CN102577983A - 五节芒快速繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了五节芒快速繁殖方法，以五节芒的幼穗为外植体，选用五节芒处于颖花原基形成期的幼穗，灭菌，切成穗段，接种在愈伤组织诱导培养基：MS+2.0-6.0mg/L 2，4-D+0-0.2mg/L 6-BA，250-300lux光照下，24±2℃培养，7天左右产生愈伤组织；愈伤组织接种在分化培养基MS+1.0-4.0mg/L 6-BA，2000lux光照下，温度24±2℃培养，直至形成丛生芽，增殖系数为4以上；以MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/L IBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根，生根率达95％以上，只需35天左右形成完整植株。

Description

五节芒快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，涉及植物组织工程技术，具体地说是一种五节芒的组织快繁方法。
背景技术
五节芒(Miscanthus floridulus)属于禾本科(Poaceae)芒属(Miscanthus Andersson)(陈守良，1997)，是一种高光效的C4植物，具有生物质产量高、抗逆性强、纤维素含量高、燃烧充分等特点，被认为是一种开发潜力巨大的生物质能源植物，在我国主要分布在热带和亚热带地区(萧运峰，1995)。目前，五节芒在组织培养有少量报道，胡恒康等(植物生理学通讯，2009)利用种子为外植体，萌发的小苗切去胚根诱导出丛生芽。刁英等在一种芒属植物五节芒体胚组培快速繁殖方法中，以幼穗为外植体，诱导胚性愈伤组织，幼穗取材长度及消毒方法与本发明不同，并且本发明诱导愈伤组织过程中使用的培养基等均未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种五节芒的快速繁殖方法。
五节芒快速繁殖方法，包括如下步骤：
1)外植体的选择与灭菌：选用五节芒的幼穗，将幼穗外包裹的多层叶或叶鞘去除，仅保留幼穗外的旗叶，用无菌水清洗3～4次后，在无菌操作台上用70％酒精处理15-30秒，再用0.1％的升汞消毒18～20分钟，用无菌水冲洗6～7次备用；
2)胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后带旗叶的幼穗，在超净台剥去旗叶，将幼穗切成穗段，接种在MS+2.0-6.0mg/L 2，4-D+0-0.2mg/L 6-BA的愈伤组织诱导培养基；在250-300lux光照下培养，保持温度24±2℃，诱导产生愈伤组织；(6-8天左右产生愈伤组织)；
3)丛生芽诱导及增殖：愈伤组织接种在MS+1.0-4.0mg/L 6-BA的分化培养基；在2000lux光照下培养，保持温度24±2℃，直至形成丛生芽；增殖系数为4以上；
4)生根培养：以MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/L IBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根。生根率达95％以上。
步骤1)中所述外植体的选择取幼穗时叶枕距为0-2cm。
步骤1)中所述的外植体选用五节芒处于颖花原基形成期的幼穗。
步骤2)中将幼穗切成0.3-0.5cm长度的穗段。
步骤2)中接种瓶(5.6×6.9×9.1cm(口径×胸径×高))内每瓶接种2-5个穗段。
步骤3)中愈伤组织生长至直径0.5-0.8cm，挑选淡黄色并致密的愈伤组织，接种在分化培养基。
本发明提出的五节芒的组织培养方法，采用幼穗外植体，保证了遗传稳定性；避免幼穗直接与酒精和升汞接触，以免幼穗褐化，降低出愈率；同时，本发明方法仅需35天左右形成完整植株，3～5个月内可获得大量完整植株。
附图说明
图1为五节芒幼穗诱导愈伤组织的图片；
图2为五节芒胚性愈伤组织分化的图片；
图3为五节芒增殖培养的图片；
图4为五节芒生根培养的图片。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1
取材：五节芒(M.floridulus)02117采自湖南郴州，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃内。
1、外植体的选择与灭菌：选用五节芒优良单株，切取叶枕距为0的处于颖花原基形成期的幼穗。首先将幼穗外部叶清除干净，仅留旗叶，用无菌水清洗3次后，在无菌操作台上用70％酒精处理15秒左右，再用0.1％的升汞消毒18分钟，用无菌水冲洗6次备用；
2、胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后带旗叶的幼穗，在超净台上去除旗叶，将幼穗切成0.3cm左右的穗段，接种在愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D2.0mg/L+6-BA0.1mg/L。接种瓶内每瓶接种5个穗段，在培养室下300lux光照，保持温度24±2℃，培养7天左右诱导出愈伤组织；
3、丛生芽诱导及增殖：愈伤组织生长至直径为0.5cm左右，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织，接种在MS+6-BA2.0mg/L的分化培养基。在2000lux光照下培养，保持温度24+2℃，直至形成丛生芽，增殖系数为4.6以上；在生根培养基：MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/LIBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根，生根率达95％以上，只需35天左右形成完整植株；
4、试管苗的移栽：选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移栽到天然泥土中，注意保水保湿，移栽1个月后，移栽成活率达到90％以上。
实施例2
取材：五节芒(M.floridulus)04405采自安徽马鞍山，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃内。
1、外植体的选择与灭菌：选用五节芒优良单株，切取叶枕距为1.5cm的幼穗。首先将幼穗外部叶清除干净，仅留旗叶，用无菌水清洗4次后，在无菌操作台上用70％酒精处理20秒左右，再用0.1％的升汞消毒20分钟，用无菌水冲洗6次备用；
2、胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后带旗叶的幼穗，在超净台上去除旗叶，将幼穗切成0.4cm左右的穗段，接种在愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D4.0mg/L+6-BA0.2mg/L。接种瓶内每瓶接种4个穗段，在培养室下250lux光照，保持温度24±2℃，培养7天左右诱导出愈伤组织；
3、丛生芽诱导及增殖：愈伤组织生长至直径为0.7cm左右，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织，接种在MS+6-BA4.0mg/L的分化培养基。在2000lux光照下培养，保持温度24+2℃，直至形成丛生芽，增殖系数为4.8以上；在生根培养基：MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/LIBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根，生根率达95％以上，只需35天左右形成完整植株；
4、试管苗的移栽：选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移栽到天然泥土中，注意保水保湿，移栽1个月后，移栽成活率达到90％以上。
实施例3
取材：五节芒(M.floridulus)02155采自湖南常德，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃内。
1、外植体的选择与灭菌：选用五节芒优良单株，切取叶枕距为2cm的处于颖花原基形成期的幼穗。首先将幼穗外部叶清除干净，仅留旗叶，用无菌水清洗4次后，在无菌操作台上用70％酒精处理30秒左右，再用0.1％的升汞消毒20分钟，用无菌水冲洗7次备用；
2、胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后带旗叶的幼穗，在超净台上去除旗叶，将幼穗切成0.5cm左右的穗段，接种在愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D6.0mg/L+6-BA0mg/L。接种瓶内每瓶接种3个穗段，在培养室下250lux光照，保持温度24±2℃，培养7天左右诱导出愈伤组织；
3、丛生芽诱导及增殖：愈伤组织生长至直径为0.8cm左右，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织，接种在MS+6-BA4.0mg/L的分化培养基。在2000lux光照下培养，保持温度24±2℃，直至形成丛生芽，增殖系数为4.2以上；在生根培养基：MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/LIBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根，生根率达95％以上，只需35天左右形成完整植株；
4、试管苗的移栽：选取根系生长良好的试管苗，放入清水中把根部的琼脂清洗干净，移栽到天然泥土中，注意保水保湿，移栽1个月后，移栽成活率达到90％以上。

Claims (6)

1.五节芒快速繁殖方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)外植体的选择与灭菌：选用五节芒的幼穗，将幼穗外包裹的多层叶或叶鞘去除，仅保留幼穗外的旗叶，用无菌水清洗3～4次后，在无菌操作台上用70％酒精处理15-30秒，再用0.1％的升汞消毒18～20分钟，用无菌水冲洗6～7次备用；
2)胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后带旗叶的幼穗，在超净台剥去旗叶，将幼穗切成穗段，接种在MS+2.0-6.0mg/L 2，4-D+0-0.2mg/L 6-BA的愈伤组织诱导培养基；在250-300lux光照下培养，保持温度24±2℃，诱导产生愈伤组织；
3)丛生芽诱导及增殖：愈伤组织接种在MS+1.0-4.0mg/L 6-BA的分化培养基；在2000lux光照下培养，保持温度24±2℃，直至形成丛生芽；
4)生根培养：以MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/L IBA+1.0mg/L CCC诱导芽和根。
2.根据权利要求1所述的五节芒快速繁殖方法，其特征在于，步骤1)中所述外植体的选择取幼穗时叶枕距为0-2cm。
3.根据权利要求1或2所述的五节芒快速繁殖方法，其特征在于，
步骤1)中所述的外植体选用五节芒处于颖花原基形成期的幼穗。
4.根据权利要求1所述的五节芒快速繁殖方法，其特征在于，
步骤2)中将幼穗切成0.3-0.5cm长度的穗段。
5.根据权利要求1或4所述的五节芒快速繁殖方法，其特征在于，
步骤2)中接种瓶内每瓶接种2-5个穗段。
6.根据权利要求1所述的五节芒快速繁殖方法，其特征在于，
步骤3)中愈伤组织生长至直径0.5-0.8cm，挑选淡黄色并致密的愈伤组织，接种在分化培养基。
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