CN102863458B - 他克莫司粗品的纯化方法 - Google Patents
他克莫司粗品的纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种他克莫司粗品的纯化方法，将他克莫司粗品经第一有机溶剂溶解并超声振荡后，采用快速滤纸抽滤，之后把抽滤所得的滤液即样品溶液通过制备型高速逆流色谱仪进行连续纯化并收集含他克莫司的主峰，然后合并收集到的收集液，接着依次进行减压浓缩、有机溶剂萃取、浓缩萃取液并重结晶以获得产品。本发明不仅能够获得高纯度的他克莫司，且具有较高的纯化收率，从而可降低工业化的成本。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种医药生物技术领域的纯化方法，尤其涉及一种他克莫司粗品的纯化方法。
【背景技术】
他克莫司是一种新型强效的大环内酯类免疫抑制剂，最早由日本藤泽药品工业公司探索研究所于1984年自日本筑波山土壤中分离到的筑波霉菌的发酵液中提取得到；1989年他克莫司首次应用于临床肝脏移植；1991年日本开发的名为普乐可复(Prograf)他克莫司胶囊剂和注射剂正式上市，用于原发性肝移植和肾移植的排斥反应治疗，后又被批准用于骨髓移植。目前他克莫司制剂已在日本、美国、英国、德国、加拿大、丹麦、法国、意大利、西班牙、爱尔兰等80多个国家上市，广泛应用于肝脏、胰腺、肾脏、心脏和肺等实体器官移植后的抗排异治疗。1999年他克莫司软膏投放日本市场，用于治疗成人的特应性皮炎。此外，他克莫司对牛皮癣、银屑病、鱼鳞病、糖尿病、白塞氏病、变应性皮炎、类风湿性关节炎以及多发性硬化病等自身免疫病有疗效。
主要地，由于他克莫司来源于发酵产品，发酵过程同时也产生了多个他克莫司类似物，包括二氢他克莫司和子囊霉素等杂质；这些杂质和他克莫司结构极为相似，物理化学性质相近，通过常规的纯化技术难于获得较高纯度的原料药，从而难以满足市场需要。现有关于他克莫司分离纯化的文献中虽然均揭露了用吸附树脂或改性硅胶来精制他克莫司，但存在着纯化收率低、工业化成本高的问题。
次要地，高速逆流色谱技术(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是基于流体动力学原理开发的一种新兴无固体载体的高效液-液分配色谱技术，已成功应用于多种天然中药和活性成分分离，并开始在微生物发酵药物分离过程中应用。随着高速逆流色谱技术的发展，制备型逆流色谱仪已开始得到应用，但如何节约溶剂并进行连续生产并未见相关报道。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种他克莫司粗品的纯化方法，不仅能够获得高纯度的他克莫司，且具有较高的纯化收率，从而可降低工业化的成本。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种他克莫司粗品的纯化方法，该纯化方法包含如下具体步骤：
(1)用第一混合有机溶剂溶解他克莫司粗品以获得浓度为5-40g/L他克莫司粗品溶液，之后将该他克莫司粗品溶液进行超声振荡，超声频率40KHz，超声时间30-60min；所述第一混合有机溶剂由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100～110:340～380:275～305的体积比混合而成；
(2)将步骤(1)超声结束后的他克莫司粗品溶液进行快速滤纸抽滤，抽滤所得的滤液即样品溶液采用制备型高速逆流色谱仪进行连续纯化并收集含他克莫司的主峰；
(3)合并步骤(2)收集所得的收集液，之后依次进行减压浓缩、有机溶剂萃取、浓缩萃取液并重结晶以获得产品；
其中，所述步骤(2)中制备型高速逆流色谱仪的色谱条件为：
制备型高速逆流色谱仪：上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A型制备型高速逆流色谱仪；
溶剂体系：单独配置流动相与固定相；其中流动相为所述第一混合有机溶剂；固定相为第二混合有机溶剂，且该第二混合有机溶剂由体积比为13～16:11～13.5:0.9～1.1的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇组成；
进样方式：连续进样；
主机转速：450-500rpm；
流动相流速：20-25ml/min；
检测波长：254nm；
制备温度：20-25℃；
在线检测软件：N2000色谱工作站。
进一步地，所述步骤(2)中采用制备型高速逆流色谱仪纯化的过程为：将所述固定相以75-100ml/min的流速装满色谱分离柱，然后开启速度控制器使逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机转速达到450-500rpm时，以20-25ml/min流速泵进该流动相，待流动相流出且两相溶剂体系在色谱柱内达到平衡时，取所述样品溶液进样200ml，然后分段收集含他克莫司的主峰。
进一步地，所述第二混合有机溶剂的制备过程为：将正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按体积比13～16:11～13.5:0.9～1.1混合搅拌20-30min，之后采用40KHz频率的超声波脱气20-30min即可。
进一步地，所述步骤(3)中的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。
本发明他克莫司粗品的纯化方法的有益效果在于：
1、通过本发明纯化方法的操作步骤，不仅能够获得高纯度的他克莫司，且具有较高的纯化收率，从而可降低工业化的成本；
2、改变了常规高速逆流色谱单次进样的缺点，采用连续进样的方式，使得一次逆流可以分离的样品量得以大大提升；
3、另外，在连续的逆流生产过程需要大量的流动相，只需要少量固定相，本发明通过改变常规高速逆流色谱利用萃取分层同时配制流动相和固定相的方式，而采用了根据需要单独配制固定相和流动相，不仅节省了大量溶剂，且因溶剂无需静置，从而节省了时间。
【具体实施方式】
本发明他克莫司粗品的纯化方法，该纯化方法包含如下具体步骤：(1)用第一混合有机溶剂溶解他克莫司粗品以获得浓度为5-40g/L他克莫司粗品溶液，之后将该他克莫司粗品溶液进行超声振荡，超声频率40KHz，超声时间30-60min；第一混合有机溶剂由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100～110:340～380:275～305的体积比混合而成；(2)将步骤(1)超声结束后的他克莫司粗品溶液进行快速滤纸抽滤，抽滤所得的滤液即样品溶液，之后将固定相以75-100ml/min的流速装满色谱分离柱，然后开启速度控制器使逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机转速达到450-500rpm时，以20-25ml/min流速泵进流动相，待流动相流出且两相溶剂体系在色谱柱内达到平衡时，取所述样品溶液进样200ml，分段收集含他克莫司的主峰；(3)合并步骤(2)收集所得的收集液并进行减压浓缩，将获得的浓缩液采用乙酸乙酯或乙酸丁酯萃取，之后将萃取液进行浓缩，接着在浓缩后的萃取液中加入热乙醚，搅拌溶解后置于0-5℃结晶，结晶获得的晶体采用冷乙醚洗晶，之后将晶体进行50-60℃真空干燥，得到产品。
其中，步骤(2)中制备型高速逆流色谱仪的色谱条件为：
制备型高速逆流色谱仪：上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A型制备型高速逆流色谱仪；
溶剂体系：单独配置流动相与固定相；其中流动相为第一混合有机溶剂；固定相为第二混合有机溶剂，且该第二混合有机溶剂由体积比为13～16:11～13.5:0.9～1.1的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇组成；
进样方式：连续进样；
主机转速：450-500rpm；
流动相流速：20-25ml/min；
检测波长：254nm；
制备温度：20-25℃；
在线检测软件：N2000色谱工作站。
且第二混合有机溶剂的制备过程为：将正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按体积比13～16:11～13.5:0.9～1.1混合搅拌20-30min，之后采用40KHz频率的超声波脱气20-30min即可。
为了对本发明纯化方法进行进一步地阐述说明，申请人给出了以下几个实施例，且在各实施例中所采用的仪器和试剂：TBE-5000A型制备型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)；8823B紫外检测器(北京宾达英创科技有限公司)；N2000色谱工作站(浙江智达信息工程有限公司)；HX-2050恒温循环器(北京博医康实验仪器有限公司)；LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；BUCHI旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司)；所有应用于HSCCC的有机溶剂均为化学纯；应用于HPLC的有机溶剂为色谱纯。
实施例1：
称取100g他克莫司粗品并溶解于3400ml由体积比为105:356:290的甲基叔丁基醚、甲醇和水混合而成的第一混合有机溶剂中，之后进行超声振荡40分钟，超声频率40KHz；超声结束后的溶液采用快速滤纸抽滤；配制流动相即该第一混合有机溶剂81L；配制固定相6000ml，具体地，将正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按体积比14.4:12.4:1混合搅拌25min，之后采用40KHz频率的超声波脱气25min即可。
将固定相以80ml/min的流速装满色谱分离柱，然后开启HX-2050恒温循环器调节温度为22℃，开启速度控制器，使逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机转速达到480rpm时，以22ml/min流速泵进流动相，待流动相流出，两相溶剂体系在色谱柱内达到平衡时，取样品溶液通过六通阀进样200ml，开启8823B紫外检测器，然后根据N2000色谱工作站色谱图分段收集含他克莫司的主峰，且每4min收集一瓶；当含他克莫司的主峰出完后，再次进样，连续进样17次(每次进样200ml)，且对每次进样后的含他克莫司的主峰均每4min收集一瓶。
合并收集到的收集液，并采用BUCHI旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩所得的浓缩液采用乙酸丁酯萃取两次，之后所得乙酸丁酯萃取液用BUCHI旋转蒸发仪浓缩至粘稠状，接着将浓缩后的乙酸丁酯萃取液倒入烧杯，并往烧杯内加入热乙醚，搅拌溶解后置于3℃结晶并过滤，过滤得到的晶体用冷乙醚洗晶，然后将晶体进行55℃真空干燥，得到粉末即产品，最后产品经LC-2010A高效液相色谱仪检测得知，产品中他克莫司含量达到99.2％(即产品纯度高达99.2％)、子囊霉素含量0.18％、二氢他克莫司含量0.17％、收率为62.5％。
实施例2：
称取18g他克莫司粗品并溶解于3600ml由体积比为100:340:275的甲基叔丁基醚、甲醇和水混合而成的第一混合有机溶剂中，之后进行超声振荡30分钟，超声频率40KHz；超声结束后的溶液采用快速滤纸抽滤；配制流动相即该第一混合有机溶剂85L；配制固定相6000ml，具体地，将正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按体积比13:11:0.9混合搅拌30min，之后采用40KHz频率的超声波脱气30min即可。
将固定相以75ml/min的流速装满色谱分离柱，然后开启HX-2050恒温循环器调节温度为25℃，开启速度控制器，使逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机转速达到450rpm时，以25ml/min流速泵进流动相，待流动相流出，两相溶剂体系在色谱柱内达到平衡时，取样品溶液通过六通阀进样200ml，开启8823B紫外检测器，然后根据N2000色谱工作站色谱图分段收集含他克莫司的主峰，且每5min收集一瓶；当含他克莫司的主峰出完后，再次进样，连续进样18次(每次进样200ml)，且对每次进样后的含他克莫司的主峰均每5min收集一瓶。
合并收集到的收集液，并采用BUCHI旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩所得的浓缩液采用乙酸丁酯萃取两次，之后所得乙酸丁酯萃取液用BUCHI旋转蒸发仪浓缩至粘稠状，接着将浓缩后的乙酸丁酯萃取液倒入烧杯，并往烧杯内加入热乙醚，搅拌溶解后置于5℃结晶并过滤，过滤得到的晶体用冷乙醚洗晶，然后将晶体进行50℃真空干燥，得到粉末即产品，最后产品经LC-2010A高效液相色谱仪检测得知，产品中他克莫司含量达到99.8％(即产品纯度高达99.8％)、子囊霉素含量0.08％、二氢他克莫司含量0.06％、收率为77.4％。
实施例3：
称取120g他克莫司粗品并溶解于3000ml由体积比为110:380:305的甲基叔丁基醚、甲醇和水混合而成的第一混合有机溶剂中，之后进行超声振荡60分钟，超声频率40KHz；超声结束后的溶液采用快速滤纸抽滤；配制流动相即该第一混合有机溶剂75L；配制固定相6000ml，具体地，将正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按体积比16:13.5:1.1混合搅拌20min，之后采用40KHz频率的超声波脱气20min即可。
将固定相以100ml/min的流速装满色谱分离柱，然后开启HX-2050恒温循环器调节温度为20℃，开启速度控制器，使逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机转速达到500rpm时，以20ml/min流速泵进流动相，待流动相流出，两相溶剂体系在色谱柱内达到平衡时，取样品溶液通过六通阀进样200ml，开启8823B紫外检测器，然后根据N2000色谱工作站色谱图分段收集含他克莫司的主峰，且每3min收集一瓶；当含他克莫司的主峰出完后，再次进样，连续进样15次，且对每次进样后的含他克莫司的主峰均每3min收集一瓶。
合并收集到的收集液，并采用BUCHI旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩所得的浓缩液采用乙酸乙酯萃取两次，之后所得乙酸乙酯萃取液用BUCHI旋转蒸发仪浓缩至粘稠状，接着将浓缩后的乙酸乙酯萃取液倒入烧杯，并往烧杯内加入热乙醚，搅拌溶解后置于0℃结晶并过滤，过滤得到的晶体用冷乙醚洗晶，然后将晶体进行60℃真空干燥，得到粉末即产品，最后产品经LC-2010A高效液相色谱仪检测得知，产品中他克莫司含量达到99.3％(即产品纯度高达99.3％)、子囊霉素含量0.19％、二氢他克莫司含量0.16％、收率为61.1％。
综上，通过本发明纯化方法的操作步骤，不仅能够获得纯度高达99.0％以上的他克莫司产品，且具有较高的纯化收率，从而可降低工业化的成本；采用连续进样的方式，使得一次逆流可以分离的样品量提升至100g；另外，在连续的逆流生产过程需要大量的流动相，只需要少量固定相，本发明采用了根据需要单独配制固定相和流动相，不仅节省了大量溶剂，且因溶剂无需静置，从而节省了时间。
Claims (4)
1.一种他克莫司粗品的纯化方法，其特征在于：该纯化方法包含如下具体步骤：
(1)用第一混合有机溶剂溶解他克莫司粗品以获得浓度为5-40g/L他克莫司粗品溶液，之后将该他克莫司粗品溶液进行超声振荡，超声频率40KHz，超声时间30-60min；所述第一混合有机溶剂由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100～110:340～380:275～305的体积比混合而成；
(2)将步骤(1)超声结束后的他克莫司粗品溶液进行快速滤纸抽滤，抽滤所得的滤液即样品溶液采用制备型高速逆流色谱仪进行连续纯化并收集含他克莫司的主峰；
(3)合并步骤(2)收集所得的收集液，之后依次进行减压浓缩、有机溶剂萃取、浓缩萃取液并重结晶以获得产品；
所述步骤(2)中制备型高速逆流色谱仪的色谱条件为：
制备型高速逆流色谱仪：上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A型制备型高速逆流色谱仪；
溶剂体系：单独配置流动相与固定相；其中流动相为所述第一混合有机溶剂；固定相为第二混合有机溶剂，且该第二混合有机溶剂由体积比为13～16:11～13.5:0.9～1.1的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇组成；
进样方式：连续进样；
主机转速：450-500rpm；
流动相流速：20-25ml/min；
检测波长：254nm；
制备温度：20-25℃；
在线检测软件：N2000色谱工作站。
2.根据权利要求1所述的他克莫司粗品的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中采用制备型高速逆流色谱仪纯化的过程为：将所述固定相以75-100ml/min的流速装满色谱分离柱，然后开启速度控制器使逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机转速达到450-500rpm时，以20-25ml/min流速泵进该流动相，待流动相流出且两相溶剂体系在色谱柱内达到平衡时，取所述样品溶液进样200ml，然后分段收集含他克莫司的主峰。
3.根据权利要求1所述的他克莫司粗品的纯化方法，其特征在于：所述第二混合有机溶剂的制备过程为：将正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按体积比13～16:11～13.5:0.9～1.1混合搅拌20-30min，之后采用40KHz频率的超声波脱气20-30min即可。
4.根据权利要求1所述的他克莫司粗品的纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。
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