CN101978059A - 合成磷酸二酯寡核苷酸及其治疗用途 - Google Patents

合成磷酸二酯寡核苷酸及其治疗用途 Download PDF

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Abstract

本发明生成了模拟去纤维蛋白多核苷酸作用的各种确定长度的磷酸二酯寡核苷酸组合物。所述组合物基本上由包含范围从40mer至60mer的Nmer的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物组成。磷酸二酯寡核苷酸优选的为杂聚物，在其各个位置可由A、G、C和T之一组成，但也可为同聚物，即寡核苷酸的各个位置可为相同的碱基。这些混合物在治疗癌症及其他疾病中有作用。

Description

合成磷酸二酯寡核苷酸及其治疗用途
发明领域
本发明涉及范围从40mer至65mer的名为Nmer的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物，特别是使用这些寡核苷酸治疗疾病，包括癌症。磷酸二酯寡核苷酸优选的为杂聚物，在其各个位置可由A、G、C和T之一组成，但也可为同聚物，即寡核苷酸的各个位置可为相同的碱基。
发明背景
术语去纤维蛋白多核苷酸(defibrotide)定义了从动物和/或植物组织，特别是从猪或牛的肠中(US 3,770,720和US 3,899,481)通过抽提得到的单链寡核苷酸(15-80mer，平均45mer)的复杂混合物。具有16.5±2.5kDa平均分子量的去纤维蛋白多核苷酸通常以碱金属(一般为钠)盐的形式使用。去纤维蛋白多核苷酸主要以其抗血栓活性使用(US3,829,567)，但也可用于其他应用如，例如，急性肾功能不全的治疗(US4,694,134)和急性心肌缺血的治疗(US 4,693,995)。其他去纤维蛋白多核苷酸的文献引用如下。
US 5,081,109公开了去纤维蛋白多核苷酸在治疗高级阶段(I I I和IV阶段)的外周动脉病中的用途。
US 5,116,617公开了强化人毛细血管的方法，包含局部施用包括去纤维蛋白多核苷酸的组合物。
US 5,977,083公开了通过应答观察到的常规、疾病和修复标记的波动(例如，增加、减少、出现、消失)修饰去纤维蛋白多核苷酸的剂量可治疗多种病情。
US 6,046,172公开了具有4000-10000道尔顿分子量的动物来源寡脱氧核糖核苷酸，其可通过多聚脱氧核糖核苷酸分级分馏得到，或通过高分子量脱氧核糖核酸的化学或酶促解聚得到。
US 6,699,985和US 5,624,912公开了使用去纤维蛋白多核苷酸治疗各种病症(包括HIV感染)的方法。
US 7,338,777公开了测定去纤维蛋白多核苷酸生物学活性的方法。
EP1276497公开了通过去纤维蛋白多核苷酸与至少一种具有动员造血祖细胞能力的造血因子(例如G-CSF)组合或相继施用，提高哺乳动物外周血中的干细胞和祖细胞的量的方法。
WO2005023273公开了去纤维蛋白多核苷酸的抗肿瘤作用。
WO2006094916公开了去纤维蛋白多核苷酸在治疗血管生成依赖性肿瘤中的用途。
此外，Kornblum等人的一篇综述文章“Defibrotide，a PolydisperseMixture of Single Stranded Phosphodiester Oligonucleotides withLifesaving Activity in Severe Hepatic Veno-occlusive Disease：Clinical Outcomes and Potential Mechanisms of Action，”(Oligonucleotides，16：105-114(2006))讨论了去纤维蛋白多核苷酸及其在治疗静脉闭塞病(VOD)中的用途。
1998年，马萨诸塞州波士顿市Dana-Farber癌症研究所的PaulRichardson博士开始将去纤维蛋白多核苷酸用于骨髓移植后的严重肝VOD(静脉阻塞性疾病)的治疗。药物经静脉给药，几乎没有毒性并治愈了约40％-50％的患者，而该病迄今的致死率为95％。之后，美国和欧洲多个机构的实验确认了去纤维蛋白多核苷酸的效力，尽管其作用机制未知。
US 4,985,552和US 5,223,609描述了制备去纤维蛋白多核苷酸的方法，该方法得到的产物具有稳定和非常确定的物化特征，并且不具有任何不期望的副作用。
EP1325162公开了测定去纤维蛋白多核苷酸生物学活性的方法。
几十年来人们认定磷酸二酯寡核苷酸由于核酸酶的消化不能作为药物使用，但是人们忽略了由于其低毒性可以对患者以大剂量施用。去纤维蛋白多核苷酸的临床经验明确指示了可以使用这些种类的分子，且具有治疗效力。然而，因为去纤维蛋白多核苷酸为自然产物，就其是否可被同一的再生产而言目前仍存在疑问。因此，在本领域内需要发展出一种组合物，其具有和去纤维蛋白多核苷酸相同的效用但可以被同一的再生产。
发明概述
本发明涉及治疗疾病或病症的方法，包含施用合成磷酸二酯寡核苷酸混合物，所述合成磷酸二酯寡核苷酸长度为约40碱基至约65碱基，优选的为约40碱基至约60碱基，更优选的为约45碱基至约60碱基，约45碱基至约55碱基或约50碱基至约55碱基。
本发明也包括药物组合物，所述药物组合物基本上由具有上述平均长度的合成磷酸二酯寡核苷酸和药物载体(和任选的可药用的赋形剂和/或佐剂)组成，并不含有其他实质影响合成的磷酸二酯寡核苷酸活性的成分。
在本发明的方法中，所述寡核苷酸可为单链的；所述寡核苷酸序列可为DNA和/或RNA序列；所述寡核苷酸序列也可为随机序列。
在本发明的方法中，所述寡核苷酸的嘌呤碱基可选自鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤，嘧啶碱基可选自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶；所述寡核苷酸的糖可选自核糖和脱氧核糖。
在本发明的方法中，疾病或病症可为静脉闭塞病、血栓性血小板减少性紫癜、肿瘤、血管生成依赖性肿瘤或使用抗凝血剂导致的疾病或病症；所述方法也可用于通过去纤维蛋白多核苷酸与至少一种具有动员造血祖细胞能力的造血因子组合或相继施用，以提高哺乳动物外周血中的干细胞和祖细胞的量。
本发明的这些方面和其他方面在参考下面的详述和附图之后将是显而易见的。此处引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上述或下述的，在此以其整体引入作为参考。
详细说明
定义
为了更好的理解本发明，给出下述定义：
核苷酸是由3部分组成的化学化合物：杂环碱基、糖和一或多个磷酸基团。在最常见的核苷酸中，碱基是嘌呤或嘧啶的衍生物，糖是戊糖(5碳糖)脱氧核糖或核糖。核苷酸是核酸例如DNA或RNA的单体。
寡核苷酸是短序列的核苷酸，一般为20或更少碱基。自动化合成仪能合成长达160至200碱基的寡核苷酸。合成碱基的长度通常以“mer”表示(来自“希腊语”meros“部分”)。例如，25个碱基的片段称为25-mer。
磷酸二酯键是在磷酸基团中的磷原子和2个其他分子间以2个酯键连接的一组强共价键。磷酸二酯键构成DNA和RNA链的骨架。
DNA和RNA是称为核苷酸的简单单元的长多聚体，具有经磷酸二酯键连接的糖和磷酸基团构成的骨架。每个糖上连接有4种碱基分子中的一种。在DNA和RNA中，磷酸二酯键连接核糖的3′碳原子和5′碳原子。
DNA通常为双链的，通常包括2种嘌呤碱基，鸟嘌呤和腺嘌呤，和2种嘧啶碱基，胞嘧啶和胸腺嘧啶。在一些情况下，嘌呤和嘧啶碱基可被其突变形式替换：鸟嘌呤和腺嘌呤可分别被黄嘌呤和次黄嘌呤替换，而胞嘧啶可被甲基胞嘧啶替换。RNA和DNA非常类似，但是在一些重要的结构细节存在差异：RNA一般是单链，而DNA一般为双链。并且，RNA核苷酸包括核糖，而DNA包括脱氧核糖；此外，RNA包含尿嘧啶而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶。
随机核苷酸序列是基本上包括等量的2种不同嘌呤碱基和2种不同嘧啶碱基的混合物的核苷酸序列，其中在序列的各个位置，各个嘌呤或嘧啶碱基具有25％±5的出现概率，优选的25％±2的出现概率，更优选的25％±1的出现概率。
如此处使用的，术语“分离的”是指提及的物质已从其天然被发现的环境中移除，表征为在特定的样品中有足够的量确立存在。可通过任意标准技术进行这些表征，如，例如测序、杂交、免疫实验、功能性实验、表达、大小测定等等。因此，如果一种生物学物质不具有细胞组分(即发现或自然产生所述物质的细胞组分)，则可为“分离的”。
分离的细胞器、细胞或组织是指已从其被发现的来源生物的解剖位点(细胞、组织或生物)去除的细胞器、细胞或组织。分离的物质可为“纯化的”或非“纯化的”。如此处使用的，术语“纯化的”是指在可检测的减少或消除其他污染物质的条件下分离得到的物质(例如，核酸分子或蛋白质)。污染物可能或可能不包括得到所述纯化物质的天然物质。纯化的物质优选的包括少于约90％、少于约75％、少于约50％、少于约25％、少于约10％、少于约5％或少于约2％的以重量计的其他与所述物质本来相关的组分。
除非特别提出反例，本发明的实施将应用本领域技术范围内的分子生物学、细胞生物学和蛋白质化学的传统方法，为了说明的目的以下详细描述。这些技术在文献中充分解释。见，例如，Sambrook，等人，“MolecularCloning：A Laboratory Manual”(第二版，1989)；“DNA Cloning：APractical Approach，卷I&II”(D.Glover编)；“OligonucleotideSynthesis”(N.Gait编，1984)；“Nucleic Acid Hybridization”(B.Hames&S.Higgins编，1985)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”(1984)；Ausubel等人，“Current protocols in MolecularBiology”(New York，John Wiley and Sons，1987)；Bonifacino等人，“Current Protocols in Cell Biology”(New York，John Wiley&Sons，1999)。
术语“约”是指特定数值在本领域普通技术人员测定的可接受误差范围内，其部分取决于所述数值是如何测量或确定的，即测量系统的限制。例如，“约”可表示在本领域每次实施的可接受标准差内。或者，“约”可表示给定数值的多至±20％、优选的多至±10％、更优选的多至±5％和更优选的多至±1％的范围。或者，特别是就生物学系统或方法而言，所述术语可表示在数值范围的数量级范围内，优选的在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定数值时，除非另外说明，术语“约”是隐含的，在此上下文中的意思是特定数值在可接受的误差范围内。
在本发明的上下文范围中，当涉及任意此处列举的疾病病症时，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或类似用语是指预防、缓解或减轻至少一种与所述病症相关的症状，或减慢或逆转所述病症的进程。例如，在本发明的意图内，术语“治疗(treat)”也表示阻止、延缓发病(即，疾病的临床显现之前的时期)和/或降低疾病发展或恶化的风险。此处使用的术语“保护”是指预防、延缓、治疗或以上全部，视受试者疾病的发展、持续或加重情况而定。
和本发明组合物相连使用的词组“可药用的”是指所述组合物的分子实体和其他成分当施用于如哺乳动物(例如人)的动物时为生理学可容许的，并且一般不引起不利反应。优选的，如此处使用的，术语“可药用的”是指被联邦管理机构或州政府认可的，或列于美国药典或其他公认的药典中用于哺乳动物，更具体的用于人的组合物。
如此处使用的，措辞“合成磷酸二酯寡核苷酸混合物”是指具有相同和/或不同序列的合成磷酸二酯寡核苷酸的混合物。根据第一个实施方案，所述混合物可包括具有相同序列的寡核苷酸和具有不同序列的寡核苷酸两者；其中，所述具有不同序列的寡核苷酸可具有相同或不同的长度。根据第二个实施方案，所述混合物可由具有不同序列但相同长度的寡核苷酸组成。
术语“施用(administering)”或“施用(administration)”旨在包含将化合物直接或间接递送至其预期作用位点的所有方法。
术语“动物”是指任意动物，包括哺乳动物，特别是人。
附图简述
包括的附图仅仅是用于说明本发明的优选实施方案，不以任何方式限制本发明，其中：
图1A为条带强度，显示了对于ClRNH32P-OdT18与bFGF的结合，去纤维蛋白多核苷酸和具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分对其的竞争。
图1B为标准化的条带强度对去纤维蛋白多核苷酸或具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分的浓度log值作图。
图2为图表，表中显示了在ClRNH32P-OdT18与bFGF的结合中，去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer竞争物的Kc值比较。
图3A为条带强度，显示了烷化寡脱氧核苷酸ClRNH32P-OdT18对PDGF BB的修饰。
图3B为相对条带强度对具反应性的寡脱氧核苷酸浓度的作图。
图3C为图3B中数据的双倒数作图。
图4为图表，表中显示了在ClRNH32P-OdT18与bFGF的结合中，去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer竞争物的Kc值比较。
图5为图表，表中显示了在ClRNH32P-OdT18与VEGF的结合中，Nmer和Tmer竞争物的Kc值比较。
图6为图表，表中显示了在ClRNH32P-OdT18与层粘连蛋白的结合中，Nmer和Tmer竞争物的Kc值比较。
图7为图表，表中显示了在ClRNH32P-OdT18与层粘连蛋白的结合中，Nmer和Tmer竞争物的Kc值比较。
图8A为图表，显示了去纤维蛋白多核苷酸对bFGF介导的HMEC-1增殖的抑制。
图8B为图表，显示了去纤维蛋白多核苷酸在bFGF不存在的情况下对细胞生长的抑制作用。
图9A为图表，显示了Nmer对bFGF介导的HMEC-1增殖的抑制。
图9B为图表，显示了Nmer在bFGF不存在的情况下对细胞生长的抑制作用。
图10为图表，显示了去纤维蛋白多核苷酸和Nmer对部分凝血致活酶时间(PTT)的影响。
图11A为图表，显示了将HMEC-1细胞暴露于浓度渐增的去纤维蛋白多核苷酸24小时后，TFPI的剂量依赖性释放至条件培养液中。
图11B为图表，显示了在用5μM去纤维蛋白多核苷酸诱导下，TFPI释放至条件培养基中的时程。
图11C为图表，显示了将HMEC-1细胞暴露于浓度渐增的去纤维蛋白多核苷酸30分钟后，TFPI的剂量依赖性释放至条件培养液中。
图12A为图表，显示了将HMEC-1细胞暴露于浓度渐增的具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分后，TFPI的剂量依赖性释放至条件培养液中。
图12B为图表，显示了在用5μM去纤维蛋白多核苷酸诱导下，TFPI释放至条件培养基中的时程。
图13为图表，显示了在用bFGF+肝素刺激的、FGFR2转染的C11细胞的增殖中，去纤维蛋白多核苷酸和Nmer替代肝素的能力。
发明详述
寡核苷酸，如去纤维蛋白多核苷酸，可以结合与肝素结合的蛋白质。如此处使用的，术语肝素是指低亲和性肝素。可以制备与天然产物具有相当或更高活性的去纤维蛋白多核苷酸的合成类似物，并且这些类似物具有抗癌活性，因为它们能够与结合肝素的生长因子结合。3种对癌症细胞具有重要作用的肝素结合蛋白质包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和层粘连蛋白；本发明的组合物可以纳摩尔的亲和力与这些蛋白质结合，然而这种结合不是序列特异性的。
本发明组合物以下述惊人发现为基础：具有约40mer至约65mer长度的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物可重现去纤维蛋白多核苷酸的特性，因此可作为此活性成分的合成替代物使用。本发明的寡核苷酸可优选的具有约40-60mer的长度，优选的约45-60mer；根据本发明较好的实施方案，所述寡核苷酸可具有约45-55mer的长度，优选的约50-55mer。
本发明寡核苷酸的嘌呤碱基优选的选自鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤，嘧啶碱基选自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶。根据一个实施方案，寡核苷酸序列由各遗传碱基(A、G、C和T)在各个位置混合组成；优选的为随机序列。根据另一个实施方案，寡核苷酸序列的各个位置由相同的碱基(如胸腺嘧啶，即Tx)组成(称为Tm系列，或Tmer)。根据另一个实施方案，本发明寡核苷酸的糖选自核糖和脱氧核糖。
根据另一个实施方案，本发明寡核苷酸由DNA和/或RNA序列组成。
根据一个优选的实施方案，本发明寡核苷酸为单链。
在实验部分显而易见，本发明者令人惊讶的发现去纤维蛋白多核苷酸的低分子量级分，特别是低于40kDa分子量的级分与肝素结合生长因子的结合能力较低。由此，这一发现使选择定义明确的寡核苷酸混合物成为可能，所述寡核苷酸可被容易和同一的复制，并能够模拟去纤维蛋白多核苷酸的效果。
因此，本发明混合物可用于治疗患有可施用去纤维蛋白多核苷酸治疗的疾病的哺乳动物患者，优选的为人，所述疾病如VOD、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、肿瘤、血管生成依赖性肿瘤(如多发性骨髓瘤或乳腺癌)；这些混合物也可作为抗凝血剂使用，或当与至少一种具有动员造血祖细胞能力的造血因子组合或相继施用时，用于提高哺乳动物外周血中的干细胞和祖细胞的量。
本发明的寡核苷酸混合物可以与去纤维蛋白多核苷酸相同的方式施用；优选的，其可通过注射施用，优选的静脉内注射，通过水溶液进行。所述水溶液的寡核苷酸可具有从5至60微摩尔/升的浓度，优选的从10至50微摩尔/升。
实施例
通过参考以下的非局限性实施例，可更好的理解本发明。
材料与方法
合成磷酸二酯寡核苷酸的生成
为生成一系列Nmer，使用了DNA测序仪(通常可购买到，例如从ABI或Millipore公司)。在测序反应中使用等量的(通过摩尔浓度测定)各种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)。将仪器的程序设定为生成随机长度的单链DNA，长度从25碱基至200碱基，其中每个碱基从4种遗传碱基中随机选择。
细胞培养
SV40转化的HMEC-1细胞从Atlanta，GA的CDC获得。细胞培养于添加10％热失活的胎牛血清(FBS)、10ng/ml EGF、1μg/mL氢化可的松、100U/ml青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的MCDB 131培养液中。无支原体的人黑色素瘤细胞系518A2从Austria Vienna大学的Volker Wacheck博士处获得。细胞培养于添加10％热失活FBS、100U/ml青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养液中。人肝脏星状细胞LX2细胞系由SV40T抗原在低血清条件下自发永生化生成，由纽约的Mount Sinai School ofMedicine的Scott L.Friedman博士提供。LX2细胞培养于添加1％热失活FBS、100U/ml青霉素G钠和100μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养液中。原种培养物于湿润的5％CO2培养箱中于37℃维持培养。
去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分和合成磷酸二酯寡核苷酸的生成
去纤维蛋白多核苷酸，一种由单链磷酸二酯多聚脱氧核糖核酸(分子量为16.5±2.25kDa)组成的高度复杂的多分散物质，是通过从猪肠组织提取的DNA的受控解聚制备得到，由Gentium(Como，Italy)提供。具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分是从猪肠组织分离的去纤维蛋白多核苷酸经分馏得到(A2、E2、G2、I2和L2，分别具有分子量9,353、12,258、16,761、21,840和26,190道尔顿)，也由Gentium提供。Nmer(一系列具有多种确定长度的合成磷酸二酯寡核苷酸)和Tmer(一系列具有确定长度的胸腺嘧啶均聚体的合成磷酸二酯寡核苷酸)通过上述详细步骤合成和纯化，由Trilink Biotechnologies(San Diego，CA)提供。
重组蛋白质和细胞培养材料
重组人bFGF和VEGF165，血小板来源的生长因子-BB(PDGF BB)和结合肝素的表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。层粘连蛋白购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。DMEM、MCDB 131、M199培养液和FBS购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。纤维连接蛋白包被的板和基质胶购自BD Bioscience(Bedford，MA)。IMUBIND Total TFPI ELISA试剂盒购自American Diagnostica(Stanford，CT)。
烷基化寡脱氧核苷酸探针ClRNH32p-OdT18的合成
10OD U的OdT18经5′-多核苷酸激酶反应在5′端用[32P]磷酸标记。多余的ATP通过在0.1M高氯酸锂中的Sephadex G25层析从反应产物中分离。之后加入2％LiClO4/丙酮沉淀寡核苷酸，并将寡核苷酸以200OD U/μl浓度溶解于水中。之后加入8％溴化十六烷基三甲铵的水溶液沉淀寡核苷酸并干燥。之后在干燥的寡核苷酸中依次加入6.5mg溶于20μl二甲基甲酰胺中的p-(苄氨基)-N-氯乙基-N-甲胺(ClRNH2)、8mg二硫联吡啶和9.5mg三苯基膦。2小时后，加入2％LiClO4/丙酮沉淀寡核苷酸，溶解于25μl1MNaCl，用乙醇沉淀并干燥。终产物再次溶解于水中，并于-80℃贮存。
肝素结合蛋白的ClRNH32P-OdT18修饰
使用Yakubov等人(Oligonucleotides interact with recombinantCD4at multiple sites.J.Biol.Chem.1993268：19918-18823)的方法进行肝素结合蛋白的ClRNH32P-OdT18修饰。起初，将bFGF(50nM浓度)、PDGF BB(500nM)、VEGF(150nM)、层粘连蛋白(50nM)或HB-EGF(400nM)在包含10-20μM ClRNH32P-OdT18的0.1M Tris-HCl pH 7.4中孵育。去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分、Tmer或Nmer以递增的浓度作为探针磷酸二酯寡核苷酸与蛋白质的结合竞争物使用。在37℃孵育1小时后，加入1体积的包含10％甘油、4％β-巯基乙醇、4％SDS和0.2％溴酚蓝的缓冲液，并进行SDS-PAGE。将凝胶干燥并在Kodak X光胶片上曝光直至条带显现。将胶片显影，通过激光密度测定法定量条带强度。
增殖实验
汇合的HMEC-1细胞在原位用包含2.5％FBS的M199培养液处理24小时，之后接种(2x 104细胞/孔)于纤维连接蛋白包被的96孔板中(在添加2.5％FBS的M199培养液中)。之后，将培养液替换为仅包含20ng/mLbFGF的新鲜培养液，或包含去纤维蛋白多核苷酸或Nmer及包含或不包含bFGF的新鲜培养液。在37℃处理3天后，通过磺基罗丹明B染色评价细胞生长。所有实验一式4份进行。
组织因子途径抑制剂(TFPI)释放的测定
HMEC-细胞以10x104细胞/孔密度接种于24孔板中，使用包含2.5％FBS的M199培养液。细胞用去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分或Nmer处理不同时间。之后，收集经条件细胞培养液，在10,000g离心10分钟以去除细胞碎片，使用ELISA实验按照制造商的描述测量培养液中组织因子途径抑制剂(TFPI)的浓度。
结果
具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer对于肝素结合蛋白的相互作用类似
去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer与肝素结合蛋白相互作用，肝素结合蛋白在肿瘤生长、存活、肿瘤血管生成和迁移中起重要作用。通过竞争实验对去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer与肝素结合蛋白的结合能力进行评估。首先，合成烷基化的32P-标记的磷酸二酯18mer胸腺嘧啶同聚物(ClRNH32P-OdT18)。将此分子与bFGF、PDGF BB、BB、VEGF、层粘连蛋白或HB-EGF混合，在包含10-20μM标记探针和递增浓度的去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分或Nmer的0.1M Tris-HCl pH7.4中孵育。之后将混合物经凝胶电泳分离并放射自显影。去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer是ClRNH32p-OdT18结合的竞争物，因此是蛋白质被放射性标记的寡核苷酸烷基化的竞争物。ClRNH32P-OdT18对这些蛋白质的Kd值以前已被测定：对bFGF的平均Kd为0.5μM(Guvakova，等人，″Phosphorothioate oligodeoxynucleotides bindto basic fibroblast growth factor，inhibit its binding to cellsurface receptors，and remove it from low affinity binding sites onextracellular matrix″，J.Biol.Chem.，1995，(270)2620-2627)，对层粘连蛋白的平均Kd为14μM(Khaled，等人″Multiple mechanisms maycontribute to the cellular antiadhesive effects of phosphorothioateoligodeoxynucleotides″，Nucl.Acids Res.，1996，(24)737-745)。为测定对VEGF165的Kd，检测了ClRNH32P-OdT18对VEGF修饰的浓度依赖性(图3A)。这些结果描述于图3B，其中修饰寡脱氧核苷酸的浓度作为凝胶条带强度的函数作图。VEGF与修饰寡脱氧核苷酸的结合展示了近似饱和结合，并可通过Michaelis-Menton型的单位点结合方程描述。图3C描述了图3B中数据的双倒数重新作图。这些数据为线性的(R2＝0.98)，直线与横坐标的交点对应于明显的33.9μM的Kd值。对PDGF BB和HB-EGF进行了类似的实验。Kd分别为4.5和8.7μM。
Kc通过Cheng和Prusoff描述的方程1计算：
方程1Kc＝IC50/(1+[ClRNH32P-OdT18]/Kd
在图1A中显示了与bFGF结合的竞争。按照方程1，凝胶条带的标准化强度对竞争物浓度的作图为线性的(图1B)。经观察测定IC50。也测定了不同竞争物对所有目的蛋白质的类似竞争结合。按照同样的方法测定Kc值，并总结于图2、4、5、6和7的表中。
Nmer(以长度依赖方式)和去纤维蛋白多核苷酸抑制肝素结合生长因子对于组织培养中的转化了SV40的HMEC-1细胞生长的最大刺激能力
细胞因子刺激的细胞生长通过使用磺基罗丹明B(SRB)测定。这些实验在SV40转化的HMEC-1细胞中进行，用bFGF刺激其生长。细胞在用包含2.5％FBS的M199培养液中用bFGF处理前，在0％血清中培养24小时，以上调bFGF细胞表面受体，之后在包含20ng/mL bFGF及包含或不包含递增浓度的去纤维蛋白多核苷酸或Nmer的培养液中培养3天。如图8和9显示，两种Nmer以长度依赖方式(长度约45核苷酸或更多的有作用)和去纤维蛋白多核苷酸引起了bFGF诱导的最大细胞增殖的小幅降低(在Nmer的情况下，为长度依赖性的)。与未刺激组和bFGF对照相比，HMEC-1细胞的增殖率在用bFGF处理后增长了60-70％。在加入bFGF之前1小时加入去纤维蛋白多核苷酸的抑制作用和二者同时加入观察到的抑制作用相比没有显著差异(数据未显示)。
去纤维蛋白多核苷酸和Nmer毒性的评估
去纤维蛋白多核苷酸和Nmer的主要毒性，凝血病和出血，是由于寡核苷酸与凝血级联中的肝素结合成员结合并抑制其功能的结果。通过部分凝血致活酶时间(PTT)评估抗凝血作用。将健康志愿者的血浆与各种浓度的去纤维蛋白多核苷酸或Nmer混合，进行标准PTT实验。如图10显示，去纤维蛋白多核苷酸和Nmer没有引起显著的PTT升高。仅在高浓度的去纤维蛋白多核苷酸N50或N60(～100μM)存在时观察到PTT的延长(与对照相比为1.5-1.7倍，图10)。对较长的Nmer，N80，这一作用甚至在25μM浓度时观察到。
去纤维蛋白多核苷酸、具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分和Nmer提高组织因子途径抑制剂(TEPI)的合成和从HMEC-1细胞中的释放
为研究去纤维蛋白多核苷酸如何影响TEPI的急性和长期释放，进行了浓度和时程研究，TEPI为HMEC-1细胞中减弱凝血病的蛋白质。在选定的时间间隔内收集HMEC-1细胞的条件培养液，根据制造商的描述使用ELISA实验测定TEPI水平。如图11A显示，12.5μM去纤维蛋白多核苷酸引起了培养液中TEPI的时间依赖性增加，在20-30分钟后引起了大量释放(与对照细胞相比为5-6倍的增加)。在急性期(30分钟)，递增浓度的去纤维蛋白多核苷酸对HMEC-1的刺激引起了TEPI释放的浓度依赖性增加，在12.5μM的去纤维蛋白多核苷酸浓度下达到平台(图11C)。细胞与12.5
μM具去纤维蛋白多核苷酸分子量的部分或Nmer孵育24小时后，与未刺激的细胞相比引起了培养液中TEPI的7-8倍增加。
C11细胞有丝分裂发生的测定
C11克隆是经基因改造过表达成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)的BAF3小鼠淋巴样细胞，bFGF与成纤维细胞生长因子受体1的结合具有高(pM)亲和力。这些细胞来自D.Ornitz(Washington University，St.Louis)。bFGF对这些细胞的增殖是绝对必需的；此外，早就知道肝素对bFGF的活性是必需的。早已证明DF和Nmer可将bFGF从其细胞外基质的低亲和力(nM)位点去除(Guvakova，等人，″Phosphorothioateoligodeoxynucleotides bind to basic fibroblast growth factor，inhibit its binding to cell surface receptors，and remove it fromlow affinity binding siteson extracellular matrix″，J.Biol.Chem.，1995，(270)2620-2627)。本发明者现在想确定DF和Nmer是否可影响bFGF与其高亲和力结合位点的结合。由此，将C11细胞用缺乏IL-3的RPMI培养液清洗2次。以每孔2.2x104细胞接种于48孔板中。加入bFGF(终浓度1nM)和DF或Nmer(终浓度10μM)或肝素(1μg/mL)至终体积为200μL。将细胞(每个实验n＝3)培养2-3天，用磺基罗丹明蓝(SRB)染色。将细胞数标准化至对照水平(不存在bFGF、肝素或寡核苷酸情况下的增殖)。如图13所示，bFGF或肝素本身在3天后对细胞增殖具有很少或没有作用。肝素和DF均加强bFGF的活性，证明DF可替代肝素的作用。然而，DF没有影响bFGF与其高亲和力结合位点的结合。Nmer，以长度依赖方式，也可替代DF或肝素的作用，但是在达到约80mer长度之前，其活性不如DF显著。
结论
本发明的合成磷酸二酯寡核苷酸(Nmer)事实上可重现去纤维蛋白多核苷酸的特性。
评估和比较了Nmer和去纤维蛋白多核苷酸在与肝素结合蛋白(包括bFGF、PDGF BB、VEGF165、层粘连蛋白和HB-EGF)的结合能力以及引起HMEC-1细胞释放TEPI的能力。Nmer可经普通盐水或5％葡萄糖水溶液的静脉内输注施用于患有癌症或VOD(或可通过施用去纤维蛋白多核苷酸治疗的其他疾病)的患者，以10mg/kg至60mg/kg体重的剂量每日1次剂量或分几次剂量施用约14天。取决于个体患者对治疗的具体疗程的反应可调整剂量。
bFGF、PDGF和各种长度Nmer的Kc值(图2、4、5、6和7)证明了约至少40mer长度的Nmer就足以达到最大Nmer活性。这些Kc值也证明更长的Nmer对总体肝素结合蛋白的亲和力增加很少；因此，基于其更高的重量/剂量比和合成的困难程度，具有长度约大于65mer的Nmer作为去纤维蛋白多核苷酸的替代物似乎是没有必要的。
因此可使用具有长度从约40mer至约65mer的合成磷酸二酯寡核苷酸作为去纤维蛋白多核苷酸的替代物，具体的，它们可用于上述题为“发明背景”的章节中公开的所有治疗的应用，所述章节在此处以其整体引用作为参考。
本发明的优点之一是相关药物制剂的剂量可作为合成磷酸二酯寡核苷酸的浓度函数确定，而不是生物学活性函数，目前使用的抽提来源的寡核苷酸混合物即为后者情况。
本发明的另一个优点体现在下述事实：本发明提供了仅活性序列的施用；因此，如果与例如抽提来源的寡核苷酸混合物相比的话，本发明提供了每剂量更少的寡核苷酸的施用，就效力、安全性和副作用而言均具有明显优势。
本发明至此描述完毕，显而易见的，可以对上述实施方案进行各种改变和修改而不背离本发明的精神和范围。

Claims (49)

1.具有长度为约40碱基至约65碱基的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物。
2.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸具有约40碱基至约60碱基的长度。
3.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸具有约45碱基至约60碱基的长度。
4.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸具有约45碱基至约55碱基的长度。
5.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸具有约50碱基至约55碱基的长度。
6.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸为单链。
7.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸序列为DNA和/或RNA序列。
8.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸序列为随机序列。
9.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸的嘌呤碱基选自鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤，嘧啶碱基选自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
10.权利要求1的混合物，其中所述寡核苷酸的糖选自核糖和脱氧核糖。
11.权利要求1至10的混合物，作为药物使用。
12.权利要求1至10的混合物，用于治疗和/或预防静脉闭塞病。
13.权利要求1至10的混合物，用于治疗和/或预防血栓性血小板减少性紫癜。
14.权利要求1至10的混合物，用于治疗肿瘤。
15.权利要求1至10的混合物，用于治疗血管发生依赖性肿瘤。
16.权利要求1至10的混合物，当与至少一种具有动员造血祖细胞能力的造血因子组合或相继施用时，用于提高哺乳动物外周血中的干细胞和祖细胞的量。
17.权利要求1至10的混合物，作为抗凝血剂使用。
18.包含权利要求1至10的混合物的药物制剂。
19.根据权利要求18的药物制剂，其特征在于所述药物制剂为水溶液。
20.根据权利要求18的药物制剂，其特征在于所述药物制剂经静脉内施用。
21.根据权利要求18的药物制剂，其特征在于对哺乳动物施用所述药物制剂。
22.根据权利要求21的药物制剂，其特征在于所述哺乳动物为人。
23.根据权利要求19的水溶液，其特征在于具有5至60微摩尔/升的寡核苷酸浓度。
24.根据权利要求23的水溶液，其特征在于具有10至50微摩尔/升的寡核苷酸浓度。
25.治疗疾病或病症的方法，包含施用具有长度为约40碱基至约65碱基的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物。
26.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸具有约40碱基至约60碱基的长度。
27.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸具有约45碱基至约60碱基的长度。
28.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸具有约45碱基至约55碱基的长度。
29.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸具有约50碱基至约55碱基的长度。
30.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸为单链。
31.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸序列为DNA和/或RNA序列。
32.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸序列为随机序列。
33.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸的嘌呤碱基选自鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤，嘧啶碱基选自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
34.权利要求25的方法，其中所述寡核苷酸的糖选自核糖和脱氧核糖。
35.权利要求25的方法，其中所述疾病或病症为静脉闭塞病。
36.权利要求25的方法，其中所述疾病或病症为血栓性血小板减少性紫癜。
37.权利要求25的方法，其中所述疾病或病症为肿瘤。
38.权利要求25的方法，其中所述疾病或病症为血管发生依赖性肿瘤。
39.权利要求25的方法，其中所述疾病或病症为使用抗凝血剂导致的疾病或病症。
40.提高哺乳动物外周血中的干细胞和祖细胞的量的方法，所述方法包含具有约40碱基至约65碱基长度的合成磷酸二酯寡核苷酸混合物与至少一种具有动员造血祖细胞能力的造血因子组合或相继施用。
41.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸具有约40碱基至约60碱基的长度。
42.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸具有约45碱基至约60碱基的长度。
43.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸具有约45碱基至约55碱基的长度。
44.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸具有约50碱基至约55碱基的长度。
45.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸为单链。
46.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸序列为DNA和/或RNA序列。
47.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸序列为随机序列。
48.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸的嘌呤碱基选自鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤，嘧啶碱基选自胞嘧啶、胸腺嘧啶、甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
49.权利要求40的方法，其中所述寡核苷酸的糖选自核糖和脱氧核糖。
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