CN102115793A - 含内参的hcv荧光定量rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速、简便的含内参的使用荧光RT-PCR技术定量检测HCV病毒RNA的方法及试剂盒。本发明针对丙型肝炎病毒(HCV)基因序列保守片段设计了检测引物和探针，使用改进的一步法RT-PCR实时荧光扩增技术对HCV病毒RNA进行定性和定量检测，操作简单，重复性好，具有较高的特异性和灵敏性。
Description
技术领域
本发明涉及一种含内参的使用荧光RT-PCR技术定量检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法，属于分子生物学领域。
背景技术
丙型肝炎病毒是单股正链RNA病毒.1991年，国际病毒命名委员会(ICTV)将其归为黄病毒科丙型肝炎病毒属，其基因组含有一个大约9033个核苷酸构成的大开放读码框(ORF)，可编码3010-3033个氨基酸的多蛋白前体，多蛋白N端的1/4依次为核心蛋白(C)和包膜蛋白(E1和E2)等结构蛋白，其余依次为NS2、NS3、NS4和NS5等非结构蛋白，膜蛋白分布于病毒表面，NS3蛋白具有蛋白酶的功能，NS5蛋白为一依赖于RNA的RNA多聚酶。
与其他RNA病毒一样，HCV基因组有很大的变异性，可能会引起其分子生物学行为、感染性、临床致病性及对药物治疗的反应等诸方面的不同[3-4].现已证实，90％非肠道传播的非甲非乙型肝炎(NANBH)为HCV感染所致，35-50％的非甲非乙型肝炎发展为慢性肝炎，与肝癌的发生相关。
HCV感染后一般到抗体转阳有一个较长的窗口期，平均为70天，有的患者窗口期可延长至6-9个月或更长，约1-3％的患者抗-HCV可持续阴性，而基因组的复制出现得很早，感染后数天即出现病毒血症.已有输血后即有丙型肝炎病毒感染发生的报道，这表明抗-HCV阴性的献血员中有少数存在丙型肝炎病毒输血传播的可能性；另外，美国已报道了1例抗-HCV阴性的器官捐赠者对接受移植者造成丙型肝炎病毒急性感染；Willems et al检测克罗地亚不同地区输血中心的2718份抗-HCV阴性血浆中2.1％为HCV RNA阳性.因此直接检测HCVRNA对于筛查窗口期HCV感染的献血者，降低输血后HCV感染的发病率是必要的。
外周血中检出HCV RNA是HCV复制活跃的可靠指标，在感染1-2wk内血清中可检测到HCV RNA，在感染自然恢复前血清中HCV RNA将达到一个高峰，但HCV RAN在达到峰值或重新出现前数天或数周内偶尔也可能检测不到.在大多数向慢性转化的感染者中，HCVRNA含量降低速度逐渐减慢，最后趋于稳定，晚期肝病患者的HCV RNA水平很低，甚至无法测出。
HCV RNA检测包括定性和定量两种方法，其基本原理就是逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：首先经逆转录酶作用，在特异性引物存在下，将HCV RNA逆转录为单链的cDNA，再通过PCR将cDNA扩增.定性PCR的灵敏度高于定量PCR，例如罗氏公司试剂，定性PCR的灵敏度为50kIU/L，定量PCR为600kIU/L；拜尔公司的定性PCR(转率介导扩增法，TMA)试剂的灵敏度为10kIU/L，其定量PCR为615kIU/L，因此定性PCR主要用于急慢性丙型肝炎诊断，而定量PCR则用于疗效监测[15].不同定量分析方法中的检测单位与临床标本的HCV RNA实际水平的关系不完全一致，世界卫生组织制定了HCV RNA定量分析单位的国际标准(IU)，目前分析方法检测的下限值范围为30-615kIU/L，上限值范围为5×105-7.7×105kIU/L，特异性为98-99％，且不受基因型的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便的含内参的使用荧光RT-PCR技术定量检测HCV病毒RNA的方法。
为解决上述问题，本发明提供了一种使用一步法荧光RT-PCR技术对HCV RNA进行定量的方法，根据GeneBank中的HCV序列为模板，设计了一对引物及特异性探针，检测长度为114bp的目标RNA，其引物探针序列分别为：
引物1：5`-AACCAACCCGCTCAATACC-3` (Seq No.1)
引物2：5`-GCACTCGCAAGCACCCT-3` (Seq No.2)
探针1：5`-CCGCGAGATCACTAGCCGAGTAGT-3` (Seq No.3)
探针2：5`-ATCTACCCAACACGAATCGCTACC-3` (Seq No.4)
或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
设计的探针跨越了一段内含子，分别与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影响，同时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。
上述方法中使用的探针，其5`端的荧光发光基团可为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团可为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。
本发明提供的使用荧光RT-PCR技术定量检测HCV RNA的方法是使用一步法RT-PCR的技术，使操作更为简便、快速。使用已知浓度的人工合成的RNA序列制作标准曲线，能对标本中的HCV RNA进行定量分析。其人工合成的RNA序列如下：
内参阳模RNA：
5-AACCAACCCGCUCAAUACCCGGAAAUUUGGGCGUGCCCAUCUACCCAACACGAAUCGCUAC
CGUUGGGUCGCGAAAGGCCUUGUGGUACUGCCUGAUAGGGUGCUUGCGAGUGC-3`(Seq No.5)
本发明提供的使用荧光RT-PCR技术定量检测HCV RNA的方法形成的试剂盒组成包括：One step RT-PCR反应缓冲液、探针、混合酶、RNA提取液、校准品1、校准品2、校准品3、阳性对照品和阴性对照品。
PCR反应体系包含Tris-HCl(PH 8.3)、KCl、d(AGC)TP、dUTP、MgCl2、引物1和引物2、探针1和探针2、AMV酶、Taq酶以及适当浓度的内参阳模。
本发明提供的方法形成的试剂盒操作步骤如下：
PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液16ul、探针3ul和混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水(RNA阳性对照品直接取8ul)，使反应总体积为30ul，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在40℃反应10分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM和JOE通道荧光)。
传统的RT-PCR使用两步法扩增，时间长，操作相对复杂，且因多了一个步骤而易发生污染，所以本发明提供的试剂盒采用一步法RT-PCR技术，将RT步骤与PCR步骤一步完成，无须开管进行二次加样，将少了污染的机会。由于反应体系中RT步骤是使用特异性引物进行延伸，与传统的随机引物法相比，逆转录需要的时间更短，通常可在1.5小时内完成全部RT-PCR反应，并且由于试剂盒使用热稳定性较强的AMV逆转录酶，可在50℃进行RT反应，产品的特异性非常高。
附图说明
图1为使用本发明试剂盒在ABI公司ABI7500荧光扩增仪上对临床样本的扩增曲线图。
具体实施方式
根据GeneBank中的HCV相关序列进行比对和分析，设计和制备引物与探针：
引物1：5`-AACCAACCCGCTCAATACC-3` (Seq No.1)
引物2：5`-GCACTCGCAAGCACCCT-3` (Seq No.2)
探针1：5`-CCGCGAGATCACTAGCCGAGTAGT-3` (Seq No.3)
设计内参探针序列：探针2：
5`-ATCTACCCAACACGAATCGCTACC-3` (Seq No.4)
设计并制备人工合成RNA序列：
内参阳模RNA：
5-AACCAACCCGCUCAAUACCCGGAAAUUUGGGCGUGCCCAUCUACCCAACACGAAUCGCUAC
CGUUGGGUCGCGAAAGGCCUUGUGGUACUGCCUGAUAGGGUGCUUGCGAGUGC-3`(Seq No.5)
将该人工合成的RNA序列用DEPC处理过的水溶解并稀释成1E+6copies/ml、1E+5copies/ml和1E+4copies/ml，依次作为RNA标准品1-3。
按如下配方配制One step RT-PCR反应缓冲液(终浓度)：50mM Tris-HCl(Ph 8.3)、50mMKCl、300uM dNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。
按如下配方配制探针(终浓度)：200nM探针1、200nM探针1和1E+4copies/ml内参阳模。
按如下配方配制混合酶(终浓度)：0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
试剂盒组成为：
组成成分(20人份/盒) 体积
One step RT-PCR反应缓冲液 320μl
探针 60μl
混合酶 60μl
校准品1 20μl
校准品2 20μl
校准品3 20μl
DEPC水 1ml
本发明提供的方法形成的试剂盒未提供mRNA提取试剂，用户可根据自身要求使用传统的酚-氯仿提取方法或购买商业化的RNA提取试剂盒。
检测步骤：
PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的RNA并补充DEPC水(RNA标准品直接取8ul)，使反应总体积为30ul。
按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在42℃反应10分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集相应探针标记通道的荧光)。
结果分析与监控：
根据仪器分析的结果，在如下情况视实验有效：RNA标准品1-3的Ct值均<35，且呈JOE较好的线性(r＞0.9)。
直接读取仪器分析的定量值即为HCV RNA的定量值。
当JOE通道未检测到荧光扩增信号，而FAM通道也未检测到荧光扩增信号时，表明PCR扩增失败，需要重新进行反应液的配制的实验。
SEQUENCE LISTING
<110>上海复星医学科技发展有限公司
上海复星医药 (集团) 股份有限公司
剑军，何
懿，夏
大治，吴
倩，韩
维祥，沈
<120>含内参的HBV荧光定量PCR检测试剂盒
<130>XQ00325617211
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aaccaacccg ctcaatacc 19
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gcactcgcaa gcaccct 17
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccgcgagatc actagccgag tagt 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atctacccaa cacgaatcgc tacc 24
<210>5
<211>114
<212>RNA
<213>人工合成RNA
<400>5
aaccaacccg cucaauaccc ggaaauuugg gcgugcccau cuacccaaca cgaaucgcua 60
ccguuggguc gcgaaaggcc uugugguacu gccugauagg gugcuugcga gugc 114
Claims (5)
1.含内参的HCV荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包含一对特异性引物、一条HCV特异性检测探针和内参探针，分别用于检测HCV病毒核酸RNA和人工合成的内参RNA片段，其中，用于检测HCV病毒RNA的扩增片段长度为114bp，引物和探针序列如下：
引物1：5`-AACCAACCCGCTCAATACC-3` (Seq No.1)
引物2：5`-GCACTCGCAAGCACCCT-3` (Seq No.2)
探针1：5`-CCGCGAGATCACTAGCCGAGTAGT-3` (Seq No.3)
探针2：5`-ATCTACCCAACACGAATCGCTACC-3` (Seq No.4)
或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。人工合成的内参RNA片段除探针1的结合区域更换成探针2的结合区域外，其余部分与HCV RNA的扩增序列最好完全相同，但亦可完全不同。内参RNA片段序列如下：
内参阳模RNA：
5`- AACCAACCCGCUCAAUACCCGGAAAUUUGGGCGUGCCCAUCUACCCAACACGAAUCGCUACCGUUGGGUCGCGAAAGGCCUUGUGGUACUGCCUGAUAGG
2.含内参的HCV荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于内参DNA片段预先加入到含探针1和探针2的组成成分“探针”中，试剂盒的组成成分包括：One step RT-PCR反应缓冲液、探针、混合酶、校准品1、校准品2、校准品3、阳性对照品和阴性对照品。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于两条标记探针的荧光发光基团不同，根据不同的荧光定量PCR仪器，从以下荧光基团中选择两个分布于不同的仪器检测通道的两种荧光进行组合，荧光种类为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange和ROX；荧光淬灭基团根据选择的荧光发光基团的种类和组合从DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的选择一种或两种淬灭基团。优选的方案为：两条探针分别用FAM-BHQ1和TET-BHQ1进行标记。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于PCR反应体系包含Tris-HCl(PH 8.3)、KCl、d(AGC)TP、dUTP、MgCl2、引物1和引物2、探针1和探针2、AMV酶、Taq酶以及适当浓度的内参阳模，试剂盒校准品为已知核酸RNA浓度并包含引物1和引物2扩增片段的人工合成RNA片段，阳性对照品为适当浓度的HBV国家标准品，阴性对照品为纯净水。
5.根据权利要求2所述的试剂盒其特征在于，按如下程序进行实时荧光PCR检测：反应管先在42℃反应10分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集相应探针标记通道的荧光)。
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| CN 200910247530 CN102115793A (zh) | 2009-12-30 | 2009-12-30 | 含内参的hcv荧光定量rt-pcr检测试剂盒 |
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN102559930A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-11 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种荧光定量rt-pcr检测丙型肝炎病毒的试剂盒 |
| CN102719558A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-10-10 | 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 | 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒 |
| CN104372072A (zh) * | 2014-07-29 | 2015-02-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量pcr方法 |
-
2009
- 2009-12-30 CN CN 200910247530 patent/CN102115793A/zh active Pending
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| CN104372072A (zh) * | 2014-07-29 | 2015-02-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量pcr方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20110706 |