一类新型的Exendin-4类似物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域,具体而言涉及一类新型的治疗糖尿病的Exendin-4类似物及制备方法。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种肠促胰岛素,在体内由肠道L细胞分泌,并由胰高血糖素基因转录、翻译及加工而成。肠腔内的营养物质如葡萄糖、脂肪等能直接刺激GLP-1的释放。GLP-1分子有多种分子形式,其中GLP-1(7-36)介导80%的生物活性。GLP-1在体内的生物功能主要有:保护胰岛β细胞,促进β细胞分泌胰岛素,并且是已知的诱导胰岛素分泌能力最强的物质;增强胰岛素受体的敏感性;降低食欲减缓胃排空;呈葡萄糖依赖性降低血糖,不会引起低血糖。但是GLP-1的半衰期很短,生理条件下只有2-6分钟,其N端2Ala是二肽基肽酶(DPPIV)的水解位点,这就极大地限制了GLP-1的临床应用。
而外端素(Exendin-4)是从生活在北美洲西南部的吉拉毒蜥(Gila monster,Helodermasuspectum)唾液腺中分离出来的GLP-1类似物。Exendin-4由39个氨基酸组成,分子式C184H282N50O60S,分子量4187.61。其氨基酸序列如下:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
Exendin-4与GLP-1有53%的序列同源性,其N端同源性达到80%。试验发现Exendin-4也能激活GLP-1受体(GLP-1R),活性与GLP-1相似。GLP-1R是一个7次跨膜蛋白,属于G蛋白偶联受体B家族,是一种具有选择性和组织特异性的蛋白。Exendin-4与GLP-1R结合后,诱导第二信使cAMP合成增加,激活cAMP依赖的蛋白激酶,控制胰岛素释放的相关蛋白磷酸化;同时引起细胞膜去极化,导致ATP依赖的K+通道开放,L型Ca2+通道开放,Ca2+内流,细胞内Ca2+浓度增加,刺激β细胞分泌胰岛素,从而降低血糖,但Exendin-4降血糖的作用机制是葡萄糖依赖的,当血浆中葡萄糖含量减少时,会引起负反馈,使得胰岛素分泌减少,从而不会造成低血糖。
但在Exendin-4序列中不包含GLP-1序列中的DPPIV水解位点,此外Exendin-4的C端多了9个氨基酸PSSGAPPPS,形成Trp-Cage结构,增加了Exendin-4的稳定性和GLP-1R结合活性。因此在体内,Exendin-4的半衰期比GLP-1要长,为9.57h。
近年来关于Exendin-4类似物的研究成为热点。已经上市的有礼来公司和安米林公司共同开发的艾塞那肽(SEQ ID NO:1),它是C端酰胺化的Exendin-4。尽管艾塞那肽在体内的稳定性较GLP-1的有很大的提高,但是其序列中的第14位甲硫氨酸和第25位色氨酸易氧化,原料的稳定性较差,不利于制备稳定的制剂。
发明内容
本发明涉及的一类新型的Exendin-4类似物,所述类似物具有以下通式序列:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-XXa14-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-XXa25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Xaa39(SEQ ID NO:2)
其中Xaa14代表第14位氨基酸,选自D-Met、β-Met、β-D-Met、Ala、D-Ala、β-Ala、β-D-Ala、Nle、D-Nle、β-Nle、β-D-Nle、Nva、D-Nva、β-Nva、β-D-Nva、D-Val、β-Val、β-D-Val、D-Ile、β-Ile、β-D-Ile、D-Leu、β-Leu或β-D-Leu中的一种,其中优选Nle,Nva,D-Met,D-Nle,D-Val,β-Leu,β-Ile或β-Val,最优选D-Met,Nle,Nva或β-Leu;
其中Xaa25代表第25位氨基酸,选自D-Trp、β-Trp、β-D-Trp、1-NaI、1-D-NaI、β-1-NaI、β-1-D-NaI、2-NaI、2-D-NaI、β-2-NaI、β-2-D-NaI、Bip、D-Bip、β-Bip、β-D-Bip、Cha、D-Cha、β-Cha、β-D-Cha、Pal、D-Pal、β-Pal、β-D-Pal、Bta、D-Bta、β-Bta或β-D-Bta中的一种,其中优选Bip,Cha,Pal,Bta,D-Trp,1-NaI,2-NaI或2-D-NaI,最优选D-Trp,1-NaI,2-NaI或2-D-NaI;
其中Xaa39代表第39位氨基酸,选自Ser或Ser-NH2。
作为一种优选方案Xaa14选自Nle,Nva,D-Met,D-Nle,D-Val,β-Leu,β-Ile或β-Val;Xaa25选自Bip,Cha,Pal,Bta,D-Trp,1-NaI,2-NaI或2-D-NaI;Xaa39选自Ser或Ser-NH2。
作为一种更优选的方案Xaa14选自D-Met,Nle,Nva或β-Leu;Xaa25选自D-Trp,1-NaI,2-NaI或2-D-NaI;Xaa39选自Ser或Ser-NH2。
本发明所涉及的氨基酸若不特别限定D或L,代表L型氨基酸。若不特别限定α或β,代表α型氨基酸。
本发明所涉及的多肽序列中Ser-NH2代表酰胺化的丝氨酸。
本发明所涉及的天然氨基端对应的三字母代码如表1所示:
表l:天然氨基酸三字母代码表
本发明所涉及的非天然氨基酸对应的三字母代码及其结构如表2所示:
表2:非天然氨基酸三字母代码及其结构
本发明的一个优选的实施例中公开了Exendin-4类似物,其氨基酸序列如下:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-2-NaI-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(SEQ ID NO:3)
本发明的另一个优选的实施例中公开了Exendin-4类似物,其氨基酸序列如下:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-1-Nal-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO:6)
本发明的又一个优选的实施例中公开了Exendin-4类似物,其氨基酸序列如下:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-2-D-Nal-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO:8)
本发明的又一个优选的实施例中公开了Exendin-4类似物,其氨基酸序列入下:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-D-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-2-Nal-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(SEQ ID NO:11)
本发明还有一个目的是提供上述Exendin-4类似物的合成方法。
本发明一个显而易见的优势在于所涉及的Exendin-4类似物可以通过本领域常规的多肽固相化学合成技术制备。
制备步骤如下:
(1)在树脂上固相合成多肽;
(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解,优选三氟乙酸,并加入侧链保护基清除剂,然后与5-20倍体积比的冰乙醚混合,沉淀多肽,离心,干燥得到粗肽;
若本发明所涉及的多肽C末端为丝氨酸的羧酸形式则步骤(1)采用偶联Ser的Wang树脂进行合成,若本发明所涉及的多肽C末端为丝氨酸的酰胺形式则步骤(1)采用Rink AmideMBHA树脂进行合成。
步骤(1)是在液相环境中进行,具体包括:浸泡树脂-脱除氨基保护基-洗涤-监测-偶联氨基酸-监测-洗涤-脱除氨基保护基(顺序连接其余氨基酸)-干燥树脂。
其中氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基选自:叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)和9-芴基-甲基羰基(Fmoc),优选9-芴基-甲基羰基(Fmoc)。
作为固相多肽合成技术的一个优势,对部分氨基酸的侧链可以通过引入化学基团进行保护,例如Arg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf);His、Gln、Asn可以采用三苯甲基(Trt);Lys可以采用叔丁氧羰基(Boc);Thr、Ser可以采用叔丁基(tBu);Asp、Glu可以采用叔丁酯(Otbu)。所述的保护基团不限于此,可以根据本领域常规方案进行合理选择。
步骤(1)的液相环境所用溶剂选自:二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM),优选DMF。
步骤(1)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂,氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液,浓度10-40%(PIP/DMF),脱除时间为20-50min。优选浓度为20-25%(PIP/DMF),脱除时间25-35min。
步骤(1)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂,偶联试剂由:碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂与1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。
碳二亚胺型试剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)及N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。
苯并三氮唑鎓盐型试剂包括2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)等。
偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)与1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)与1-羟基苯并三唑(HOBt),最优选DIC(二异丙基碳二亚胺)与1-羟基苯并三唑(HOBt)。
步骤(1)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
步骤(1)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。
步骤(2)所述的侧链保护基清除剂是选自如茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、乙二硫醇、间甲酚等两个或者两个以上的组合并以三氟乙酸或氢氟酸按5-20%(V/V)进行配制得到。优选三氟乙酸(TFA)∶茴香硫醚∶三异丙基硅烷∶苯酚∶水=85∶5∶5∶3∶2。
特别有益的是为满足医药用途的质量要求,本发明所提供多肽制备方法还可以采用常规手段进行纯化。所采用的纯化方法可以为反相色谱法或离子交换色谱法,优选反相色谱法。
本发明所述的Exendin-4类似物可以通过非胃肠道途径给予生物体,优选静脉内注射、皮下注射、肌肉注射或适合粘膜吸收的给药方式给予生物体。
本发明适合以无菌冻干物形式储存,在给药前以适当的剂量与合适的等渗溶液混合。
本发明的还有一个目的是提供所述Exendin-4类似物在降低血糖方面的作用。试验证实本发明多肽不仅具有强的降血糖活性及抗DPPIV酶的稳定性,而且较艾塞那肽相比,原料抗氧化的能力大幅度增加。本领域技术人员知道,制约肽类化合物形成适于使用、储存的药物制剂的一个重要原因是易被氧化变质。因此本发明多肽可以作为活性成分制备稳定制剂在临床上用于糖尿病的治疗。
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面,不是本发明主题的局限。
具体实施方式
实施例1
[Nle14,2-NaI25]-Exendin-4-NH2的制备
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-2-Nal-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(SEQ ID NO:3)
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂,取代值0.41mmol/g。
所需带保护的氨基酸Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-L-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-L-Nle-OH和Fmoc-L-2-Nal-OH。
试剂:HOBt、DIC、DMF、哌啶。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters高效液相色谱仪、磁力搅拌器。
(3)操作步骤(以0.25mmol为例)
a.固相化学合成多肽
称取Rink Amide MBHA树脂0.61g,置于多肽合成仪的反应器中,加入10mLDMF,浸泡2h,然后加入20%PIP/DMF溶液15mL,混合30min来脱除氨基保护剂,用DMF洗涤树脂7次,然后向反应器中加入383.4mg Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、等摩尔的偶联试剂DIC(0.33mol/L)与HOBt(0.33mol/L)进行反应,反应温度为室温,以茚三酮反应监测反应进程,确保氨基酸偶联到树脂上,用DMF洗涤树脂7次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后,即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应,如此循环,直至第39个氨基酸偶联完成。
b.裂解及沉淀
肽合成结束后,真空干燥树脂,称重。按照1g树脂7mL裂解试剂的比例加入裂解试剂,试剂配比为TFA∶茴香硫醚∶三异丙基硅烷∶苯酚∶水=85∶5∶5∶3∶2,室温搅拌反应3小时,抽滤。接着向裂解抽滤液中,以10倍体积加入冰乙醚,沉淀多肽,离心,弃上清,真空干燥,称重粗肽。
c.反相色谱纯化
用制备型HPLC,采用反相色谱法,纯化上述粗肽。
HPLC条件如下:
色谱柱:XBridgeTM Prep C18 5μm OBDTM 19×150mm
流速:10mL/min
流动相:A:含0.1%TFA水溶液
B:含0.1%TFA的乙腈
用20-50%的B相梯度洗脱70min。
纯度为99%
ESI-MS测定的分子量为4179.0。
实施例2
[D-Met14,2-NaI25]-Exendin-4-NH2的制备
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-D-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-2-Nal-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(SEQ ID NO:11)
固相合成操作步骤同实施例1,纯度为97%。ESI-MS测定分子量为4196.9。
实施例3
以类似实施例1的方法制备表3所示的Exendin-4类似物,但本发明所涉及的Exendin-4类似物并不限于此。
表3 C末端酰胺的Exendin-4类似物
实施例4[Nle14,1-NaI25]-Exendin-4
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-1-Nal-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO:6)
(1)材料及试剂
Fmoc-Ser(tBu)-Wang树脂,取代值0.44mmol/g。
所需带保护的氨基酸Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-L-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-L-Nle-OH和Fmoc-L-1-Nal-OH。
试剂:HOBt、DIC、DMF、哌啶。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters高效液相色谱仪、磁力搅拌器。
(3)操作步骤(以0.3mmol为例)
a.固相化学合成多肽
称取Fmoc-Ser(tBu)-Wang树脂0.68g,置于多肽合成仪的反应器中,加入15mLDMF,浸泡3h。然后加入25%PIP/DMF溶液15mL,混合30min来脱除氨基保护剂,用DMF洗涤树脂7次。然后向混合反应器中加入404.8mg Fmoc-L-Pro-OH、等摩尔的偶联试剂HOBt(0.33mol/L)与DIC(0.33mol/L)进行反应,反应温度为室温,以茚三酮反应检测反应进程,确保氨基酸偶联到树脂上。用DMF洗涤树脂7次。当第二个氨基酸偶联到树脂上后,即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应,如此循环,直至第39个氨基酸偶联完成。
b.裂解及沉淀
肽合成结束后,真空干燥树脂,称重。按1g树脂8mL裂解试剂的比例加入裂解试剂,试剂配比为TFA∶茴香硫醚∶三异丙基硅烷∶苯酚∶水=85∶5∶5∶3∶2,室温搅拌反应3小时,抽滤。接着向裂解抽滤液中,以15倍体积加入冰乙醚,沉淀多肽,离心,弃上清,真空干燥,称重粗肽。
c.反相色谱纯化
用制备型HPLC,采用反相色谱法,纯化上述粗肽。
HPLC条件如下:
色谱柱:XBridgeTM Prep C18 5μm OBDTM 19×150mm
流速:10mL/min
流动相:A相:含0.1%TFA水溶液
B相:含0.1%TFA的乙腈
用20-50%B相梯度洗脱70min。
纯度为99%
ESI-MS测定的分子量为4180.3。
实施例5[N]e14,2-D-NaI25]-Exendin-4具有序列肽的制备
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-2-D-Nal-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO:8)
固相合成操作步骤同实施例4,纯度为98%,ESI-MS测定分子量为4180.4。
实施例6
以类似实施例4的方法制备表4所示的Exendin-4类似物,但本发明所涉及的Exendin-4类似物并不限于此。
表4 C末端羧酸的Exendin-4类似物
实施例7体外抗氧化能力测定
将艾塞那肽原料、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11所代表的多肽以0.1%H2O2为溶剂,配制成浓度为0.4mg/mL的肽溶液,然后室温放置,在10分钟及2小时的时候取样,用HPLC分析它们的含量变化及氧化率。
HPLC条件如下:XBridge C18(5μm)4.6×150mm柱,流动相A:0.05%TFA水溶液、B:0.05%TFA的乙腈溶液。洗脱条件是B相梯度从10%到20%洗脱20min,20%到40%洗脱10min,检测波长210nm。
其中主峰面积是由HPLC积分得出。试验结果如表5所示。
表5 Exendin-4类似物与艾塞那肽抗氧化能力比较
从表5中可以看出,用0.1%H2O2处理2小时后,本实施例所制备的Exendin-4类似物的含量均在90%以上且氧化率均不大于5%,而艾塞那肽的含量降到了46%且氧化率高达57%,由此可以看出本实施例所制备的Exendin-4类似物抗氧化能力均强于艾塞那肽原料,有利于制备更稳定的制剂。
实施例8体外抗DPPIV稳定性测定
取适量艾塞那肽原料、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11所代表的多肽分别放入0.1mol/L pH7.4三乙胺-HCl反应缓冲液中,终浓度为25μmol/L,然后分别加入DPPIV酶5mU(2μL),在37℃孵育10-180min,在上述过程中分别在10min、30min、60min、90min、120min及180min取样,取样后用等体积10%TFA终止反应,然后用HPLC分析多肽浓度的变化。
HPLC条件如下:XBridge C18(5μm)4.6×150mm柱分析,流动相A:0.05%TFA水溶液、B:0.05%TFA的乙腈溶液。洗脱条件是B相梯度从10%到20%洗脱20min,20%到40%洗脱10min,检测波长210nm。
试验结果如表6所示。
表6体外DPPIV水解后溶液中的多肽浓度变化(μM)
从表6中可以看出本实施例所制备的Exendin-4类似物在体外具有与艾塞那肽相类似的抗DPPIV酶稳定性
实施例9对正常小鼠血糖水平的影响
取ICR小鼠18只,雌、雄各半,然后按体重随机分成3组,每组6只,分别为:正常对照组、艾塞那肽组(10ug/kg)、SEQ ID NO:11(10ug/kg),按0.05mL/10g SC给药,给药后0.5h、1h及2h后用测得利血糖仪与试纸(台湾测得利公司)测定血糖浓度并以正常对照组为参照,计算0-2h糖耐量曲线下面积(AUC)。
试验结果如表7及表8所示。
表7 0-2h正常小鼠血糖变化
表8 0-2h糖耐量曲线下面积(AUC)
从表7中可以看出,与正常对照组相比,SEQ ID NO:11所代表的多肽在0-0.5h内有明显的降血糖作用,但随着给药时间的延长,SEQ ID NO:11所代表的多肽降血糖作用逐渐减弱,其对中枢神经系统的负反馈响应敏感性更优于艾塞那肽。从表8可以看出,与艾塞那肽组相比,SEQ ID NO:11所代表的多肽在体内具有更长的半衰期,在体内更稳定。
实施例10 NOD小鼠药效试验
取非肥胖糖尿病小鼠(NOD小鼠)36只(体重20±2g),禁食2h。将小鼠随机分成6组,每组6只,分别为:生理盐水组、艾塞那肽组、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:8,然后腹腔注射0.1μg上述物质,并于0.5h、1h、1.5h及2h时用测得利血糖仪与试纸(台湾测得利公司)测定血糖浓度变化,并计算血糖的变化率。
试验结果如表9所示。
表9 0-2h NOD小鼠血糖变化率(%)
从表9可以看出,本发明所制备的Exendin-4类似物均具有很明显的降血糖作用,可以在临床上用作活性成分用于糖尿病的治疗。