CN102321002A - 半胱氨酸衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸修饰化合物技术领域,特别涉及半胱氨酸衍生物及其制备方法和用途。本发明所要解决的第一个技术问题是提供一类新的半胱氨酸衍生物,结构如式I所示,本发明提供了一类Fmoc-S-烷基酸酯-半胱氨酸,为多肽合成提供了一类新的原料。并且其制备时原料易得,操作简单,工艺稳定,重现性好。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸修饰化合物技术领域,特别涉及半胱氨酸衍生物及其制备方法。
技术背景
多肽类药物一直是生物医药行业的热点领域。多肽类药物的化学本质是具有生物活性的大分子物质,它们大多参与人体许多重要的生理过程,比如造血、抑制肿瘤细胞活性、免疫等,因此这类药物往往作用机理明确,效果明显,具有很高的临床应用价值,具有很好的市场前景。
随着多肽药物研究的不断深入,大量的修饰多肽成为了当前研究的热点,国内外已有大量的修饰多肽进入临床研究,同时已有多个产品上市,而修饰多肽的关键为氨基酸修饰,所以发现并制备新的氨基酸修饰化合物是修饰多肽开发的基础。
目前半胱氨酸衍生物主要有:S-叔丁基-半胱氨酸、S-甲基-半胱氨酸、S-苄基-半胱氨酸、S-4-甲苄基-半胱氨酸、S-4-甲氧苄基-半胱氨酸、S-三苯甲基-半胱氨酸、S-乙酰胺甲基-半胱氨酸、S-羧甲基-半胱氨酸等,其中Fmoc-S-叔丁基-半胱氨酸、Fmoc-S-三苯甲基-半胱氨酸、Fmoc-S-乙酰胺甲基-半胱氨酸等已大量用于固相多肽合成中。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一类新的半胱氨酸衍生物,结构如式I所示:
R1~R4独立的为H或C1~C8烷基;
R5~R12独立的为H或C1~C8烷基;
m=0~1,n=0~1,p=0~1,q=0~1,r=0~1,t=0~1,u=0~1。
优选的,R1~R4独立的为H或C1~C4烷基;
R5~R12独立的为H或C1~C4烷基;
m=0~1,n=0~1,p=0~1,q=0~1,r=0~1,t=0~1,u=0~1。
最优的,R1~R4为H;
R5~R12为H;
m=0~1,n=0~1,p=0~1,q=0~1,r=0~1,t=0~1,u=0~1。
进一步优选的,半胱氨酸衍生物结构如式II所示:
其中,R1~R4独立的为H或C1~C8烷基;R10~R12独立的为H或C1~C8烷基。
优选的,R1~R4独立的为H或C1~C4烷基;R10~R12独立的为H或C1~C4烷基。
最优的,R1~R4为H,R10~R12为H。
反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮,优选DMF。
半胱氨酸可以为(L)对应体,也可以为(D)对应体和(DL)消旋体。半胱氨酸可以半胱氨酸盐酸盐的形式作为反应原料。
卤素优选为Cl、Br或I。
反应时可以采用氮气保护。反应温度为室温,反应时间为6-15小时。
本发明所要解决的第三个技术问题是一类新的半胱氨酸衍生物,结构如式III所示:
R1~R4独立的为H或C1~C8烷基;
R5~R12独立的为H或C1~C8烷基;
m=0~1,n=0~1,p=0~1,q=0~1,r=0~1,t=0~1,u=0~1。
优选的,R1~R4独立的为H或C1~C4烷基;
R5~R12独立的为H或C1~C4烷基;
m=0~1,n=0~1,p=0~1,q=0~1,r=0~1,t=0~1,u=0~1。
最优的,R1~R4为H;
R5~R12为H;
m=0~1,n=0~1,p=0~1,q=0~1,r=0~1,t=0~1,u=0~1。
进一步优选的,半胱氨酸衍生物结构如式IV所示:
其中,R1~R4独立的为H或C1~C8烷基;R10~R12独立的为H或C1~C8烷基。
优选的,R1~R4独立的为H或C1~C4烷基;R10~R12独立的为H或C1~C4烷基。
最优的,R1~R4为H,R10~R12为H。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供式III所示半胱氨酸衍生物的制备方法,以式I所示化合物为原料与Fmoc-OSu反应即得。式I所示化合物与Fmoc-OSu的摩尔比为1∶1~1.3,优选为1∶1.2。
反应时先将式III所示半胱氨酸衍生物加水,调pH=8~9,然后再与Fmoc-OSu反应。反应溶剂为水与四氢呋喃的混合溶剂,优选为水∶四氢呋喃(2.5∶1,V/V)的混合溶剂。
调pH的试剂为碳酸钠、碳酸钾或氢氧化钠-碳酸氢钠-碳酸钠。
反应温度为室温,反应时间为1-5小时。
本发明所要解决的第五个技术问题是提供式III所示半胱氨酸衍生物在多肽合成中的应用,特别是在卡贝缩宫素中的应用。
式III所示半胱氨酸衍生物上的氨基能够与氨基酸上的羧基偶联生成二肽,进而合成多肽。式III所示半胱氨酸衍生物上的在四三苯基膦钯和苯硅烷作用后能够与氨基酸上的氨基偶联成四三苯基膦钯与苯硅烷摩尔比为1∶8~12,优选为1∶10,四三苯基膦钯用量为式III所示半胱氨酸衍生物摩尔量的0.2~0.3倍,优选为0.25倍。偶联时的溶剂为DCM。
本发明的优点是:提供了一类Fmoc-S-烷基酸酯-半胱氨酸,为多肽合成提供了一类新的原料。并且其制备时原料易得,操作简单,工艺稳定,重现性好。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明,但不能限制本发明的内容:
实施例1Fmoc-S-(2-(乙酸丙烯酯))-L-半胱氨酸[Fmoc-Cys(CH2COOAll)]的制备
取2-氯代乙酸丙烯酯1160g,加7.5L DMF,搅拌溶解,氮气保护,加入L-半胱氨酸盐酸盐1044g搅拌溶解完全后,加入三乙胺180ml,室温搅拌反应过夜,TLC反应完全后,JIA减压浓缩蒸去DMF,加入3L水,搅拌溶解,过滤去不溶物,滤液用6mol/L盐酸调pH=6-7析出固体,过滤得固体,固体用水洗3次,过滤,滤洗,得固体,40℃烘干得S-(2-(乙酸丙烯酯))-L-半胱氨酸384g(收率25.3%)。结构鉴定数据如下:
1H NMR(DMSO,ppm)):12.6(S,1H),5.9(m,1H),5.2(m,2H),4.8(d,2H),3.8(m,2H),3.4(s,2H),3.0(d,2H),2.0(s,2H);
MS m/z:220(100%M+1)。
取S-(2-(乙酸丙烯酯))-L-半胱氨酸360g,加水2500ml,搅拌下加Na2CO3调反应液pH=8-9,待固体全部溶解后,用乙酸乙酯提取杂质3次(每次乙酸乙酯用量500ml),提取后的水溶液加四氢呋喃1L,搅拌下加Fmoc-OSu:450g,室温反应至完全,过滤,滤液用乙酸乙酯提取产品3次(每次乙酸乙酯用量500ml),合并乙酸乙酯提取液,提取液依次用2%Na2CO3溶液、0.5N盐酸溶液、饱和氯化钠溶液各洗3次(每次洗液用量300ml),得乙酸乙酯溶液,乙酸乙酯溶液加无水MgSO4300g干燥,过滤,滤饼MgSO4乙酸乙酯滤洗,合并乙酸乙酯液,60℃浓缩至干得油状物,油状物加石油醚研磨2次,析出固体,过滤得固体,真空减压干燥,得Fmoc-S-(2-(乙酸丙烯酯))-L-半胱氨酸561g(收率77.2%)。
1H NMR(DMSO,ppm)):12.8(S,1H),8.0(d,2H),7.8(d,2H),7.7(S,1H),7.5(t,2H),7.4(t,2H),5.8(m,1H),5.4(dd,1H),5.3(dd,H),4.4(d,2H),4.3(m,2H),4.2(m,1H),4.1(m,1H),3.0(dd,2H),3.4(s,2H);
MS m/z:464(100%M+Na),442(58%M+1)。
实施例2Fmoc-S-(4-(正丁酸丙烯酯))-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys((CH2)3COOAll))的制备
取4-溴代正丁酸丙烯酯1000g,加7.5L DMF,搅拌溶解,氮气保护,加入L-半胱氨酸盐酸盐1044g搅拌溶解完全后,加入三乙胺180ml,室温搅拌反应过夜,TLC反应完全后,JIA减压浓缩蒸去DMF,加入3L水,搅拌溶解,过滤去不溶物,滤液用6mol/L盐酸调pH=6-7析出固体,过滤得固体,固体用H2O洗3次,过滤,滤洗,得固体,40℃烘干得S-(4-(正丁酸丙烯酯))-L-半胱氨酸372g(收率29.3%)。
1H NMR(DMSO,ppm)):12.7(S,1H),5.9(m,1H),5.2(m,2H),4.7(d,2H),3.8(m,2H),3.0(d,2H),2.4(t,2H),2.3(t,2H),2.1(m,2H),2.0(s,2H);
MS m/z:248(100%M+1)。
S-(4-(正丁酸丙烯酯))-L-半胱氨酸330g加水2500ml,搅拌下加Na2CO3调反应液PH=8-9,待固体全部溶解后,用乙酸乙酯提取杂质3次(每次乙酸乙酯用量500ml),提取后的水溶液加四氢呋喃1L,搅拌下加Fmoc-OSu:450g,室温反应至完全,过滤,滤液用乙酸乙酯提取产品3次(每次乙酸乙酯用量500ml),合并乙酸乙酯提取液,提取液依次用2%Na2CO3溶液、0.5N盐酸溶液、饱和氯化钠溶液各洗3次(每次洗液用量300ml),得乙酸乙酯溶液,乙酸乙酯溶液加无水MgSO4:300g干燥,过滤,滤饼MgSO4乙酸乙酯滤洗,合并乙酸乙酯液,60℃浓缩至干得油状物,油状物加石油醚研磨2次,析出固体,过滤得固体,真空减压干燥得S-(4-(正丁酸丙烯酯))-L-半胱氨酸457g(收率72.5%)。
1H NMR(DMSO,ppm)):12.9(S,1H),7.9(d,2H),7.7(d,2H),7.6(S,1H),7.4(t,2H),7.3(t,2H),5.9(m,1H),5.3(dd,1H),5.2(dd,H),4.5(d,2H),4.3(m,2H),4.2(m,1H),4.1(m,1H),2.9(dd,2H),2.5(t,2H),2.4(t,2H),1.8(m,2H)。
MS m/z:470(100%M+1)
实施例3Fmoc-Cys((CH2)3COOAll)-Ala-NH2二肽的合成
取Fmoc-Ala-Rink Amide AM氨基树脂100g(取代值为1.0mmol/g),用DMF洗涤2次,用20%哌啶/DMF溶液预洗一次,再用20%哌啶/DMF溶液去保护反应25分钟,去保护反应完成后,用DMF洗涤5次。
另取0.2mol Fmoc-Cys((CH2)3COOAll)和0.2mol 1-羟基苯并三唑(HOBt),用200mlDMF溶解,搅拌下慢慢加入0.2mol N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC),搅拌30分钟后加入到上述树脂中,再搅拌偶联反应2小时。
偶联反应完成后得到Fmoc-Cys((CH2)3COOAll)-氨基树脂,该树脂用分别用DMF洗涤5次、甲醇洗涤3次,减压干燥,得二肽树脂122.1g,收率为96.1%。
取二肽树脂122.1g,加入裂解试剂[TFA/水/三异丙基硅烷=94∶5∶5(V/V)]1300ml,搅拌均匀,室温搅拌反应3小时,反应混合物使用砂芯漏斗过滤,收集滤液,树脂再用少量TFA洗涤3次,合并滤液后减压浓缩,加入无水乙醚1300ml,过滤收集沉淀,再用无水乙醚洗沉淀3次,减压干燥,得二肽粗品。
取二肽粗品溶于30%乙腈水中,用0.45μm滤膜过滤,采用液相色谱纯化,色谱拄为反相C18柱,纯化用流动相为5%醋酸/水-5%醋酸/乙腈混合溶剂,检测波长230nm,收集并合并主峰溶液,在40℃以下减压浓缩,将浓缩液冷冻干燥,得Fmoc-Cys((CH2)3COOAll)-Ala-NH2二肽产品43.3g,总收率为80.5%。MS m/z:540(100%M+1)。
Claims (10)
8.根据权利要求7所述的半胱氨酸衍生物,其特征在于:优选的,R1~R4独立的为H或C1~C4烷基;R10~R12独立的为H或C1~C4烷基;
最优的,R1~R4为H,R10~R12为H。
9.权利要求5~8任一项所述半胱氨酸衍生物的制备方法,以权利要求1~3任一项所述化合物为原料与Fmoc-OSu反应即得。
10.权利要求5~8任一项所述半胱氨酸衍生物在多肽合成中的应用。
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