CN102746417A - 一种采用酶法提取怀山药多糖的提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用酶法提取怀山药多糖的提取工艺，以怀山药为原料，采用蛋白酶法提取山药多糖，中性蛋白酶的提取条件为：怀山药的底物浓度为20%~30%、中性蛋白酶用量为2.0%~3.5%、提取温度为45℃、提取时间为3.0h~4.0h、pH值为6.0~6.5、中性蛋白酶酶活为120万U/g。在多糖水浸提过程中加入蛋白酶提取多糖，可以使多糖更容易被浸提出来，提高山药多糖的提取率。通过本工艺制的山药多糖是纯多糖，具有生产工艺合理、简单，易于工业化生产的特点，生产的山药多糖可以广泛的应用于各种保健食品及保健药品中。

Description

一种采用酶法提取怀山药多糖的提取工艺

技术领域

本发明涉及到一种酶法提取怀山药多糖工艺，具体为采用中性蛋白酶酶法提取怀山药多糖的制备工艺。

背景技术

山药是我国最大众化的传统保健食品之一，在众多品种中，以古怀庆府今河南焦作境内的怀山药最负盛名，其含有丰富的营养物质，既是我国传统食用的食品，又是入药的地道药材，是历史上著名的四大怀药之一，素有“怀参”的美称。“久服耳聪目明、轻身延年”，怀山药含有丰富的蛋白质、多糖、淀粉、氨基酸以及常量、微量元素等成分，对人体具有十分显著抗肿瘤、降血糖、调节免疫力等的功效，多糖是目前比较公认的活性成分，也是研究的比较多、比较具体的成分。它能够预防心血管疾病，清除心血管上沉积的脂肪，使血管保持弹性，防止动脉粥样硬化的发生，增强机体的免疫调节能力。

山药多糖的组成和结构比较复杂，不同的研究者提取分离出了不同的山药多糖，山药的品种不同以及提取的手段的不同，所提取的山药多糖也是不同的。提取的多糖中有均多糖，杂多糖，还有糖蛋白，相对分子质量从数千到数百万不等，其多糖含量和糖基组成也各不相同。经测定，山药中多糖的含量约为52.4%，大部分为酸性多糖和中性多糖，主要由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成。

山药多糖的提取方法有很多种，国内学者在山药多糖提取方面做了大量工作，综合起来有以下几种：

水浸提法  水浸提法是采用比较多的传统提取方法，简单的说，就是水扩散进入山药颗粒，颗粒内部有效成分被水溶解后向表面扩散，以及溶质由颗粒表面向水中扩散，是山药多糖从山药内部向水中进行扩散的两相间传质的过程。在对水浸提过程进行优化时，主要考察的参数是温度、时间、料水比和浸提次数。这一提取方法比较简单，提取比较方便，但是提取率不是很高。

超声辅助法  在水浸提的基础上，采用超声波辅助提取，超声波产生的空化效应、机械效应、热效应和其他次级效应能加速细胞壁的破碎, 在不改变多糖结构的基础上，促进胞内多糖的溶出,缩短提取时间。

酶法  酶法提取是在水浸提的过程中加入各种酶，以破坏底物细胞壁，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质等物质降解，便于多糖的溶出。纤维素酶能分解纤维素和半纤维素破坏细胞结构，使细胞内的多糖更好的被释放；山药含有大量的淀粉，使提取液黏度增大，淀粉酶能水解淀粉，降低提取液黏度，提高多糖溶出率；山药多糖主要与蛋白质结合在一起呈黏液质形式存在，蛋白酶可对细胞结构产生破坏作用，可将与多糖结合的蛋白质酶解，使存在于细胞内部的多糖释放出来。常用的酶有α-淀粉酶、纤维素酶和碱性、中性蛋白酶。

在这几种提取方式中，酶法提取效果明显优于其他方法，具有提取条件温和，提取率高的特点，是未来提取山药多糖的首选方法，而各种酶的作用机理不同，可在山药多糖不同提取阶段采用不同的酶，最大限度的提高多糖溶出量。

发明内容

为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供了一种采用酶法提取怀山药中的多糖成分，并将其用于保健品的开发，促进山药资源的开发利用以及山药产品的加工升值。在水浸提的基础上，采用酶法提取多糖可以缩短提取时间，提高多糖的浸出率。

本发明的目的是这样实现的：

一种采用酶法提取的怀山药多糖，其特征在于：它是以怀山药为原料，采用中性蛋白酶酶法提取得到怀山药多糖，

中性蛋白酶的提取条件为：怀山药的底物浓度为20%~30%、中性蛋白酶用量为2.0%~3.5%、提取温度为45℃、提取时间为3.0h~4.0h、pH值为 6.0~6.5。中性蛋白酶酶活为120万U/g；

所述的采用酶法提取怀山药多糖的提取工艺，其步骤如下：

（1）原料预处理：选取无霉烂、病虫害的怀山药，剔除杂质，洗净；

（2）提取：怀山药的底物浓度为20%~30%、中性蛋白酶用量为2.0%~3.5%、提取温度为45℃、提取时间为3.0h~4.0h、pH值为 6.0~6.5，在提取期间维持提取液pH不变；

（3）粗沉：提取液冷却至室温，4000r/min将提取液离心20min，收集上清液，采用旋转蒸发仪将上清液浓缩体积，加入四倍于浓缩后上清液体积的无水乙醇溶液，过夜，4000r/min离心沉淀，沉淀即为粗水溶性怀山药多糖；

（4）精制：将粗多糖复溶于水，加入三氯乙酸至浓度为15%，摇匀，静置过夜，离心，沉淀为蛋白质，上清液为多糖，将上清液浓缩，加入四倍浓缩后上清液体积的无水乙醇溶液，摇匀，静置过夜，沉淀即为精制后的怀山药多糖。

山药多糖含量的测定—苯酚硫酸法，以葡萄糖做标准曲线。

苯酚-硫酸法是利用多糖在浓硫酸水合产生高温的作用下，迅速发生水解反应释放出单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，然后与苯酚缩合生成490nm处有最大吸收峰的有色化合物来进行测定的。

称取烘干(105℃)至恒重的无水葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL及1.8mL，各以水补至2.0mL，然后加入6％苯酚1.0mL及浓H₂S0₄5.0mL，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm波长处测吸光度A，以2.0ml的水按同样显色操作为空白，以对照品溶液浓度为横坐标X，吸光度测定值为纵坐标Y，做标准曲线。标准曲方程：Y=7.4628X-0.049，R²=0.9934对照品溶液在0.008mg/ml-0.036mg/ml之间有良好线性关系。

依据标准曲线的方法，加入2mL样品稀释液，1mL 6%苯酚，5mL浓硫酸，放置10min后震荡，放置20min测量样品稀释液的吸光度。

提取液中多糖质量（g）=f×C×V×D×10^-3

    f：换算因子(0.9)

    C：测得样品溶液的葡萄糖浓度(mg/mL)

    D：样品溶液稀释倍数

    V：测定液总量(mL)

多糖提取率=（提取液多糖质量/山药质量）*100%

上述方法建立了解决了传统水浸提山药多糖周期长的难题，提高了山药多糖的浸出率。在此方法下，怀山药多糖的提取率为8.55%。

积极有益效果：本发明涉及一种酶法提取怀山药多糖工艺，以怀山药为原料，采用蛋白酶法提取山药多糖。在多糖水浸提过程中加入蛋白酶提取多糖，可以使多糖更容易被浸提出来，提高山药多糖的提取率。通过本工艺制的山药多糖是纯多糖，具有生产工艺合理、简单，易于工业化生产的特点，生产的山药多糖可以广泛的应用于各种保健食品及保健药品中。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图一；

图2为本发明的工艺流程图二。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，对本发明做进一步的说明：

一种采用酶法提取的怀山药多糖，其特征在于：它是以怀山药为原料，采用中性蛋白酶酶法提取得到怀山药多糖，

中性蛋白酶的提取条件为：怀山药的底物浓度为20%~30%、中性蛋白酶用量为2.0%~3.5%、提取温度为45℃、提取时间为3.0h~4.0h、pH值为 6.0~6.5。中性蛋白酶酶活为120万U/g；

所述的采用酶法提取怀山药多糖的提取工艺，其步骤如下：

（1）原料预处理：选取无霉烂、病虫害的怀山药，剔除杂质，洗净；

（2）提取：怀山药的底物浓度为20%~30%、中性蛋白酶用量为2.0%~3.5%、提取温度为45℃、提取时间为3.0h~4.0h、pH值为 6.0~6.5，在提取期间维持提取液pH不变；

（3）粗沉：提取液冷却至室温，4000r/min将提取液离心20min，收集上清液，采用旋转蒸发仪将上清液浓缩体积，加入四倍于浓缩后上清液体积的无水乙醇溶液，过夜，4000r/min离心沉淀，沉淀即为粗水溶性怀山药多糖；

（4）精制：将粗多糖复溶于水，加入三氯乙酸至浓度为15%，摇匀，静置过夜，离心，沉淀为蛋白质，上清液为多糖，将上清液浓缩，加入四倍浓缩后上清液体积的无水乙醇溶液，摇匀，静置过夜，沉淀即为精制后的怀山药多糖。

实施例1

如图1所示，（1）原料预处理：选取50千克无霉烂、病虫害的优质怀山药，剔除杂质，洗净，去皮，温水浸泡至软而不烂，用纯水打浆配成1:20的溶液； 

（2）提取：采用直接加蛋白酶的方式将中性蛋白酶添加到底物中，中性蛋白酶的添加量为2%，在45℃温度控温提取3.0h，提取pH值为6.0，在提取期间维持提取液pH不变；

（3）粗沉：提取液冷却至室温，4000r/min将提取液离心20min，收集上清液，采用旋转蒸发仪将上清液浓缩至一定体积，加入四倍体积的无水乙醇溶液，过夜，4000r/min离心沉淀，沉淀即为粗水溶性怀山药多糖；

（4）精制：将粗多糖复溶于水，加入三氯乙酸至浓度为15%，摇匀，静置过夜，离心，沉淀为蛋白质，上清液为多糖，将上清液浓缩，加入四倍体积的无水乙醇溶液，摇匀，静置过夜，沉淀即为精致后的怀山药多糖。

实施例2

如图2所示，（1）原料预处理：选取80千克无霉烂、病虫害的优质怀山药，剔除杂质，洗净，去皮，切块，在105℃下烘干至恒重，粉碎，用纯水配成1:25的溶液；

（2）提取：采用直接加蛋白酶的方式将中性蛋白酶添加到底物中，中性蛋白酶的添加量为3%，在45℃温度控温提取3.8.0h，提取pH值为6.3，在提取期间维持提取液pH不变；

（3）粗沉：提取液冷却至室温，4000r/min将提取液离心20min，收集上清液，采用旋转蒸发仪将上清液浓缩至一定体积，加入四倍体积的无水乙醇溶液，过夜，4000r/min离心沉淀，沉淀即为粗水溶性怀山药多糖；（4）精制：将粗多糖复溶于水，加入三氯乙酸至浓度为15%，摇匀，静置过夜，离心，沉淀为蛋白质，上清液为多糖，将上清液浓缩，加入四倍体积的无水乙醇溶液，摇匀，静置过夜，沉淀即为精致后的怀山药多糖。

实施例3

如图2所示，（1）原料预处理：选取100千克无霉烂、病虫害的优质怀山药，剔除杂质，洗净，去皮，切块，在105℃下烘干至恒重，粉碎，用纯水配成1:30的溶液；

（2）提取：采用直接加蛋白酶的方式将中性蛋白酶添加到底物中，中性蛋白酶的添加量为3.5%，在45℃温度控温提取4.0h，提取pH值为6.5，在提取期间维持提取液pH不变；

（3）粗沉：提取液冷却至室温，4000r/min将提取液离心20min，收集上清液，采用旋转蒸发仪将上清液浓缩至一定体积，加入四倍体积的无水乙醇溶液，过夜，4000r/min离心沉淀，沉淀即为粗水溶性怀山药多糖；（4）精制：将粗多糖复溶于水，加入三氯乙酸至浓度为15%，摇匀，静置过夜，离心，沉淀为蛋白质，上清液为多糖，将上清液浓缩，加入四倍体积的无水乙醇溶液，摇匀，静置过夜，沉淀即为精致后的怀山药多糖。

山药多糖含量的测定—苯酚硫酸法，以葡萄糖做标准曲线。

苯酚-硫酸法是利用多糖在浓硫酸水合产生高温的作用下，迅速发生水解反应释放出单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，然后与苯酚缩合生成490nm处有最大吸收峰的有色化合物来进行测定的。

称取烘干(105℃)至恒重的无水葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL及1.8mL，各以水补至2.0mL，然后加入6％苯酚1.0mL及浓H₂S0₄5.0mL，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm波长处测吸光度A，以2.0ml的水按同样显色操作为空白，以对照品溶液浓度为横坐标X，吸光度测定值为纵坐标Y，做标准曲线。标准曲方程：Y=7.4628X-0.049，R²=0.9934对照品溶液在0.008mg/ml-0.036mg/ml之间有良好线性关系。

依据标准曲线的方法，加入2mL样品稀释液，1mL 6%苯酚，5mL浓硫酸，放置10min后震荡，放置20min测量样品稀释液的吸光度。

提取液中多糖质量（g）=f×C×V×D×10^-3

    f：换算因子(0.9)

    C：测得样品溶液的葡萄糖浓度(mg/mL)

    D：样品溶液稀释倍数

    V：测定液总量(mL)

多糖提取率=（提取液多糖质量/山药质量）*100%

上述方法建立了解决了传统水浸提山药多糖周期长的难题，提高了山药多糖的浸出率。在此方法下，怀山药多糖的提取率为8.55%。

本发明涉及一种酶法提取怀山药多糖工艺，以怀山药为原料，采用蛋白酶法提取山药多糖。在多糖水浸提过程中加入蛋白酶提取多糖，可以使多糖更容易被浸提出来，提高山药多糖的提取率。通过本工艺制的山药多糖是纯多糖，具有生产工艺合理、简单，易于工业化生产的特点，生产的山药多糖可以广泛的应用于各种保健食品及保健药品中。

本发明中所描述的具体实施例仅仅对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采取类似的方式替代，但是并不会偏离本发明的精神或者超越所附权力要求书定义的范围。

Claims (2)

1.一种采用酶法提取的怀山药多糖，其特征在于：它是以怀山药为原料，采用中性蛋白酶酶法提取得到怀山药多糖；中性蛋白酶的提取条件为：怀山药的底物浓度为20%~30%、中性蛋白酶用量为2.0%~3.5%、提取温度为45℃、提取时间为3.0h~4.0h、pH值为 6.0~6.5、中性蛋白酶酶活为120万U/g。

2.如权利要求1所述的采用酶法提取怀山药多糖的提取工艺，其步骤如下：

（1）原料预处理：选取无霉烂、病虫害的怀山药，剔除杂质，洗净；

（2）提取：怀山药的底物浓度为20%~30%、中性蛋白酶用量为2.0%~3.5%、提取温度为45℃、提取时间为3.0h~4.0h、pH值为 6.0~6.5，在提取期间维持提取液pH不变；

（3）粗沉：提取液冷却至室温，4000r/min将提取液离心20min，收集上清液，采用旋转蒸发仪将上清液浓缩体积，加入四倍于浓缩后上清液体积的无水乙醇溶液，过夜，4000r/min离心沉淀，沉淀即为粗水溶性怀山药多糖；

（4）精制：将粗多糖复溶于水，加入三氯乙酸至浓度为15%，摇匀，静置过夜，离心，沉淀为蛋白质，上清液为多糖，将上清液浓缩，加入四倍浓缩后上清液体积的无水乙醇溶液，摇匀，静置过夜，沉淀即为精制后的怀山药多糖。

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