CN101967131B

CN101967131B - 一种法尼基环六烷醇类衍生物及其应用

Info

Publication number: CN101967131B
Application number: CN2010102931508A
Authority: CN
Inventors: 牛雪梅; 张克勤; 张会香; 魏录霞
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2010-09-27
Filing date: 2010-09-27
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-09-27
Also published as: CN101967131A

Abstract

本发明涉及一种法尼基环六烷醇类衍生物及其应用，属微生物农药技术领域。本发明的生产菌株YMF1.01435已于2010年1月18日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.3591。本发明由YMF1.01435菌株经常规发酵、提取分离获得三个新的法尼基环六烷醇类代谢产物，命名为法尼基环六烷醇H(oligosporol H)、法尼基环六烷醇I(oligosporol I)和法尼基环六烷醇J(oligosporol J)。本发明的法尼基环六烷醇类代谢产物在抗细菌活性测试中显示出较强的抑制作用。本发明的法尼基环六烷醇类衍生物具有对环境无污染、成本低、抑制细菌效果佳的优点，能应用于抗菌农药剂的制备。

Description

一种法尼基环六烷醇类衍生物及其应用

技术领域：

本发明涉及一种法尼基环六烷醇类衍生物及其应用，属微生物农药技术领域。

背景技术：

在自然界中，生物在长期进化过程和生存竞争中，由于物种间的相互作用，形成和发展了许多防护机能。发生在微生物间的拮抗作用就是微生物之间“化学战术”的表现，某种微生物产生的代谢产物可抑制它种微生物的生长发育甚至将后者杀死。最典型的就是抗生菌所产生的能抑制其它生物生长发育的抗生素，如1944年青霉素的发现就是一个最早最好的例子。研究发现，生物体所使用的“化学武器”是随着进化而变得越来越精致，往往是在接收到“侵略信号”时即启动和使用这套系统，并且可能随着“敌人”的不同和“受侵犯”程度的不同而反应也有所不同。生物物种之间的化学生态作用是普遍现象，化学防御机制是保持生物物种分布平衡的基本因素。随着耐药细菌的出现和其更新换代的速度加快，寻找新的有效抗菌制剂一直都是人们研究的热点之一。而从其周围环境中的微生物真菌的次生代谢产物研究开发杀菌剂提供了一条潜在的有别于传统方法的从自然界寻找具有生物活性物质的天然筛选模型。也是近年来寻找特效抗菌制剂的重要途径。

发明内容：

本发明的目的旨在提供一种具有抗菌活性的法尼基环六烷醇类衍生物及其应用。

本发明从普遍存在的土壤真菌Arthrobotrys oliospora中筛选出YMF1.01435，从YMF1.01435菌株的次生代谢产物中提取抗菌活性化合物，为研究开发生物抗菌制剂和研究开发仿生生物药奠定基础。

本发明是这样实现的：

本发明人在前期研究中，筛选获得了的土壤真菌Arthrobotrys oligosporaYMF1.01435菌株已于2010年1月18日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.3591。

本发明将YMF1.01435菌株采用PDA培养基，用常规发酵方法培养，将发酵液低压浓缩后，用乙酸乙酯萃取，然后将有机部分合并浓缩后，再通过硅胶(氯仿/甲醇洗脱)和Sephedex-LH20凝胶柱(甲醇洗脱)反复层析，即得到本发明的无色的法尼基环六烷醇类化合物，该类化合物是经核磁共振波谱，质谱，红外光谱紫外和旋光光谱确定为三个新的法尼基环六烷醇类代谢产物，命名为法尼基环六烷醇H(oligosporol H)、法尼基环六烷醇I(oligosporol I)、和法尼基环六烷醇J(oligosporol J)。该类代谢产物的结构如下(以下分别简称为化合物1-3，上部分为化合物1的结构式，中部分为化合物2的结构式，下部分为化合物3的结构)：

本发明所述的从少孢节从孢中分离得到的法尼基环六烷醇类次生代谢产物的物理外观分别为无色油状，与硫酸显色呈棕色；黄色油状，与硫酸显色呈黄绿色变灰色；无色油状，与硫酸显色呈黄色变灰色。分子式都为C₂₂H₃₄O₆。核磁谱特征见表1，其溶解溶剂为CD₃COCD₃，400MHz，δ：ppm.

法尼基环六烷醇H(oligosporol H)(1)：IR(KBr)vmax 3424，2966，2922，2856，1657，1638，1631，1460，1451，1442，1433，1383，1271，1172，1109，1087，1019，948，cm^-1；¹H NMR and ¹³C NMR see Table 1；Negative HRESI-MS m/z 391.2249[M-H]^-，calculated 391.2247for C₂₂H₃₁O₆.

法尼基环六烷醇I(oligosporolI)(2)：IR(KBr)vmax 3423，2967，2924，2856，1657，1639，1630，1441，1384，1261，1167，1104，1076，1021，950，896cm-1；¹HNMR and ¹³C NMR see Table 1；Negative HRESI-MS m/z 391.2244[M-H]^-，calculated 391.2247 for C₂₂H₃₁O₆.

法尼基环六烷醇J(oligosporol J)(3)：Colorless oil；[α]+19.36°(c 0.3，MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)205.2(3.90)；IR(KBr)vmax 3423，2967，2924，2856，1657，1639，1630，1441，1384，1261，1167，1104，1076，1021，950，896cm^-1；¹H NMR and¹³C NMR see Table 1；Negative HRESI-MS m/z 409.2232[M-H]^-，calculated 409.2231 for C₂₂H₃₃O₇；Positive HRESI-MS m/z 433.2198[M+Na]⁺，calculated 433.2196 for C₂₂H₃₄O₇Na.

表1.化合物1-3的¹H and¹³C NMR数据

^aData were measured in acetone-d₆ at 400MHz for ¹H and 100MHz for ¹³C；^bData were measured inmethanol-d₆ at 400MHz for ¹H and 100MHz for ¹³C；with reference to the solvent signals，δin ppm and Jin Hz.

本发明的法尼基环六烷醇类代谢产物在抗细菌活性测试中显示出较强的抑制作用。本发明的法尼基环六烷醇类衍生物具有对环境无污染、成本低、抑制细菌效果佳的优点，能应用于抗菌农药剂的制备。

具体实施方式：

实施例1：

化合物1-3的分离制备：

1.真菌YMF1.01435菌株的种子培养：

从斜面培养基中取一菌种移植块，接种到PDA培养基上(PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，自然PH，灭菌后倒成平板)，在25℃下培养5-7天左右。

2.真菌YMF1.01435菌株的液体发酵培养：

利用上述步骤获得的活化菌种进行发酵，发酵采用PDB液体培养基，培养基组成：马铃薯200～300克，葡萄糖20克；500mL三角瓶，内装250mL，121℃高温灭菌30分钟，冷却后接入液体种子拌匀，在25℃条件180r/min摇床培养25d。

3.将发酵液过滤，滤液即发酵原液减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取，然后将乙酸乙酯部萃取物合并后进行硅胶色谱分离，以甲醇/氯仿＝0-25％为洗脱剂梯度洗脱。

4.收集2％～10％的甲醇/氯仿洗脱液，减压浓缩。将浓缩液再进行反复硅胶色谱分离

5.收集TLC板上硫酸显色为绿色的洗脱液浓缩，经甲醇Sephedex-LH 20，丙酮Sephedex-LH 20反复分离后得到化合物1-3。

实施例2：

用滤纸平板法检测本发明化合物的单体抗菌活性的实验：

1.试验用药剂

将化合物1-3溶于10μl丙酮，再加入10％浓度的吐温-20溶液，分别制备400μg·mL^-1、200μg·m^-1、100μg·mL^-1、50μg·mL^-1和25μg·mL^-1浓度的供试液，在该溶液中，丙酮的终浓度不超过3％，吐温-20的终浓度不超过0.5％。另将相同浓度的丙酮溶解于含有0.5％(v/v)的吐温-20水溶液作为对照。

2.细菌培养与制备

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、土壤细菌芽孢杆菌(Bacillusspp.)菌株3.34，3.38，和3.42于37℃在LB培养基(胰蛋白胨tryptone 10g/L，酵母提取物yeast extract 5g/L，氯化钠NaCl 10g/L，水1000mL，PH 7.4，灭菌)培养1～2天，配置每种菌株的菌悬液(OD600≈0.8)。

3.试验方法

使用滤纸片法进行。用打孔器打取直径为6mm的圆形滤纸于121℃湿热灭菌20min后，取无菌圆形滤纸片分别浸在丙酮(阴性对照)、农用链霉素(阳性对照)和测试样品中，分别取每种菌悬液各0.5mL涂布于LB固体培养基的琼脂平板上(胰蛋白胨tryptone 10g/L，酵母提取物yeast extract 5g/L，氯化钠NaCl10g/L，琼脂15g/L，水1000mL，PH 7.4，灭菌后倒成平板)，然后将浸有不同浓度药剂的滤纸片放在每个涂布后的平板上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养，24h后观察，通过滤纸周围的抑菌圈的大小(圆形滤纸片周围外直径)，确定抑菌效果和大致的抑菌浓度范围。

取农用链霉素、丙酮和测试样品1mL加入到装有4mL LB液体培养基的试管，再接入0.5mL供试菌的菌悬液，充分振荡摇使各试管中菌的含量为10⁵cfu/mL。将试管置于37℃下摇床培养(rpm＝115r/min)24h后，用分光光度计法检测各管细菌生长的情况。若0D大于0，有菌生长记为阳性(+)；若OD＝0，无菌生长记为阴性(一)，以无菌生长时的测试样品的最低浓度为对此种菌的MIC。

4.实验结果

表1供试化合物对细菌的抑制结果

结果表明：本发明的化合物1-3对上壤细菌都有较好的抑制作用，尤其在高浓度下，所有滤纸片周围都不长菌。由此可见，该类化合物极有开发成抗细菌的抗菌剂农药的潜力。

Claims

1.一种法尼基环六烷醇类衍生物，由生产菌株经常规发酵、提取分离获得；其特征在于：

a.生产菌株YMF1.01435菌株已于2010年1月18日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.3591;

b.法尼基环六烷醇类衍生物为：

2.权利要求1所述法尼基环六烷醇类衍生物在制备抗菌药物制剂中的应用。