CN102559521A - 一种提高粘红酵母生物量的培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高粘红酵母生物量的培养基及其发酵粘红酵母的方法，是将麦芽汁培养基离心后，保留上清液，再将沉淀部分重新溶解，将溶解部分与前一步离心后的上清液合并作为粘红酵母的培养基，在温度25-33℃、转速120-160r/min条件下培养96-192h，发酵粘红酵母，结果发现粘红酵母的生物量比传统方法的生物量增加70％～100％，本发明方法具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体地，涉及一种提高粘红酵母生物量的培养基及其应用。
背景技术
粘红酵母(Rhodotorula glutinis)是产油微生物种类之一，其含油量25％～40％以上。近年来，全球面临应对气候变化、能源危机的挑战，生物燃料包括微生物油脂成为研究热点之一，对于粘红酵母的研究也倍受关注。粘红酵母产油量的多少取决于两个方面，一是粘红酵母的含油量，二是其生物量。生物量的提高是粘红酵母在发酵过程中细胞快速增殖的结果，说明培养基更适合其生长。粘红酵母在实际应用中，如生产油脂或提取生理活性物质，只有高的生物量才有提取应用的物质基础，如何提高粘红酵母的生物量是研究者和产业界追求的热点。因此，研究提高粘红酵母生物量的方法对研究其生物学特性和生产应用均具有重要的价值。
粘红酵母传统培养方法是应用葡萄糖培养基和麦芽汁培养基。葡萄糖培养基配制比较复杂，需要有机物和无机物十余种，而麦芽汁培养基配制简单，即将麦芽浸粉水溶，离心后的上清液就是粘红酵母培养基。以往将其离心沉淀部分废弃，这不仅浪费了资源而且也增加了培养成本。这两者培养基的共同特点是细胞增殖速率较慢，难以适应粘红酵母的工业化生产，因此，研究一种提高粘红酵母生物量的方法势在必行，具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高粘红酵母生物量的培养基及其制备方法和应用；
本发明的另一个目的在于提供一种提高粘红酵母生物量的方法。
粘红酵母细胞圆形、卵形或长形。多边芽殖，有明显的红色或黄色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落。在麦芽汁斜面上培养一个月以上，菌苔颜色呈现珊瑚红到橙红或微带橘红色。常因由荚膜而形成粘质状菌落，产β-胡萝卜素和L-苯丙氨酸。空气、水、花、土壤、鳟鱼肠道、泡菜水等处均可分离到粘红酵母。
本发明使用的粘红酵母菌种购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 2.704。
本发明提供的粘红酵母培养基，通过以下步骤制备：
(1)将麦芽浸粉溶于蒸馏水中，离心，取上清液进行高压灭菌；
(2)将步骤(1)中的离心沉淀物和灭菌过程中形成的沉淀物合并，用蒸流水搅拌或超声波处理，再离心，取上清液与步骤(1)的上清液合并，调节溶液pH值5.0-5.5，经高压再次灭菌，得到粘红酵母培养基。
具体地，所述步骤(1)麦芽浸粉与蒸馏水的质量体积比为100g/L。
所述步骤(1)离心条件为3000～6000r/min离心15～20min。
所述步骤(2)对合并的沉淀物用2-5倍体积量的蒸流水800～2600r/min搅拌20min～60min或400～900W超声波处理15-20min，3000～6000r/min离心15～20min后的上清液与步骤(1)的上清液合并，得到粘红酵母培养基。
所述步骤(2)对合并的沉淀物用4倍体积量的蒸流水1500r/min搅拌30min或800W超声波处理15min，4000r/min离心20min后的上清液与步骤(1)的上清液合并，调节溶液pH值5.3，得到粘红酵母培养基。
在本发明的一个实施例中所用的超声波细胞粉碎仪额定频率为18～22KHz，本领域技术人员可以通过调节超声波仪的功率来控制超声处理的强度。
本发明提供了一种提高粘红酵母生物量的方法，是将粘红酵母接种于本发明的粘红酵母培养基上，置于摇床中进行培养。
本发明提供的粘红酵母培养基1L中接种浓度为50×106～80×106个/ml的粘红酵母50ml。
本发明提供的粘红酵母培养基1L中接种浓度为70×106个/ml的粘红酵母50ml。
具体地，培养温度为25～33℃；摇床转速为120～160r/min；培养时间为96～192h。
优选地，培养温度为30℃。
优选地，摇床转速为140r/min。
优选地，培养时间为144h。
本发明提供了上述培养基在提高粘红酵母生物量中的应用。
本发明提供了上述发酵方法在提高粘红酵母生物量中的应用。
本发明还提供了上述培养基和培养方法在生物发酵中的应用。
本发明是将传统的麦芽汁培养基配制过程中，废弃沉淀的部分经过高速搅拌和超声波处理使其进一步的溶解。高速搅拌和超声波处理是广泛应用在化学等相关领域常用的方法，本发明的本质就是用最普通的方法处理传统麦芽汁配制过程中废弃的部分，使其培养基的营养组份更加全面，使原本没有外力难以溶解的物质从而溶解出来，部分大分子转化成小分子物质，更利于粘红酵母的吸收和利用，获得了粘红酵母生长因子，从而达到了大幅度提高了其生物量的效果。
本发明提供的粘红酵母培养基和发酵方法能够大幅度降低粘红酵母规模化培养的成本，又能获得大量的粘红酵母生物量，利用本发明方法培养粘红酵母的生物量比用传统法方法培养的生物量增加70％～100％以上。
附图说明
图1为不同培养基对粘红酵母生物量的影响图，其中横坐标1为麦芽汁培养基，2为葡萄糖培养基，3为实施例1制得的培养基，4为实施例2制得的培养基，5为实施例3制得的培养基，纵坐标代表培养基发酵粘红酵母结束后测得的粘红酵母生物量。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1粘红酵母培养基制备
(1)将100g麦芽浸粉溶于1L蒸馏水中，4000r/min离心15min，滤纸过滤，将上清液1×105Pa高压灭菌15min；
(2)将步骤(1)中的离心沉淀物和灭菌过程中形成的沉淀物合并，用4倍体积量的蒸流水进行高速2600r/min搅拌30min，离心4000r/min 20min后的上清液与步骤(1)离心的上清液合并，调节溶液pH值5.0，然后经1×105Pa高压再次灭菌15min，得到粘红酵母培养基。
实施例2粘红酵母培养基制备
(1)将100g麦芽浸粉溶于1L蒸馏水中，3000r/min离心15min，滤纸过滤，将上清液1×105Pa高压灭菌30min；
(2)将步骤(1)中的离心沉淀物和灭菌过程中形成的沉淀物合并，用2倍体积量的蒸流水超声波800W处理15min，3000r/min离心15min后的上清液与步骤(1)离心的上清液合并，调节溶液pH值5.5，然后经1×105Pa高压再次灭菌30min，得到粘红酵母培养基。
实施例3粘红酵母培养基制备
(1)将100g麦芽浸粉溶于1L蒸馏水中，6000r/min离心15min，滤纸过滤，将上清液1×105Pa高压灭菌20min；
(2)将步骤1)中的离心沉淀物和灭菌过程中形成的沉淀物合并，用5倍体积量的蒸流水进行高速800r/min搅拌60min，6000r/min离心15min后的上清液与步骤(1)离心的上清液合并，调节溶液pH值5.3，然后经1×105Pa高压再次灭菌20min，得到粘红酵母培养基。
实施例4粘红酵母菌种的发酵培养
1、从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的粘红酵母菌种(编号：CGMCC2.704)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，将安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.3mL 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.1mL菌体悬浮液加至斜面培养基中，33℃恒温培养40h。
2、粘红酵母菌种扩大培养
在容量为250mL的三角瓶中装200mL实施例1制得的培养基，用接种针接种一环已恢复活性的粘红酵母，约(1×108～2×108个/ml)个粘红酵母菌，在温度25℃，120r/min条件下振荡培养24h。
3、粘红酵母菌种摇瓶培养方法
取扩大培养的粘红酵母50×106个/ml，约为10mL分别加入到实施例1制得的200mL培养基中，在温度25℃、pH值5.0的培养基，在160r/min的摇床转速条件下培养192h。
实施例5粘红酵母菌种的发酵培养
1、从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的粘红酵母菌种(编号：CGMCC2.704)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，将安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5mL 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2mL菌体悬浮液加至斜面培养基中，30℃恒温培养48h。
2、粘红酵母菌种扩大培养
在容量为250mL的三角瓶中装200mL实施例2制得的培养基，用接种针接种一环已恢复活性的粘红酵母，约(1×108～2×108个/ml)个粘红酵母菌，在温度30℃，140r/min条件下振荡培养24h。
3、粘红酵母菌种摇瓶培养方法
取扩大培养的粘红酵母70×106个/ml，约为10mL分别加入到实施例2制得的200mL培养基中，在温度30℃、pH值5.0的培养基，在140r/min的摇床转速条件下培养144h。
实施例6粘红酵母菌种的发酵培养
1、从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的粘红酵母菌种(编号：CGMCC2.704)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，将安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.4mL 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2mL菌体悬浮液加至斜面培养基中，30℃恒温培养48h。
2、粘红酵母菌种扩大培养
在容量为250mL的三角瓶中装200mL实施例3制得的培养基，用接种针接种一环已恢复活性的粘红酵母，约(1×108～2×108个/ml)个粘红酵母菌，在温度28℃，160r/min条件下振荡培养24h。
3、粘红酵母菌种摇瓶培养方法
取扩大培养的粘红酵母80×106个/ml，约为10mL分别加入到实施例3制得的200mL培养基中，在温度33℃、pH值5.0的培养基，在120r/min的摇床转速条件下培养96h。
实施例7粘红酵母生物量测定
对实施例4-6中分别采用实施例1-3制得的培养基进行发酵获得的粘红酵母进行生物量测定。取实施例4-6发酵结束后的粘红酵母菌液40mL，在4000r/min的条件下离心10min，除去上清液，将沉淀物在80℃的温度下真空干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温后称重。即得单位体积菌液干物质的重量为粘红酵母的生物量。按着该生物量测定方法，测定结果见图1，结果发现用实施例2制得的培养基比麦芽汁培养基的生物量增加约为100.08％、实施例1、3制得的培养基比麦芽汁培养基的生物量增加约为83.33％和71.43％，也比葡萄糖培养基发酵粘红酵母的生物量增加明显。
选用本发明实施例1、实施例2、实施例3制得的培养基进行相同的粘红酵母培养实验，结果说明使用本发明提供的的粘红酵母培养基进行粘红酵母的发酵培养，能够有效提高粘红酵母的生物量。
Claims (10)
1.一种提高粘红酵母生物量的培养基，通过以下步骤制备：
1)将麦芽浸粉溶于蒸馏水中，离心，取上清液进行高压灭菌；
2)将步骤1)中的离心沉淀物和灭菌过程中形成的沉淀物合并，用蒸流水搅拌或超声波处理，再离心，取上清液与步骤1)的上清液合并，调节溶液pH值5.0-5.5，经高压再次灭菌，得到粘红酵母培养基。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述步骤1)麦芽浸粉与蒸馏水的质量体积比为100g/L。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述步骤1)离心条件为3000～6000r/min离心15～30min。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述步骤2)对合并的沉淀物用2-5倍体积量的蒸流水800～2600r/min搅拌20min～60min或400～900W超声波处理15-20min，3000～6000r/min离心15～20min后的上清液与步骤1)的上清液合并，得到粘红酵母培养基。
5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述步骤2)对合并的沉淀物用4倍体积量的蒸流水1500r/min搅拌30min或800W超声波处理15min，4000r/min离心20min后的上清液与步骤1)的上清液合并，调节溶液pH值5.3，得到粘红酵母培养基。
6.一种提高粘红酵母生物量的方法，其特征在于，在权利要求1-5任一所述的粘红酵母培养基上接种粘红酵母，置于摇床中进行培养。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，1L权利要求1-5任一所述的培养基中接种浓度为50×106～80×106个/ml的粘红酵母50ml。
8.如权利要求6所述的方法，其培养条件为：温度为25～33℃，摇床转速为120～160r/min，培养时间为96～192h。
9.如权利要求6-8任一所述的方法，其培养温度为30℃，摇床转速为140r/min，培养时间为144h。
10.权利要求1-5任一所述的培养基在提高粘红酵母生物量中的应用。
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| CN103409449A (zh) * | 2012-09-18 | 2013-11-27 | 江南大学 | 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达方法 |
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| CN102100260A (zh) * | 2010-12-03 | 2011-06-22 | 滨州学院 | 酵母油脂及其制备方法和应用 |
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