CN102517371A - 低温诱导细胞去铺展用于动态测量药物影响细胞铺展的方法 - Google Patents
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Abstract
一种低温诱导细胞去铺展用于动态测量药物影响细胞铺展的方法，其特征是按以下步骤：将处于悬浮状态的贴壁细胞种植在培养孔或板上，在培养箱中孵育，让细胞完全铺展开；加入药物与细胞共孵育20min-1h，随后去除药物；将药物处理的细胞放置于显微镜下，拍摄细胞铺展之前的形貌图像；吸去水溶液，加入4℃的细胞培养液或缓冲液；立即用显微镜动态观察细胞的去铺展状态，每隔几分钟连续获取细胞形貌图像，约持续30min-1h；用软件测量出每个细胞的贴壁面积或者每个时间点所有细胞的贴壁面积平均值；将上述过程得到的数据与空白对照的数据进行比较和分析，得到药物影响细胞铺展的数据。本发明过程简单、对细胞无损伤、检测快速、可动态观察或测量、效果好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，是用于测量各种药物对贴壁细胞铺展状态的影响的方法。
技术背景
细胞铺展是贴壁细胞的重要生理活动或功能之一，许多人体生理活动或疾病与细胞的铺展有关。例如，血管内皮细胞通过细胞的铺展来构建血管内壁或者修补破损的血管内皮层，因此，内皮细胞铺展的改变往往与心血管疾病的产生、发展和肿瘤转移等有关，而药物对细胞铺展的影响也必然是评估药物疗效的体外细胞试验中的重要指标之一。
目前，有直接和间接两种方法来测定药物对细胞铺展状态的影响。前者是将药物直接加入已经铺展完全或铺展中的细胞，再测量药物对细胞铺展的影响；后者是先将药物加入铺展完全的细胞中共同孵育一段时间，然后去除溶液中的药物并用试剂诱导细胞去铺展，再观察细胞再次铺展的能力。
胰蛋白酶常被用作细胞去铺展的试剂。然而，胰蛋白酶对细胞膜表面的各种蛋白有较大的损伤作用，而且还不清楚是否会对细胞的各种生理活动（如细胞铺展等）产生影响，因而，这种生化方法会使得药物影响细胞铺展的研究和分析更加复杂化，迫切需要更加温和、无副作用、同时又有效的细胞去铺展的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种低温诱导细胞去铺展用于动态测量药物影响细胞铺展的方法，本发明简单、快速、温和、有效地诱导细胞去铺展并动态观察和测定药物对细胞铺展状态的影响的方法，以取代胰蛋白酶去铺展的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
（1）将处于悬浮状态的贴壁细胞种植在培养孔或板上，在培养箱中孵育，让细胞完全铺展开。
（2）加入药物与细胞共孵育20min-1h，随后去除药物。
（3）将药物处理的细胞放置于显微镜下，拍摄细胞去铺展之前的形貌图像。
（4）吸去水溶液，加入4℃的细胞培养液或缓冲液。
（5）立即用显微镜动态观察细胞的去铺展状态，每隔几分钟连续获取细胞形貌图像，约持续30min-1h。
（6）用软件测量出每个细胞的贴壁面积或者每个时间点所有细胞的贴壁面积平均值。
（7）将上述过程得到的数据与空白对照的数据进行比较和分析，得到药物影响细胞铺展的数据。
本发明所述的步骤（3）中，所述的显微镜优选能控制温度在37℃的共聚焦显微镜。
本发明的主要特点是。
（1）过程简单。观察或测量前只需加入低温的培养液或缓冲液就可以。
（2）对细胞无损伤。没有添加任何的生物或化学试剂。
（3）检测快速。基本上可以在1小时内测定。而直接测量方法要用时几个小时甚至24小时。
（4）可动态观察或测量。由于用时比较短，可动态观察整个去铺展过程或药物的影响。
（5）有效。实验数据显示（在具体的实施方案中），这种方法可以检测出药物对细胞铺展的影响。
具体实施方案
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
本发明所述的实施例所使用的成像设备为德国产的Carl Zeiss 710激光共聚焦显微镜，其中细胞贴壁面积的测量，是使用该显微镜的面积测量功能（该显微镜自带的LSM 710 Release Version 5.5 sp2软件）。
实施例1：低温诱导细胞去铺展的定量测量。
将悬浮的人脐静脉内皮细胞种植在含有培养液的24孔板上，放置于CO2培养箱（37℃，5% CO2）中培养。培养24小时后，将细胞放置于共聚焦显微镜自带的细胞培养系统中（37℃，5% CO2），用共聚焦显微镜观察并获取某个视野的细胞形貌图像。加入温度为4℃的培养液，立即使用共聚焦显微镜自带的动态观察软件，每隔1分钟自动扫描一次同一个视野的细胞形貌图像。用该显微镜自带的测量软件测量出每个时间点图像中所有单个细胞的贴壁面积并计算出平均值。这里只给出每个5分钟时的数据。计算得出：低温处理前细胞的平均铺展面积为1545.4±368.8 um2； 低温处理后1分钟面积降为1384.7±332.1 um2；随后，前15分钟细胞平均面积迅速分别下降为1239.3±296.0 um2（第5分钟）、1112.7±269.6 um2（第10分钟）、1069.1±245.6 um2（第15分钟）；之后的15分钟基本保持不变，分别为1086.6±258.0 um2（第20分钟）、1078.4±278.9 um2（第25分钟）、1002.6±252.0 um2（第30分钟）。数据显示，细胞在低温处理后发生了去铺展现象，且主要发生在0-15分钟内，下降幅度约为500 um2。
实施例2：低温诱导细胞去铺展用于测量药物对细胞铺展的影响的定量测量。
实验步骤与实验例1基本相同，只是在培养细胞24小时后，将药物（10ug/ml神经节苷脂GM1）加入，与细胞共培育30分钟后去除药物并换新鲜的培养液，将样品放置于显微镜下低温诱导细胞去铺展并动态观察和测量。计算得出：药物处理的细胞在低温处理前的平均铺展面积为1053.9±396.8 um2； 低温处理后1分钟面积为983.8±350.9 um2；此后，每隔5分钟分别为933.0±298.4 um2（第5分钟）、702.9±266.9 um2（第10分钟）、640.7±240.5 um2（第15分钟）、605.5±221.1 um2（第20分钟）、593.5±213.6 um2（第25分钟）、643.9±240.3 um2（第30分钟）。数据显示，药物作用的细胞在低温处理后也发生了去铺展现象，主要发生在5-15分钟内，与对照（实施例1；发生在0-15分钟内）相比稍微滞后；下降幅度约为400 um2，比对照（约500 um2）稍小。数据比对说明了药物GM1能够抑制这种细胞的铺展，这与文献报道的用其它方法得到的结论完全相符。
Claims (2)
1.一种低温诱导细胞去铺展用于动态测量药物影响细胞铺展的方法，其特征是按以下步骤：
（1）将处于悬浮状态的贴壁细胞种植在培养孔或板上，在培养箱中孵育，让细胞完全铺展开；
（2）加入药物与细胞共孵育20min-1h，随后去除药物；
（3）将药物处理的细胞放置于显微镜下，拍摄细胞铺展之前的形貌图像；
（4）吸去水溶液，加入4℃的细胞培养液或缓冲液；
（5）立即用显微镜动态观察细胞的去铺展状态，每隔几分钟连续获取细胞形貌图像，约持续30min-1h；
（6）用软件测量出每个细胞的贴壁面积或者每个时间点所有细胞的贴壁面积平均值；
（7）将上述过程得到的数据与空白对照的数据进行比较和分析，得到药物影响细胞铺展的数据。
2.根据权利要求1所述的低温诱导细胞去铺展用于动态测量药物影响细胞铺展的方法，其特征是步骤（3）中，所述的显微镜选择能控制温度在37℃的共聚焦显微镜。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103823025A (zh) * | 2014-03-04 | 2014-05-28 | 浙江大学宁波理工学院 | 用于细胞的抗冻剂溶液加入或取出程序筛选装置 |
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- 2011-12-08 CN CN201110405992.2A patent/CN102517371B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘民培: "《现代临床实验研究技术》", 30 April 2008, 清华大学出版社 * |
| 张元兴 等: "《动物细胞培养工程》", 31 January 2007, 化学工业出版社 * |
| 李奇 等: "透明质酸在巨噬细胞的分布以及对细胞黏附和迁移的影响", 《解剖学报》 * |
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| CN103823025A (zh) * | 2014-03-04 | 2014-05-28 | 浙江大学宁波理工学院 | 用于细胞的抗冻剂溶液加入或取出程序筛选装置 |
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