CN102302491B - 索拉非尼在治疗动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种式(I)的索拉非尼在制备用于治疗蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛的药物组合物中的应用。通过动物实验证实BAY 43-9006对SAH后脑血管痉挛具有显著抑制的效果，可以用来改善SAH后脑血管痉挛。

Description

索拉非尼在治疗动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物新用途技术领域，具体涉及一种索拉非尼在治疗动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的应用。 

背景技术

自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的年发病率约6～16/100 000人，约占脑卒中总发病率的6～8％，颅内动脉瘤破裂是自发性SAH的主要原因。脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)是动脉瘤性SAH后有潜在致残、致死性的一种常见并发症。数十年来，众多学者对CVS形成的病理过程进行了大量的基础和临床研究，但其确切发生机制至今仍未完全清楚。核转录因子κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)在炎症反应中起到重要调节作用，而活化的Raf-1激酶通过促进NF-κB-IκB复合物中IκB的降解是促使NF-κB活化的重要途径。 

动脉瘤性SAH后CVS的确切病理机制目前仍不十分清楚，治疗上也因此缺乏针对性。临床上对于SAH后CVS的防治方法主要有手术清除血凝块、脑脊液持续外引流等预防措施和3H治疗、钙离子拮抗剂的应用等治疗措施，但效果均不理想。由于CVS是多因素、多种机制综合作用的结果，因而防治的关键在于能够同时针对不同的机制逆转其发生和发展的过程。现阶段亟需一种能够控制动脉瘤性SAH后CVS的治疗手段来减轻脑血管痉挛的影响。本发明因此而来。 

索拉非尼(Sorafenib，BAY-43-9006)，分子式为C₂₁H₁₆ClF₃N₄O₃，分子量为464.8294，化学名为4-[4-[3-[4-Chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]-ureido]phenoxy]-N-methylpyridine-2-carboxamide，CAS No.为284461-73-0，其结构如式(I)所示， 

是拜耳公司开发的一种多靶向性的治疗肿瘤的口服药物。其用于治疗对标准疗法没有响应或不能耐受之胃肠道基质肿瘤和转移性肾细胞癌。能选择性地 靶向某些蛋白的受体，后者被认为在肿瘤生长过程中起着一种分子开关样的作用。 

索拉非尼是一种多激酶抑制剂。临床前研究显示，索拉非尼能同时抑制多种存在于细胞内和细胞表面的激酶，包括RAF激酶、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、KIT和FLT-3。由此可见，索拉非尼具有双重抗肿瘤效应，一方面，它可以通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长；另一方面，它又可通过抑制VEGFR和PDGFR而阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长. 

与口服溶液相比，索拉非尼片的相对生物利用度为38％～49％；高脂饮食可使索拉非尼生物利用度降低29％。索拉非尼达峰时间约为3小时，平均消除半衰期约为25～48小时，血浆蛋白结合率为99.5％。索拉非尼主要通过肝脏代谢酶CYP3A4进行氧化代谢，以及通过UGT1A9进行葡萄糖苷酸化代谢。目前已知索拉非尼有8种代谢产物，其中5种可在索拉非尼达到稳态后的患者血浆中检测到。索拉非尼主要以原形物(占总剂量51％)和代谢物方式随粪便排泄，有部分葡萄糖苷酸化代谢产物(占总剂量19％)随尿液排泄。 

发明内容

本发明目的在于提供一种索拉非尼在治疗动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的新用途，揭示了一种动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的新治疗途径。 

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是： 

一种式(I)的索拉非尼 

在制备用于治疗蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛的药物组合物中的应用。 

优选的，所述脑血管痉挛为自发性蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉 挛。 

优选的，所述脑血管痉挛为动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛。 

优选的，所述药物组合物包含药学上有效量的索拉非尼和药学上可接受的载体。 

本发明中，索拉非尼不限于该药物本身，还可以是其可药用的盐，索拉非尼的衍生物或如WO2000041698专利申请中所披露的各种索拉非尼的类似物；同时，本发明应用中还可以将索拉非尼替换为多靶点激酶抑制剂的其他药物。 

本发明中，可将本发明中的索拉非尼采用本领域常规的方法制备成适用于胃肠道给药或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选将索拉非尼制备成适用于胃肠道给药的药物制剂，其制剂形式可以为常规片剂或胶囊剂或控释、缓释制剂。在本发明中索拉非尼药物组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式或制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以为质量计为1％～99％，优选为10％～90％；本发明所述的药学上可接受的载体为组合物中制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不和本发明活性成分发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提，所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。 

本发明中，组合物的制备方法没有限制，索拉非尼直接做成制剂，或者分别或/和辅料混合后做成制剂，然后安装本领域常规的方式进行包装，与其他辅料混合制成制剂。 

本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。 

本发明通过动物实验证实BAY 43-9006对SAH后脑血管痉挛具有显著抑制的效果，可以用来改善SAH后脑血管痉挛。具体的，动物实验证实BAY43-9006能干预抑制Raf-1、ERK1/2和NF-κB的活化及减少IL-6和IL-1βmRNA的表达，同时减轻了血管痉挛的程度。其干预机制可能为Raf-1/ERK1/2和Raf-1/NF-κB信号通路在SAH后基底动脉呈现显著激活，Raf-1可能通过此二条通路参与脑血管痉挛的发生，应用Raf-1激酶抑制剂 可以减轻血管痉挛。 

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是： 

本发明采用枕大池二次注血大鼠SAH模型，通过对大鼠基底动脉形态学进行观察，并应用定量逆转录聚合酶链式反应(quantitive reversetranscription-polymerase chain reaction，Quantitative RT-PCR)、电泳迁移率转变试验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)和Western blot等方法证实了应用Raf-1激酶抑制剂对SAH后CVS的影响，从而提供了一种新的防治SAH后脑血管痉挛的手段。 

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述： 

图1为大鼠基底动脉HE染色检查；其中A：对照组，B：SAH组，C：Vehicle组，D：BAY 43-9006组； 

图2为基底动脉管径平均面积比较，其中^＊P＜0.05vs对照组，^#P＜0.05vs Vehicle组，^nsP＞0.05 vs SAH组； 

图3为基底动脉壁磷酸化Raf-1免疫组化表达，其中A：对照组，B：SAH组，C：Vehicle组，D：BAY 43-9006组； 

图4为基底动脉壁磷酸化Raf-1免疫组化半定量得分比较，其中^＊P＜0.05vs对照组，^#P＜0.05 vs Vehicle组，^nsP＞0.05 vs SAH组； 

图5为基底动脉壁磷酸化Raf-1 Western blot表达； 

图6为基底动脉壁磷酸化Raf-1相对表达量比较；其中^＊P＜0.05 vs对照组，^#P＜0.05 vs Vehicle组，^nsP＞0.05 vs SAH组； 

图7为基底动脉壁磷酸化ERK1/2 Western blot表达； 

图8为基底动脉壁磷酸化ERK1/2相对表达量比较；其中^＊P＜0.05 vs对照组，^#P＜0.05 vs Vehicle组，^nsP＞0.05 vs SAH组； 

图9为基底动脉壁IκB-α Western blot表达； 

图10为基底动脉壁IκB-α相对表达量比较；其中^＊P＜0.05 vs对照组， ^#P＜0.05 vs Vehicle组，^nsP＞0.05 vs SAH组； 

图11为基底动脉壁胞核内NF-κB的表达；其中A：对照组，B：SAH组，C：Vehicle组，D：BAY 43-9006组； 

图12为基底动脉壁胞核内NF-κB的相对表达量比较；其中^＊P＜0.05 vs 对照组，^#P＜0.05 vs Vehicle组，^nsP＞0.05 vs SAH组； 

图13为基底动脉壁IL-6、IL-1βmRNA的相对表达量比较，其中^＊P＜0.05vs对照组，^#P＜0.05 vs Vehicle组，^nsP＞0.05 vs SAH组。 

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 

实施例1 BAY 43-9006对SAH后脑血管痉挛的影响 

材料和方法 

一、材料 

1、主要试剂及药品 

Trizol总RNA抽提试剂购自美国Invitrogen公司；焦碳酸二乙脂(DEPC)购自美国Sigma公司；M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司；Taq DNA聚合酶购自美国New England Biolabs公司；dNTPs购自美国NewEngland Biolabs公司；六随机引物购自美国Promega公司；SYBR Green I购自日本Takara公司；氯仿购自上海化学试剂公司；异丙醇购自上海化学试剂公司；无水乙醇购自上海化学试剂公司。 

兔抗phospho-ERK1/2(Thr202/Tyr204)抗体，购自美国cell signaling公司；兔抗IkB-α(C-21)，购自美国santa cruz公司。 

PCR引物：从NCBI Genbank文库中查到大鼠IL-6、IL-1β和β-actin基因cDNA序列，应用Premer5.0软件程序设计有意义引物，并由上海生工生物有限公司合成，具体序列如下： 

IL-6(224bp)  Sense：5′-AAGACAAAGCCAGAGTCATTCA-3′； 

Antisense：5′-TTGCCGAGTAGACCTCATAGTG-3′； 

IL-1β(292bp)Sense：5′-TATGTCTTGCCCGTGGAGC-3′； 

Antisense：5′-CACAGGGATTTTGTCGTTGC-3′； 

β-actin(150bp) Sense：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′； 

Antisense：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 

生物素标记EMSA探针-NF-κB，购自江苏碧云天生物技术研究所，探 针序列：5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′； 

3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5′。 

胞核-胞浆蛋白制备试剂盒，购自北京普利莱基因技术有限公司； 化学发光EMSA试剂盒，购自美国Pierce公司；尼龙膜(进口分装)，购自江苏碧云天生物技术研究所；BAY 43-9006，购自德国拜耳公司；聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)，购自美国Sigma公司。 

2、主要仪器 

NanoDrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计，购自美国NanoDrop公司；荧光定量PCR仪(FTC2000)，购自加拿大Funglyn Biotech公司；紫外线交联仪(CX-2000)，购自美国UVP公司。 

二、方法 

1、BAY 43-9006的准备 

将BAY 43-9006溶解在由聚氧乙烯蓖麻油和95％乙醇按1∶1体积混匀的混合液体中(考虑到灌胃时的液体量，按200mg BAY 43-9006溶于8ml混合液)，装于棕色试剂瓶避光保存，每三天重新配制一次，临用前加水稀释，按聚氧乙烯蓖麻油/乙醇/水＝1∶1∶6的比例混匀再灌胃使用。 

2、实验动物及分组 

健康清洁级SD大鼠，体重300～350g，雄性，由苏州大学医学部实验动物中心提供。随机分为对照组，SAH组，SAH+Vehicle组，SAH+BAY43-9006组，共四组，每组36只，如有意外死亡，及时补足。枕大池二次注血法建立SAH模型，SAH组不予处理，BAY 43-9006组在一次注血(注射自体动脉血)后即开始以灌胃方式按30mg/Kg/次，2次/天给药，Vehicle组和治疗组一样，只是灌胃所使用的是溶解BAY 43-9006的溶媒，对照组接受和SAH组一样的整套模型制作过程，仅将注射自体动脉血改为等量的37℃的生理盐水，所有动物在一次“注血”后5天处死。每组6只经灌注固定后用于形态学观察及免疫组化检查，12只用于蛋白抽提行Western blot检测，12只用来行EMSA检查，另外6只行RT-PCR检查。 

3、大鼠二次注血模型的制备 

采用枕大池二次注血法制作SAH模型。动物经腹腔注射10％水合氯醛0.35ml/100g体重麻醉成功后，俯卧位固定于动物手术台上。剪去枕颈部手 术区毛发，安尔碘消毒，枕外粗隆下方寰枕交界部正中作长约1cm的纵形切口分离肌肉。手术显微镜下找到寰枕筋膜，鼠下颌内收，用27号针头经寰枕筋膜缓缓刺入枕大池，深度约1mm，回抽出0.1ml清亮脑脊液。再使大鼠仰卧于手术台，消毒鼠尾，在鼠尾腹侧面正中作一0.5～1cm长之皮肤切口，分离出尾动脉，持27号针穿刺尾动脉抽取非肝素化动脉血0.3ml，结扎尾动脉，立即将动物俯卧于手术台，按上面方法缓慢(约2min)注入枕大池蛛网膜下腔。筋膜穿刺处用明胶海绵加ZT胶修补封闭，并消毒缝合伤口，皮下注射20ml生理盐水以防手术造成的脱水。术毕动物取头低30°俯卧位并保持30min，以利所注血液积聚在基底动脉周围。穿刺器具及穿刺要求无菌操作。48hr后重复上述过程行第二次注血。对照组除注入枕大池为等量的生理盐水外，手术操作与SAH模型相同。手术过程中维持室温25℃，体温维持在37℃左右。建立动物模型手术后行血气分析，术后每天监测体温变化。取一次注血后5天为研究时间窗。 

4、灌注固定与标本取材 

动物经10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，胸部备皮，自剑突下沿胸骨两侧向上U形剪开胸腔，打开心包，暴露心脏及主动脉根部，绕主动脉根部预置一丝线，将连接静脉输液装置尖端磨平的针头经左心室插入升主动脉约0.5cm，预置丝线结扎固定穿刺针，血管钳在膈肌水平夹闭腹主动脉和下腔静脉以阻断下腔静脉回流，调整输液装置的高度，吊瓶距鼠心脏平面约1米(约100cmH2O)，剪开右心耳，松开输液夹开始灌注，先以0.1mol/L PBS(pH 7.4)约300ml灌注冲洗出血管内血液，待右心耳流出液颜色清亮后，再用4％多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液300ml灌注固定，灌注速度先快后慢，迅速开颅取含基底动脉全长的脑干和脑组织，操作时注意避免基底动脉牵拉等损伤。光镜常规病理和免疫组化检查标本在4％多聚甲醛溶液中固定24hr，备组织学检查。另外12只动物用PBS灌注至右心耳流出液颜色清亮后，将大鼠置于冰块上迅速开颅，在显微镜下分离基底动脉及Willis环动脉，清除粘连之结缔组织，立即放入液氮中保存备用。 

5、基底动脉形态学检测 

取材组织块固定后，将整个基底动脉分成上中下3段，每段中间横断切取约3mm长的动脉连带脑干用来常规石蜡包埋，连续横行切片，厚度5μm。 

5.1 苏木素-伊红(Haematoxylin and eosin stain，HE)染色 

主要操作步骤如下：(1)切片常规二甲苯脱蜡，经各级酒精至水。(2)苏木素染色5～10min。(3)1％盐酸酒精分化30sec。(4)自来水冲洗15min返蓝。(5)置伊红液染色5～10min，自来水冲洗1min。(6)梯度酒精分化脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 

5.2 动脉管径面积的测定 

动脉横断面形态由于各种原因并不一定能显示为规则的圆形，为了比较管径的大小，本实验量取管径的周长，取三段的平均值，然后利用数学公式(面积＝p2/4π，p为周长)来推导出管径在圆形时的面积，由此而作痉挛程度的比较。周长的测定利用软件ImageJ(version 1.32)来完成。 

6、基底动脉壁磷酸化Raf-1免疫组化检查 

免疫组织化学检查采用SABC法，主要操作步骤如下：(1)石蜡切片厚5μm，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，56℃烤片2hr。(2)二甲苯常规脱蜡至水。(3)蒸馏水冲洗。(4)抗原修复：烧杯中放入PH6.0的枸橼酸钠缓冲液，加热至沸，将待用切片放入杯中微波照射，95℃抵挡维持5min×2次。取出切片置TBS中，室温条件下静置20min。(5)滴加0.3％ H₂O₂甲醇液，阻断内源性过氧化物酶活性，室温静置10min。(6)每张切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温条件放置20min，甩去多余液体。(7)每张切片滴加一抗phospho-Raf-1(Ser338/Tyr340)，工作浓度1∶100，37℃湿盒中孵育1hr。(8)滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20min，PBS洗5min×3次。(9)滴加试剂SABC，37℃孵育20min，PBS洗5min×3次。(10)滴加0.04％DAB+0.03％H2O2显色5～10min，显微镜下控制显色强度，自来水洗涤。(11)苏木素衬染。(12)酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。检测结果判断：显微镜下观察，以细胞浆或胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞，否则为阴性细胞。半定量判断phospho-Raf-1表达的程度，“0”代表血管壁没有可见的阳性细胞，“1”代表仅有较低密度的阳性细胞，“2”代表有中等密度阳性细胞，“3”代表较高密度阳性细胞，“4”代表有高密度阳性细胞。高倍镜视野(×400)下每张切片任选5个视野，计数平均阳性细胞表达程度。 

7、Western blot检测基底动脉壁磷酸化Raf-1、磷酸化ERK1/2和IκB-α 

血管从液氮中取出后，组织剪切成细小碎片，加入200μl的预冷的含终 浓度为1mM的PMSF RIPA裂解液(裂解液成分：50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1％ NP-40，0.1％ SDS)。冰浴中充分匀浆后离心(12,000g，10min，4℃)，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。取出上样样品与等体积2×SDS上样缓冲液混合，混匀后沸水中煮3min使蛋白变性。每个样品取等量(30μg)的蛋白上样行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转移到PDVF膜，丽春红染色观察转移效果，根据标准分子量蛋白确定目的蛋白的条带位置。膜放入杂交袋，用含5％脱脂奶粉和0.5％Tween-20的TBS液室温预杂交1hr，封闭好的膜与一抗phospho-Raf-1(用含5％脱脂奶粉和0.5％Tween-20的TBS液稀释，1∶200)室温孵育1hr，TBST洗膜3次，每次5min。再将膜与HRP标记的羊抗兔IgG(封闭液稀释，1∶5000)室温孵育1hr，TBST洗膜3次，每次5min，然后TBS洗膜一次，5min。将化学发光试剂加在PVDF膜的正面，孵育大概约5min，暗室内X胶片曝光，将胶片放入显影液中，出现条带后，立即放入定影液中，流水冲洗胶片后晾干对胶片进行扫描，然后用UVP凝胶图象处理系统Labworks4.6软件分析目的条带的灰度值。本实验把3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参一抗，根据目的条带与GAPDH条带吸光度的比值表示待测蛋白含量。 

8、EMSA检测胞核NF-κB活性 

按试剂盒操作说明进行。(1)核蛋白抽提：将标本尽可能剪成细小的碎片，用PBS液振荡冲洗后弃除PBS液，加入预冷的细胞浆蛋白抽提试剂A(加入蛋白酶抑制剂PMSF，终浓度为1mM)，并在玻璃匀浆器内冰浴中充分匀浆后离心(1,000g，4℃，5min)，弃上清。细胞沉淀中加入100μl的细胞浆蛋白抽提试剂A，再加入5μl细胞浆蛋白抽提试剂B，最高速剧烈振荡10sec，冰浴1min后离心(1,000g，4℃，5min)，弃上清。细胞沉淀中加入100μl的细胞浆蛋白抽提试剂A，4℃ 1,000g离心5min，弃上清。加入50μl的细胞核蛋白抽提试剂，最高速剧烈振荡10sec，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，放回冰浴中，每5min最高速剧烈振荡10sec，共30min。4℃ 12,000g离心5min，立即吸取上清至预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。蛋白含量采用BCA蛋白浓度测定法测定。(2)设置EMSA结合反应体系：将提取的核蛋白4μg与Binding Buffer(1X)2μl、2.5％ Glycerol 1μl、Ultrapure Water 11μl、5mM MgCl₂ 1μl、50ng/μl Poly(dI·dC)1μl和0.05％NP-40 1μl混匀，室温下放置10min，然后加入标记好的生物素标记探针2μl，混匀成20μl的结合反应体系，室温放置20min，再加入5μl EMSA上样缓冲液(5X)到每个20μl的结合反应体系，混匀后立即上样(每个样上20μl)于预先配置好的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶。本实验设置阴性对照反应(不含核蛋白提取物)和探针冷竞争反应(加入未标记的探针)作为对照。(3)电泳：按照100V的电压电泳。电泳至EMSA上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。(4)转膜：取出EMSA胶放置到尼龙膜上(尼龙膜浸泡在0.5X TBE至少10min)，以电转膜装置(380mA，30min)把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。(5)交联：用紫外交联仪选择254nm紫外波长，120mJ/cm²，交联60sec。(6)封闭：加20ml封闭液摇床上孵育15min；制备conjugate/blocking buffer solution：20μl封闭液加入66.7μl StabilizedStreptavidin-HRP(1∶300稀释)；然后将膜从封闭液取出，放入conjugate/blocking buffer solution中，摇床上孵育15min；1X洗液(120ml超纯水加入40ml 4X Wash Buffer)20ml洗5次，每次5min，平衡液平衡5min。(7)化学发光检测：将化学发光试剂加在尼龙膜的正面，孵育大概约5min，暗室内X胶片曝光，显影定影，流水冲洗胶片后晾干对胶片进行扫描，然后用UVP凝胶图象处理系统Labworks4.6软件分析目的条带的灰度值。 

9、定量RT-PCR检测基底动脉IL-6、IL-1βmRNA表达 

9.1 RNA的提取：(1)组织匀浆：迅速剪碎液氮保存的组织标本，加入约1ml TRIzol试剂，在玻璃匀浆器中将组织匀浆，直至组织块溶化。如有不溶物，可于4℃ 12000g离心10min去除。(2)将上述匀浆液室温放置5min，待核酸和蛋白充分解离。每1ml TRIzol试剂用量的匀浆液中加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，手动剧烈震摇15sec，然后室温静置2～3min。(3)4℃ 10,000g离心10min。(4)小心吸取上层水相(无色)加入到新试管中，同时计算所吸取的水相体积。(5)加入所吸取水相等体积预冷的异丙醇，盖紧管盖，轻轻摇匀。(6)室温静置10min，待RNA充分沉淀。(7)4℃ 10,000g离心10min。(8)将上清弃除，每管加入1ml 75％乙醇润洗，盖紧管盖，轻轻晃动试管，以去除残留的异丙醇和盐份。4℃ 7,500g离心5min。 (9)将上清弃除，打开管盖，将RNA沉淀干燥(室温挥发或真空干燥)。(10)将RNA沉淀溶解于50μl的无RNase水中。(11)测定RNA浓度和纯度：按照 

ND-1000使用说明测定RNA浓度和纯度，样品RNA浓度计算公式为：A260×40ng/μl。RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1表明纯度较好。 

9.2反转录：在30μl反转录反应体系中进行，成分如下：RNA7μl，M-MLV逆转录酶1μl，10nMdNTPs 1μl，随机引物(100pmol/μl)1μl，RNA热酶抑制剂0.5μl，5×Buffer(250mM Tris-HCL pH8.3，375mM KCL，15mMMgCL2)6μl，加DEPC处理的双蒸水至30μl，轻摇均匀后37℃×3min，42℃×50min，85℃5min，冰浴3～5min，-20℃保存备用。 

9.3荧光定量PCR扩增：在25μl反应体积中进行，成分如下：1)含上述逆转录产物2μl，10×PCR缓冲液(250mM Tris-HCL pH8.3)2.5μl，25mMMgCL2 3μl，10mM dNTPs 0.5μl，上游引物0.5μl(10pmol/μl)，下游引物0.5μl(10pmol/μl)，TaqDNA聚合酶0.25μl，SYBR Green I 0.25μl加双蒸水至25μl。荧光定量PCR扩增条件的设置：94℃预变性4min；94℃变性20sec、60℃退火30sec、72℃延伸30sec，循环35次，72℃检测信号。 

10、统计学分析 

数据以均数±标准差 

表示，采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Student-Newman-Keuls检验进行两两分析比较，以P＜0.05为有统计学差异，SAS 8.0统计软件进行数据分析。 

三、结果 

1、一般情况观察 

各组动物在接受手术当天在摄食、饮水及活动等方面较正常动物明显减少，第二天起即明显改善，各SAH组间在摄食及活动等方面未见明显差异，但较对照组各SAH组摄食及活动略减少。各组体温、动脉血气监测无明显差异。 

2、形态学检测 

2.1 大体观察 

对照组蛛网膜下腔无任何积血。SAH组、Vehicle组和BAY 43-9006组 蛛网膜下腔积血明显，暗红色的凝血块多分布在脑底部，主要聚集在基底池和基底动脉周围。 

2.2 光镜检查(HE) 

在光镜下，对照组基底动脉管壁较薄，血管管腔光滑，内皮细胞排列平整，无坏死、脱落，形成连续的单细胞层，胞核无固缩、浓染；内弹力层平整、无皱缩和断裂；血管平滑肌细胞呈扁平状，细胞器完整。而SAH组，可见基底动脉管径变窄，管壁增厚，内弹力层呈波纹状皱缩，内皮细胞肿胀，排列不平整，被邻近波纹状内弹力层扭曲而突向管腔内，偶可见细胞核固缩；平滑肌细胞肥大、扭曲变形。Vehicle组与SAH组表现一致。BAY 43-9006组血管管腔狭窄程度较SAH组缓解，管壁变薄，内皮细胞变性、坏死减轻，内弹力层轻度卷曲，平滑肌细胞肥大、扭曲变形缓解，少量平滑肌细胞变性坏死(见图1)。 

2.3、基底动脉横断面积的检测结果 

对照组基底动脉管径平均面积为56,115±9,043μm2，SAH组较对照组变窄，平均面积约17,225±4,436μm2，Vehicle组与SAH组面积接近，平均面积为19,780±7,870μm2，BAY 43-9006组管腔狭窄明显缓解，平均面积为31,513±5,426μm2(见图2)。 

3、基底动脉壁磷酸化Raf-1免疫组化检测结果 

对照组基底动脉壁没有或仅有少量细胞呈较弱的磷酸化Raf-1阳性免疫反应，而SAH组阳性细胞数量明显增加，主要表达在内膜层及平滑肌层，外膜层亦有少量表达，定位主要在胞膜、胞浆。Vehicle组与SAH组与表达程度类似，BAY 43-9006组阳性表达细胞明显弱于SAH和Vehicle组。半定量测定示各组平均得分分别为：对照组(0.40)，SAH组(3.40)，Vehicle组(3.47)，BAY 43-9006组(1.97)。与对照组比较，SAH组、Vehicle组基底动脉壁磷酸化Raf-1表达明显上调(P＜0.05)，而SAH组与Vehicle组表达无明显差异(P＜0.05)；与SAH与Vehicle组比，BAY 43-9006组血管壁磷酸化Raf-1表达已明显减弱(P＜0.05)(见图3，图4)。 

4、基底动脉壁磷酸化Raf-1 Western blot检测结果 

磷酸化Raf-1在对照组仅有少量表达，而在SAH组、Vehicle组表达均明显增加，BAY 43-9006组表达明显下降。和对照组比，SAH组、Vehicle 组的磷酸化Raf-1表达差异有统计学意义(P＜0.05)，BAY 43-9006组和SAH组、Vehicle组比，组间差异有统计学意义(P＜0.05)(见图5，图6)。 

5、基底动脉壁磷酸化ERK1/2 Western blot检测结果 

如图7、图8所示，磷酸化ERK1/2在对照组仅有少量表达，而在SAH组、Vehicle组表达均明显增加，BAY 43-9006组表达则明显下降，其表达变化趋势与磷酸化Raf-1表达相一致。和对照组比，SAH组、Vehicle组的磷酸化ERK1/2表达差异有统计学意义(P＜0.05)，BAY 43-9006组和SAH组、Vehicle组比，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。 

6、基底动脉壁IκB-α Western blot检测结果 

如图9、图10所示，IκB-α在对照组有较多量表达，而在SAH组、Vehicle组表达却明显下降，BAY 43-9006组表达则又较SAH组有增加；和对照组比，SAH组、Vehicle组的IκB-α表达差异有统计学意义(P＜0.05)，BAY43-9006组和SAH组、Vehicle组比，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。 

7、基底动脉壁EMSA测定胞核内NF-κB的含量 

如图11、图12所示，自左向右泳道顺序依次为冷竞争、对照组、SAH组、Vehicle组、BAY 43-9006组、对照组、SAH组、Vehicle组、BAY 43-9006组和阴性对照。SAH组和Vehicle组条带的面积和灰度较对照组更为明显(P＜0.05)，而BAY 43-9006组较前两组表达要弱(P＜0.05)。与IκB-α相对比，两者表达变化趋势相反。

8、基底动脉壁IL-6、IL-1βmRNA表达的变化 

对照组基底动脉壁IL-6、IL-1βmRNA有少量表达。与对照组相比，SAH组IL-6、IL-1βmRNA表达明显上调(P＜0.05)，其中IL-6增加约2.55倍，IL-1β增加约4.39倍；Vehicle组IL-6、IL-1βmRNA表达较对照组也明显增加(P＜0.05)，分别增加约2.80倍和3.82倍，但与SAH组比较差异不明显(P＞0.05)；BAY 43-9006组IL-6、IL-1βmRNA表达较SAH组明显下调(P＜0.05)(见图13)。 

本发明利用大鼠枕大池二次注血模型证实，在血管痉挛的高峰期(SAH5天)，应用蛋白印迹法显示磷酸化ERK1/2的表达水平较对照组表达显著上调，这与形态学上血管壁平滑肌细胞增生、管壁增厚和管腔收缩狭窄的表现相一致，表明在血管痉挛的过程中ERK1/2得到了明显激活，ERK1/2在SAH 后CVS的发生中可能起到重要作用。本发明利用EMSA法检测了脑血管壁胞核NF-κB的活性水平，结果显示SAH组的NF-κB活化程度明显高于对照组的水平，NF-κB的活性水平与血管壁的痉挛呈正相关；同时本发明运用蛋白印迹法检测了脑血管壁IκB的蛋白水平，结果提示IκB在对照组的表达水平明显高于SAH组，IκB的表达与NF-κB活性水平呈负相关，IκB的降解增加伴随有NF-κB活性的增高，进一步证实了在痉挛血管壁中NF-κB的激活是依靠IκB的降解得以实现的。除此之外，本发明利用定量PCR对SAH后脑血管壁基因受NF-κB调控的IL-6、IL-1β mRNA进行检测，发现两者的表达较对照组明显上调，分别增加约2.55和4.39倍，不仅再次提示了炎症反应参与了CVS的发生，同时也验证了NF-κB的激活可以促进促炎因子在基因水平的转录，从而发挥其在炎症反应中的调节作用。这些都表明，在血管痉挛的过程中NF-κB得到了明显激活，NF-κB可能通过炎症反应参与到SAH后CVS的发生过程中。 

本实施例令人惊奇的发现，BAY 43-9006部分抑制了Raf-1的活化，也使得ERK1/2的活性得到了明显抑制，形态学上血管痉挛的程度、管壁的厚度等得到了相应地减轻。Raf-1通过激活其下游激酶ERK1/2，并由此可能引起血管壁细胞增生及平滑肌细胞的持续收缩而参与了脑血管的痉挛发生，通过抑制Raf-1的活性来抑制ERK1/2的激活可以减轻脑血管痉挛的程度。在部分抑制了Raf-1的活化后，NF-κB的活性也明显降低，与之相对应的是IκB蛋白的增加和IL-6、IL-1β mRNA表达的明显下调。SAH后血管壁Raf-1激酶的过度活化，增加了IκB蛋白降解，导致NF-κB的活性升高，进而上调了细胞因子等促炎性因子的表达，通过加重血管壁的炎症反应参与到了CVS的发生中，抑制Raf-1的过度活化可以降低血管壁的炎症反应而减轻脑血管痉挛，因此，通过抑制Raf-1治疗脑血管痉挛的同时或许会对SAH引起的脑损伤有一定的保护作用，这可能是机制所在。 

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 

Claims (2)

1.一种式（I）的索拉非尼

在制备用于治疗动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的药物组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物组合物包含药学上有效量的索拉非尼和药学上可接受的载体。

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