CN102154465A - 一种含复脑素的红花的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物科学技术领域，由于红花的重要活性成分复脑素含量的高低，直接影响红花品质。本发明采用cDNA-AFLP对两者的表达特性进行分析，分离与复脑素密切相关的差异表达基因，通过RT-PCR进一步验证其特征基因型及cDNA-AFLP方法的正确性。本发明获得的特异性DNA片段具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明将上述特异性DNA片段用于筛选含复脑素的红花品种，进而为实现红花高品质性状的定向调控提供有效途径。

Description

一种含复脑素的红花的筛选方法

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及一种高复脑素含量的红花的筛选方法。

背景技术

红花Carthmus tinctorius L.为菊科植物红花的干燥管状花，临床应用广泛。主要化学成分有黄酮类、吲哚类、木脂素类、烷基二醇类等。其中山奈酚-3-O-芸香糖苷，英文名：Nicotiflorin，俗称复脑素，缩写为FNS：)是红花的重要活性成分之一，具有抗心肌缺血、脑缺血、保护脑神经元细胞等多种药理活性，对心脑血管疾病有很好的防治作用，具有很好的应用前景(详见参考文献：1.郭美丽，张戈，张汉明：复脑素在心脑血管疾病中的应用.中专利ZL01131942.9；2.Runping Li，Meili Guo，Ge Zhang，Xiongfei Xu，QuanLi：Nicotiflorin reduces cerebral ischemic damage and upregulates endothelialnitric oxide synthase in primarily cultured rat cerebral blood vessel endothelialcells.Ethnopharmacology，2006.107(1)：143-150；3.Runping Li，Meili Guo，GeZhang，Xiongfei Xu，and Quan Li：Neuroprotection of nicotiflorin in permanentfocal cerebral ischemia and in neuronal cultures.Biological & PharmaceuticalBulletin，2006.29(9)：1868-1872)。因此，红花中FNS含量的高低，直接影响红花品质的优劣。对红花品质相关功能基因进行研究，对提高红花的产量和质量具有重要意义。目前传统的筛选含FNS的红花品种的方法有高效液相方法(张戈，郭美丽，李颖，张汉明，苏中武：不同品种红花黄酮类成分的HPLC含量测定及其遗传稳定性研究中草药2004，35(12)：1411-1414)，但此方法需将红花药材成品晒干并用含水溶剂提取得到FNS的提取物后，再用纯度高的FNS为对照品进行含量测定后才能检测到，而直接应用基因条带筛选可不需对照品，直接从新鲜红花材料中筛选含FNS的品种。

cDNA-AFLP技术(cDNA amplified fragment length polymorphism)，是Bachem等将AFLP技术应用于mRNA表达差异分析的mRNA指纹图谱技术，广泛应用于植物生长发育过程基因分离与差异表达特性的研究。分群分类方法(BSA)，是由Michelmore等(Michelmore R W et al.Identification of markers todisease resistance genes by Bulked Segregant analysis.A rapid method to detectmarders in specific genomic regions by using segregating populations.Proc NatlAcad Sci USA，1991，88：9828-9832)首先提出的一种筛选分子标记的高效方法。即按照选择目标把单交组合产生的F2代、回交群体或者DH群体的个体分成两个混合群体，这样在两个群体之间除了目的性状以外，遗传背景是一致的，具有和近等基因系相似的遗传组成，是对近等基因系的原理的一种突破。通过对这两个群体进行cDNA-AFLP引物的筛选可以找到与目的基因相连锁的标记。cDNA-AFLP和BSA的结合可以大大地提高筛选的效率。

目前尚无应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含FNS的红花进行差异表达分析。本发明的目的在于利用cDNA-AFLP技术，结合BSA法在红花中找到与FNS紧密连锁的基因，继而提供一种筛选FNS的红花品种的方法。

发明内容

本发明目的是提供一种含复脑素(FNS)的红花的筛选方法。

本发明应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含FNS的红花进行差异表达分析，在红花中找到与FNS紧密连锁的1条基因，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。具体方法如下：

本发明以高FNS含量的红花No.25为父本，不含FNS的红花品系No.16为母本，进行杂交，获得F1代种子，F1代种子进行自交加代获得的F2种子，继续种植，从单粒F2种子获得F2代群体共计215个单株。然后进行以下步骤：

1.根据F₂代群体的FNS的含量有无，取等量含FNS的F₂代个体的花冠混成有池，另取不含FNS的F₂代个体的花冠混成无池；

2.提取红花总RNA，反转录成双链cDNA；

3.通过cDNA-AFLP对含有FNS与不含FNS的红花的差异表达分析，在PstI-CG/MseI-TT引物组合中获得TDF-2′一条片段

4.对TDF-2′片段进行回收，克隆和测序。TDF-2′具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种含FNS的红花的筛选方法，该方法是用cDNA序列分析方法鉴定红花基因中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

上述序列分析方法包括RT-PCR方法、Northerning Bloting法以及cDNA末端快速扩增(RACE)法等。

上述方法包括以下步骤：

A、根据TDF-2′(SEQ ID No.1)序列设计并合成RT-PCR引物，

TDF-2′引物：S2：5’-TAGCAGATTGGGAGTT-3’

A2：5’-CTAAGAGCAGGGTTTG-3’

B、提取红花的总RNA；

C、以红花总RNA为模板，翻转录成第一链cDNA；

D、以第一链cDNA为模板加入合成的引物，进行PCR扩增；

E、琼脂糖电泳，紫外显色；

F、测序。

在含FNS的红花中得到与SEQ ID NO.1相同序列的基因，而在不含FNS的的红花中未得到，证明cDNA-AFLP实验的可靠性。

按照上述筛选含FNS红花的方法，在含FNS的红花品种和不含FNS的红花品种共12个不同红花品种之间应用此方法，均发现在含有FNS的红花中有与TDF-2′相同序列的基因片段，而在不含FNS的红花中不存在。

本发明为筛选含FNS的红花品种，进而为实现红花高品质性状的定向调控奠定基础。

附图说明

图1：红花cDNA-AFLP差异表达的银染结果。

箭头代表TDF-2′；M：DL 2000 DNA相对分子标记；1-13：不含FNS的F₂代单株；14：母本；15-19：含FNS的F₂代单株；20：父本；21：不含FNS池；22：含FNS池；引物：PstI-CG/MseI-TT

图2：cDNA-AFLP差异表达片段在RT-PCR的验证结果。

1-5含FNS的F₂代单株；8-14：不含FNS的F₂代单株

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：本发明TDF-2′片段的分离

1.应用高效液相色谱方法、薄层色谱法测定F₂代群体的FNS的含量，检测其有无。

2.根据测定结果各取含与不含FNS的红花花冠，提取总RNA，并转化成双链cDNA。

3.构建含与不含FNS的近等基因池，取含FNS单株的cDNA各1μg，共10株混成有池；另取不含FNS的cDNA单株各1μg共10株混成无池。

4.cDNA-AFLP差异表达分析：

(1)限制性酶切与接头连接：采用PstI和MseI两种限制性内切酶对cDNA双酶切，酶切时间37℃6h；然后用T₄DNA连接酶将PstI和MseI接头与酶切片段连接，16℃12h。

(2)片段的预扩增：本研究用连接产物做模板，采用预扩增引物组合P₀₀/M₀₀(5′-GACTGCGTACATGCAG-3′/5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′)。对连接产物稀释10倍。在Biometra PTC-200型PCR仪上按以下程序扩增：94℃3min，94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保温。预扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上检测，-20℃保存备用。

(3)选择性扩增：采用选择性扩增引物组合P_+NN/M_+NN(5′-GACTGCGTACATGCAGNN-3′/5′-GATGAGTCCTGAGTAANN-3′(N代表ACGT，N代表ACGT任意一种，P1-P16共16条引物，M1-M16共16条引物))，对预扩产物稀释150倍。选扩反应体系根据Bachem等体系作略微调整。扩增程序：94℃3min，94℃30s，65℃30s每循环降低0.7℃，72℃1min 12个循环，94℃30s，退火温度56℃30s。72℃1min 30个循环，72℃10min；4℃保温。扩增产物在1.5％琼脂糖检测，-20℃保存备用。

(4)cDNA-AFLP扩增产物的电泳：按30V/cm的电压进行30min预电泳。扩增产物∶溴酚兰8∶3混合，95℃变性8min，立即冰浴。去除在预电泳时扩散出来的尿素后加样，1800V电泳，恒压。

(5)银染检测：固定胶：将胶浸在固定液中振荡20min至电泳染料颜色消失。用超纯水洗胶三次，每次8min。染色30min。将胶浸入超纯水中、取出沥水、立即放入盛有预冷显色液显色：胶在摇床上摇动至出现模板带或可见第一条带。将胶转至剩余的1升预冷的显色液中，继续显色3-5min或至全部条带显现出来。加入1升固定/终止溶液，在摇床上反应2-3min，终止显色反应。用超纯水漂洗聚丙烯酰胺凝胶两次，每次5min，室温放置干胶，如图1所示。

5.TDF-2′的分离克隆和测序：将引物PstI-CG/MseI-TT筛选得到的特异性片段TDF-2′，从PAGE胶上回收，并以此片段为模板作PCR。琼脂糖扩增产物采用Axygen生物技术(杭州)有限公司AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行回收，回收的多态性片段连接至pMD-18T vector中，并转化E.coli DH5α。通过氨苄抗性筛选转化子，挑选阳性克隆，将阳性克隆扩倍后送往Introgen公司测序，测得序列为292bp如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1(TDF-2′)292bp

CGTTCTTAGATGTAGCCTATCTTTTATTGTATGGGAACTTACCTTCTCAGAGCCAGTTA

GCAGATTGGGAGTTCACTGTAGCACAACATTCAGCTGTTCCACAGGGAATCTTGGAT

ATCATACATGCCATGCCTCATGATGCTCATCCAATGGGTGTTCTGGTCAGTGCAATGA

GCGCCCTTTCTGTACTTCATCCTGATGCAAACCCTGCTCTTAGAGGTCAAGATCTGTA

CAAGTCTAAGCCAGTGCGAGATAAGCAAATAGTGCGCATACTTGGGAAGGCACCAA

CTAT

实施例2：RT-PCR对TDF-2′基因表达验证：

A、根据TDF-2′(SEQ ID No.1)序列设计并合成RT-PCR引物如下：

S2：5’-TAGCAGATTGGGAGTT-3’(SEQ ID No.2)

A2：5’-CTAAGAGCAGGGTTTG-3’(SEQ ID No.3)

B、提取石河子红花的总RNA；

C、以红花总RNA为模板，翻转录成第一链cDNA；

D、以第一链cDNA为模板，加入合成的引物，进行PCR扩增；

E、琼脂糖电泳，紫外显色。

F、测序。

在含FNS的红花中得到与SEQ ID No.1相同序列的基因，而在不含FNS的红花中未得到，证明cDNA-AFLP实验的可靠性，如图2所示。

实施例3：本筛选方法的应用：

1.分别提取各产地含与不含FNS红花总RNA，转成双链cDNA。

2.应用PstI-CG/MseI-TT引物组合，用实施1的方法对含有FNS与不含FNS红花进行cDNA-AFLP差异表达分析，在石河子红花，塔城红花，若羌红花，乌鲁木齐红花，上海红花，崇明红花，清徐红花，海南红花中获得1条特异性片段，而在哈密红花，吴中古城红花，芮城红花，新乡红花，菏泽红花，毫州红花，简阳红花，开封红花，郑州红花，四川重庆红花中未获得。

3.含有该条特异性片段的上述红花品种经用高效液相方法测定，均含FNS；而不含上述片段的品种，均不含FNS。

4.对该条片段进行回收，克隆和测序，与TDF-2′序列相同。

5.用实施2的方法进行RT-PCR验证，发现在含有FNS的红花品种如：石河子红花，塔城红花，若羌红花，乌鲁木齐红花，上海红花，崇明红花，清徐红花，海南红花中存在；在不含FNS的红花品种如：哈密红花，吴中古城红花，芮城红花，菏泽红花，简阳红花，开封红花，郑州红花，四川重庆红花中不存在。

Claims (3)

1.一种含复脑素的红花的筛选方法，其特征在于该方法是用cDNA序列分析方法鉴定红花基因中含有如SEQ ID No.1核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种含复脑素的红花的筛选方法，其特征在于其中的cDNA序列分析方法是RT-PCR方法、Northerning Bloting法或cDNA末端快速扩增法。

3.根据权利要求1或2所述的一种含复脑素的红花的筛选方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

A、设计并合成下述RT-PCR引物；

5’-TAGCAGATTGGGAGTT-3’

5’-CTAAGAGCAGGGTTTG-3’

B、提取红花的总RNA；

C、以红花总RNA为模板，翻转录成第一链cDNA；

D、以第一链cDNA为模板加入合成的引物，进行PCR扩增；

E、琼脂糖电泳，紫外显色；

F、测序。

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