国对于泛素蛋白酶体系统的研究主要集中在肿瘤的发病机制以及治疗学方面,是蛋白质的选择性降解中一项非常重要的机制;研究发现该通路介导的细胞蛋白降解是一个非常复杂而缜密的调控过程,是细胞调控的重要机制,通过降解细胞各通路的抑制因子和(或)激活因子发挥着上调或下调作用。最新有实验研究出 晶状体上皮细胞中也含有泛素蛋白酶体系统的所有组成部分,大约有40%~50%受损的晶体蛋白可以通过泛素蛋白酶体系统进行降解。泛素蛋白酶体系统是晶状体中主要的蛋白质质量控制体系,它可以通过选择性地降解受损的晶状体蛋白,还能发挥有条件地降解与细胞内多种生物过程相关的调控蛋白的作用,参与晶状体的发育与分化。近年来,泛素蛋白酶体系统作为细胞内蛋白质非溶解体性降解的主要途径已受到人们的日益重视,但泛素蛋白酶体系统在白内障的研究目前仍处于起步阶段。
目前对于泛素蛋白酶体途径的研究世界各国主要集中于肿瘤的发病机制和治疗方面,对于UPP在白内障的研究尚无相关的报道。而在晶状体中已经发现含有全部的UPP的功能基团,并且是一个高效的蛋白质降解系统,其实如何增强晶状体自身的蛋白质质量的控制效率,使得其自身有效地修复或是清除收到损伤的蛋白质,从而延长晶状体的功能寿命,是老年性白内障防治过程的一个关键点,那么作为一种重要的蛋白质质量控制体系的UPP在白内障形成的过程中扮演了什么样的角色呢?它是否能够有效的防止白内障的发生呢?探索UPP活性的提高和UPP的功能障碍对于白内障作用和机制将为白内障及其它的年龄相关眼病提供一个新的治疗靶点。而已经有学者研究出UPP可以选择性地降解受损的晶状体蛋白。
因此,发明人假设UPP活性的年龄相关性降低是受损蛋白质在晶状体中蓄积沉淀进而形成白内障的主要原因,能不能通过表达一种下调UPP活性的基因转染到晶状体细胞内,观测UPP功能受损导致受损蛋白质的聚集形成白内障的证据和机制;反之通过上调UPP的活性如果能起到延缓白内障的形成也可以探究其中的主要机制。例如可以应用腺病毒载体这一安全性好、免疫源性低、能感染分裂和非分裂细胞而且能够介导外源基因长期稳定表达诸多优点,应用腺病毒载体将一些抑制或激活基因转移到晶状体中,探寻UPP在白内障发生过程中的机理。这样不但能加深我们对白内障形成的分子机制的理解,而且还将为白内障以及其它年龄相关的眼部疾病的防治提供一种新的思路。
发明人通过研究泛素蛋白酶体系统对晶状体上皮细胞内受损蛋白质水平的影响,探讨其是否能够清除受损变性的晶体蛋白。发明人通过原代培养的晶状体上皮细胞,对泛素蛋白酶体系统活性和白内障形成及受损蛋白之间的关系进行评估,探讨抗白内障的作用机理。
总之,发明人的实验发现了此化合物具有良好的抗晶状体浑浊作用,为白内障药物防治的临床前期研究提供可靠的理论实验依据,而且这将对于其它年龄相关性眼部疾病的防治也有重要的参考价值。
根据此想法和思路,发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索,已成功得到预期的研究结果和应用产品。
二、确定泛素蛋白酶体系统能够用于制备抗晶状体浑浊产品的理论设想与研究基础
1、概述
晶状体具有独特的代谢方式,其中央无显著的蛋白质合成、氧浓度极低、长期遭受环境和眼内各种应激的刺激,给蛋白质翻译后修饰带来了机会,因此晶状体蛋白是研究人体老化 极好的器官。白内障的形成是晶状体老化的最终结果。晶状体是富含蛋白质的组织,晶状体蛋白约占整个晶状体湿重的34%,透明性是由于这些蛋白质短程有序的排列方式,特别是α晶状体蛋白,随着年龄老化,或者是遭受氧化应激,晶体蛋白短程有序的排列方式,特别是α晶状体蛋白,随着年龄老化,或者是遭受氧化应激,晶状体蛋白的结构排列方式发生变化时,均可影响晶状体的正常功能。
晶状体蛋白的各种翻译后修饰(post translational modification,简称:PTM)包括βB1、βB2和βA3/βA1晶状体蛋白N端的切除,α晶状体蛋白部分磷酸化和C-末端降解;αA和γs晶状体蛋白的脱酰胺,αA晶状体蛋白内双硫键形成和γs晶状体蛋白巯基暴露等可导致不同程度的α晶状体蛋白分子伴侣活性的下降,β晶状体蛋白的溶解性降低。所以如何有效的修复或清除受损的晶状体蛋白质,防止其在晶状体内聚合沉淀,对维持晶状体的透明性及防治老年性白内障起着关键作用。
泛素蛋白酶体系统能够调节生物体内许多重要的生命过程,例如蛋白质的折叠、炎症反应、细胞基质重建以及肿瘤抑制等。它由240个氨基酸残基组成,在X光下的晶体结构为球状蛋白并含有9个α-螺旋和3个β-折叠。在其表面距离C末端约20个残基处具有一个环状结构区RSL(Reactive site loop),该结构是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的标志性结构,该结构区中存在能被靶酶的底物识别位点识别的酶切位点,包括临近N-末端的第一个氨基酸(P1),和临近C-末端与P1相邻的第一个氨基酸(P1′)。泛素蛋白酶体系统在反应构象改变过程中将失去约37%的结构特征,使其抵抗热变性及化学变性的能力大大提高。发明人前期的实验结果显示了二硫苏糖醇(dithiothreitol,简称:DTT)和叔丁醇(Tert-butyl alcohol,简称:TAB)以及异丙醇对晶状体混浊都有一定的抑制作用,泛素蛋白酶体系统化学结构中的对甲基磺酰基(Tosyl,简称:Ts)作为一个亲电子基团,可以保护醇羟基,间接发挥与DTT类似的作用;另外结构中的甲基酮作为烷化剂,和异丙醇一样封闭巯基,能够替代蛋白质暴露出的巯基,减少蛋白之间非特异性聚集变性的可能性,阻止蛋白高分子聚合物的形成,进而阻止其蛋白由水溶性变为水不溶性,具有良好的抑制晶状体蛋白中的含巯基蛋白的抗氧化作用。
本研究通过对泛素蛋白酶体系统和晶状体蛋白氧化损伤之间关系的研究,不但能够使发明人理解泛素蛋白酶体系统的抗晶状体损伤混浊的作用,还将为白内障以及其他年龄相关性眼部疾病的防治提供新的思路。并且对进一步探索泛素蛋白酶体系统的抗晶状体氧化损伤的分子生物学机制提供实验依据。
综上所述,本发明从该靶蛋白的生物化学结构特征着手,着重研究了物理、化学等因素诱导晶体蛋白变性的机理;并据此研制抗靶蛋白变性的化合物,此化合物可作为能够保护晶体蛋白不受或少受促变异影响的外用药物;该化合物能够采用脂质体作为晶体角膜的导入体;并先期用于硒(亚硒酸钠Na2SeO3)诱导的SD大鼠白内障模型,模拟老年性白内障的病理变化,裂隙灯每日观察、记录晶体透光性改变进程,观察疗效;进而探讨临床应用的前景,期望该化合物能够对于延缓和治疗老年性白内障,尤其针对大部分初发期的老年性白内障治疗产生积极 影响。
2、泛素蛋白酶体系统对晶状体上皮细胞内受损蛋白质水平的影响
本发明基于对晶状体混浊发病机制的深入了解为起点,设计、筛选合适的抗晶状体混浊的新型药物,并验证其作用效果,探讨过度表达泛素蛋白酶体系统的限速成分Ubc4对晶状体上皮细胞内受损蛋白质水平的影响,进而探讨药物的作用机制。本发明的实验研究主要包括以下内容:
方法:采用原代培养的方法体外培养晶状体上皮细胞,经泛素蛋白酶体系统通路的上调因子miRNA Ubc4转染到传代的晶状体上皮细胞中,检测转染后的细胞对抗环境应激能力的影响。
结果:转染Ubc4上调泛素蛋白酶体系统的活性后的晶状体上皮细胞中受损的晶状体蛋白αA1-162(是αA晶状体蛋白的降解片段,容易聚集沉淀;αA晶状体蛋白是一种公认的保护性晶状体蛋白,该蛋白受损遭到降解后其保护作用降低)的含量明显少于未转染细胞中的水平。
结论:转染siRNAUbc4后的晶状体上皮细胞中的αA降解片段(αA1-162)含量减少,有助于防止受损蛋白质的聚集沉淀,进而在晶状体受到氧化应激的损伤时混浊变性具有一定的保护作用。
三、泛素蛋白酶体系统的用途
1、概述
本发明研究涉及到的药物作用机制与泛素蛋白酶体系统有关,并进行了进一步的动物实验研究与理论探索。
发明人经过研究的最新发现是:发明人以晶状体浑浊为研究重点,详细阐述了对泛素蛋白酶体系统对蛋白质降解的积极作用。如采用泛素蛋白酶体系统干预晶状体,减缓晶状体因受氧化应激作用而浑浊,即明确了泛素蛋白酶体系统的预防、治疗作用。
虽然还有很多问题有待解释和解决,但是发明人的实验为泛素蛋白酶体系统防治白内障的作用机制提供了实验依据,对下一步药物开发以及运用于临床前期的治疗方案提供了崭新思路。
也就是说,泛素蛋白酶体系统或其组合物能够用于制备抗晶状体浑浊产品,可用于所涉及晶状体浑浊的防护、治疗等应用,最优选的是抗晶状体浑浊药物。
经实验研究表明,泛素蛋白酶体系统体外能够显著延缓晶状体浑浊相关疾病的发展。已完成的急性毒性实验证明,小鼠腹腔注射给药对泛素蛋白酶体系统的最大耐受量超过1.5mg/kg,相当于临床推荐用药剂量的30倍以上,表明该有效部位安全可靠,解决了该类药物剂量使用禁忌上的问题。
综上所述,发明人对抗晶状体浑浊产品进行了理论探索,经过大量的实验研究包括长期的药理学试验,发现所述及的泛素蛋白酶体系统有显著的预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊的活性,为研制抗晶状体浑浊产品尤其是抗晶状体浑浊药物提供了新的来 源,为进一步开发利用中国现有药物提供了科学依据。
因此,泛素蛋白酶体系统或其组合物尤其是药物组合物可用于制备抗晶状体浑浊产品,优选以本发明泛素蛋白酶体系统为原料制备而成的抗晶状体浑浊药物。
2、泛素蛋白酶体系统的使用方法与要求
本发明泛素蛋白酶体系统可以单独或进一步与其它活性组分联合使用,包括用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品,包括药物或试剂等,尤其是药物。
在具体使用方面,本发明所述的泛素蛋白酶体系统能够单独直接使用,还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能,包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解泛素蛋白酶体系统的副作用等,这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种;优选包括医药学上可接受的载体等中的一种或多种。
本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下,在该组合物中最好包括等渗剂,例如,糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质,例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种,它们增强了泛素蛋白酶体系统的有效期或效力。
从具体的分类上看,所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体,包括润滑剂,如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸镁等中的一种或多种;崩解剂,如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠或低取代羟丙纤维素等中的一种或多种;填充剂,如淀粉、糊精或乳糖等中的一种或多种;粘合剂,如预胶化淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素等中的一种或多种;渗透压调节剂,如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种;pH调节剂,如盐酸、氢氧化钠等酸或碱中的一种或多种;溶剂,如水、缓冲液、乙醇或丙二醇等中的一种或多种等;抗氧剂和络合剂,如亚硫酸钠、EDTA等中的一种或多种;表面活性剂,如季铵化合物、十六烷醇等;吸附载体,如高岭土或皂粘土等中的一种或多种;高分子骨架剂,如环糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一种或多种;稀释剂如淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖和大豆油等中的一种或多种;稳定剂如羧甲基纤维素钠或环糊精等中的一种或多种;防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或苯甲酸钠等中的一种或多种。另外,还可以在泛素蛋白酶体系统中加入其他辅助剂,如香味剂和/或甜味剂如蔗糖、果糖和天冬甜素等中的一种或多种。
例如,将泛素蛋白酶体系统溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如,蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如,植物油例如橄榄油、芝麻油、 棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中,即可制得注射制剂,其中溶剂中可含有增溶剂(例如,聚山梨酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚维酮、环糊精、泊洛沙姆、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如,氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下,如有必要,可加入添加剂,例如稳定剂(例如,人血清白蛋白等)、止痛剂(例如,盐酸普鲁卡因或利多卡因等中的一种或多种)等。
本发明所述及的泛素蛋白酶体系统还可以联合使用,特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物,包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种,优选人、小鼠、大鼠、猴、猪、兔或犬等中的一种或多种,进一步优选人、大鼠或猴等中的一种或多种。例如,可以将本发明泛素蛋白酶体系统加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常,该药用组合物包含本发明泛素蛋白酶体系统和药学上可接受的载体。
泛素蛋白酶体系统的组合物特别是药物组合物可以有各种形式,包括例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种;其中所说的药物组合物包括治疗有效量的泛素蛋白酶体系统为活性成分,以及一种或多种医药学上可接受的载体。
本发明所述的泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物能够可以采用本领域公知的常规生产方法制成任何一种适合于实验、研究或临床上应用的剂型,包括固体制剂如胶囊、片剂、颗粒制剂等,液体制剂如口服液或者注射剂等。
例如使活性成分与一种或多种载体混合,然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种,采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗晶状体浑浊的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。
泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的泛素蛋白酶体系统与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言,通过将泛素蛋白酶体系统加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下,推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如,通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂,可以保持溶液的适当流动性。
该组合物中可包括延迟吸收的药剂,例如单硬脂酸盐或明胶,以达到注射组合物的延长吸收;可包括高分子聚合物载体,如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯,以达到口服组合物的延长释放。
用于患者时,本发明所述的泛素蛋白酶体系统剂量为0.05~0.5mg/kg·d,可以分一次或 多次使用,该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。
本发明泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明泛素蛋白酶体系统。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。泛素蛋白酶体系统的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及泛素蛋白酶体系统在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指泛素蛋白酶体系统的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。
“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者,预防有效量通常小于治疗有效量。本发明泛素蛋白酶体系统的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是0.05~0.5mg/kg,更优选为0.1~0.3mg/kg。应注意,剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化,也就是说用于患者时,本发明所述的泛素蛋白酶体系统剂量或用量,通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。
另外,应理解,对于任何特定受治疗者,应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度,并且本文设定的剂量范围仅为例证性的,并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。
也就是说,需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等,变化本发明泛素蛋白酶体系统的每次和/或每日的剂量或用量。例如,经静脉给予哺乳动物,尤其是成年人(如体重60kg),所述泛素蛋白酶体系统的单剂量约为0.2~3mg,优选约0.8mg,优选每日给药1次。可以调整剂量单位,以提拱最佳所需反应(例如,治疗或预防应答)。
例如,可以单次大剂量给药,可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式,指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位;每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物泛素蛋白酶体系统。本发明的剂量单位形式的规格,由以下确定并直接取决于以下(a)泛素蛋白酶体系统的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果,和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性泛素蛋白酶体系统的技术中的内在限制。
3、泛素蛋白酶体系统的药物剂型和给药途径
本发明所述的泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物制备的用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品,其中按照试剂技术领域的要求制备的产品能够用于诊断、检测、研究抗晶状体浑浊;按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗、诊断、预防或研究,既能够单独直接用于制备治疗、预防或研究的药物,也能够与许多化学物质进行混合或组合,直接或间接用于制备治疗、预防或研究的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。
在本发明中,所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等,均应根据实际情况和需要,采用试剂级或药用级的物料。
本发明所述的泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物,可以用本领域已知的各种方法给药,尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是喷雾剂或口服给药。但是,技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中,该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如控释制剂,包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外,还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物,例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,纽约,1978)。
本发明所述的泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物中,可以含有本领域公知的医药学上可接受的载体和其它任选成分。载体包括羧甲基淀粉、淀粉、纤维素、明胶、碳酸氢钠、丙二醇或吐温80等。任选成分例如是着色剂、甜味剂、抗氧剂等。
本发明所述的泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物,通常通过口服、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式,施用于需要这种治疗的患者。
本发明所述的泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物可以制成任何一种适合于临床上应用的剂型,包括固体制剂,如胶囊、片剂、颗粒制剂等,半固体制剂如软膏等,液体制剂如口服液、混悬剂、乳剂等,或者注射剂。采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗晶状体浑浊的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。
用于口服时,可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时,本发明泛素蛋白酶体系统可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。泛素蛋白酶体系统(和其它成分,如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药,可以将所述泛素蛋白酶体系统与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。
为了以非肠道给药之外给予本发明泛素蛋白酶体系统,可能需要用防止其失活的材料对泛素蛋白酶体系统包衣或与泛素蛋白酶体系统一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时,将本发明泛素蛋白酶体系统与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用,可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物,因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。
制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种,如糖浆、酊剂或酏剂等中的一种或多种;用于肠胃外给药时,可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等 中的一种或多种。
以上药物或药物组合物能够使用各种途径,在所述的使用形式中,优选的形式是口服制剂(如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液或混悬液等中的一种或多种)、非肠道给予剂型(如注射剂、软膏或贴剂等中的一种或多种)等中的一种或多种,进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种,特别优选片剂或注射剂中的一种。
综上所述,本发明泛素蛋白酶体系统的组合物尤其是药物组合物可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品,优选药物和食品,进一步优选药物。
四、技术特长
本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊提供了一种新的药物来源和应用剂型,从而对现有的抗晶状体浑浊产品系统特别是药物进行了改进、改善和提高,从而拓展了现有药物的应用。
本发明安全有效,实用性较强,价廉,方便快捷,其制备工艺简便、容易操作,使用简便、疗效显著,可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究各类晶状体浑浊的治疗和预防。
本发明有针对性地研究晶状体浑浊,发现了一种新的抗晶状体浑浊产品,作出了意想不到的成绩;同时,本发明也有针对性地研究泛素蛋白酶体系统的活性,其药理作用较强,使用安全,最大限度地发挥了作用。本发明对泛素蛋白酶体系统拓展了新的医药用途,也为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊提供了一种新的药物来源。
泛素蛋白酶体系统用于治疗晶状体浑浊、特别是晶状体浑浊,可明显改善晶状体浑浊引起的细胞凋亡,治疗效果显著,且毒副作用小,克服了现有的常用药物造成的副作用。本发明拓展了现有的泛素蛋白酶体系统新的医药用途,也为防治晶状体浑浊提供了一种新的药物干预手段。
本发明泛素蛋白酶体系统药理作用较强,效果明显,其原料来源丰富、价廉,性质稳定,制备工艺简单,质量控制简便,更适于医药、试剂等工业和行业的大规模生产和商业应用;使用范围特别广,因此容易推广应用,能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。
总之,本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要,为研究开发新的抗晶状体浑浊产品提供了新的药物和制剂来源,对开发利用中国现有药物具有重要价值,是用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊等方面的安全原料,对改进和提高现有的医疗水平具有重要价值。
附图说明
图1:晶状体上皮细胞第三代(×100);
图2:晶状体上皮细胞第三代(×200);
图3:晶状体上皮细胞第三代鉴定荧光图;
图4:荧光显微镜下估测FAM荧光转染效率约为70%;
图5:高表达siRNAUbc4对晶状体上皮细胞的影响;
图6:原代LEC细胞的复苏步骤;
图7:胰酶消化细胞的步骤;
图8:细胞冻存的步骤;
图9:原代LEC细胞的复苏步骤;
图10:胰酶消化细胞的步骤;
图11:细胞冻存的步骤。
具体实施方式
本发明研究了现有的抗晶状体浑浊技术,提供了一种新的抗晶状体浑浊产品,便于医疗、试剂等行业的安全使用。
本发明最终需要制备成抗晶状体浑浊产品进行应用,下面将列举实施例进行进一步说明。如有问题,可以与发明人直接联系13386272938。上述提供的一些实验数据以及下列实施例中按前述发明内容给出几种配方及其使用方法及一些试验研究内容,但应该理解本发明并不仅限于此处所列出的研究内容,还应该理解此处所使用的术语仅用于描述特定的实施例,而并不是对本发明的限定。
下面以泛素蛋白酶体系统部分具体实验研究内容(调控晶状体上皮细胞内受损蛋白质水平)为例,进一步阐述本发明泛素蛋白酶体系统的新用途。
1、概述
泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,简称:泛素蛋白酶体系统)是Hershko(Hershko A,Ciechanover A,Varshavsky A.The ubiquitin system[J].Nature Med,2000,10:1073-1081.)等发现的一个高效蛋白质降解系统,是ATP依赖性的能特异降解胞内调控蛋白的主要途径,由泛素(ubiquitin)、泛素连接酶和26s蛋白水解酶复合体(proteasome)3部分组成。在这里主要介绍一下泛素连接酶,它包括:泛素活化酶(简称:E1)、泛素结合酶(简称:E2)、泛素-蛋白连接酶(简称:E3)。泛素活化酶E1是泛素与底物蛋白质结合所需要的第一个酶,它通过水解ATP与泛素的羧基末端之间高能硫脂键,从而激活泛素;泛素活化酶E2接受活化的泛素从E1转移给E2的活性部位半胱氨酸基团,形成泛素-E2中间体;最后通过E3的催化,泛素羧基末端与底物蛋白的赖氨酸残基的ε-氨酸以一个酰胺异构肽键连接,成为泛素化蛋白。这里简要描述泛素连接酶是因为本部分设计的siRNA就是一种泛素结合酶E2。泛素蛋白酶体系统对蛋白稳定性的调控被认为是调节细胞众多生理事件的一种重要机制,如信号转导、细胞周期调控、转录活性调节、抗原提呈、凋亡等。尤其在细胞周期调控方面起到重要的作用,该发现获得2004年诺贝尔化学奖。泛素蛋白酶体系统对靶蛋白的降解分为两个连续但相对独立的过程:靶蛋白的泛素化修饰,即多聚泛素链与靶蛋白结合,对其进行标记;26s蛋白水解酶复合体识别并降解被多聚泛素化修饰的靶蛋白。靶蛋白只有被多聚泛素链标记后,才能被26s蛋白酶体识别、结合,并最终水解成多肽,而多聚泛素链在泛素再循环酶的作用下分解成单个泛素分子被重新利用,从而形成泛素-蛋白酶体途径的循环。
世界各国关于泛素蛋白酶体系统的研究较多的集中在肿瘤的发病机制和治疗方面,另外泛素蛋白酶体系统与其他疾病诸如慢性阻塞性肺疾病患者骨骼肌萎缩,去泛素化酶参与了其基因的调控(LIU Qian,XU Wei-guo.Ubiquitin-proteasome system and their implication to the muscle atrophy in chronic obstructive pulmory disease[J].Int J Respi,2010;30(19): 1180-1183.);遗传性疾病囊性纤维化(cystic fibrosis,简称:CF)细胞中的跨膜转导因子(简称:CFTR,一种氯离子通道)基因突变导致CFTR不能正常细胞表面,而在内质网中沉积,并被泛素蛋白酶体系统降解(Skach WR.Defects in processing and trafficking of the cystic fibrosis transmembrace conductance regulator[J].Kidney Int,2000,57(3):825-831.);II型糖尿病中泛素蛋白酶体途径通过对炎症信号通路、能量代谢影响在胰岛素信号转导及发病中起到了重要作用(Rui L,Yuan M,Frantz D.SOCS-1 and SOCS-3 block insulin signaling by ubiquitin mediated degradation of IRS1 and IRS2[J].Biol Chem,2002,277(44):42394-42398.);糖尿病视网膜病变(简称:DR)相关基因均属于泛素蛋白酶体途径中的组成部分,参与了DR的发病过程(Scheffner M,Huibregtse JM.The HV-16 E6 and E6-AP complex function as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of P53[J].Cell,1993,75(3):495-505.)。
最新的研究发现在晶状体细胞中含有泛素蛋白酶体系统的所有组成部分,而且在晶状体上皮细胞中大约有40~50%的细胞浆内受损的蛋白是通过泛素蛋白酶体系统来降解的(Pereira P,Shang F,G irao H,Taylor A.Lens fibers have a fully functional ubiquitin-proteasome pathway[J].Exp Eye Res,2003;76:623-631.和G irao H,Pereira P,Taylor A,Shang F.Subeellular redistribution of components of the ubiquitin-proteasome pathway during lens differentiation and maturation[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005;46:1386-1392.)。在白内障形成的过程中,晶状体内受损的蛋白质蓄积与其混浊进而发生白内障密切相关,那么如何有效清除受损的蛋白质是延缓白内障形成的关键。而泛素蛋白酶体系统作为晶状体中重要的蛋白质质量控制体系,Madeleine Zetterberg等(Medeleine Zetterberg,Xinyu Zhang,Allen Taylor,Bingfen Liu,Jack J.Liang,Fu Shang.Glutathiolation enhances the degradation of γC-crystallin in lens and reticulocyte lysates,partially via the ubiquitin-proteasome pathway[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,47(8):3467-3472.)于2006年研究显示谷胱甘肽化的晶状体蛋白更容易受到泛素蛋白酶体途径的降解,这可以说明泛素蛋白酶体系统能够有效地清除受损的晶状体蛋白,清除受损蛋白质的聚合沉淀,在延长晶状体的功能性寿命,维持晶状体的透明性方面起到了重要的作用。但是有关于泛素蛋白酶体系统在白内障形成过程中的机制世界各国均未见报道。
因此,本部分实验想通过研究与蛋白质控制有关的泛素蛋白酶体系统通路和受损蛋白质之间的关系,探究泛素蛋白酶体系统活性提高对白内障形成的防御作用。这从另一方面即酶系统清除蛋白非特异性聚集的角度来分析白内障形成的机理,结合前两部分泛素蛋白酶体系统的作用机制,将加深发明人理解有效地修复或者清除受损的晶状体蛋白,延长晶状体的功能性寿命与防治白内障之间的关系,还将为后续过渡到临床前期的实验打下坚实的基础,并且能够提供防治其它年龄相关性眼病新的作用靶点。
2、材料与方法
(1)实验所用细胞:大鼠晶状体上皮细胞原代细胞系。
(2)主要仪器及耗材:移液器、显微镜、超净台、培养箱、超纯水装置、梯度降温盒、冻存管、培养瓶、培养板、硝酸纤维素膜、细胞刮刀。
(3)主要试剂:培养基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶、PBS、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、兔抗鼠CK-19、羊抗兔IgG FITC标记、Lipofectamin2000,青、链、两性霉素三抗,多聚甲醛、无水乙醇、甲醇、甲醛、异丙醇、氯仿、盐酸,总蛋白裂解液,蛋白酶抑制剂和PMSF,预染蛋白分子量标准参照物,超敏底物化学发光ECL试剂盒等。
(4)实验方法
①细胞复苏及培养
A、原代LEC细胞的复苏
运送来的冻存细胞立即复苏,步骤如图6。
B、LEC细胞的换液
根据培养液颜色改变换液,换液时先把配制好的培养基PBS拿出室温放置复苏,超净台紫外线消毒后,酒精擦拭超净台,点燃酒精灯,擦拭双手后,把室温复苏的培养基和PBS拿进超净台内,从培养箱取出细胞。
C、细胞传代
传代前先将胰酶PBS、FBS-DMEM F12从冰箱拿出复苏,酒精擦拭超净台,点燃酒精灯,酒精擦拭双手后从培养箱取出细胞,将旧培养液吸出,PBS清洗,按图7步骤胰酶消化细胞。
D、细胞冻存
具体步骤见图8。
②细胞鉴定
A、CK-19
细胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK-19)可用来鉴定上皮细胞。
B、免疫荧光法鉴定细胞
一抗使用兔抗大鼠CK-19,二抗为FITC标记的羊抗兔的IgG。在荧光显微镜下观察。
③转染siRNA
A、RNAi原理
RNAi(RNAinterfering,RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的,dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
B、siRNA的设计
C、转染前细胞状态
细胞在培养瓶中传代,应使得细胞汇合在24小时内达到70~90%左右。
D、合适的Lipofectamin2000用量
合适的siRNA:lipofectamin2000的比例对核酸的高效转染有重要影响。
E、贴壁细胞转染方法
转染的前一天,细胞接种在6孔板上,加入含FBS和抗生素的DMEM F12(或者Opti-MEM)细胞培基;
选择用于初期接种的细胞数量,应该能在24小时内使细胞汇合达到40~50%;
在DMEM F12(或者Opti-MEM,或者其他无血清培养基)无血清培养基中加入siRNA, 混匀,室温下放置;
混匀lipofectamin试剂,用无血清的DMEM F12(或者Opti-MEM,或者其他无血清培养基)稀释lipofectamin试剂,混匀,室温放置;
将稀释好的siRNA和Lipofectamin试剂混合,混匀放置,形成siRNA/lipofectamin复合物;
将siRNA/lipofectamin复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,摇晃细胞培养板;
细胞在CO2培养箱中温育后,更换培养液(应用无血清培养液或者Opti-MEM),观察细胞状态,荧光显微镜下观察转染效率,进行转染后其他检测步骤。
④引物设计
用于测定转染小干扰RNA后细胞中基因的Real-time引物(表3-1)
表3-1.目的基因引物设计
⑤转染RNA后细胞处理
siRNA转染到细胞后立即放入CO2温箱中孵育,然后更换普通培养液DMEM F12,在超净台内把6孔板打开盖子,放置于距离紫外线处照射进行氧化应激处理。
⑥分组
6孔板中细胞分别设置为未转染siRNA对照组,转染RNA组和Negative control(NC)对照组。
⑦Real-Time PCR RNAi效果检测
转染细胞铺板密度很重要,由于siRNA沉默时效性的影响,转染后才能进行进行RT-PCR检测。如果转染时铺板密度较高,细胞一方面转染效果不理想,直接影响沉默效果和数据的可靠性,另一方面,沉默检测最佳点时,过于密集的细胞将影响细胞状态,从而影响实验结果。因此6孔板中细胞汇合达到40~50%稳转细胞,48hr之内视细胞状态进行RNA抽提。
A、RNA抽提及反转录:
RNA操作中所需要的玻璃和金属器材均经高温处理,塑料器材均用DEPC水中浸泡过夜后高压灭菌,溶液均用DEPC水配制或配制好后用DEPC处理过夜后高压灭菌,令RNA酶灭活。
弃去6孔板中的培养液,PBS洗涤,加入TRIzol,充分裂解细胞后移入EP管中放置;
加入氯仿,盖紧管口,震荡后,静置,离心;
吸取上清液于另一Eppendorf管中,加入异丙醇,混匀,静置,离心;
离心后可见白色胶样RNA沉淀,吸取上清,加入乙醇,混匀,震荡洗涤,离心;
吸去上清尽量吸取干净干燥沉淀;
用DEPC水重新溶解RNA;
分光光度仪定量选择OD260/OD280比值1.9~2.1的RNA样品,浓度均在1.5μg/μl以上;
用反转录试剂盒在冰上进行操作。每个样品按照RNA+ddH2O总体积,反应体系进行反转录。分别取总RNA的样品溶液,并用DEPC处理的水补足,加入随机引物,混匀,其它反转录试剂依次加入。反转录好的cDNA可以贮存-20℃冰箱。
B、Real-Time PCR:
使用SYBR Green I荧光染料嵌入法进行表3-1目的基因的Real time PCR扩增。将待测cDNA模板和相应引物按照20μl PCR反应体系加入PCR管中,在PCR仪上进行反应。以β-actin作为内参照,独立实验重复多次。计算平均CT值,以目的基因/内参基因为相对量进行分析。
⑧蛋白抽提及western blot
A、细胞总蛋白抽提
转染后进行蛋白检测。首先弃去6孔板中的培养液,用PBS室温复苏后洗涤,加入蛋白裂解液,用细胞刮刀刮下细胞,转移到Eppendorf管中,震荡后离心,吸取上清,即为总蛋白,留取样品用于蛋白定量,其余存于Eppendorf管中,-80℃保存。
B、蛋白定量
采用BCA法对所抽提的蛋白样品进行定量。
C、western blot检测
电泳:取细胞总蛋白样品,每孔上样,于聚丙烯酰胺凝胶中电泳。至溴酚蓝泳出凝胶后结束电泳。
电转移:切胶,依次按Scotch-Brite垫-Whatman滤纸-凝胶-NC膜-Whatman滤纸-Scotch-Brite垫的顺序放好,用夹子夹紧后,放入塑料支撑体中,然后浸入盛有转移缓冲液的槽中。冰浴条件下电转移,取出结合有蛋白质膜的NC膜,在合适位置切割NC膜。
封闭:用TBS-T在脱色摇床上室温封闭。
抗原抗体反应:丢弃封闭液,用TBST稀释抗体。将膜放入塑料凹槽中,加入一抗,转印面朝上,置于冰箱摇床过夜。翌日,以TBS-T漂洗。同法加入稀释好的羊抗兔HRP标记的二抗,孵育后,用TBS-T洗膜。
化学发光反应:取免疫印迹化学发光试剂luminol(ECL Reagent A&B),A液与B液按照1∶1混匀后,均匀滴加在NC膜上,上机曝光检测。
⑨统计与分析
3、结论
晶状体受到氧化应激损伤时晶状体蛋白的变性进而聚集沉淀与白内障的形成密切相关。除此之外,在一些动物模型系统(Qian W,Shichi H.Cataract formation by a semiquinone metabolite of acetaminophen in mice:possible involvemental of ca(2+)and calpain activation[J].Exp Eye Res,2000,71:567-574.和Nakamura Y,Fukiage C,Shih M.Contribution of calpain lp82-induced proteolysis to experimental cataractogenesis in mice.[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41:1460-1466.和Azuma M,Sheater TR.Involvement of calpain in diamide induced cataract in cultured lenses[J].FEBS Lett,1992,307:313-317.和Sakamoto-Mizutani K,Fukiage C,Tamada Y,Azuma M,Sheater TR.Contribution of ubiquitous calpains to cataractogenesis in the spontaneous diabetic wbn/kob rat[J].Exp Eye Res,2002,75:611-617.和Tamada Y,Fukiage C,Mizutani K.Calpain inhibitor,sja6017,reduces the rate of formation of selenite cataract in rats[J].Curr Eye Res,2001,22:280-285.和Takeuchi N,Ouchida A,Kamei A.C-terminal truncation of alpha-crystallin in hereditary cataractous rat lens[J].Biol Pharm Bull,.2004,27:308-314.和Robertson LJ,Morton JD,Yamaguchi M.Calpain may contribute to hereditary cataract formation in sheep[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46:4634-4640.)中得出晶状体中的蛋白酶通过提高晶状体内钙离子浓度在蛋白质聚合和白内障形成中也起到了一定的作用。蛋白酶会把晶状体蛋白降解成一些大的片段而并非将其分解为氨基酸(Biswas S,Harris F,Dennison S,Singh J,Phoenix DA.Calpains:targets of cataract prevention?[J].Trends Mol Med,2004,10:78-84.)。被蛋白酶降解的蛋白质其溶解性(Shih M,David LL,Lampi KJ.Proteolysis by m-calpain enhances in vitro ligat scattering by crystallins from human and bovine lenses[J].Curr Eye Res,2001,22:458-469.和Sheater TR,Shih M,Mizuno T,David LL.Crystallins from rat lens are especially susceptible to calpain-induced light scattering compared to other species[J].Curr Eye Res,1996,15:860-868.和David LL,Sheater TR,Shih M.Sequence analysis of lens beta-crystallins suggests involvement of calpain in cataract formation[J].Biol Chem,1993,268:1937-1940.)和生物学功能(Kelly MJ,David LL,Iwasaki N,Wrigat J,Sheater TR.A-crystallin chaperone activity is reduced by calpain II in vitro and in selenite cataract[J].Biol Chem,1993,268:18844-18894.和Thampi P,Abraham EC.Influence of the c-terminal residues on oligomerization of alpha crystallin[J].Biol Chem,2003,42:11857-11864.)均相应地降低。因此蛋白酶降解的蛋白质片段在晶状体内聚集并改变生物特性转为不溶性蛋白最终会导致细胞毒性和白内障的发生。在晶状体中存在各种各样的蛋白酶例如氨基肽酶(Taylor A,Daims M,Lee J,Surgenor T.Identinal and quantification of leucine aminopeptidase in aged normal and cataractous human lenses and ability of bovine lens lap to cleave bovine crystallins[J].Curr Eye Res,1982,2:47-56.和Taylor A.Aminopeptidases:towards a mechanism of action[J].Trends Bio Chem,1993,18:167-172.和Taylor A,Sandord D,Nowell T.Structure and function of bovine lens aminopeptidase and comparison with homologous aminopeptidase[J].Aminopeptidases,1996,6:21-59.),胰蛋白酶样蛋白酶(Swaminathan S,Chandrasekher G,Venkataraman A,Pattabiraman TN.Proteases and protease inhibitory activities in normal mammalian lenses and human cataractous lenses[J].Biochem Med Metab Biol,1986,35:184-190.和Srivastava OP,Ortwerth BJ.The effects of agmg and cataract formation on the trypsin inhibitor activity of human lens[J].Exp Eye Res,1989,48:25-36.)和泛素蛋白酶(Shang F,Gong X,McAvoy JW.Ubiquitin-dependent pathway is up-regulated in differentiating lens cells[J].Exp Eye Res,1999,68:179-192.和Shang F,Gong X,Palmer HJ,Nowell TR,Taylor A.Age-related decline in ubiquitin conjugation in response to oxidative stress in the lens[J].Exp Eye Res,1997,64:21-30.和Shang F,Nowell TR,Taylor A.Removal of oxidatively damaged protein from lens cells by the ubiquitin-proteasome pathway[J].Exp Eye Res,2001,73:229-238.和Pereira P,Shang F,Girao H,Taylor A.Lens fibers have a fully funtional ubiquitin-proteasome pathway[J].Exp Eye Res,2003,76:623-631.)。这些酶类在对蛋白酶裂解的蛋白质片段的清除方面起到了重要的作用。已经证实其中泛素蛋白酶体系统能够降解受到损伤以及被修饰的蛋白,包括氧化损伤(Shang F,Taylor A.Oxidative stress and recovery from oxidative stress are associated with altered ubiquitin conjugating and proteolytic activities in bovine lens epithelial cells[J].Biochem J,1995,307:297-303.和Huang LL,Shang F,Nowell TR Jr,Taylor A.Degradation of differentially oxidized α-crystallins in bovine lens epithelial cells[J].Exp Eye Res,1995,61:45-54.)、热变性(Marques C,Guo W,Pereira P.The triage of damaged proteins:degradation by the ubiquitin-proteasome pathway or repair by molecular chaperones[J].FASEB,2006,20:741-743.和Shang F,Taylor A.Funtion of the ubiquitin protolytic pathway in the eye[J].Exp Eye Res,2004,78:1-14.)、谷胱甘肽化的蛋白和突变的蛋白质(Zetterberg M,Zhang X,Taylor A.Glutathiolation enhances the degradation of γC-crystallin in lens and reticulocyte lysates,partially via the ubiquitin-proteasome pathway[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,47:3467-3473.和Marques C,Pereira P,Taylor A.Ubiquitin-depent lysosomal degradation of the HNE-modified proteins in lens epithelial cells[J].FASEB J,2004,18:1424-1426.)。因此发明人本部分的实验假设泛素蛋白酶体系统能够降解蛋白酶裂解的蛋白质,通过转染具有提高泛素蛋白酶体系统活性的小干扰RNA,观察对泛素蛋白酶体系统活性的影响,通过比较转染组细胞与未转染组细胞中的被降解的蛋白质的含量,从而评价泛素蛋白酶体系统在降解蛋白酶裂解蛋白质方面的作用。以此初步了解泛素蛋白酶体系统在白内障发生中的作用。为后续深入的机制研究奠定基础。
在白内障的发生过程中,蛋白质的聚集和沉淀是晶状体混浊的一个原因。在晶状体蛋白中,α晶状体蛋白和β晶状体蛋白都对蛋白裂解酶的降解敏感,α晶状体蛋白亲水的C端,β晶状体蛋白大部分的N端都可以被蛋白裂解酶降解,而这些亲水性末端对晶状体蛋白的水溶性起着重要的作用。γ晶状体蛋白相对比较稳定,最初它被认为是晶状体内的一种结构蛋白,比较不容易受到蛋白裂解酶的降解。三种晶状体蛋白中都含有一定数量的半胱氨酸(Cysteine,Cys),Cys中的游离巯基(-SH)极其容易遭受氧化损伤(Lou MF.Redox regulation in the lens[J].Progress in Retinal and Eye Research,2003,22(5):657-682.)进一步聚集形成二硫键,引起蛋白的变性沉淀,晶状体混浊的产生。英国牛津大学眼科的最新研究成果显示α晶体蛋白和含巯基的还原剂共同作用,可使人白内障晶状体中活性已丧失的酶“起死回生”(Schey KL,Little M,Fowler JG.Characterization of human lens major intrinsic protein structure[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41(1):175-183.)。α晶状体蛋白和硫甲丙脯酸使谷胱甘肽还原酶活性“回升”79%,α晶状体蛋白和二硫苏糖醇(DTT)能使巯醇转移酶活性增加200%。这进 一步揭示了α晶体蛋白的分子伴侣活性在维持晶状体代谢中的重要性,分子伴侣可“解救”一类由于蛋白质错误折叠累积导致的构象性疾病,首次临床应用药物性伴侣治疗构象性疾病已取得可喜结果。α晶状体蛋白在透明性发面发挥着多功能的作用,α晶状体蛋白的特性以及蛋白质的低聚性是维持晶状体透明状态所需的。1992年Horwitz(Horwitz J.Alpha crystallin can function as a molecular chaperone [J].Natl Acad Sci,.1992,89:10449-10453.)提出α晶状体蛋白与年龄相关白内障的关系:α晶状体蛋白通过分子伴侣的作用纠正在老龄化拥挤的纤维细胞中的错误折叠或受损变性的蛋白,依次来抑制变性蛋白的聚集沉淀,维持晶状体的透明。鉴于此α晶状体蛋白的降解参与了晶状体混浊的发生,受到损伤而被蛋白酶类降解的α晶状体蛋白片段在晶状体内聚集沉淀,最终会导致晶状体不溶性蛋白增加,透光度减低,混浊逐渐产生。αA1-162晶状体蛋白是m-蛋白裂解酶的主要降解产物,而且研究显示出它在一般正常的晶状体中含量极少,在糖尿病白内障的晶状体中出现(Thampi P,HassanA,Smith JB,Abraham EC.Enhanced c-terminal truncation of αA-and αB-crystallins in diabetic lenses[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43:3265-3237.),这也说明了它只有在遭受到氧化应激、离子辐射、药物或者毒性刺激例如高糖状态的损伤时,才会出现并且容易聚集进而引起晶状体的混浊。
因此,在研究抗晶状体蛋白聚集的新途径时发明人设想:晶状体蛋白的聚集与否主要取决于是否形成分子内或分子间的二硫化物交联,而保持游离-SH只是阻止上述交联的可能条件,而非必须条件。本部分的实验结果显示,在紫外线辐射的刺激下,晶状体上皮细胞中能够检测到αA1-162晶状体蛋白,这是晶状体上皮细胞中的αA晶状体蛋白在氧化应激的损伤下被蛋白酶裂解而产生的片段分子,这种片段由于暴露出本身结构中半胱氨酸的-SH,使得片段之间容易偶联聚合,蛋白变性聚集沉淀导致晶状体的混浊。已有研究表明在晶状体上皮细胞中应用泛素蛋白酶体系统的化学性蛋白酶体抑制剂会使受损蛋白质的水平提高(Dudek EJ,Shang F,Valverde P,Liu Q,Hobbs M,Taylor A.Selectivity of the ubiquitin pathway for oxidatively modified proteins:relevance to protein precipitation diseases[J].Faseb J,2005,19:1707-1709.)。而在发明人设计了一种上调泛素蛋白酶体系统活性的siRNA Ubc4(一种泛素聚合酶E2)并将其转染到晶状体上皮细胞后,增加了泛素蛋白酶体系统的活性,结果显示可以清除受损而被蛋白酶裂解的小片段αA1-162晶状体,较之未转染的细胞其中的αA1-162晶状体蛋白的含量明显减少。Ubc4是一种泛素蛋白酶体系统中的泛素聚合酶,由于它在晶状体细胞内的含量是有限的,发明人构建出以脂质体为载体的基因并通过RNA转移技术,在晶状体中过度表达这些限速成分,增加了泛素蛋白酶体系统的蛋白质降解效率,使得晶状体蛋白的小分子降解片段即使得到清除,阻止这些受损晶状体蛋白之间二硫键的形成、非特异性交联、聚集增强形成高分子量物质(简称:HMW),保持晶状体的透明性。
发明人证实了泛素蛋白酶体系统通过降解受损的晶状体蛋白,清除其非特异性聚集一定程度上延缓了晶状体的混浊。
总之,通过整个的实验结果,发明人得知泛素蛋白酶体系统以及泛素蛋白酶体系统都能 够对晶状体中的蛋白质进行调控,在白内障的形成过程中发挥了一定的功能。白内障的发病机制极其复杂,是机体内外多重因素对晶状体综合作用而产生的结果,晶状体在整个的生命旅程中都处于动态的分化进程,其正常的分化状态是保持透明度的前提(Nakamura T,Pichel JG,Williams-Simons L.An apoptotic defect in lens differentiation caused by human p53 is rescued by a mutant allele[J].Pro Natl Acad Sci,1995,92(13):6142-6146.),分化失常则形成白内障。泛素蛋白酶体途径则是通过清除遭受损伤时的晶状体蛋白的C-末端降解片段,这种片段属于晶状体蛋白损伤后的翻译后修饰,种类甚多如糖基化、氨甲酰化、脱酰胺、附加谷胱甘肽、C-端降解、N-端降解、蛋白质-蛋白质二硫化合物的形成等(严宏,惠延年.晶状体的老化和白内障形成[J].第四军医大学学报,2005,26(2):97-101.和Harding JJ.Viewing molecular mechanisms of ageing through a lens[J].Ageing Res Rev,2002,1(3):465-479.)。这些都是影响晶体蛋白聚集的常见因素,发明人实验结果显示提高泛素蛋白酶体系统活性可以减少受损晶状体上皮细胞中α晶状体蛋白的C-末端降解片段αA1-162晶状体蛋白的含量,有效地清除这些受损容易聚集的蛋白质,防止其在晶状体内沉淀,对维持晶状体的透明性起着关键作用。
总之,通过整个的实验结果,发明人得知泛素蛋白酶体系统能够对晶状体中的蛋白质进行调控,在白内障的形成过程中发挥了一定的功能。白内障的发病机制极其复杂,是机体内外多重因素对晶状体综合作用而产生的结果,晶状体在整个的生命旅程中都处于动态的分化进程,其正常的分化状态是保持透明度的前提(Nakamura T,Pichel JG,Williams-Simons L.An apoptotic defect in lens differentiation caused by human p53 is rescued by a mutant allele[J].Pro Natl Acad Sci,1995,92(13):6142-6146.),分化失常则形成白内障。
泛素蛋白酶体系统及其组合物的常用药物制剂的制备方法
本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法,以水作为溶媒,其步骤为:取泛素蛋白酶体系统,加入赋形剂,加水溶解,调节pH,加入活性炭,过滤除菌,灌装,半轧塞,冷冻干燥,压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷、白蛋白、pH调节剂等中的一种或几种。每瓶含泛素蛋白酶体系统0.1~4mg。
本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法,以水作为溶媒,其步骤为:取泛素蛋白酶体系统,加或不加赋形剂(赋形剂同上),加水溶解,加入活性炭,过滤除菌,喷雾干燥,无菌分装,压塞轧盖即可。每瓶含泛素蛋白酶体系统0.1~4mg。
本发明制备小针剂时,以注射用水作为溶媒配制即可,也可加适量辅料,辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、环糊精、抗氧剂、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。注射剂可以配制成溶液、微乳液、乳液、脂质体、微球、微囊或其它适合于高药物浓度的有序结构,其中可包括延迟吸收的药剂,例如单硬脂酸盐、明胶、乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等,以达到注射组合物的延长吸收。每支含泛素蛋白酶体系统0.1~4mg。
本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液,以注射用水作为溶媒,加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可,也可加适量辅料,辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、 pH调节剂、表面活性剂、抗氧剂、环糊精、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。每瓶含泛素蛋白酶体系统0.1~4mg。
本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂,辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等,按常规技术制备。可包括高分子聚合物载体,如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯等,以达到口服组合物的延长释放。
在本发明中,以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明,并不是用来限制发明的范围。
下面通过实施例对本发明作详细描述。
以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均是来自上述的描述或符合上述的要求。
实施例1、泛素蛋白酶体系统调控晶状体上皮细胞内受损蛋白质水平的初步分析
1、材料与方法
(1)实验所用细胞
由武汉原生原代生物医药科技有限公司提供的大鼠晶状体上皮细胞原代细胞系,货号RAT-CELL-0067,规格5×105。
(2)主要仪器及耗材
(3)主要试剂
多聚甲醛、无水乙醇、甲醇、甲醛、异丙醇、氯仿、盐酸均购自国药集团化学试剂有限公司;总蛋白裂解液(5×Passive Lysis Buffer)购自Promega公司;蛋白酶抑制剂(100×Mammalian Protease Inhibitor)和PMSF购自申能博彩公司;预染蛋白分子量标准参照物购自beyotime公司;超敏底物化学发光ECL试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。
(4)主要试剂和溶液的配制
①LEC培养液
45ml DMEM F12+5ml FBS+0.9ml三抗(即50ml培养基中10%FBS,1%三抗),操作在超净台内完成,严格无菌。
②细胞冻存液
10%DMSO+90%FBS(1.5ml冻存管,一管中0.1ml DMSO与0.9ml FBS混匀)。
③siRNA20μM溶液
泛素蛋白酶体系统的限速成分Ubc4(一种泛素结合酶E2)可以促进泛素蛋白酶体系统的降解效率,提高泛素蛋白酶体系统的活性。在设计好的si RNA Ubc4(EP管中为减压离心干燥品,制品干燥于管底,为干粉状)管中加入150μl DEPC水,配制成可用的20μM的溶液待用。-20℃保存可放6个月。
注:小或短干扰RNA是一类20-25个核苷酸长度的双链RNA分子,其主要RNAi通路中起作用,如抗病毒机制,基因组染色体结构的塑造等,其结构是一段完全互补的RNA双链,两端各有两个未互补的碱基。
④转染试剂
选择最合适的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作,可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,也可应用于DNA/RNA共转染操作,是一种新型的高效siRNA转染试剂。
⑤75%乙醇
无水乙醇1500μl与DEPC水500μl混匀,即为75%乙醇,根据比例和所用体积现用现配。
⑥10×磷酸盐缓冲液(Phosphate-Bufer-Solution,PBS)
NaCL 80g
KCL 2g
Na2HPO47H2O 11.5g
KH2PO4 2.0g
用800ml双蒸水溶解,调节pH值至7.2~7.4,定容至1000ml,4℃保存,用前10倍稀释。
(5)实验方法
①细胞复苏及培养
A、原代LEC细胞的复苏
运送来的冻存细胞立即复苏,步骤如图9。
B、LEC细胞的换液
根据培养液颜色改变约2-3天换液一次,换液时先把配制好的培养基PBS拿出室温放置复苏,超净台紫外线消毒后,酒精擦拭超净台,点燃酒精灯,擦拭双手后,把室温复苏的培养基和PBS拿进超净台内,从培养箱取出细胞。换液步骤:培养瓶在酒精灯火焰下烧瓶口(注意酒精灯火焰不可太小),打开培养瓶,用巴氏吸管小心吸出旧的培养液;再用新的巴氏吸管,吸取适量PBS清洗,吸出PBS;更换新的巴氏吸管,吸取5ml左右的培养基,加到培养瓶中。放入培养箱中培养,注意瓶盖稍微拧松以利于细胞的呼吸。
C、细胞传代
传代前先将胰酶PBS、FBS-DMEM F12从4℃冰箱拿出,室温复苏;酒精擦拭超净台,正确摆放器械(以保证足够的操作空间,便于操作,另外可减少污染);点燃酒精灯(注意火焰不可太小),酒精擦拭双手后从培养箱取出细胞,将旧培养液吸出,PBS清洗两遍,然后按照图10步骤胰酶消化细胞。
D、细胞冻存
具体步骤见图11。
②细胞鉴定
A、CK-19
细胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK-19)是上皮细胞特征性标记物,分子量约40000Da,是角蛋白家族中最小的成员。CK-19是一种支持蛋白,与肌动蛋白纤维等共同构成了细胞支架,这是上皮细胞的特征性标志。因此可以用来鉴定上皮细胞。
B、免疫荧光法鉴定细胞
一抗使用Thermo公司的兔抗大鼠CK-19,二抗为FITC标记的羊抗兔的IgG。在荧光显微镜下可以观察到结合有特异性CK-19抗体的晶状体上皮细胞。具体操作步骤如下:
①制备细胞爬片,将干净无菌的玻片放入6孔板中,接种细胞,继续培养至细胞密度适中,大约60~75%满片即可,否则容易脱片;
②取出长有细胞玻片后用4%多聚甲醛固定15min(多聚甲醛现用现配);
③(注:以下各步骤切母使玻片干燥)先用PBS冲洗3min×3遍;
④用10%正常胎牛血清封闭10分钟;
⑤加入CK-19一抗,PBS稀释抗体稀释度1∶200,4℃孵育过夜(找个小瓶盖将小玻片支起来,抗体就不容易溢出,另外还要记住“砸片”,就是将抗体从较高处滴落到片子上,以分布均匀)。
⑥PBS冲洗4次,每次各5min;
⑦加入FITC荧光二抗,室温30min。抗体稀释度1∶100;
⑧同步骤6;
⑨用90%的甘油封片,拿到荧光显微镜下观察。
③转染siRNA
A、RNAi原理
RNAi(RNAinterfering,RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的,dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
B、siRNA的设计(见本说明书第28页)
C、转染前细胞状态
细胞在培养瓶中长至90%以上时,传代到6孔板中继续培养。在细胞板上培养细胞时,应使得细胞汇合在24小时内达到70~90%左右。
D、合适的Lipofectamin2000用量
合适的siRNA∶lipofectamin2000的比例对核酸的高效转染有重要影响;吉玛公司设计的siRNA∶lipofectamin2000为1∶0.01~1∶0.1(pmol∶μl)。一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。
E、贴壁细胞转染方法
转染的前一天,4~5×105细胞接种在6孔板上,加入2ml含FBS和抗生素的DMEM F12(或者Opti-MEM)细胞培基;
选择用于初期接种的细胞数量,应该能在24小时内使细胞汇合达到40~50%(转染细胞铺板密度很重要,见下述);
在50μl的DMEM F12(或者Opti-MEM,或者其他无血清培养基)无血清培养基中加入5μlsiRNA,柔和混匀,室温下放置5分钟;
混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM F12(或者Opti-MEM,或者其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂,轻轻混匀,室温放置5分钟;
将稀释好的siRNA和Lipofectamin试剂混合,轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin复合物;
将100μl siRNA/lipofectamin复合物加到含有细胞和培养基的6孔培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板;
细胞在CO2培养箱中37℃温育4hr后,更换一次培养液(应用无血清培养液或者Opti-MEM),24hr~48hr后,观察细胞状态,荧光显微镜下观察转染效率,进行转染后其他检测步骤。
④引物设计
用于测定转染小干扰RNA后细胞中基因的Real-time引物(表3-1)
αA1-162晶状体蛋白是m蛋白酶裂解αA晶状体蛋白的主要产物,αA1-162晶状体蛋白被泛素蛋白酶体系统的快速降解,这是在正常晶状体中不含有αA1-162晶状体蛋白的一个原因。αA1-162晶状体蛋白热稳定性差,泛素蛋白酶体系统可以降解进而阻止其在氧化应激下的聚集沉淀。
⑤转染RNA后细胞处理
siRNA转染到细胞后立即放入5%CO2温箱中孵育4hr,然后更换一次普通培养液DMEM F12,在超净台内把6孔板打开盖子,放置于距离紫外线10cm处照射30min进行氧化应激处理。
⑥分组
6孔板中细胞分别设置为未转染siRNA对照组(3个孔),转染RNA组(2个孔)和Negative control(NC)对照组(1个孔)。
⑦Real-Time PCR RNAi效果检测
转染细胞铺板密度很重要,由于siRNA沉默时效性的影响,转染后48小时才能进行进行RT-PCR检测。如果转染时铺板密度较高,细胞一方面转染效果不理想,直接影响沉默效果和数据的可靠性,另一方面,48小时甚至更长时间后,沉默检测最佳点时,过于密集的细胞将影响细胞状态,从而影响实验结果。因此6孔板中细胞汇合达到40%~50%稳转细胞,48
hr之内视细胞状态进行RNA抽提。
A、RNA抽提及反转录:
RNA操作中所需要的玻璃和金属器材均经过180℃处理2hr,塑料器材均用含有0.1%的DEPC水中浸泡过夜后高压灭菌,溶液均用DEPC水配制或配制好后用DEPC处理过夜后高压灭菌,令RNA酶灭活。
弃去6孔板中的培养液,4℃的PBS洗涤2次,加入1ml的TRIzol,充分裂解细胞后移入1.5ml的EP管中,室温下放置10min;
加入200μl的氯仿,盖紧管口,剧烈震荡15s后,静置10min,4℃下12000rpm离心10min;
吸取上清液于另一Eppendorf管中,加入0.5ml的异丙醇,轻柔上下颠倒混匀数次,室温静置10min,4℃下12000rpm离心10min;
离心后可见白色胶样RNA沉淀,轻轻吸取上清(注意不可吸到沉淀),尽量吸取干净,加入1ml的75%乙醇,混匀,漩涡震荡洗涤,4℃下12000rpm离心10min;
吸去上清尽量吸取干净室温下干燥沉淀10min左右;
用30μl的DEPC水重新溶解RNA,必要时55~60℃水浴10min有助于溶解;
分光光度仪定量选择OD260/OD280比值1.9~2.1的RNA样品,浓度均在1.5μg/μl以上;
用TAKARA公司的反转录试剂盒在冰上进行操作。每个样品按照RNA+ddH2O总体积6.5μl,10μl反应体系进行反转录。分别取含有850ng的总RNA的样品溶液,并用DEPC处理的水补足至6.5μg,加入0.5μg的随机引物,混匀,其它反转录试剂按照表3-2反转录体系依次加入。反应条件37℃15min,然后85℃条件下5sec。反转录好的cDNA可以贮存-20℃冰箱。
表3-2、反转录体系
B、Real-Time PCR:
使用SYBR Green I荧光染料嵌入法进行表3-1目的基因的Real time PCR扩增。将待测cDNA模板和相应引物按照20μl PCR反应体系(表3-3)加入0.2ml的小PCR管中,在Bio-RED公司的PCR仪上进行反应。PCR的反应条件为:
94℃,2min→(94℃,变性15s→63℃,退火40s→72℃,延伸40s)循环35次;同时以94℃,15s→63℃,40s→72℃,40s的条件监测扩增产物的链融解曲线,结果显示均成重叠单峰,确认引物的特异性较好。以β-actin作为内参照,独立实验重复5次。计算平均CT值,以目的基因/内参基因为相对量进行分析。
表3-3、反转录体系
⑧蛋白抽提及western blot
A、细胞总蛋白抽提
转染后48-72小时才能进行蛋白检测。首先弃去6孔板中的培养液,用提前4℃放置的PBS室温复苏后洗涤2次,加入200μl蛋白裂解液(已4℃预冷,并按1∶100加入蛋白酶抑制剂和PMSF),用细胞刮刀刮下细胞,转移到1.5ml的Eppendorf管中,高速漩涡震荡15s后,立即4℃,12000rpm离心15min,小心吸取上清,即为总蛋白,留取10ul样品用于蛋白定量,其余存于0.5ml的Eppendorf管中,-80℃保存。
B、蛋白定量
采用BCA法对所抽提的蛋白样品进行定量,按照beyotime公司BCA蛋白定量试剂盒步骤操作。在临加样前,打开酶标仪预热30min以上,将A液与B液按50∶1混合配成工作液,在干净的96孔板中加入蛋白样品20μl及PBS空白对照,随后每孔加入200μl的BCA工作液,震荡混匀30s,盖上板盖,37℃孵育30min后冷却至室温,在酶标仪上测定波长为540nm的吸收值(OD值)并计算样本均数,利用已制定的BSA标准曲线来确定样品总蛋白浓度。将样品蛋白用PBS调整为等浓度,并加入4∶1的5×Loading Buffer,震荡混匀后煮沸10min,使蛋白充分变性,-80℃保存。
C、western blot检测
电泳:取细胞总蛋白样品,每孔上样50μg,于12%~15%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,层积胶电压80V,分离胶电压120V。至溴酚蓝泳出凝胶后结束电泳。
电转移:按beyotime公司的预染蛋白质分子量Maker(PreStained Protein Ladder)指示的分子量标准在相应位置切胶,依次按Scotch-Brite垫-Whatman滤纸-凝胶-NC膜-Whatman滤纸 -Scotch-Brite垫的顺序放好,膜的面积稍大于凝胶,用夹子夹紧后,放入塑料支撑体中,然后浸入盛有转移缓冲液的槽中。冰浴条件下以恒定电流强度200mA,电转移60min后,取出结合有蛋白质膜的NC膜,以PreStained Prptein Ladder为参考,在合适位置切割NC膜。
封闭:用含有5%脱脂奶粉的TBS-T在脱色摇床上室温封闭2hr。
抗原抗体反应:丢弃封闭液,用含有5%的BSA的TBST按1∶1000的比例稀释抗体。将膜放入塑料凹槽中,加入一抗,转印面朝上,置于4℃冰箱摇床震荡过夜。翌日,以TBS-T漂洗3次,每次20min。同法加入稀释好的羊抗兔HRP标记的二抗,室温孵育2hr后,用TBS-T洗膜3次,每次20min。
化学发光反应:取免疫印迹化学发光试剂luminol(ECLReagentA&B),A液与B液按照1∶1混匀后,均匀滴加在NC膜上,上机曝光检测。
⑨统计与分析
2、实验结果
(1)LEC培养
传代到第三、四代的晶状体上皮细胞状态最好,细胞呈现贴壁细胞常有的梭形形态,此时用于细胞的转染实验是最佳时机。传代第三代的晶状体上皮细胞,形态单一,无杂细胞,无悬浮死细胞,细胞生长状态良好。图1为较低倍数下拍照的晶状体上皮细胞;图2为较高倍数下拍照的晶状体上皮细胞。
(2)LEC细胞鉴定
传代到第三、四代的晶状体上皮细胞,用上皮细胞相对特异性抗体CK-19鉴定。CK-19是上皮细胞特有的骨架蛋白,用FITC荧光标记二抗与其结合,在荧光显微镜下即可看到细胞结构。如图3所示。
(3)siRNA转染效率
①荧光标记siRNA:
转染效率的高低可以通过荧光标记的siRNA(简称:FAM-siRNA)实现。发明人采用的是FAM荧光标记,FAM是羧基荧光素(Carboxyfluorescein,简称:FAM),与氨基反应快,产物也比较稳定,FAM适用于氩离子激光器(Argon-ion Laser)的488nm光谱线,吸收波长/发射波长(Absorption wavelength/Emission wavelength,Abs/Em)=492/518(PH=9.0),具有荧光素衍生物的普遍特性,在水中稳定。FAM-siRNA转染细胞后,可以用荧光显微镜检测确定是否有效转染和优化转染条件。FAM-siRNA来可以用作siRNA胞内定位及双标记实验。
②FAM-siRNA
于荧光显微镜下观察转染siRNA的效率,如图4所示,可见siRNA携带的荧光染料FAM 已经进入胞浆,在荧光显微镜下发出绿色荧光。从图中可以看出,转染效率大致约70%左右,转染效率较好。
(4)RT-PCR、Western检测高度表达siRNA Ubc4对晶状体上皮细胞中αA1-162晶状体蛋白的影响
为了确定高表达siRNA Ubc4对晶状体上皮细胞对抗氧化应激状态下的保护作用,分别对转染siRNA Ubc4的晶状体上皮细胞以及未转染的细胞通过Realtime PCR的方法检测稳转细胞中αA1-162晶状体蛋白的表达量,如图5显示,与对照组相比,siRNAUbc4高表达转染组细胞中αA1-162晶状体蛋白显著低于未转染组(p<0.05)。
转染siRNA Ubc4的细胞,其中的泛素蛋白酶体系统活性升高,能够降解在氧化应激状态下的受损蛋白αA1-162,因此转染组αA1-162mRNA含量最低(中间黑色柱状图),未转染细胞在紫外线诱导的氧化应激损伤状态下,αA1-162mRNA含量较之升高(蓝色柱状图),差别具有统计学意义(p<0.01)。蛋白表达量与PCR结果吻合。
3、结论
实验结果显示提高泛素蛋白酶体系统活性可以减少受损晶状体上皮细胞中α晶状体蛋白的C-末端降解片段αA1-162晶状体蛋白的含量,有效地清除这些受损容易聚集的蛋白质,防止其在晶状体内沉淀,对维持晶状体的透明性起着关键作用。
Claims (5)
1.泛素蛋白酶体系统在制备抗晶状体混浊产品中的用途。
2.泛素蛋白酶体系统的组合物在制备抗晶状体混浊产品中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的抗晶状体浑浊产品是指医药、食品、饮料和试剂技术领域中,一种直接或者间接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的产品。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述的抗晶状体浑浊产品是直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的药物。
5.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的晶状体混浊疾病包括各类晶状体混浊疾病中的一种或多种。
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朱海萍: "skp2在人晶状体上皮细胞中的表达及与p27kip1的相关性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104825249A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-08-12 | 温州医科大学 | 一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其制备方法 |
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130327 |