CN102899314A - 一种批量基因克隆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种批量基因克隆的方法。此方法包括以下步骤：将具有多个目标性状差异的两个亲本杂交构建分离群体；分离群体中随机选择的基因克隆群体与2个亲本一起基因组高通量测序，比对2个亲本基因组，获得亲本间差异等位位点。按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比。通过统计检验，获得目标性状的候选位点。然后确定目标基因座位。通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因功能。本发明对同一次实验获得的测序数据进行不同的分组，即可实现克隆多个基因的目的，实现了数据的充分发掘与利用。

Description

一种批量基因克隆的方法

技术领域

本发明属于遗传学领域，公开了一种批量基因克隆的方法。

背景技术

自然界物种性状丰富多样，如株高、抗病性、产量等。从孟德尔时代起，就逐渐认识到了性状是由遗传因子控制，摩尔根进一步将遗传因子明确为“基因”，并指出基因位于染色体上且呈线性排列。确定基因在染色体上具体的位置(基因定位)是研究性状的基础，也是分离、克隆并利用基因的前提。

经典的基因定位策略源于摩尔根的连锁理论，即染色体上相邻基因(即基因连锁)不能自由分离，而是倾向于整体向后代传递，它们所控制的性状也倾向于同时出现。二者相邻越近，性状同时出现的可能性越大，重组性状越少。因此，由重组性状(配子)的比例可以度量二者间的距离。若已知道其中一个基因在染色体上的位置(称这样的基因为标记基因)，就可以根据重组率推断另一个基因的位置。例如，黄色圆粒豌豆品种(基因型分别为YYRR)与绿色皱粒品种(基因型为yyrr)杂交产生F₁(基因型YyRr)，F₁自交可能产生YR、Yr、yR和yr 4种配子，根据F₂代的性状表现可以确定它们的比例，进而计算交换率。若交换率为1％，且已知控制颜色的Y基因位于第3染色体上，那么就可以推测，控制豌豆籽粒形状的R基因位于第3染色体且与Y基因相距1cM。从以上的分析可以看出，经典连锁标记定位的实质是找到与目标性状连锁的已知分子标记，并计算二者的交换率，进而推断目标基因的位置。分离群体分池是基因定位的实际操作策略，以上述实例进行说明如下。以籽粒形状为标准，将F₂群体划分为两个部分(池)：显性池(随机抽取的圆粒单株)和隐性池(随机抽取的皱粒单株)，比较豌豆基因组上已知的1000个SSR标记(SSR1-SSR1000)扩增产物在这两个池间的差异。若标记SSR17与籽粒形状R/r连锁，那么对籽粒形状分池，也就相当于对SSR17分池，因此，SSR17在两个池间的扩增产物是有差异的，相反就没有差异，由此确定目标基因与SSR17处于同一染色体。再分析F₂各个单株的表现，计算R/r与SSR17的遗传距离，即可进一步定位R/r在该染色体上的具体位置。

分子标记连锁定位基因经过几十年的发展，已成为基因定位的经典方法，但该方法依旧存在明显缺陷，主要表现如下：

(1)经典分子标记定位克隆基因时，一次杂交与分子标记实验只针对一个目标性状，很难实现一次实验克隆多个基因的目的，效率不高。

(2)大部分物种未开发分子标记，基因克隆还很困难；精细定位区间狭窄，交换率低，计算交换值的实验工作十分庞大；常出现无标记可用，克隆工作无法进行的情况；仅找到含目标基因的区段，需要进行基因预测，假阳性或假阴性的实验结果无法避免。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种利用同一次实验实现多个基因的快速、准确克隆的方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

一种批量基因克隆的方法，包括以下步骤：选用在多个目标性状上有差异的材料做亲本，将两个亲本杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体，与两个亲本一起基因组高通量测序并进行基因组初步de novo(直接)组装，对两个亲本基因组进行比对，获得亲本间差异等位位点，按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比，通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3∶1和0∶1的等位位点，即获得目标性状的候选位点；扩大隐性池群体，PCR、测序逐个检查隐性池中每个个体的每个候选位点，或隐性池候选位点富集后重测序，隐性池中完全没有出现的显性亲本位点即为目标基因座位，通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因功能。

本发明更具体的技术方案是：

一种基因克隆方法，包括以下步骤：

(1)基因克隆群体的构建与遗传分析：选择多个目标性状上有差异的材料做亲本，通过杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体；

(2)确定目标性状基因候选位点：分别提取克隆群体中每个个体和2个亲本的基因组DNA，按高通量测序流程分别构建文库，PCR并高通量测序；按de novo组装，初步构建克隆群体中每个个体和2个亲本全基因组序列。构建过程中，忽略难以正确组装的重复序列(因为它们多数为非蛋白编码基因)。按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比，通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3∶1和0∶1的等位位点，将它们定义为目标性状的候选位点。

(4)目标位点的确定：通过两个方式确定目标位点。第一种方式：候选位点超过50个时，通过杂交(如安捷伦SureSelect平台)或PCR方式在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，检测显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点；第二种方式：候选位点不足50个时，可采用普通PCR、实时PCR、SNaPshot(测序)或高通量的OpenArray(定制芯片)检测方式，逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点，没有出现的显性座位位点即为目标位点。

(5)基因克隆与功能验证：通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

所述亲本杂交构建分离群体是利用遗传距离近的纯系亲本构建。

本发明实施例的有益效果是：

(1)利用本发明的方法，只需要一次杂交与测序实验，即可实现克隆多个基因的目的。

(2)本发明依赖于测序而非分子标记，可用于任何生物物种，极大地拓宽了基因克隆与利用范围。直接克隆目标基因本身，而非包含目标基因的区段，结果明确，也不存在无标记可用的问题。大部分步骤有概率保证，具有判断标准，风险大为降低。实验可在较短时间(如数周或数月)内完成，速度大为加快。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的植物批量基因克隆方法流程示意图；

图2是本发明实施例2提供的同时克隆水稻高杆、抗白叶枯、抗稻瘟病基因的方法流程示意图；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1：

参见图1，一种植物批量基因克隆方法：

(1)构建分离群体

选择具有多个目标性状差异的两个亲本进行正反交(除目标性状外，其它性状差异越小越好)，通过分子标记或田间性状观察，去除假杂种。根据F₁的表现判断控制性状的基因座位是显性还是隐性。根据正反交的性状是否有差异，判断是否具有细胞质效应，若没有差异，表明不受细胞质基因影响，否则该性状与细胞质基因相关。F₁自交形成F₂群体，根据相对性状在F₂群体中植株的比例，判断控制目标性状的基因对数，卡方检验若符合3：1的分离比，则为1对基因控制，否则为多对基因控制。F₂群体即可作为基因克隆群体，为了方便反复多次观察分离后代每个个体的表现型，继续自交获得重组自交系作为克隆群体，方法如下。从F₂代起，不进行任何选择，采用“单粒传”法(每个单株收1颗种子)自交收种并形成后代群体，直至稳定，获得重组自交系。自交过程都在隔离条件下进行，以避免可能的飞花传粉，干扰研究结果。根据杂交亲本亲缘关系的远近，自交稳定的时间长短有一定差异，一般9-10代即可稳定。获得的重组自交系不再分离，可永久保存并反复观察性状。

(2)植株选择与DNA提取。

从克隆群体中随机选择100个单株与将2个杂交亲本一起，按植物/种子基因组DNA提取试剂盒(北京天漠科技开发有限公司，货号：D6120)操作手册提取DNA。通过分光光度计测定并计算A260/A280比值，以判断DNA质量与含量。

(3)高通量测序、基因组组装、比对与候选位点的获得。

按高通量测序仪(如SOLiD 5500或Illumina HiSeq 1000)操作手册构建Fragment文库、对每一单株进行高通量测序。测序深度最好覆盖基因组20倍以上，以便于组装。用基因组组装程序ABySS(http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss)对2个亲本和100个克隆群体中的个体基因组进行初步de novo组装。比对2个亲本基因组，获得2个亲本之间具有差异的等位位点。

根据所检测的100个单株的性状表现和所要定位的性状，将单株测序数据分为显性池和隐性池。例如，假设目标性状为株高，具有高和矮两个相对性状，且高为显性。那么，将这100个后代中，表现为高的所有植株基因组测序数据归入显性池，表现为矮的所有植株的基因组测序数据归入为隐性池。若目标性状为病原抗性，又可将这100个植株的测序数据重新分组，分为抗病池和感病池。根据自由组合规律，若为1对基因控制，显性池与隐性池植株的比例应为3∶1，本实施例中的理论值分别为75和25个植株。按完全匹配的比对原则，将亲本中的差异位点序列与克隆群体中每一植株基因组数据进行比对，并计算各等位位点在显性池与隐性池中显性基因与隐性位点序列的比例。在95％的概率保证下，统计检验在显性池与隐性池中的等位位点分离比分别为3∶1和0∶1(显性序列：隐性序列)的位点，定义此类位点为目标性状候选基因。

设隐性混合池中个体数为n，则与目标位点不连锁的位点的显性与隐性序列分离比也为0∶1的概率为0.5²ⁿ，当n＝25(本实施例中的期望值)时，该概率为0.5^2*25＝0.00％，为小概率不可发生事件，即通过测序，可将所有与目标位点不连锁的位点区分开。设某位点与目标位点连锁，只有当交换发生时，才能将它与目标位点区分开，设连锁距离为m cM，则发生交换的概率为1-(1-m％)²ⁿ。当n＝25(本实施例中的期望值)且m＞5.51时，发生交换的概率大于1-(1-5.51％)^2*25＝95％。即有95％的把握将与目标位点遗传距离大于5.51的位点区分开。

(4)目标基因的确定

目标基因的确定只选择隐性群体进行，但需要扩大隐性群体的个数(如从25个扩大为1000个)。有两种方式从候选基因中确定目标基因。当候选位点超过50个时，向安捷伦公司提交目标基因候选位点的序列，按安捷伦基于Web的探针设计方案(https://earray.chem.agilent.com/earray/)设计候选位点的杂交探针，按安捷伦SureSelect试剂盒操作手册对候选位点进行捕获并建立测序文库，之后进行高通量测序。当候选位点不不足50个时按PCR的方式对每一个体的每一候选位点进行PCR扩增检测。其中，PCR扩增检测分为多种，可根据不同的情况进行选择。当位点很少且等位位点序列长度差异较大时，可采用普通PCR加琼脂糖电泳或PAGE胶电泳的方式进行检测。当等位位点间序列差异不大时，可设计Tagman探针进行实时PCR检测。当位点与群体个体都较多时，可用高通量的实时PCR方法如OpenArrary进行检测。

不论采用以上那种策略，均可统计隐性池中是否出现等位位点的显性序列，若无显性序列，即为目标位点。本实施例中，当n＝1000且m＞0.29时，发生交换的概率大于1-(1-0.29％)^2*1000＝95％。即有95％的把握将与目标位点遗传距离大于0.29的连锁位点区分开。在遗传距离为0.29范围之内且具有多态性的位点多数情况下已经没有(因为要求亲本遗传距离不要太大)。若偶尔还有，可采用继续扩大群体检测或采用基因生物信息学预测的方式排除，最后再通过遗传互补实验进行验证。

(5)目标基因克隆与功能验证。

通过比对亲本基因组的方式获得目标基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

下面通过一个更具体的实施例对本发明作进一步说明：

实施例2：

参见图2，水稻高杆、抗白叶枯、抗稻瘟病基因克隆的方法：

(1)构建克隆群体

RH3与RH5为育种选育的两个水稻亲本，这两个亲本的相似性较大，但在株高、白叶枯抗性和稻瘟病抗性上有差异。其中，RH3平均株高为135cm、抗白叶菌生理小种P6、抗稻瘟病生理小种S12(从湖北恩施稻瘟病高发区分离的优势小种)；RH5平均株高为89cm、感白叶菌生理小种P6、感稻瘟病生理小种S12。RH3与RH5进行正反交产生F₁，F₁表现为高杆(平均株高134.5cm)、抗白叶菌生理小种P6、抗稻瘟病生理小种S12，且正反交之间株高没有显著差异，表明高杆、白叶枯抗性和稻瘟病抗性均为显性且不受细胞质基因控制。种植F₂共20000株，按株高＞135cm和＜90cm将群体分为高杆和矮杆两个群体，其中高杆13783株，矮杆为4637株。按剪叶接种法于水稻抽穗前接种白叶枯生理小种P6两周后，按病斑＜2cm和＞7cm，将群体分为抗白叶枯和感白叶枯两个群体，其中抗病群体有12017株，感病群体有3985株。为了减少稻瘟病小种接种难度，于人工温室中在水稻苗三叶一心时采用喷雾稻瘟病生理小种S12方式接种(孢子浓度调节为1.5-2.0×10⁵个孢子/毫升)，接种10天后调查发病情况，将具有典型梭形病斑或死亡植株判为感病植株，将没有明显感病症状的植株确定为抗病植株，共获得抗稻瘟病和感稻瘟病的植株分别为9228和3101株。以上3对性状经卡方检验在95％的概率保证下符合3∶1的分离比，表明高杆、白叶枯抗性和稻瘟病抗性均受一对显性核基因控制。从F₂群体中随机选择100个植株作为克隆群体。在这100个植株中，高杆与矮杆的植株数分别73和27株，抗白叶枯和感白叶枯的植株分别为72和28株，抗稻瘟病和感稻瘟病的植株数分别为78和22株。

(2)DNA提取

取上述100个植株及亲本RH3、RH5叶片，分别按植物DNA提取试剂盒(DP305，天更，北京)操作手册分离纯化基因组DNA，利用ND2000超微量分光光度计测定样品浓度与纯度。

(3)亲本测序与目标基因候选位点的确定

按Illumina HiSeq 2000高通量测序技术规程构建两个亲本RH3、RH5和100个分离后代个体的基因组Fragment文库、PCR扩增后高通量测序。采用条形码对每份材料进行编码，以示区分。测序后，所有102份材料共获得559.8G Clean data数据量，每个材料平均有559.8/102＝5.49G数据量，变异范围为3.82～7.03G。水稻基因组大约为0.3G，本次测序平均覆盖基因组5.49/0.3＝18.30倍，变异范围为12.77～23.43倍。

用基因组组装程序ABySS(http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss)对两个亲本RH3和RH5基因组进行初步de novo组装。比较两亲本基因组间的差异，在RH3和RH5基因组间共获得1895个等位位点，将RH3中相应的位点命名为A1，A2......A1895，对应在RH5中相应位点命名为a1、a2......a1895。按完全匹配的方式，将这1895对等位位点与27个矮杆植株进行比对，发现有28个等位位点的显性亲本序列没有在这27个隐性植株中出现。按同样的方法，通过比对感白叶枯和感稻瘟病的植株，分别发现32个和25个显性亲本序列在所有的隐性植株中都没有出现。检验以上在隐性群体中没有出现的显性位点序列与对应的隐性等位点序列在显性池中的分离比，发现绝大部分都符合3∶1的分离比，在95％的概率保证下，均不符合1∶1的分离比，表明这些位点应该是目标序列本身或连锁位点，将它们分别定义为株高、抗白叶枯、抗稻瘟病的候选基因。

(4)目标基因的确定

将矮杆、感白叶枯和感稻瘟病的隐性群体数量扩大为960株(拟采用AB公司

Genotyping Plates进行实时PCR反应检测，该反应板最低订制10张，根据实际情况，位点×样本数选择96×32的格式)。向AB公司提交所有这三个性状的候选等位位点序列，由AB公司设计检测这些候选等位位点的TagMan探针并生产

Genotyping Plates，按照OpenArray检测流程在扩大的隐性群体中对所有三个目标性状的候选位点进行基因分型。基因分型的结果表明：每个目标性状除1个等位位点中的显性亲本序列在960个隐性个体中均未出现外，其余候选位点的显性序列至少出现了2次，表明这些位点不是目标位点，而仅为目标位点的连锁位点。对显性序列出现小于等于5次的4个位点的扩增产物进行回收，并送交上海深工生物技术有限公司测序，测序结果表明这4个位点均与高通量测序中的显性位点序列一致。通过以上步骤，获得了控制株高、白叶枯抗性和稻瘟病抗性的目标基因位点序列分别如下：获得了控制株高、白叶枯抗性和稻瘟病抗性的目标基因位点序列分别为序列表中的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。获得了控制白叶枯抗性的目标基因位点序列为序列表中的SEQ ID NO.2；获得了控制稻瘟病抗性的目标基因位点序列为序列表中的SEQ ID NO.3。

根据三个位点中每个位点在RH3基因组中前后各10K序列，按植物基因组结构预测程序，如GeneSeqerPlantGDB(http://www.plantgdb.org/cgi-bin/GeneSeqer.cgi)，对基因结构进行预测，发现这三个位点分别位于相应的基因序列内，根据预测的结构，获得每个基因的起始点和结束点。根据每个基因起始点前500bp和结束点后500bp的序列按Primer5软件及其默认参数设计相应引物对预测获得的基因进行扩增，引物设计的参数按软件默认的参数进行。PCR扩增体系按试剂盒DreamTaq^TM Green PCR Master Mix(2X)(K1081，fermentas)推荐体系进行，即含PCR混合物50μl，RH23模板15ng，引物2μl(浓度：0.5μM/μL)，加纯水至总体积为100μl。扩增程序如下：94℃预变性4分钟；94℃，1分钟，51℃～54℃，3分钟，72℃，3分钟，循环44次；72℃延伸8分钟。其中，株高基因扩增引物对中，正向引物(Sense primer)为序列表中的SEQ ID NO.4：ACTCACTCCCGCTCAACA，反向引物(Antisense primer)为序列表中的SEQ ID NO.5：CATTCATCCGTCGTTCCA，退火温度为54℃；白叶枯抗性基因的扩增引物对的Sense primer为序列表中的SEQ ID NO.6：GCTCCTATTCGCAACCTG，Antisense primer为序列表中的SEQ ID NO.7：TACCAAACAAACAGAGGC，退火温度为51℃；稻瘟病抗性基因的扩增引物对中，Senseprimer为序列表中的SEQ ID NO.8：AGTTCCTGGAGATCTGTAGCACGTA，Antisenseprimer为序列表中的SEQ ID NO.9：TACGTGCTACAGATCTCCAGGAACT，退火温度为53.2℃。扩增产物用2％的琼脂糖凝胶检测。PCR产物按琼脂糖凝胶回收试剂盒(K0691，Fermentas)操作手册回收纯化扩增片段并送交上海深工生物技术有限公司测序，测序结果与RH3高通量测序后拼装的序列完全一致。通过以上技术手段，获得株高基因的全长序列为序列表中的SEQ ID NO.10，白叶枯抗性基因的全长序列为序列表中的SEQ ID NO.11，稻瘟病抗性的全长基因序列为序列表中的SEQ ID NO.12。

(4)功能互补验证

利用根癌农杆菌Ti质粒载体，将控制高杆、抗白叶枯和抗稻瘟病的基因分别转入矮杆、感白叶枯和感稻瘟病的亲本RH5中，转基因阳性植株表现为高杆、抗白叶枯或抗稻瘟病，证明了本发明实施例所克隆基因的正确性。

本发明以测序为基础，可用于任何物种，直接克隆基因本身，对同一次实验获得的测序数据进行不同的分组，即可实现克隆多个基因的目的，实现了数据的充分发掘与利用。采用本发明的方法，工作量大为减少、效率与速度大为加快、而且降低了风险。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种批量基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：选用在多个目标性状上有差异的材料做亲本，将两个亲本杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体，提取克隆群体中每个个体与两个亲本基因组一起高通量测序，并进行基因组初步直接组装；对两个亲本基因组进行比对，获得亲本间差异等位位点；按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比；通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3∶1和0∶1的等位位点，即获得目标性状的候选位点；扩大隐性池群体，PCR逐个检查隐性池中每个个体的每个候选位点或隐性池候选位点富集后重测序，在隐性池中完全没有出现的显性亲本位点即为目标基因座位；通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因功能。

2.根据权利要求1所述的批量基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建基因克隆群体：选择多个目标性状上有差异的材料做亲本，将两个亲本通过杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体；

(2)确定候选位点：分别提取克隆群体中每个个体和2个亲本基因组DNA，按高通量测序流程构建文库，PCR并高通量测序；按直接组装，初步构建克隆群体中每个个体和2个亲本的全基因组序列；按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比；通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3∶1和0∶1的等位位点，该等位位点为目标性状的候选位点；

(4)目标位点的确定：当候选位点超过50个时，通过杂交或PCR方式在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，检测显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点；当候选位点不足50个时，采用普通PCR、实时PCR、高通量PCR或测序技术的检测方式，逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点，没有出现的显性座位的等位位点即为目标位点；

(5)基因克隆与功能验证：通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

3.根据权利要求1所述的批量基因克隆的方法，其特征在于，所述亲本杂交构建分离群体是利用遗传距离近的纯系亲本。

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