CN102121015A - 一种茶树CsBDP抗逆基因及其应用 - Google Patents
一种茶树CsBDP抗逆基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种茶树CsBDP抗逆基因。所述茶树CsBDP抗逆基因cDNA全长1333bp，其包括长度为1014bp的开放阅读框(ORF)以及71bp的5′端非翻译区和248bp的3′端非翻译区。本发明所涉及的茶树CsBDP抗逆基因能够提高重组大肠杆菌对于高碱环境和热击的耐受能力，说明茶树CsBDP抗逆基因具有抗碱功能，并且当宿主菌受到热击后，茶树CsBDP抗逆基因对于宿主细胞具有保护作用。因此，本发明的茶树CsBDP抗逆基因在植物基因工程中具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种茶树抗逆基因CsBDP cDNA序列的克隆及其应用，其利用基因改良技术培育新的茶叶品种，改善在各种胁迫环境中茶树的抗逆性，提高茶叶的产量和质量，属于基因工程技术领域。
背景技术
植物分子生物学的研究热点之一是植物抗逆基因的发掘与利用。这些抗逆基因的发现为通过基因工程技术实现植物的基因改良提供了丰富的材料。植物BURP结构域(BURP-domain)是由Hattori等人根据最初发现的含有此结构域的四个植物蛋白命名。目前随着研究的深入，越来越多的植物BU RP-domain类蛋白被发现，这些成员组成了较为庞大的植物BURP-domain类蛋白家族，这个蛋白家族的不同成员在植物的生长、发育及对抗胁迫环境的抗逆性功能中发挥着重要作用。
最新的研究结果显示，植物BURP-domain类蛋白家族可以划分为BNM2-like、USP-like、RD22-like、PG1β-like、BURP V、BURP VI和BURPVII 7个亚族，不同亚族的蛋白在植物的生长发育过程中发挥不同的作用。目前的研究表明，RD22-like亚族蛋白多与植物的抗胁迫反应(如干旱脱水和脱落酸诱导)有关，即该亚族蛋白编码基因为植物的抗逆基因。
茶树是重要的经济作物，茶叶生产是一些地区的主要经济来源。因此，利用现代生物学技术，特别是基因改良技术培育新的茶叶品种有重大意义。茶树的生长对于环境的要求很高，生长环境好坏直接决定了茶树的生长状况以及茶叶品质的高低。各种胁迫环境常常会引起茶叶产量和质量下降，因此研究茶树的抗逆性，尤其是茶树自身抗逆基因，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个问题是提供一个茶树BURP-domain类蛋白抗逆基因(CsBDP)，其具有如序列表SEQ ID NO：1所示的基因序列。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种茶树CsBDP抗逆基因，通过设计一对简并引物RD01和RD02进行PCR扩增，其主要特点是：
简并引物RD01，其序列为：5-GGA GAG GAR AAR TAT TGT GC-3；
简并引物RD02，其序列为：5-TGT GGC ANA CNG CAN CTG CT-3；
PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终止延伸10min。
扩增反应后得到序列长度为304bp的CsBDP基因的保守序列片段。
对CsBDP基因进行5′RACE和3′RACE操作。根据已经获得的CsBDP保守片段设计两个基因特异性引物，其主要特点是：
基因特性引物5′-GSP，其序列为：5′-GCA TCG CTT GCC ATC TTCTTC ACT CCT T-3′；
基因特性引物3′-GSP，其序列为：5′-AGC CGT AGT GTG CCA TAAGCA AAA C-3′。
5′RACE PCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终止延伸10min。3′RACEPCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终止延伸10min。
通过5′RACE和3′RACE，分别获得了长度为918bp和659bp的CsBDP基因的5′端和3′端序列(图4)。将三段基因片段拼接后获得了CsBDP的全长cDNA序列，如序列表SEQ ID NO：1所示。CsBDP全长1333bp。
本发明所要解决的第二个问题是提供上述基因所编码的蛋白质CsBDP。其具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
通过ORFinder软件预测，CsBDP基因编码一个337个氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO：2所示。
本发明所要解决的第三个问题是提供含有茶树CsBDP基因的重组大肠杆菌。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
首先将融合PC R所需的7个DNA片段(lacO/P1、lacO/P2、lacY1、lacY2、kan1、kan2和CsBDP)进行独立扩增。采用“两步法”融合PCR构建线性DNA打靶片段kan cassette和CsBDP-kan cassette。其特征在于：
kan cassette所需片段包括：lacO/P1，kan1和lacY1；
CsBDP-kan cassette所需片段包括：lacO/P2，CsBDP，kan2和lacY2；
构建后的kan cassette长1395bp(图6)，CsBDP-kan cassette长2435bp(图7)。经测序，两个片段结构和序列正确。经过同源臂的双交换，CsBDP-kan cassette和kan cassette分别替换了野生型大肠杆菌MG 1655基因组上的lacZ基因，得到重组菌CK/ΔlacZ和对照菌K/ΔlacZ。
采用PCR方法验证重组菌基因组结构上的变化。本研究共设计了三对鉴定引物：CsBDP基因内部引物(CsBDP 146，5′-AAT GGA TGG AAG ATAAGA GCA CCG C-3′和CsBDP884，5′-GCA ACT GCT TCT GCC TTCGTT CCA T-3′)；kan内部引物(Kan45，5′-GGT GGA GAG GCT ATT CGGCTA TGA C-3′和Kan741，5′-GGC GAT ACC GTA AAG CA CGA GGAAG-3′)；lacZ基因外部引物(lacI-out，5′-AGG AGA AGA TCG CCT CTATCG CCG T-3′和lacY-out，5′-TGC GGC CTA TAT GGA TGT TGG AACC-3′)。以重组大肠杆菌基因组DNA为模板，使用不同的引物组合进行PCR，并对PCR产物测序，结果显示两个重组菌已被成功构建(图8)。
本发明所要解决的第四个问题是提供茶树CsBDP基因的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
通过测定重组菌在不同胁迫条件下的生长速率来解释茶树CsB DP蛋白具有的抗逆功能。实验发现，重组菌在高碱环境中以及热击处理后的生长都要好于对照菌，并且二者生长速率的差异具有显著的统计学意义。由此可以看出，CsBDP在重组菌中的表达提高了重组菌对于这两种胁迫环境的耐受能力，说明茶树CsBDP基因具有抗碱功能，并且当宿主菌受到热击后，CsBDP基因对于宿主细胞具有保护作用。由此可见，茶树CsBDP基因在植物基因工程中具有重要的应用价值。
本发明的有益效果是：茶树是重要的经济作物，茶叶生产是一些地区的主要经济来源。因此，利用现代生物学技术，特别是基因改良技术培育新的茶叶品种有重大意义。茶树的生长对于环境的要求很高，生长环境好坏直接决定了茶树的生长状况以及茶叶品质的高低。各种胁迫环境常常会引起茶叶产量和质量下降。目前的研究表明，RD22-like亚族蛋白多与植物的抗胁迫反应(如干旱脱水和脱落酸诱导)有关，即该亚族蛋白编码基因为植物的抗逆基因。因此研究茶树的抗逆性，尤其是茶树自身抗逆基因，具有非常重要的意义。
附图说明
图1为本发明茶树总RNA电泳图。
图2为本发明茶树总cDNA电泳图。
图3为本发明CsBDP保守片段(291bp)电泳图。
M，DNA marker；lane 1，CsBDP保守片段.
图4为本发明CsBDP两端RACE片段电泳图。
M，DNA marker；lane 1，3′RACE产物片段；lane 2，5′RACE产物片段.
图5为本发明29个BURP-domain蛋白的系统发生分析。
利用DNAMAN 6.0.40软件，采用maximum likelihood方法对29个BURP-domain类蛋白家族蛋白进行系统进化分析，每条序列使用GenBank登录号进行注释。
图6为本发明通过“两步法”融合PCR构建的kan cassette电泳图。
M，DNA marker；lane 1，kan cassette.
图7为本发明通过“两步法”融合PCR构建的CsBDP-kan cassette电泳图。
M，DNA marker；lane 1，CsBDP-kan cassette.
图8为本发明PCR鉴定重组菌CK/ΔlacZ和K/ΔlacZ。
M，DNA marker；lane 1，2，3，利用引物对CsBDP146/CsBDP884分别扩增野生型MG 1655，重组菌K/ΔlacZ和CK/ΔlacZ的基因组DNA；lane4，5，6，利用引物对CsBDP146/kan741分别扩增野生型MG1655，重组菌K/ΔlacZ和CK/ΔlacZ的基因组DNA；lane 7，8，9，利用引物对LacI-out/CsBDP884分别扩增野生型MG1655，重组菌K/ΔlacZ和CK/ΔlacZ；lane 10，11，12，利用引物对CsBDP146/kan741分别扩增野生型MG1655，重组菌K/ΔlacZ和CK/ΔlacZ的基因组DNA；lane 7，8，9，利用引物对kan45/LacY-out分别扩增野生型MG1655，重组菌K/ΔlacZ和CK/ΔlacZ的基因组DNA.
图9为本发明RT-PCR验证CsBDP和kan在重组菌株中的表达。
M，DNA marker；lane 1，3，5，利用引物对CsBDP146/CsBDP884分别扩增野生型MG 1655，重组菌K/ΔlacZ和CK/ΔlacZ的总cDNA；lane 2，4，6，利用引物对kan45/kan741分别扩增野生型MG 1655，重组菌K/ΔlacZ和CK/ΔlacZ的总cDNA.
图10为本发明重组菌CK/ΔlacZ和K/ΔlacZ在30mM NaHCO3高碱胁迫环境中的生长曲线。
图11为本发明重组菌CK/ΔlacZ和K/ΔlacZ经52℃热击30min处理后的生长曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例一：一种茶树BURP-domain类蛋白抗逆基因(CsBDP)。
采用SV Total RNA Isolation System(P romega)提取茶叶总RNA(图1)。提取的总RNA利用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)进行反转录，合成cDNA第一链(图2)。依据BURP-domain的高度保守性，设计一对简并引物RD01(5-GGA GAG GAR AAR TAT TGTGC-3)和RD02(5-TGT GGC ANA CNG CAN CTG CT-3)进行PCR扩增。PCR反应循环参数为：94℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终止延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图3)。使用DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收PCR产物。将该DNA片段连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，阳性克隆送到上海生工生物工程公司进行测序，得到长度为304bp的CsBDP基因的保守序列片段。
使用GeneRacerTM Kit(Invitrogen)进行CsBDP的5′RACE和3′RACE操作。根据已经获得的CsBDP的保守片段设计两个基因特异性引物，分别为5′-GSP(5′-GCA TCG CTT GCC ATC TTC TTC ACT CCT T-3′)和3′-GSP(5′-AGC CGT AGT GTG CCA TAA GCA AAA C-3′)。
5′RACE PCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终止延伸10min。3′RACEPCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终止延伸10min。
1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶回收PC R产物。使用TOPO TACloning Kit(Invitrogen)克隆RACE PCR产物，操作按说明书进行。将阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司测序。通过5′RACE和3′RACE，分别获得了长度为918bp和659bp的CsBDP的5′端和3′端序列(图4)。将三段基因片段拼接后获得了CsBDP的全长cDNA序列，如序列表SEQ IDNO：1所示。CsBDP全长1333bp。
实施例二：抗逆基因(CsBDP)编码的蛋白质CsBDP。
通过ORFinder软件预测，CsBDP基因编码一个337个氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO：2所示。利用DNAMAN软件对CsBDP以及其它28种不同的BU RP-domain蛋白进行系统进化分析。结果如图5所示，30种BURP-domain蛋白在系统发生树上非常清晰地聚集为7个进化枝。从图中可以看出，CsBDP与其它RD22-like亚族蛋白聚在同一进化枝上，提示CsBDP与这个亚族中的其它成员可能具有相似的功能，即参与茶树相关的胁迫应答反应，CsBDP是茶树的一个抗逆基因。
实施例三：含有茶树CsBDP基因的重组大肠杆菌。
构建两种线性DNA同源打靶片段(kan cassette和CsBDP-kancassette)。首先将融合PC R所需的7个DNA片段进行独立扩增。这些片段分别为lacO/P1、lacO/P2、lacY1、lacY2、kan1、kan2和CsBDP。lacO/P1，kan1和lacY1用于构建kan cassette，lacO/P2，CsBDP，kan2和lacY2用于构建CsBDP-kan cassette。其中，lacO/P1和lacO/P2是大肠杆菌MG1655 lacZ基因起始密码子上游的300bp序列，lacY1和lacY2是lacZ基因终止密码子下游的300bp序列，它们分别是两个同源打靶片段两端的同源臂。kan ，kan2以及CsBDP代表kan基因和CsBDP基因的ORF。
采用“两步法”融合PCR构建线性DNA打靶片段kan cassette和CsBDP-kan cassette。kan cassette长1395bp(图6)，CsBDP-kancassette长2435bp(图7)。经测序，两个片段结构和序列正确。
将大肠杆菌MG1655/pKD46接种于5ml新鲜SOB培养基30℃培养过夜，按1∶50比例转接于50ml新鲜SOB培养基，阿拉伯糖诱导细胞生长至对数中期(OD600＝0.2～0.3)，制备感受态细胞。将两端带有300bp同源臂的片段CsBDP-kan cassette和kan cassette分别转化大肠杆菌MG 1655/pKD46感受态细胞。经过同源臂的双交换，CsBDP-kan cassette和kan cassette分别替换了基因组上的lacZ基因，得到重组菌CK/ΔlacZ和对照菌K/ΔlacZ。
采用PCR方法验证重组菌基因组结构上的变化。本研究共设计了三对鉴定引物：CsBDP基因内部引物(CsBDP 146，5′-AAT GGA TGG AAG ATAAGA GCA CCG C-3′和CsBDP884，5′-GCA ACT GCT TCT GCC TTCGTT CCA T-3′)；kan内部引物(Kan45，5′-GGT GGA GAG GCT ATT CGGCTA TGA C-3′和Kan741，5′-GGC GAT ACC GTA AAG CA CGA GGAAG-3′)；lacZ基因外部引物(lacl-out，5′-AGG AGA AGA TCG CCT CTATCG CCG T-3′和lacY-out，5′-TGC GGC CTA TAT GGA TGT TGG AACC-3′)。以重组大肠杆菌基因组DNA为模板，使用不同的引物组合进行PCR，并对PCR产物测序，结果显示两个重组菌已被成功构建(图8)。
实施例四：CsBDP和kan基因在重组大肠杆菌中表达的鉴定
将两个重组大肠杆菌CK/ΔlacZ和K/ΔlacZ以及野生型大肠杆菌MG1655在含有0.1mM IPTG的LB培养基中培养至对数生长期，使用SVTotal RNA Isolation System(Promega)提取三个菌的总RNA，然后使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)将RNA反转录成cDNA。以三个菌的总cDNA为模板，分别使用引物对CsBDP146/CsBDP884和Kan45/Kan741进行扩增，以检测CsBDP和kan在lacZ位置上能否顺利表达。RT-PCR的结果证明CsBDP和kan基因在重组菌中都可以被0.1mM IPTG诱导表达(图9)。
实施例五：CsBDP基因重组大肠杆菌抗逆性
本研究通过在LB培养基中加入终浓度为0.1mM的IPTG来诱导lacZ位置上的CsBDP和kan进行表达。为了验证CsBDP的功能，测定重组菌在以下两种胁迫条件中的生长：1)在LB培养基中加入NaHCO3至终浓度30mM；2)将重组菌在52℃热击30min。当两个重组菌生长在由30mM高浓度NaHCO3所引起的高碱性环境中时，重组菌CK/ΔlacZ表现出了更好的生长状况(表1，图10)，其生长速率是K/ΔlacZ的1.15倍。通过两样本t检验发现，二者的生长速率差异显著(p＜0.05)。经热击处理后，重组菌CK/ΔlacZ同样表现出了更好的生长状况(表1，图11)，其生长速率是K/ΔlacZ的1.11倍。通过两样本t检验发现，二者的生长速率差异同样显著(p＜0.05)。
表1 CK/ΔlacZ和K/ΔlacZ在两种胁迫环境中的生长速率
由于重组菌CK/ΔlacZ和K/ΔlacZ的染色体背景仅相差一个拷贝的CsBDP基因，所以二者在相同胁迫环境下生长的差异就应该与CsBDP的表达有关。实验发现，CK/ΔlacZ在高碱环境和热击处理后的生长都要好于对照菌K/ΔlacZ，并且二者生长速率的差异具有显著的统计学意义。由此可以看出，CsBDP在CK/ΔlacZ中的表达提高了重组菌对于这两种胁迫环境的耐受能力，说明CsBDP具有抗碱功能，并在宿主受到热击后，对宿主细胞具有保护作用。CsBDP基因的这种性质决定了其在植物基因中具有重要的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQUENCE LIST
<110>安徽师范大学
<120>茶树CsBDP基因
<140>
<141>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1333
<212>DNA
<213>茶树(Camellia sinensis)
<400>1
aagtgtaagc tagctatact aataagcttt ctttctcttt catatcatag ttttctgttc
60
tgcagctttc catggagttc cacttcctac ccatccttgc atttctttct
ttgacattgg 120
tagcaagtca tgcaactcta tctcctgaag cgtactggaa ctcggttctg
ccaaactctc 180
ctatgcctac ggctgtcaag gatcttttac accctgaatg gatggaagat
aagagcaccg 240
cagtcggggt aggaaagggc ggcgtaggcg tcgatgcagg
gcaaggaaag cccggtggca 300
ctagtgttgg tgtcgggaaa ggaggtgtct ctgtgaacac cggaaaaaaa
ggaaagcccg 360
tctctgtcgg agtatcaaag ggaccgaatc cattccttta caagtacgct
gccactgcgg 420
atcaactcca tgataatccc aacatcgctc ttttcttctt ggaaaatgac
ttgaaaaaat 480
acacaaaaat gacattgcac ttcactaaaa ccaccacacc gactaccttc
ttgcctcgcc 540
aggttgctga gaaaataccc ttttcatcca agaaaattcc acaaattctt
gactacttct 600
cggtgaaacc caactccatg gaagccaaga caatcaagca
aacaatcaaa gaatgcgaag 660
agcctggaatcaaaggagaa gagaaatatt gcgcgacttc actagagtcc
atggtcgatt 720
tctgcagtac caggcttggg aaaagtatcc aagcaatctc cacagaagtc
aaaaaagaaa 780
cccctttgca aacatacact atcgaaggag tgaagaagat ggcaagcgat
gcagccgtag 840
tgtgccataa gcaaaactac gcgtacacag tgttttattg ccacaagaca
cagaccacaa 900
aggcatactc agtttcaatg gtacgcctcg atggaacgaa ggcagaagca
gttgcagtgt 960
gccataccga cacatcgggt tggaatccga aacacttggc ctttcaactg
ctcaaggtca 1020
agccagggac tgttccaatt tgccatttcc ttcctgagga tcatatagtt
tgggttcata 1080
actgatattg atctttgcaa aaaagagtca tcactacttg tttaattagt
tttttatatg 1140
ttcgtttagc ttggtttggc atgtcatcat aatctgaaaa actctactta tgttgtcttt
1200
acatatatgt gtgtactata acaactctcc cacccacata tgcatatgca
tatgagctcg 1260
acatagaggt ggcttgtttt tcaataataa tagatatgtt gtccctggta
aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaa
1333
<210>1
<211>337
<212>PRT
<213>茶树(Camellia sinensis)
<400>2
Met Glu Phe His Phe Leu Pro Ile Leu Ala Phe Leu Ser Leu Thr Leu
1 5 10 15
Val Ala Ser His Ala Thr Leu Ser Pro Glu Ala Tyr Trp Asn Ser Val
20 25 30
Leu Pro Asn Ser Pro Met Pro Thr Ala Val Lys Asp Leu Leu His Pro
35 40 45
Glu Trp Met Glu Asp Lys Ser Thr Ala Val Gly Val Gly Lys Gly Gly
50 55 60
Val Gly Val Asp Ala Gly Gln Gly Lys Pro Gly Gly Thr Ser Val Gly
65 70 75 80
Val Gly Lys Gly Gly Val Ser Val Asn Thr Gly Lys Lys Gly Lys Pro
85 90 95
Val Ser Val Gly Val Ser Lys Gly Pro Asn Pro Phe Leu Tyr Lys Tyr
100 105 110
Ala Ala Thr Ala Asp Gln Leu His Asp Asn Pro Asn Ile Ala Leu Phe
115 120 125
Phe Leu Glu Asn Asp Leu Lys Lys Tyr Thr Lys Met Thr Leu His Phe
130 135 140
Thr Lys Thr Thr Thr Pro Thr Thr Phe Leu Pro Arg Gln Val Ala Glu
145 150 155 160
Lys Ile Pro Phe Ser Ser Lys Lys Ile Pro Gln Ile Leu Asp Tyr Phe
165 170 175
Ser Val Lys Pro Asn Ser Met Glu Ala Lys Thr Ile Lys Gln Thr Ile
180 185 190
Lys Glu Cys Glu Glu Pro Gly Ile Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Cys Ala
195 200 205
Thr Ser Leu Glu Ser Met Val Asp Phe Cys Ser Thr Arg Leu Gly Lys
210 215 220
Ser Ile Gln Ala Ile Ser Thr Glu Val Lys Lys Glu Thr Pro Leu Gln
225 230 235 240
Thr Tyr Thr Ile Glu Gly Val Lys Lys Met Ala Ser Asp Ala Ala Val
245 250 255
Val Cys His Lys Gln Asn Tyr Ala Tyr Thr Val Phe Tyr Cys His Lys
260 265 270
Thr Gln Thr Thr Lys Ala Tyr Ser Val Ser Met Val Arg Leu Asp Gly
275 280 285
Thr Lys Ala Glu Ala Val Ala Val Cys His Thr Asp Thr Ser Gly Trp
290 295 300
Asn Pro Lys His Leu Ala Phe Gln Leu Leu Lys Val Lys Pro Gly Thr
305 310 315 320
Val Pro Ile Cys His Phe Leu Pro Glu Asp His Ile Val Trp Val His
325 330 335
Asn
Claims (4)
1.一种茶树CsBDP抗逆基因，其特征在于，包括长度为1014bp的开放阅读框(ORF)以及71bp的5′端非翻译区和248bp的3′端非翻译区。
2.一种由权利要求1所述的茶树CsBDP抗逆基因所编码的蛋白质，其特征在于，该蛋白质为CsBDP基因编码的含有337个氨基酸的多肽。
3.一种含有如权利要求1所述的茶树CsBDP抗逆基因的重组大肠杆菌CK/ΔlacZ及相应的对照菌K/ΔlacZ。与野生型大肠杆菌MG1655相比，所述重组大肠杆菌CK/ΔlacZ及相应的对照菌K/ΔlacZ的lacZ基因位置分别被两种线性DNA同源打靶片段CsBDP-kan cassette和kan cassette所替换并经过PCR方法验证重组菌构建成功。所述线性DNA同源打靶片段CsBDP-kan caSSette由DNA片段lacO/P2、CsBDP、kan2和lacY2经过独立扩增和“两步法”融合PCR构建而成，全长2435bp；所述线性DNA同源打靶片段kan cassette由DNA片段lacO/P1、kan1和lacY1经过独立扩增和“两步法”融合PCR构建而成，全长1395bp。
4.一种如权利要求1所述茶树抗逆基因CsBDP在植物基因工程中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010046527XA CN102121015A (zh) | 2010-01-08 | 2010-01-08 | 一种茶树CsBDP抗逆基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102121015A true CN102121015A (zh) | 2011-07-13 |
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ID=44249683
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|---|---|
| CN (1) | CN102121015A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103361354A (zh) * | 2012-04-06 | 2013-10-23 | 杭州师范大学 | 一种昆虫抗逆基因HaTPS及其应用 |
| CN108207366A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-06-29 | 信阳师范学院 | 一种茶树品种选育方法 |
-
2010
- 2010-01-08 CN CN201010046527XA patent/CN102121015A/zh active Pending
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN103361354A (zh) * | 2012-04-06 | 2013-10-23 | 杭州师范大学 | 一种昆虫抗逆基因HaTPS及其应用 |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110713 |