CN102317761A - 荧光检测装置和荧光检测方法 - Google Patents

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Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种荧光检测装置和荧光检测方法，该荧光检测装置在接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光时，生成用来对射出自激光光源部的激光进行强度调制的调制信号，并利用该调制信号对激光进行调制，并获得测量对象物被激光照射后所发出的荧光的荧光信号，并利用该荧光信号计算出荧光强度和荧光相对于调制信号的相位滞后，此时，荧光检测装置对调制信号DC成分的信号电平和刚刚输出荧光信号的放大增益的操作量进行控制，以使荧光强度信号值进入预先设定的范围内，操作量处于稳定状态后，计算出荧光强度，且利用相位滞后计算出测量对象物所发出的荧光的荧光弛豫时间。

Description

荧光检测装置和荧光检测方法
技术领域
本发明涉及一种荧光检测装置和荧光检测方法，对接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光而得到的荧光信号进行信号处理。
背景技术
应用于医疗、生物领域的流式细胞仪中内置有一种荧光检测装置，该荧光检测装置接收测量对象物的荧光色素通过激光照射而发出的荧光，由此识别出测量对象物的种类。
具体来说，流式细胞仪中，采用荧光试剂使悬浮液中的细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等活体物质标签化，然后施加压力以使测量对象物流动在以每秒10m以下程度的速度在管道内进行流动的鞘液中，由此形成分层鞘流。通过朝向该流动中的测量对象物照射激光，接收附着在测量对象物上的荧光色素所发出的荧光，并将该荧光作为标签进行识别，由此特定测量对象物。
在该流式细胞仪中，例如能够测量出细胞内的DNA、RNA、酶、蛋白质等在细胞内的相对量，且在短时间内能够对这些物质的作用进行分析。另外，使用通过荧光对特定类型的细胞或染色体进行特定、并仅对特定的细胞或染色体以活着的状态下短时间内进行分选收集的细胞分类器等。
在上述仪器的使用中，被要求在短时间内根据荧光信息对更多的测量对象物进行正确地特定。
下述专利文献1中记载有一种荧光检测装置和荧光检测方法，其中，计算出测量对象物通过激光照射而发出的荧光的荧光寿命(荧光弛豫时间)，由此能够在短时间内对较多的测量对象物进行正确地特定。
根据该文献记载有下述内容：对激光进行强度调制并将其朝向测量对象物照射，以求出由测量对象物发出的荧光信号相对于用以调制激光强度的调制信号的相位滞后，并利用该相位滞后计算出荧光弛豫时间。
专利文献1：特开2006-226698号公报
在上述的荧光检测装置和荧光检测方法中，虽然可以在短时间内高精度地求出荧光强度或荧光弛豫时间，但能够在一定精度下计算出荧光强度或荧光弛豫时间的范围是被限定的范围。这是因为相位滞后带给荧光弛豫时间的贡献并不是固定的，而是使其发生非线性变化的缘故。另外，有时也存在由于在构成电路中混入有噪音成分，因此进行AD转换时所产生的量子误差给荧光强度或相位滞后带来较大误差的情况。因此，存在无法在一定的精度下计算出荧光强度或荧光弛豫时间的问题。
发明内容
因此，本发明为了解决上述问题点，其目的在于提供一种在广泛的范围内、且在一定的精度下能够计算出荧光强度和荧光弛豫时间的荧光检测装置和荧光检测方法。
本发明的一实施方式涉及荧光检测装置，对接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光而得到的荧光信号进行信号处理，该装置包括：
光源部，对照射测量对象物的激光进行强度调制并将其发射；
受光部，输出测量对象物被激光照射后所发出的荧光的荧光信号；
光源控制部，生成用于对射出自所述光源部的激光进行强度调制的调制信号；
第一处理部，包括：放大器，对输出自所述受光部的荧光信号进行放大；混频器，生成被放大的所述荧光信号的、相对于所述调制信号的相同相位成分和被放大的所述荧光信号的、相对于所述调制信号相位发生90度位移的90度相位成分；AD转换器，对所生成的所述相同相位成分和所述90度相位成分进行数字转换；
第二处理部，利用数字转换的所述相同相位成分和所述90度相位成分计算出荧光强度信号和荧光相对于所述调制信号的相位滞后，并利用所算出的所述荧光强度信号和所述相位滞后计算出测量对象物所发出的荧光的荧光强度和荧光弛豫时间；
信号控制部，对用以所述强度调制的调制信号DC成分的信号电平和所述放大器增益中的至少一方的操作量进行控制，以使所述荧光强度信号值进入预先设定的范围内。
本发明的另一实施方式涉及荧光检测方法，对接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光而得到的荧光信号进行信号处理，该方法包括下述步骤：
设定用来对射出自激光光源部的激光进行强度调制的频率和DC成分的信号电平以生成调制信号，并利用该调制信号对激光进行调制；
获得测量对象物被所述激光照射后所发出的荧光的荧光信号；
对所述荧光信号进行放大，且生成进行所述放大的所述荧光信号的、相对于所述调制信号的相同相位成分和进行放大的所述荧光信号的、相对于所述调制信号相位发生90度位移的90度相位成分，并对所生成的所述相同相位成分和所述90度相位成分进行数字转换；
利用被数字转换的所述相同相位成分和所述90度相位成分计算出荧光强度和荧光相对于所述调制信号的相位滞后；
对所述DC成分的信号电平和所述放大增益中的至少一方的操作量进行控制，以使所述荧光强度进入预先设定的范围内；
利用在所述荧光强度值进入所述预先设定的范围内时的所述操作量下所得到的所述相同相位成分和所述90度相位成分，计算出荧光强度信号值和所述相位滞后，且利用所计算出的所述荧光强度信号值和所述相位滞后，计算出测量对象物所发出的荧光的荧光强度和荧光弛豫时间。
上述实施方式的荧光检测装置和荧光检测方法能够在广泛的范围内、且在一定的精度下能够计算出荧光强度和荧光弛豫时间。
附图说明
图1为采用本发明荧光检测装置的流式细胞仪的概略构成图；
图2为重点表示图1所示的流式细胞仪的信号流动的图；
图3为表示图1所示的流式细胞仪中控制和信号处理部的概略构成的图；
图4为表示图1所示的流式细胞仪中数据处理部的概略构成的图；
图5中的(a)和(b)为对用以本发明的荧光检测装置和相位检测方法的、相位滞后θ的调整效果进行说明的说明图；(c)为对荧光强度的调整效果进行说明的图；
图6为对本发明的荧光检测方法的一实施方式的流程进行说明的流程图。
附图标记说明
10流式细胞仪
12样品
22激光光源部
22a激光光源
22b、24b、26b透镜系统
22c激光驱动器
24、26受光部
24a、26a光电转换器
26c遮蔽板
28控制和信号处理部
30数据处理部(计算机)
30a荧光强度信号生成部
30b荧光强度计算部
30c相位滞后计算部
30d信号控制部
30e荧光弛豫时间计算部
32管道
34回收容器
40调制信号控制部
40a可变频率振荡器
40b功率分配器
40c、40d、44a放大器
40e DC信号发生器
42频率转换部
42a可变放大器
42b IQ混频器
42c低通滤波器
42d 90度移相器
42e、42f混频器
44AD转换部
44bAD转换器
具体实施方式
以下，基于适合使用本发明荧光检测装置的流式细胞仪，进行详细说明。
图1是采用本发明荧光检测装置的流式细胞仪10的概略构成图。
图2是重点表示流式细胞仪10的信号流动的图。
流式细胞仪10主要包括：激光光源部22、受光部24、26、控制和信号处理部28、数据处理部(计算机)30、管道32和回收容器34。
激光光源部22是射出具有350nm～800nm可视光带波长且通过被控制的调制信号进行强度调制的激光的部分。调制信号是调制频率和DC成分的信号电平被控制。
激光光源部22包括激光光源22a、透镜系统22b(参照图2)和激光驱动器22c(参照图2)。光源22a将具有规定波长的激光作为强度恒定的CW(连续波)激光射出，且射出时用频率对该CW(连续波)激光进行强度调制。透镜系统22b使激光聚焦在管道32中的规定测量点(测量场)上。激光驱动器22c(参照图2)驱动激光光源22a。
虽然激光光源部22为由一个激光光源构成的装置构成，但并不限定在一个激光光源。激光光源部22也可以使用多个激光光源。此时，优选激光光源部22采用分色镜等对来自多个激光光源的激光进行合成以形成朝向测量场射出的激光。
作为发射激光的光源，例如可以使用半导体激光器。激光是例如以5～100mW左右的输出功率输出的激光。另一方面，用来调制激光强度的频率(调制频率)是其周期与荧光弛豫时间相比稍长，例如为10～200MHz。
设置在光源部22的激光驱动器22c按照激光强度的DC成分电平和强度调制频率能够被控制的方式构成。即，激光强度表示在DC成分上载有基于规定频率的强度调制的强度变化，且最低强度大于0。
受光部24包括光电转换器24a(参照图2)、使前向散射光聚束在光电转换器24a上的透镜系统24b(参照图2)和遮蔽板24c(参照图2)。
光电转换器24a按照夹着管道32与激光光源部22相对而置的方式进行配置，且接收因通过测量场的样品12而发生前向散射的激光，由此输出样品12正通过测量场情况的检测信号。
遮蔽板24c设置在透镜系统24b的、样品12一侧的前面，以使激光不直接入射到光电转换器24a上。输出自该受光部24的信号被供给到控制和信号处理部28和数据处理部30，并在控制和信号处理部28和数据处理部30中作为通知样品12正通过管道32中的测量场的时间的触发信号、测量结束的OFF信号来使用。
另一方面，受光部26按照垂直于发射自激光光源部22的激光发射方向且垂直于管道32中的样品12的移动方向的方式进行配置。受光部26包括接收样品12在测量场被照射后所发出的荧光的光电转换器26a(参照图2)。
受光部26除光电转换器26a以外，还包括对来自样品12的荧光信号进行聚焦的透镜系统26b(参照图2)和带通滤波器26c(参照图2)。
透镜系统26b按照将入射到受光部26的荧光聚焦在光电转换器26a的受光面的方式构成。带通滤波器26c的透射波段按照对荧光进行滤波后通过光电转换器26a获取具有规定波段的荧光的方式进行设定。
虽然受光部26具有一个光电转换器26a，但受光部26也可以包括多个光电转换器。此时，可以按照下述方式构成：将分色镜设置在带通滤波器26c的前面，使其按照不同频带对荧光进行分割，且使各个光电转换器接收这些被分割的荧光。
带通滤波器26c被设置在各光电转换器26a的受光面的前面，其为仅使具有规定波段的荧光透射的滤波器。透射的荧光波段按照其与荧光色素发出的荧光波段相对应的方式进行设定。
光电转换器26a包括如将光电倍增管作为传感器的传感器，该传感器是将光电面所接收的光转换成电信号的传感器。在此，与激光的强度调制一样，所接收的荧光是进行强度调制后发出的的荧光，因此所输出的荧光信号成为具有与调制激光强度的频率相同频率的信号。该荧光信号被供给到控制和信号处理部28。
图3是表示控制和信号处理部28构成的图。控制和信号处理部28包括调制信号控制部40、频率转换部42和AD转换部44。
调制信号控制部40生成用来调制激光强度的调制信号并将其供给到激光驱动器22c，同时将所生成的调制信号供给到频率转换部42。
调制信号控制部40包括可变频率振荡器40a、功率分配器40b、放大器40c、40d、DC信号发生器40e、计频器40f。
可变频率振荡器40a以响应来自数据处理部30的控制信号而被确定下来的频率进行振荡并生成调制信号的部分。作为可变频率振荡器40a，例如适合使用电压控制发生器。
功率分配器40b对振荡的调制信号进行均匀分配，且将分割的调制信号分别供给到放大器40c和放大器40d。
放大器40c对调制信号进行放大后将其提供给激光驱动器22c。放大器40d对调制信号进行放大后将其供给到后述的频率转换部42。之所以将调制信号提供给频率转换部42，是因为将上述调制信号作为用以求出输出自受光部26的荧光信号相对于调制信号的相位滞后的参照信号来使用。
DC信号发生器40e生成调制信号的DC成分并将其供给到激光驱动器22c。之所以向激光驱动器22c提供DC成分的信号，这是因为通过调制激光强度使样品12发出的荧光强度达到规定强度，由此保证计算出高精度的相位滞后值，进而保证计算出高精度的荧光弛豫时间的缘故。即，其原因在于，使激光强度表示为在DC成分上载有强度调制的强度变化、且使激光的最低强度大于0的缘故。
计频器40f是对在可变频率振荡器40a进行振荡的调制信号的频率进行计数的部分。计频器40f的计频结果被供给到数据处理部30。
可变频率振荡器40a与DC信号发生器40e分别与数据处理部30相连接，由此通过来自数据处理部30的控制信号，调制信号频率和DC成分的信号电平受到控制。
频率转换部42对供给自受光部26a的荧光信号进行频率转换并实施降频转换。频率转换部42主要包括可变放大器42a、IQ混频器42b和低通滤波器42c。
可变放大器42a对荧光信号进行放大。可变放大器42a与数据处理部30相连接，由此根据来自数据处理部30的控制信号控制增益。
IQ混频器42b以供给自调制信号控制部40的调制信号为参照信号对被放大的荧光信号进行朝向低频的频率转换(降频转换)，由此生成荧光信号的、与调制信号相同相位的信号和相位发生90度位移的调制信号。
IQ混频器42b包括90度移相器42d(参照图2)、混频器42e(参照图2)、42f(参照图2)。通过90度移相器42d，生成相位与调制信号发生90度位移的信号，且相同相位相位的调制信号和相位发生90度位移的调制信号分别被供给到混频器42e、42f。
在混频器42e、42f中，分别将所供给的、相同相位相位的调制信号和相位发生90度位移的调制信号作为参照信号，使这些参照信号与被放大的荧光信号进行混合处理。被混合的荧光信号被供给到低通滤波器42c。
低通滤波器42c从被混合的荧光信号中对低于调制信号的、具有规定频率区域的信号进行滤波而提取低频信号。由此，求出以频率0区域的信号成分为主要成分的、荧光信号的Re成分(与调制信号相同相位的信号)和Im成分(相对于调制信号，相位发生90度位移的成分)。所求出的Re成分和Im成分被供给到AD转换部44。
AD转换部44将所提供的Re成分和Im成分转换成数字化数据。AD转换部44包括放大器44a和AD转换器44b。放大器44a以规定的增益对Re成分和Im成分进行放大后将其供给到AD转换器44b。AD转换器44b将被放大的Re成分和Im成分转换成数字化数据，且将数字化的Re成分数据和Im成分数据供给到数据处理部30。
数据处理部30采用所供给的Re成分数据和Im成分数据求出荧光的相位滞后θ和荧光强度信号。进而，数据处理部30使相位滞后θ值进入到预先设定的范围内，且利用荧光强度信号值进入预先设定的强度范围内时的相位滞后θ，计算出荧光弛豫时间τ和此时荧光的荧光强度。
更详细地说，所计算出的相位滞后θ值在允许范围内与预先设定的目标值相一致之前，如与45度相一致之前，一直生成用以调整在可变频率振荡器40a生成的调制信号频率的控制信号，由此对调制信号进行控制。在此，允许范围也取决于作为目标的荧光弛豫时间的计算精度，例如，±5度、±2度或者是±1度。当相位滞后θ值进入到相对于目标值的、预先设定的允许范围内时，控制达到稳定状态。
而且，数据处理部30在所计算出的荧光强度信号值进入预先设定的强度范围之前，一直生成用来调整(操作量的调整)在DC信号发生器40e生成的DC成分电平或可变放大器42a增益的控制信号。由此，在AD转换器44b进行的Re成分和Im成分的信号电平被调整。
图4是表示数据处理部30的概略构成的图。数据处理部30包括荧光强度信号生成部30a、荧光强度计算部30b、相位滞后计算部30c、信号控制部30d和荧光弛豫时间计算部30e。这些各部分是通过执行计算机可执行程序而形成的模块。即，数据处理部30是在计算机上通过启动软件来产生各功能。
相位滞后计算部30c和荧光弛豫时间计算部30e是对应于根据荧光信号计算出相对于调制信号的荧光的相位滞后、且利用该相位滞后计算出样品12发出荧光的荧光弛豫时间的处理部。
荧光强度信号生成部30a求出供给自AD转换器44b的、Re成分数据和Im成分数据的二次平方和的平方根，由此生成荧光强度信号。所计算出的荧光强度信号被供给到荧光强度计算部30b。由于荧光强度信号是对激光的DC成分和可变放大器42a的增益进行调整后的结果值，因此根据这些调整结果，荧光强度信号值具有较大变化。由此，在荧光强度计算部30b中，荧光强度信号是利用作为激光强度的DC成分电平和增益的信息进行校正的荧光强度。然而，基于该校正的荧光强度的计算是收到来自信号控制部30d的后述确定指令时才开始进行的。
其中，荧光强度信号是采用样品12通过激光测量场期间连续被供给的、Re成分数据和Im成分数据而计算出来的时序数据。
荧光强度计算部30b响应接收自信号控制部30d的确定指令，采用作为激光强度的DC成分电平和增益的信息对在荧光强度信号生成部30a计算出的荧光强度信号进行校正，由此计算出荧光强度。具体来说，将荧光强度信号值除以通过用于调整DC成分电平和可变放大器42a的增益的控制信号值来确定的系数，由此求出荧光强度。其中，用于除法计算的系数是参照将用来调整DC成分电平和增益的控制信号值与系数相关联的LUT而得到。
用来校正的激光DC成分可以是由控制信号给予的信号值，也可以使用由受光部24测量的前向散射光强度。可变放大器42a的增益可以是由控制信号给予的信号值，也可以使用对增益进行另行测量的结果值。
接收自信号控制部30d的确定指令是在荧光强度信号生成部30a所生成的控制中荧光强度信号值超过规定的设定值而成为最大值时发出。在此，规定的设定值是指，确定设定范围的下限值。用控制信号值除以此时的荧光强度信号值，由此得到荧光强度。
对生成在DC信号发生器40e的DC成分电平和可变放大器42a的增益进行调整(操作量的调整)，以使荧光强度信号值进入到预先设定的强度范围内，但是在样品12通过测量场的后半部分，荧光强度信号变弱。此时，在对生成于DC信号发生器40e的DC成分电平和可变放大器42a的增益进行调整(操作量的调整)中，即使使操作量最大，也达不到目标值。另一方面，在样品12通过测量场的前半部分至中间部分的阶段中，荧光强度信号逐渐变强，因此在该阶段中荧光强度信号值一旦进入到预先设定的范围内，就不调整操作量，而是使其处于恒定状态。此时，荧光强度信号值超过确定上述范围的设定值而成为最大值。因此，将此时的荧光强度信号值除以根据此时的控制信号值而确定的系数，由此求出荧光强度。
对于荧光强度的计算方法，除了通过上述方法计算出荧光强度值以外，还可以有通过下述方法计算出荧光强度值：将控制中的荧光强度信号值除以根据控制信号值来确定的系数，并对控制期间内的上述相除结果进行累计，然后将该累计值除以控制时间的结果值作为荧光强度值。
相位滞后计算部30c采用所供给的Re成分数据和Im成分数据计算出tan-(Im/Re)(Im是Im成分数据值，Re是Re成分数据值)，由此计算出相位滞后θ。所计算出的相位滞后θ被供给到信号控制部30d。另外，所计算出的相位滞后θ被供给到荧光弛豫时间计算部30e。
荧光弛豫时间计算部30e响应来自信号控制部30d的确定指令，采用供给自相位滞后计算部30c的相位滞后θ、且根据式τ＝1/(2πf)·tan(θ)求出荧光弛豫时间τ。之所以能够通过上述式计算出荧光弛豫时间τ，这是因为荧光大致随着一次滞后做出弛豫响应的缘故。其中，在调制信号频率f中使用供给自计频器40f的调制信号频率的计数结果。也可以使用信号控制部30通过控制信号来确定的调制信号的目标频率替代使用频率计数结果。
信号控制部30d对供给自荧光强度信号生成部30a的荧光强度信号值和供给自相位滞后计算部30c的相位滞后θ是否进入分别被设定的范围进行判定，并根据判定结果生成控制信号。
即，信号控制部30d对射出自光源部22的激光的DC成分电平和可变放大器44b的增益进行控制，以使荧光强度信号值进入到预先设定的范围内。
判定结果为荧光强度信号值没有进入到设定范围的情况下，信号控制部30d生成用来调整DC信号发生器40e的DC成分信号电平的控制信号，并将其供给到DC信号发生器40e。由此，调整了DC成分信号电平的调制信号被供给到激光驱动器22c，且激光的强度调制得到调整。另外，信号控制部30d生成用来调整设置于受光部26a正后面的可变放大器42a增益的控制信号，以便控制可变放大器42a的增益。在此，用于判定的预先设定的范围是指，例如，对于时序Re成分数据和Im成分数据的最大值，其按照通过AD转换而被量子化的量子电平占AD转换中整个量子电平的30％以上(当12比特时电平为308以上)的方式进行确定的值的范围。
在本实施方式中，虽然对DC信号发生器40e的调制信号和可变放大器26a的增益进行控制，但也可以进行上述控制中的任一种控制。
另外，信号控制部30d时常监视由荧光强度信号生成部30a生成的荧光强度信号，且当荧光强度信号值达到超过规定设定值的最大值时，发出进行校正的确定指令。
另外，信号控制部30d也是按照使相位滞后θ值接近于45度的方式对调制信号频率进行控制的部分。接近于预先设定值是指，在调制信号的控制前后中，控制后的相位滞后θ值与控制前的相位滞后θ值相比更接近预先设定值的情况。相位滞后θ值虽然通过该控制接近作为目标值的预先设定值，但相对于该目标值，优选在预先设定的允许范围内发生聚束。
信号控制部30d，当相位滞后θ值在允许范围内与作为目标值的45度不相一致时，生成用来调整可变频率振荡器40a的振荡频率的控制信号，并将其供给到可变频率振荡器40a。由此，频率被调整的调制信号被供给到激光驱动器22c，且激光强度调制得到调整。
信号控制部30d在荧光强度信号值进入预先设定的范围、且相位滞后θ进入预先设定的范围时，判定为已得到高精度的相位滞后θ，所以朝向荧光强度计算部30b和荧光弛豫时间计算部30e发出计算荧光强度和荧光弛豫时间的确定指令。
这样，当荧光强度信号值和相位滞后θ均进入到设定范围时，可以得到高精度的相位滞后θ。由此可以计算出高精度的荧光弛豫时间。在本发明中，通过荧光强度信号值是否在预先设定的范围的判定，至少可以得到高精度的相位滞后θ。
图5(a)是将激光强度调制频率(角频率2πf)与此时荧光相位滞后θ之间的关系表示在各相关荧光弛豫时间τ上的图。
相位滞后θ为45度时，相对于角频率2πf的相位滞后θ的角度变化最大。即，在45度的角度，相位滞后θ的灵敏度变得较高。因此，按照使相位滞后θ接近于45度的方式控制调制信号的频率，由此能够在高灵敏度的位置上计算出相位滞后θ。即，能够计算出高精度的相位滞后θ。
另外，设想在AD转换器44b进行AD转换时，如图5(b)所示，由于Re成分或Im成分中包括误差，因此AD转换中变动一个量子化电平时的情况。此时，相位滞后θ在允许范围内处于45度时的相位滞后变化Δθ1小于位于除此以外范围内的相位滞后Δθ2。因此，当相位滞后θ在允许范围内处于45度时，能够减小因量子误差而产生的相位滞后θ的误差。
而且，如图5(c)所示，假设将量子化电平大的为A点、量子化电平小的为B点时，由于Im成分的误差，从B点变成B’点时所产生的相位角的变化大于从A点变成A’点时所产生的相位角的变化。因此，使由Re成分数据和Im成分数据算出的荧光强度信号值进入预先设定的范围，由此能够求出相对于AD转换时所含有的误差具有一定精度的相位滞后θ。
图6是对荧光检测装置10中所进行的荧光检测方法的一实施方式的流程进行说明的图。该实施方式是为了计算出荧光强度和荧光弛豫时间而对激光强度的DC成分、刚刚接收到荧光后的荧光信号的放大增益和调制信号频率进行调整的方法。
首先，根据来自数据处理部30的控制信号，在调制信号控制部40设定用来调制激光强度的调制信号的DC成分的信号电平和频率转换部42的可变放大器42a的增益(步骤S10)。这些是在处理开始时设定有被默认设定的DC成分的信号电平和增益。
进而，在调制信号控制部40中，根据来自数据处理部30的控制信号设定调制信号的频率。例如，频率被设定成默认设置。采用上述设定的DC成分的信号电平、增益和调制信号频率生成调制信号，并从激光光源22a发射强度已被调制的激光(步骤S12)。
然后，激光被照射，通过测量场的样品12所发出的荧光被受光部26a所接收，由此输出荧光信号(步骤S14)。
其次，按照由可变放大器42a设定的增益对上述荧光信号进行放大，然后将其供给到混频器42e、42f进行混合，由此求出Re成分和Im成分。进而，Re成分和Im成分在AD转换部44被转换成数字信号，由此得到Re成分数据和Im成分数据(步骤S16)。
再其次，在数据处理部30的相位滞后计算部30c中，利用数字化的Re成分数据和Im成分数据计算出荧光信号的相位滞后θ(步骤S18)。
再其次，在信号控制部30d对所计算出的相位滞后θ是否在允许范围内与预先设定的、作为目标值的45度相一致进行判定(步骤S20)。在此，如果相位滞后θ在允许范围内与作为目标值的45度相一致，则生成用来改变调制信号频率的控制信号，并将其提供给可变频率振荡器40a。这样，调制信号的频率得到改变(步骤S22)。在此，频率的改变采用所计算出的相位滞后θ、例如频率f＝2πf1/tan(θ)(f1是目前所设定的调制信号频率)来进行。
这样，重复步骤S10～S22，直至相位滞后θ在允许范围内与作为目标值的45度相一致。
如果在步骤S20的判定结果是肯定(“是”时)，信号控制部30进一步判定出荧光强度信号值是否进入到预先设定的范围(步骤S24)。当荧光强度信号值进入到预先设定的范围时(“是”时)，朝向荧光强度计算部30b和荧光弛豫时间计算部30e发出计算荧光强度和荧光弛豫时间的确定指令。这样，由荧光强度计算部30b计算的荧光强度和由荧光弛豫时间计算部30e计算的荧光弛豫时间作为样品12的测量结果而被确定下来(步骤S26)。
如果荧光强度信号值没有进入到预先设定的范围(“否”的情况下)，用于调制信号的DC成分的信号电平和增益被改变(步骤S28)，并返回到步骤10。
这样，重复步骤S10～S24和步骤S28，直至荧光强度信号值进入到预先设定的范围。这样，根据DC成分的信号电平和增益的控制信号值，对荧光强度信号值进入预先设定范围内而成为最大值时的荧光强度信号值进行校正，并将其输出。
所计算出的测量结果与DC成分的信号电平、增益、调制信号频率等信息一起被输出到未图示的显示器或打印机等输出装置。
在上述的荧光检测方法中，使用下述处理：对相位滞后θ是否进入到所设定的范围进行判定，当判定结果为肯定时，再判定出荧光强度信号值是否进入到设定范围。然而，在本实施方式中，也可以使用下述处理：对荧光强度信号值是否进入设定范围进行判定，当判定结果为肯定时，再判定出相位滞后θ是否进入到设定范围内。
这样的控制通过图1所示的流式细胞仪进行时，可以按照下述方式实施。
即，假设样品12由多个样品粒子构成，且该样品粒子以恒定速度一个个间歇性地通过照射激光的测量场。此时，信号控制部30d在样品粒子开始通过照射激光的测量场后，马上开始对调制信号DC成分的信号电平和可变放大器42a增益的的控制，以使荧光强度信号值进入到预先设定的范围内。数据处理部30在样品粒子结束通过照射激光的测量场的流动之前，找出荧光强度信号值进入预先设定的范围内的操作量。数据处理部30根据在找出的操作量条件下所得到的相位滞后和调制信号频率计算出荧光弛豫时间。进而，数据处理部30用在设定时刻的荧光强度信号值和操作量计算出荧光强度。此时，也同时进行对调制信号频率的控制。
另外，采用样品12被放置在比色皿等的固定容器内、且在静止的状态下受到激光照射的测量装置时，实施以下测量方法即可。即，假设样品12被放置在比色皿等的固定容器内、且在静止的状态下受到激光照射的情况。此时，信号控制部30按照荧光强度信号值进入预先设定的范围内的方式，对调制信号DC成分的信号电平和可变放大器42a的增益进行控制，且利用测量对象物在该控制达到稳定状态时所发出的荧光的相位滞后计算出所述荧光弛豫时间。进而，用控制达到稳定状态时的荧光强度信号值和操作量，计算出荧光强度。此时，也同时进行对调制信号的频率的控制。
如此地，利用获得自荧光信号的荧光强度信号来调整Re成分和Im成分的信号电平，由此能够在广泛的范围内求出具有一定精度的相位滞后θ和荧光强度。当Re成分和Im成分的信号电平较低时，由IQ混频器42b或低通滤波器42c或AD转换器44b等所引起的噪音混入到Re成分和Im成分中，因此这些成分中有可能包括误差。如果在该状态下进行AD转换，则进行量子化时的误差变大、且使此后算出的相位滞后θ的误差变大。然而，由于使通过Re成分和Im成分计算出的荧光强度信号进入到预先设定的范围内，因此能够恒定地保持Re成分和Im成分的信号电平。因此，本实施方式能够将相位滞后θ的误差抑制在一定范围内，或者能够进行控制。
另外，计算荧光弛豫时间时，按照相位滞后接近于目标值45度的方式对激光的调制信号频率进行调整，由此能够使相位滞后带给荧光弛豫时间的非线性贡献达到恒定。因此，本实施方式能够扩大固定精度下可计算出荧光弛豫时间的范围。例如，当荧光做出一次滞后的弛豫响应时，本实施方式能够将非线性部分tanθ(将θ作为相位滞后)作为不限于荧光弛豫时间的大致恒定的值，因此能够防止相位滞后θ较大和较小时tanθ的贡献存在较大不同且精度发生变化的情况。
特别是，通过使相位滞后θ接近于45度的方式，能够在相位滞后对调制信号频率的灵敏度较高的位置上计算出相位滞后，因此能够计算出高精度的荧光弛豫时间。
在上述说明中，虽然相位滞后和荧光强度信号均被控制，但也可以是对相位滞后不进行控制、且对相位滞后θ在允许范围内是否与目标值一致不进行判定、而是仅对荧光强度信号是否进入预先设定的范围进行判定并控制的方式。
综上，本实施方式计算荧光强度和荧光弛豫时间时，对用以调制强度的、调制信号DC成分的信号电平和放大器增益中的至少一个的操作量进行调整，以使利用数字转换的相同相位成分和90度相位成分而算出的荧光强度信号值进入预先设定的范围内。由此，本实施方式能够将由AD转换时的量子化误差而产生的荧光强度和相位滞后的误差抑制在一定的电平范围内。因此，本实施方式能够扩大一定精度下可计算出荧光强度和荧光弛豫时间的范围。
进而，本实施方式除了按照使光强度值进入预先设定的范围内的方式控制用以调制强度的、调制信号DC成分的信号电平和放大器增益中的至少一个的操作量以外，还控制强度调制的频率，以使荧光的相位滞后接近于45度。由此，本实施方式能够在广泛的范围内计算出高精度的荧光强度和荧光弛豫时间。即使所计算出的荧光弛豫时间的长短较长，也可以进行高精度地计算。
综上，对本发明的荧光检测装置和荧光检测方法进行了详细的说明，但本发明并不限定于上述实施方式，在不脱离本发明主题的范围内所进行的各种改良或改变均包括在本发明中。

Claims (10)

1.一种荧光检测装置，对接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光而得到的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括：
光源部，对照射测量对象物的激光进行强度调制并将其发射；
受光部，输出测量对象物被激光照射后所发出的荧光的荧光信号；
光源控制部，生成用于对射出自所述光源部的激光进行强度调制的调制信号；
第一处理部，包括：放大器，对输出自所述受光部的荧光信号进行放大；混频器，生成被放大的所述荧光信号的、相对于所述调制信号的相同相位成分和被放大的所述荧光信号的、相对于所述调制信号相位发生90度位移的90度相位成分；AD转换器，对所生成的所述相同相位成分和所述90度相位成分进行数字转换；
第二处理部，利用数字转换的所述相同相位成分和所述90度相位成分计算出荧光强度信号和荧光相对于所述调制信号的相位滞后，并利用所算出的所述荧光强度信号和所述相位滞后计算出测量对象物所发出的荧光的荧光强度和荧光弛豫时间；
信号控制部，对用以所述强度调制的调制信号DC成分的信号电平和所述放大器增益中的至少一方的操作量进行控制，以使所述荧光强度信号值进入预先设定的范围内。
2.如权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于，所述信号控制部找出所述荧光强度信号值进入预先设定范围内时的所述操作量后，所述第二处理部利用在该找出的所述操作量下所得到的荧光强度信号值和所述操作量，计算出测量对象物所发出的荧光的所述荧光强度，且利用所述相位滞后计算出测量对象物所发出的荧光的荧光弛豫时间。
3.如权利要求2所述的荧光检测装置，其特征在于，测量对象物由多个样品粒子构成，且所述样品粒子以恒定速度一个个间歇性地通过照射激光的测量场；
在所述信号控制部，当所述样品粒子开始通过照射激光的测量场后，马上开始对所述操作量的控制，以使所述荧光强度信号值进入预先设定的范围，且在所述样品粒子结束通过照射激光的测量场之前，找出所述荧光强度信号值进入预先设定的范围内的所述操作量，并利用在找出的所述操作量条件下所得到的所述相位滞后和所述调制信号频率，计算出所述荧光弛豫时间，同时利用进入预先设定的所述范围内的荧光强度信号值和所述操作量计算出所述荧光强度。
4.如权利要求2所述的荧光检测装置，其特征在于，所述测量对象物被放置在固定容器内，且在静止的状态下受到激光的照射；
所述信号控制部对所述操作量进行控制，以使所述荧光强度值进入预先设定的范围；
所述第二处理部在所述控制达到稳定状态时计算出所述荧光强度和所述荧光弛豫时间。
5.如权利要求1～4中任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，所述信号控制部除了控制所述操作量之外，还对所述强度调制的频率进行控制，以使所述荧光的相位滞后角度接近于45度，且利用对所述频率的控制达到稳定状态时的所述荧光强度信号值和相位滞后计算出所述荧光强度和所述荧光弛豫时间。
6.一种荧光检测方法，对接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光而得到的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括下述步骤：
设定用来对射出自激光光源部的激光进行强度调制的频率和DC成分的信号电平以生成调制信号，并利用该调制信号对激光进行调制；
获得测量对象物被所述激光照射后所发出的荧光的荧光信号；
对所述荧光信号进行放大，且生成进行所述放大的所述荧光信号的、相对于所述调制信号的相同相位成分和进行放大的所述荧光信号的、相对于所述调制信号相位发生90度位移的90度相位成分，并对所生成的所述相同相位成分和所述90度相位成分进行数字转换；
利用被数字转换的所述相同相位成分和所述90度相位成分计算出荧光强度和荧光相对于所述调制信号的相位滞后；
对所述DC成分的信号电平和所述放大增益中的至少一方的操作量进行控制，以使所述荧光强度进入预先设定的范围内；
利用在所述荧光强度值进入所述预先设定的范围内时的所述操作量下所得到的所述相同相位成分和所述90度相位成分，计算出荧光强度信号值和所述相位滞后，且利用所计算出的所述荧光强度信号值和所述相位滞后，计算出测量对象物所发出的荧光的荧光强度和荧光弛豫时间。
7.如权利要求6所述的荧光检测方法，其特征在于，找出所述荧光强度信号值进入预先设定范围内时的所述操作量后，利用在该找出的所述操作量的条件下所得到的荧光强度信号值和相位滞后，计算出测量对象物所发出的荧光的所述荧光强度和所述荧光弛豫时间。
8.如权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，测量对象物由多个样品粒子构成，且所述样品粒子以恒定速度一个个间歇性地通过照射激光的测量场；
当所述样品粒子开始通过照射激光的测量场后，马上开始对所述操作量的控制，以使所述荧光强度值进入预先设定的范围，且在所述样品粒子结束通过照射激光的测量场之前，找出所述荧光强度信号值进入预先设定的范围内的所述操作量，并利用在找出的所述操作量条件下所得到的所述相位滞后和所述调制信号频率，计算出所述荧光弛豫时间，同时利用进入预先设定的所述范围的荧光强度信号值和所述操作量计算出所述荧光强度。
9.如权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，所述测量对象物被放置在固定容器内，且在静止的状态下受到激光的照射；
对所述操作量进行控制，以使所述荧光强度值进入预先设定的范围，并利用所述控制达到稳定状态时的所述荧光强度信号值和测量对象物所发出的荧光的相位滞后，计算出所述荧光强度和所述荧光弛豫时间。
10.如权利要求6～9中任一项所述的荧光检测方法，其特征在于，在控制所述操作量的步骤中，除了控制所述操作量之外，还对所述强度调制的频率进行控制，以使所述荧光的相位滞后角度接近于45度，且利用对所述频率的控制达到稳定状态时的所述荧光强度信号值和相位滞后计算出所述荧光强度和所述荧光弛豫时间。
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