CN102362916A

CN102362916A - 保肝中药复方提取物及其制备方法

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Publication number: CN102362916A
Application number: CN2011102913453A
Authority: CN
Inventors: 张宁; 张春蕾; 周琦; 朴成玉; 赵旭; 祁永华; 王发善
Original assignee: 王发善
Current assignee: Zhang Ning
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2031-09-30
Also published as: CN102362916B

Abstract

本发明公开了一种具有保肝作用的中药复方提取物。本发明中的中药复方提取物是以桃仁、白花败酱草、车前子、文冠果种仁、当归、白芍、柴胡和甘草等八种中药为原料，采用二氧化碳超临界萃取技术和大孔吸附树脂富集技术，在一定工艺参数下提取制得的提取物，该提取物具有显著的抗肝损伤作用，该提取物可以直接安全地应用于保肝药物制剂和保健食品的制备。

Description

保肝中药复方提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药复方提取物，具体是涉及一种采用二氧化碳超临界萃取技术和大孔吸附树脂富集技术，以桃仁、白花败酱草、车前子、文冠果种仁、当归、白芍、柴胡和甘草为原料制得的提取物，该提取物具有明显的抗肝损伤作用。本发明还涉及了该提取物在制备保肝药物制剂和保健食品中的应用。

背景技术

肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种病理状态，其中，由病毒型肝炎引起的肝损伤、酒精性肝损伤以及由药物、毒物引起的化学性肝损伤最为常见，肝损伤长期存在往往是导致肝纤维化，甚至肝硬化、肝癌发生的重要使动因素。我国是病毒性肝炎高发区，约有1.2亿人口为乙型肝炎病毒携带者，其中约10％发展为慢性肝炎，会逐渐出现肝损伤以及更严重的病理损害。但是，无论中医还是现代医学均没有直接杀灭患者体内肝炎病毒的良策。所以，防治肝损伤，阻断肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌的发展进程，是治疗病毒型肝炎的有效方法，从而使患者处于终身无症状病毒携带者状态，将会大大延长生命，改善生活质量。另外，在亚洲各国(包括我国)，尽管病毒性肝炎所致的各种肝病占主要地位，但是随着酒类消耗量的增加，人们饮食结构的改变，近年来由酒精所致的肝损害亦呈逐年上升趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因。因此，如何防治酒精性肝损伤也已经成为医学界研究的热点。

现代医学在肝损伤的治疗方面并无特异性药物，多采用休息、加强营养、补充维生素或对症治疗等，严重者甚至被迫终止用药。而中医药历经几千年的发展，通过方剂的用药规律配伍，而辨证组方，其作用既优于西药，而毒性又会明显小于西药。因此，寻找能够有效治疗肝损伤(保肝)的中药组方，并开展现代新药研发，对拓宽肝损伤的防治手段意义重大。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有抗肝损伤作用的中药复方提取物。

本发明另一个目的是提出该中药复方提取物在制备具有保肝作用的药物制剂和保健食品中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

组方药材及比例为：以重量份计，桃仁5份、车前子3份、白花败酱草3份、文冠果种仁3份、当归3份、柴胡3份、白芍2份、甘草1份。

以重量份数计，按照桃仁5份、车前子3份、白花败酱草3份、文冠果种仁3份、当归 3份、柴胡3份、白芍2份、甘草1份，称取各药材适量，混合粉碎，过药典2号筛，药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中，加入夹带剂无水乙醇，用量为0.5ml/g药粉，设定萃取温度为45℃，萃取压力为40MPa，解析I压力为10MPa、温度为40℃，解析II压力为4MPa、温度为25℃，萃取时间为2h，得棕黄色粘稠油状物。再将上一步二氧化碳超临界萃取后的药渣，加入10倍量70％乙醇浸泡12小时，加热回流提取2小时，过滤，再向药渣中再加入5倍量70％乙醇加热回流提取2小时，过滤，合并滤液，减压干燥得浸膏。将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌匀，上样于D-101型大孔吸附树脂柱中(上样量以生药量与树脂量之比计算为1∶2)，静态吸附30分钟，然后依次用10个柱体积的水、10个柱体积的20％乙醇和10个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。将此粉末与二氧化碳超临界萃取制得的棕黄色粘稠油状物混合，即得本发明的中药复方提取物。

作为对上述技术方案的改进和补充：

1、组方中药材的相对量以重量份计，可以按照：桃仁4-6份、车前子2-4份、白花败酱草2-4份、文冠果种仁2-4份、当归2-4份、柴胡2-4份、白芍1-3份、甘草1-2份的比例进行调整。

2、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度可以设定为30-60℃。

3、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取压力可以设定为20-60MPa。

4、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取时间可以设定为1h或以上。

5、在进行二氧化碳超临界萃取时，夹带剂可以为乙醇或浓度为95％以上的乙醇，并且用量可以设定为0.1-1ml/g药粉。

6、在用旋转蒸发仪对二氧化碳超临界萃取液进行减压浓缩回收乙醇时，温度可以设定为45℃或以下。

7、在对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取溶剂可以是30％-100％乙醇。

8、在对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取方式可以是加热回流提取、超声提取或者渗漉提取。

9、在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，使用的柱脂可以是D-101型或者AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂。

10、在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，洗脱溶剂可以是水或不同浓度的乙醇，依照乙醇浓度由低到高依次洗脱。

通过上述技术方案制备得到的提取物，具有明显的抗肝损伤作用，可以用于制备保肝药物制剂和保健食品。

当将上述提取物混合进保肝药物制剂和保健食品时，除这些提取物外，在不防碍本发明效果的范围内，可以根据需要适当混合用于通常的药物制剂和保健食品的其他成分中，例如：交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲淀粉钠、微晶纤维素、乳糖、阿司巴坦、硬脂酸镁等内加辅料、外加辅料和包衣辅料。其型剂可以是任何一种药学上所说的剂型，优选片剂、丸剂、胶囊剂或口服液。

本发明中药复方提取物是药食兼用的纯天然的植物提取物，随后的药效实验将证明，本发明中药复方提取物具有抗肝损伤的作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例和表格，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。为说明方便，以下将本发明提取物简称为TQW。

实施例1(TQW对ConA诱导的肝损伤模型小鼠的保护作用)

ConA诱导的肝损伤与肝炎病毒所致的肝损伤机理相似，本实施例用此模型来验证TQW对病毒型肝炎引起的肝损伤的保护作用。

1材料与方法

1.1材料

清洁级ICR雄性小鼠60只，体重18～20g，4～5周龄，购自黑龙江中医药大学GLP中心。

TQW混悬液：将TQW混悬于蒸馏水中即得。

ConA(刀豆蛋白A)IV型(sigma公司)，临用时在无菌条件下，用0.9％氯化钠注射液配制成0.2％溶液，0.22um微孔滤膜过滤除菌。

联苯双酯片(上海天平制药厂)，临用时配成水混悬液。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、小鼠γ干扰素(IFN-γ)试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2分组、造模与给药

小鼠购买后适应性喂养3天，将60只小鼠随机分为空白组、模型组、联苯双酯组(阳性对照组)和TQW低、中、高剂量组。

于第4日上、下午，第5日上、下午，第6日上午灌胃给药或等体积的蒸馏水0.2mL/只/次(药物用蒸馏水稀释成等体积)，共计5次。TQW低剂量组每次灌胃TQW(30mg/kg体重)，TQW中剂量组每次灌胃TQW(60mg/kg体重)，TQW高剂量组每天灌胃TQW(90mg/kg体重)，联苯双酯组每次灌胃联苯双酯(100mg/kg体重)，空白组和模型组每天灌胃等体积的蒸馏水。

末次给药后4h，禁食不禁水，除空白组尾静脉注射0.9％氯化钠注射液外，其余5组尾静脉注射ConA20mg/kg体重。10h后摘眼球取血，检测各指标。

2实验结果

2.1TQW对ConA所致肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响

结果见表1，与空白组比较，模型组小鼠血清ALT、AST显著升高，说明ConA诱发小鼠肝损伤模型成功。与模型组比较，TQW各组及联苯双酯组ALT、AST显著降低。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

表1 TQW对ConA肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(

n＝10)

注：与模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.2TQW对ConA所致肝损伤小鼠血清IFN-γ和TNF-α的影响

结果见表2，与空白组比较，模型组小鼠血清IFN-γ、TNF-α显著升高，说明ConA诱发小鼠肝损伤模型成功。与模型组比较，TQW各组及联苯双酯组ALT、AST显著降低。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

表2 TQW对ConA肝损伤小鼠血清IFN-γ、TNF-α的影响(

n＝10)

注：与模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.3TQW对ConA所致肝损伤小鼠肝组织病理学的影响

空白组小鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构完整，肝索细胞排列整齐，肝细胞无肿胀、变性、坏死，无淋巴细胞浸润。模型组小鼠肝组织可见肝小叶正常结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，部分肝细胞变性坏死，有细胞水肿现象，并有大量的淋巴细胞浸润，提示造模成功。联苯双酯组趋于空白组，肝小叶结构完整，有个别出现肝细胞点状坏死，有少量炎细胞浸润。TQW高、中、低剂量组不同程度改善，表现为肝细胞结构趋于正常，肿胀程度减轻，淋巴细胞浸润减少。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

3小结

本研究发现TQW能显著减轻ConA所致免疫性小鼠肝损伤，具有明显的保肝作用。

实施例2(TQW对酒精诱导的肝损伤模型小鼠的保护作用)

本实施例采用酒精诱导的肝损伤动物模型来验证TQW对酒精性肝损伤的保护作用。

1材料与方法

1.1材料

TQW混悬液：将TQW混悬于蒸馏水中即得。

60％医用酒精：取95％医用酒精用蒸馏水稀释即得。

联苯双酯片(上海天平制药厂)，临用时配成水混悬液。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、超氧化物岐化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1造模与分组

60只小鼠随机分为空白组、模型组、联苯双酯组(阳性对照组)和TQW低、中、高剂量组，除空白组外各组小鼠每日灌胃60％医用酒精(0.1ml/10g体重)，连续10天，空白组灌胃给予等体积蒸馏水。

1.2.2给药方法

从造模第1天起，TQW低剂量组每天灌胃TQW(30mg/kg体重)，TQW中剂量组每天灌胃TQW(60mg/kg体重)，TQW高剂量组每天灌胃TQW(90mg/kg体重)，联苯双酯组每天灌胃联苯双酯(100mg/kg体重)，空白组和模型组每天灌胃等体积的蒸馏水，连续12d。末次给药后4h摘眼球取血，检测各指标。

2实验结果

2.1TQW对酒精所致肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响

结果见表1，与空白组比较，模型组小鼠血清ALT、AST显著升高，说明酒精诱发小鼠肝损伤模型成功。与模型组比较，TQW各组及联苯双酯组ALT、AST显著降低。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

表1 TQW对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(

n＝10)

注：与模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.2TQW对酒精所致肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA的影响

结果见表2，与空白组比较，模型组小鼠肝组织SOD显著降低、MDA显著升高，说明酒精诱发小鼠肝损伤模型成功。与模型组比较，TQW各组及联苯双酯组SOD显著升高、MDA显著降低。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

表2 TQW对酒精性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA的影响(

n＝10)

注：与模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.3 TQW对酒精所致肝损伤小鼠肝组织病理学的影响

空白组小鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，无淋巴细胞浸润及纤维增生，肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，肝小叶轮廓清晰，肝细胞分界清、无肿胀、变性、坏死，肝细胞核圆而清晰，核位于细胞中央，胞质丰富。模型组小鼠肝组织可见肝小叶正常结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，胞质疏松，胞质内可见大小不一的脂滴空泡，部分肝细胞变性坏死，有细胞水肿现象，汇管区有大量淋巴细胞浸润，提示造模成功。联苯双酯组趋于空白组，肝小叶结构完整，有个别出现肝细胞点状坏死，少量淋巴细胞浸润。TQW高、中、低剂量组不同程度改善，表现为肝组织结构趋于正常，肝细胞肿胀程度减轻，淋巴细胞浸润减少。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

3小结

本研究发现TQW能显著减轻酒精所致小鼠肝损伤，具有明显的保肝作用。

实施例3(TQW对CCl₄诱导的肝损伤模型大鼠的保护作用)

CCl₄肝损伤大鼠模型是目前公认的化学性肝损伤动物模型，本实施例用此模型来验证TQW对化学性肝损伤的保护作用。

1材料与方法

1.1材料

清洁级Wistar大鼠60只，体重180～220g，雌雄各半，6～8周龄，购自黑龙江中医药大学GLP中心。

TQW混悬液：将TQW混悬于蒸馏水中即得。

联苯双酯片(上海天平制药厂)，临用时配成水混悬液。

CCl₄(沈阳化学试剂厂)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、超氧化物岐化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1造模与分组

60只大鼠随机分为空白组、模型组、联苯双酯组(阳性对照组)和TQW低、中、高剂量组，除空白组外各组大鼠皮下注射40％CCl₄橄榄油溶液2mL/kg体重，每2天1次，共注射6次，首次皮下注射40％CCl₄橄榄油溶液4mL/kg体重，空白组皮下注射等体积的橄榄油。

1.2.2给药方法

从造模第1天起，TQW低剂量组每天灌胃TQW(15mg/kg体重)，TQW中剂量组每天灌胃TQW(30mg/kg体重)，TQW高剂量组每天灌胃TQW(45mg/kg体重)，联苯双酯组每天灌胃联苯双酯(50mg/kg体重)，空白组和模型组每天灌胃等体积的蒸馏水，连续15d。末次给药后4h摘眼球取血，检测各指标。

2实验结果

2.1TQW对CCl₄所致肝损伤大鼠血清ALT、AST的影响

结果见表1，与空白组比较，模型组大鼠血清ALT、AST显著升高，说明CCL₄诱发大鼠肝损伤模型成功。与模型组比较，TQW各组及联苯双酯组ALT、AST显著降低。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

表1 TQW对CCl₄肝损伤大鼠血清ALT、AST的影响(

n＝10)

注：与模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.2TQW对CCl₄所致肝损伤大鼠肝组织SOD、MDA的影响

结果见表2，与空白组比较，模型组大鼠肝组织SOD显著降低、MDA显著升高，说明CCL₄诱发大鼠肝损伤模型成功。与模型组比较，TQW各组及联苯双酯组SOD显著升高、MDA显著降低。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

表2 TQW对CCl₄肝损伤大鼠肝组织SOD、MDA的影响(

n＝10)

注：与模型组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.3TQW对CCl₄所致肝损伤大鼠肝组织病理学的影响

空白组大鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构完整，肝细胞无肿胀、变性、坏死，无淋巴细胞浸润及纤维增生。模型组大鼠肝组织可见纤维组织增生，肝小叶正常结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，部分肝细胞变性坏死，有细胞水肿现象，并有大量淋巴细胞浸润，提示造模成功。联苯双酯组趋于空白组，肝小叶结构完整，有个别出现肝细胞点状坏死，少量淋巴细胞浸润，散在的肝细胞脂肪变性。TQW高、中、低剂量组不同程度改善，表现为肝组织结构趋于正常，肝细胞肿胀程度减轻，纤维组织增生减轻，肝细胞脂肪变性减少，淋巴细胞浸润减少。TQW高剂量组与联苯双酯组作用相当。

3小结

本研究发现TQW能显著减轻CCl₄所致的化学性大鼠肝损伤，具有明显的保肝作用。

实施例4(分散片的制备)

按重量份计，处方为：TQW4～6份，微晶纤维素3～5份，羧甲基淀粉钠1份，低取代羟丙纤维素1份，交联羧甲纤维素钠1份，滑石粉0.1份，硬脂酸镁0.1份。取处方量的TQW、微晶纤维素、低取代羟丙纤维素1份，交联羧甲纤维素钠，过筛，混合均匀，用适量0.05g/ml浓度的聚乙烯吡咯烷酮(K30)的60％乙醇溶液制软材，过18目筛制粒，60℃干燥4小时，18目筛整粒，加入滑石粉、硬脂酸镁混合均匀，压片即得。

实施例5(片剂的制备)

按重量份计，取TQW5～9份，加入滑石粉1～2份，淀粉1～2份，羧甲基淀粉钠1～2份，喷入95％乙醇润湿，湿法制粒，干燥，加入0.5～1％硬脂酸镁，混合均匀，压片；加入15％欧巴代包衣液包衣，增重7％包衣得薄膜衣片。

实施例6(胶囊剂的制备)

按重量份计，取TQW8～9份，加入滑石粉1～2份，喷入95％乙醇润湿，湿法制粒，干燥，加入0.5～1％硬脂酸镁，混合均匀，分装得胶囊剂。

Claims

1.一种具有保肝作用的中药复方提取物，其提取方法如下：

以重量份计，按照桃仁4-6份、车前子2-4份、白花败酱草2-4份、文冠果种仁2-4份、当归2-4份、柴胡2-4份、白芍1-3份、甘草1-2份，称取各药材适量，混合粉碎，过药典2号筛，药粉进行二氧化碳超临界萃取，以乙醇为夹带剂，在一定的工艺参数下萃取得棕黄色液体，减压浓缩回收乙醇，最终得棕黄色粘稠油状物。再将上一步二氧化碳超临界萃取后得到的药渣，用适当浓度乙醇浸泡后提取，提取液干燥得浸膏，浸膏利用大孔吸附树脂柱进行富集，在一定的工艺参数下制得棕色粉末；将此粉末与二氧化碳超临界萃取制得的棕黄色粘稠油状物混合，即得本发明的中药复方提取物。

2.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度为30-60℃，萃取压力为20-60MPa，萃取时间为1h或以上，夹带剂无水乙醇用量为0.1-1ml/g药粉，解析压力为20MPa或以下，解析温度为40℃或以下。

3.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取溶剂为30％-100％乙醇，第一次用量为10倍量，浸泡12小时，加热回流提取或者超声提取或者渗漉提取2小时，过滤，向药渣中再加入5倍量30％-100％乙醇，再提取2小时，过滤，合并滤液，减压干燥得浸膏。

4.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌匀，上样于D-101型或者AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂柱中，上样量以生药量与树脂量之比计算为1∶2，静态吸附30分钟，然后依次用10个柱体积的不同浓度的乙醇进行洗脱，收集20％-50％乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。

5.根据权利要求2所述的中药复方提取物，其特征在于在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度为45℃，萃取压力为40MPa，萃取时间为2h，夹带剂无水乙醇用量为0.5ml/g药粉，解析I压力为10MPa、温度为40℃，解析II压力为4MPa、温度为25℃。

6.根据权利要求3所述的中药复方提取物，其特征在于对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取方式为加热回流提取、超声提取或者渗漉提取。

7.根据权利要求4所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，使用的柱脂为D-101型或者AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂。

8.根据权利要求4所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，洗脱溶剂为水或不同浓度的乙醇，依照乙醇浓度由低到高依次洗脱。

9.根据权利要求4所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌匀，上样于D-101型大孔吸附树脂柱中(上样量以生药量与树脂量之比计算为1∶2)，静态吸附30分钟，然后依次用10个柱体积的水、10个柱体积的20％乙醇和10个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。

10.权利要求1-9中任何一项所述的中药复方提取物在保肝药物制剂及保健食品中应用。