CN101952724A - 检测对象的检测方法和定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于：提供可以快速、廉价、简便且高精度地检测、定量检测对象的检测方法和定量方法。该检测方法包括以下步骤：将第1结合物10和检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物11凝集的条件下，之后施加磁力，测定产生的磁场，根据施加磁力后磁场的增加程度来检测检测对象50，所述第1结合物10为含有刺激响应性聚合物11和微粒状磁性物质19的第1物质与抗检测对象50的第1抗体13结合的结合物。
Description
技术领域
本发明涉及检测对象的检测方法和定量方法。
背景技术
一直以来，作为检测被检体中的检测对象的方法，采用胶乳凝集法。所谓胶乳凝集法，是指在检测生物体样品等流体中的抗原时，通过将担载有与抗原特异性结合的抗体或其片段的胶乳和流体混合，测定胶乳的凝集程度，来检测或定量抗原的方法(例如参照专利文献1)。
根据该胶乳凝集法，作为检验体添加的抗原使多个胶乳结合抗体交联，促进胶乳的凝集。这样，由于程序简单，因此能够简便且快速地检测抗原。但是，当抗原为微量时，不易发生交联，因此胶乳不能充分凝集。因此，难以检测微量的抗原。
于是，人们还广泛采用ELISA法或CLEIA法这样的利用酶底物反应的方法。这些方法中，例如使与抗原特异性结合的一次抗体与抗原结合，并使具有酶的二次抗体与该一次抗体结合。其中，通过添加酶底物，测定酶催化反应的程度，来检测或定量抗原。
根据这些方法，例如使用发光试剂作为底物时，底物添加后的发光检测灵敏度高，因此也可以检测微量的抗原。
专利文献1：特公昭58-11575号公报
发明内容
发明所要解决的课题
但是，在利用酶底物反应的方法中，必须使用二次抗体或发光试剂等多种特殊的试剂，作业成本高。此外，为了抑制发光试剂的褪色(漂白现象)，必须在极短时间内结束测定步骤，因此人们担心测定精度不够。
另一方面，如图10所示，该方法包括：培育试样和各试剂的步骤(ST110、ST130)、清洗系统的步骤(ST120)、测定发光的步骤(ST140)等多个阶段，操作繁杂。而且，各阶段所需的时间非常长，不适合大规模处理。
本发明鉴于上述情况而设，其课题在于：提供能够快速、廉价、简便且高精度地检测、定量检测对象的检测对象的检测方法和定量方法。
解决课题的方法
本发明人等发现：若接近具有电荷或亲水性的物质，则刺激响应性聚合物的凝集被阻碍；通过活用磁力，可以高精度地检测刺激响应性聚合物凝集的程度，从而完成了本发明。
具体而言，本发明具有以下构成。
[1]检测检验体中的检测对象的方法，该方法包括以下步骤：
将第1结合物和上述检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，之后施加磁力，所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物和微粒状磁性物质的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物；
测定产生的磁场，根据施加磁力后磁场的增加程度来检测上述检测对象。
[2][1]所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：在施加磁力之前向上述混合物中进一步添加第1物质。
[3][1]或[2]所述的方法，其中，将第1结合物和上述检验体与第2结合物混合，所述第2结合物为具有电荷或亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物，
第1亲和性物质和第2亲和性物质可以在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
[4]定量检验体中的检测对象的方法，该方法包括以下步骤：
将第1结合物和上述检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的预定条件下，之后施加磁力，所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物和微粒状磁性物质的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物，
测定产生的磁场，根据上述检测对象的量与磁场在上述预定条件下的关系式，算出上述检验体中检测对象的量。
[5][4]所述的方法，其中进一步包括以下步骤：在施加磁力之前向上述混合物中进一步添加第1物质。
[6][4]或[5]所述的方法，其中，将第1结合物和上述检验体与第2结合物混合，所述第2结合物为具有电荷或亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物，
第1亲和性物质和第2亲和性物质可以在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
发明效果
根据本发明，当存在检测对象时，第1亲和性物质与该结合对象结合。这样，检测对象的电荷部分或亲水性部分接近于与第1亲和性物质结合的刺激响应性聚合物。由此，电荷部分或亲水性部分被配置在刺激响应性聚合物附近，所以由对刺激作出响应的刺激响应性聚合物引起的第1物质的凝集依赖于检测对象的量而被阻碍。
此处，若对第1物质施加磁力，则其具备以下特性：处于凝集状态时显示出强磁性，具有大的残留磁；处于非凝集状态时显示出超常磁性，不具有残留磁。即，施加磁力后磁场的增加程度依赖于第1物质的凝集程度。
因此，施加磁力后磁场的增加程度依赖于检测对象的量，所以根据磁场的增加程度可以检测检测对象。此外，根据检测对象量与磁场的关系式可以定量检测对象。
而且，以上程序均无需特别使用特殊试剂即可进行，廉价且简便。此外，由于只测定磁场，而不是利用被酶催化的反应的系统，所以可以快速且高精度地进行检测对象的检测或定量。另外，所测定的磁场不会受到检测对象中的夹杂物的很大影响，因此测定前未必需要进行除去夹杂物这样的预备程序，即可高精度且更快速地进行检测对象的检测或定量。
附图说明
图1是本发明一实施方式的方法中使用的第1结合物的概略构成图。
图2是显示上述实施方式的第1结合物的使用状态的模式图。
图3是本发明一实施方式的方法中使用的检查装置的概略构成图。
图4是本发明一实施方式的方法中使用的第1结合物和第2结合物的概略构成图。
图5是显示上述实施方式的第1结合物和第2结合物的使用状态的模式图。
图6是显示参考例的方法中测定时间与浊度的关系的图。
图7是本发明一实施例的方法中使用的计测装置的概略构成图。
图8是显示上述实施例的方法中测定时间与磁场的关系的图。
图9是显示上述实施例的方法中检测对象的量与磁场的关系式的图。
图10是以往例的方法的流程图。
符号说明
10 第1结合物
11 刺激响应性聚合物
13 第1抗体(第1亲和性物质)
15 抗生物素蛋白
17 生物素
19 磁性物质
20 第2结合物
21 第2物质
23 第2抗体(第2亲和性物质)
50 检测对象
具体实施方式
以下，参照附图来说明本发明的实施方式。需要说明的是，在第1实施方式以外的各实施方式的说明中，对于与第1实施方式共通的实施方式，附上相同的符号，并省略其说明。
<第1实施方式>检测方法
[混合、凝集]
在本发明的检测方法中，首先，将第1结合物和检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下。首先，对其中使用的第1结合物进行详细说明。
[第1结合物]
第1结合物是含有刺激响应性聚合物的第1物质与对检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物。
(第1物质)
本发明所使用的第1物质是含有刺激响应性聚合物的物质，该刺激响应性聚合物是对外部刺激作出响应而发生结构变化，从而可以调整凝集和分散的聚合物。对刺激没有特别限定，可以是温度变化、光照射、酸或碱的添加(pH的变化)、电场变化等。
在本发明中，作为刺激响应性聚合物，特别可以使用根据温度变化能够凝集和分散的温度响应性聚合物。需要说明的是，作为温度响应性聚合物，可以是具有下限临界溶液温度(以下也称作LCST)的聚合物或具有上限临界溶液温度的聚合物(以下也称作UCST)。例如，具有LCST为37℃的下限临界溶液温度的聚合物，其在低于LCST的温度的水溶液中完全分散，若将水温升至LCST以上则可立即凝集。此外，具有UCST为5℃的上限临界溶液温度的聚合物，其在超过UCST的温度的水溶液中完全分散，若将水温降至UCST以下则可立即凝集。
作为本发明所使用的具有下限临界溶液温度的聚合物，可以列举：包含N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰基吡咯烷、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基丙烯酰基吗啉等N取代(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物；羟丙基纤维素、聚乙烯醇部分乙酰化物、聚乙烯基甲基醚、(聚氧乙烯-聚氧丙烯)嵌段共聚物、聚氧乙烯月桂基胺等聚氧乙烯烷基胺衍生物；聚氧乙烯脱水山梨糖醇月桂酸酯等聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯衍生物；(聚氧乙烯壬基苯基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯辛基苯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基苯基醚)(甲基)丙烯酸酯类；以及(聚氧乙烯月桂基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯油烯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基醚)(甲基)丙烯酸酯类等聚氧乙烯(甲基)丙烯酸酯衍生物等。并且，还可以利用包含这些聚合物和它们中的至少2种单体的共聚物。此外，还可以使用N-异丙基丙烯酰胺与N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。使用含有(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物时，可以在该聚合物中以具有下限临界溶液温度的范围共聚其他可共聚的单体。在本发明中，其中可以优选使用包含选自N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰基吡咯烷、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基丙烯酰基吗啉的至少1种单体的聚合物或N-异丙基丙烯酰胺与N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。
作为本发明所使用的具有上限临界溶液温度的聚合物，可以使用包含选自丙烯酰基甘氨酰胺、丙烯酰基哌啶甲酰胺、丙烯酰基天冬酰胺(アクリロイルアスパラギンアミド)和丙烯酰基谷氨酰胺等的至少1种单体的聚合物。另外，可以是包含它们中的至少2种单体的共聚物。这些聚合物中，可以以具有上限临界溶液温度的范围共聚丙烯酰胺、乙酰基丙烯酰胺、生物素醇丙烯酸酯(biotinol acrylate)、N-生物素基-N’-甲基丙烯酰基三亚甲基酰胺、丙烯酰基肌氨酰胺、甲基丙烯基肌氨酰胺、丙烯酰基甲基尿嘧啶等、其他可共聚的单体。
另外，在本发明中，作为刺激响应性聚合物，可以使用根据pH变化能够凝集和分散的pH响应性聚合物。对pH响应性聚合物发生结构变化的pH没有特别限定，但从给予刺激时可以抑制由第1结合物、第2结合物和检验体的变性等引起的检测、定量精度的降低的角度考虑，优选pH4～10，进一步优选为pH5～9。
作为这样的pH响应性聚合物，可以例示：含有羧基、磷酸、磺酰基、氨基等基团作为官能团的聚合物。更具体而言，可以是(甲基)丙烯酸、马来酸、苯乙烯磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、(甲基)丙烯酸磷酰基乙酯、甲基丙烯酸氨基乙酯、氨基丙基(甲基)丙烯酰胺、二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺等具有解离基团的单体聚合的聚合物，还可以是这些具有解离基团的单体以不损及pH响应能力的程度与其他乙烯基单体、例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯等(甲基)丙烯酸酯类、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯等乙烯基酯类、苯乙烯、氯乙烯、N-乙烯吡咯烷酮等乙烯基化合物、(甲基)丙烯酰胺类等共聚的共聚物。
(微粒状磁性物质)
在此使用的微粒状磁性物质可以由多元醇和磁铁矿构成。该多元醇只要是构成单元中具有至少2个羟基且可与铁离子结合的醇结构体即可，没有特别限定，例如有葡聚糖、聚乙烯醇、甘露醇、山梨醇、环糊精。例如，在日本特开2005-82538公报中公开了使用葡聚糖的微粒状磁性物质的制造方法。此外，还可以使用如甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物那样具有环氧基、且开环后形成多元醇结构体的化合物。使用这样的多元醇制备的微粒状磁性物质(磁性微粒)，优选其平均粒径为0.9nm以上且不足1000nm，以具有良好的分散性。为了提高目标检测对象的检测灵敏度，平均粒径特别优选为2.9nm以上且不足200nm。
(第1亲和性物质)
第1亲和性物质例如可以是识别检测对象的不同抗原决定簇的单克隆抗体。在此使用的抗体可以是任意类型的免疫球蛋白分子，也可以是Fab等具有抗原结合位点的免疫球蛋白分子片段。此外，抗体既可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。
[第1结合物的制作]
第1结合物通过将第1物质和第1亲和性物质结合来制作。对该结合方法没有特别限定，例如在第1物质侧(例如刺激响应性聚合物部分)和第1亲和性物质(例如第1抗体)侧这两侧结合相互具有亲和性的物质(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶)，经由这些物质使第1物质和第1亲和性物质结合。
具体而言，如国际公开WO01/009141号小册子所述，生物素与刺激响应性聚合物的结合，可以通过使生物素等与甲基丙烯基或丙烯基等聚合性官能团结合形成加成聚合性单体，再与其他单体共聚来进行。另外，抗生物素蛋白等与第1亲和性物质的结合可以按照常规方法来进行。接下来，将生物素结合刺激响应性聚合物和抗生物素蛋白结合第1亲和性物质混合，则经由抗生物素蛋白与生物素的结合，第1亲和性物质和刺激响应性聚合物结合。
作为另外的方法，可以采用在聚合物聚合时使具有羧基、氨基或环氧基等官能团的单体与其他单体共聚，经由该官能团，按照本技术领域周知的方法使抗体亲和性物质(例如Melongel(メロンゲル)、蛋白A、蛋白G)与聚合物结合的方法。通过使第1抗体与如此操作得到的抗体亲和性物质结合，来制作刺激响应性聚合物与抗检测对象抗原的第1抗体的第1结合物。
或者，可以在聚合物聚合时使具有羧基、氨基或环氧基等官能团的单体与其他单体共聚，按照常规方法使抗检测对象抗原的第1抗体与这些官能团直接结合。
或者，可以使第1亲和性物质和刺激响应性聚合物与微粒状磁性物质结合。
也可以将第1物质置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，之后通过离心进行分离，从而纯化第1结合物。第1结合物的纯化还可以通过以下方法来进行：使微粒状磁性物质与刺激响应性聚合物结合，再使其与第1亲和性物质结合，之后施加磁力来回收磁性物质。
微粒状磁性物质与刺激响应性聚合物的结合，可以通过经由反应性官能团进行结合的方法、或向磁性物质中的多元醇上的活性氢或多元醇中导入聚合性不饱和键进行接枝聚合的方法等本技术领域周知的方法来进行(例如参照ADV.Polym.Sci.、第4卷、第111页、1965和J.Polymer Sci.、Part-A、3、第1031页、1965)。
再返回说明检测方法的程序。若将上述第1结合物和检验体的混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，则当存在检测对象时，刺激响应性聚合物被检测对象的电荷部分或亲水性部分阻碍凝集而分散。另一方面，当不存在检测对象时，刺激响应性聚合物的凝集没有被阻碍而发生凝集。
参照图1～图2来说明该现象。
如图1所示，第1结合物10含有刺激响应性聚合物11，该刺激响应性聚合物11经由抗生物素蛋白15和生物素17与抗检测对象50的第1抗体13结合。另外，第1结合物10含有微粒状磁性物质19，在该磁性物质19的表面结合有刺激响应性聚合物11。由此，检测对象50经由第1抗体13可以接近磁性物质19，此时检测对象50的正电荷部分位于磁性物质19附近。需要说明的是，在本实施方式中，形成检测对象50的正电荷部分位于磁性物质19附近的构成，但并不限于此，也可以是负电荷部分或亲水性部分位于磁性物质19附近的构成。
为了使刺激响应性聚合物11凝集，例如在使用温度响应性聚合物时，将装有混合液的容器移入温度响应性聚合物凝集的温度的恒温槽内即可。温度响应性聚合物有两种：具有上限临界溶液温度(以下有时简称为“UCST”)的聚合物和具有下限临界溶液温度(以下有时简称为“LCST”)的聚合物。例如，使用具有LCST为37℃的下限临界溶液温度的聚合物时，通过将装有混合液的容器移入37℃以上的恒温槽内，即可使温度响应性聚合物凝集。当使用具有UCST为5℃的上限临界溶液温度的聚合物时，通过将装有混合液的容器移入低于5℃的恒温槽内，即可使温度响应性聚合物凝集。
使用pH响应性聚合物时，向装有混合液的容器中加入酸溶液或碱溶液即可。具体而言，向装有处于pH响应性聚合物发生结构变化的pH范围外的分散混合液的容器中加入酸溶液或碱溶液，使容器内变为pH响应性聚合物发生结构变化的pH范围即可。例如，使用在pH5以下凝集、超过pH5则分散的pH响应性聚合物时，向装有超过pH5则分散的混合液的容器中加入酸溶液使pH达到5以下即可。此外，使用在pH10以上凝集、不足pH10则分散的pH响应性聚合物时，向装有低于pH10则分散的混合液的容器中加入碱溶液使pH达到10以上即可。对pH响应性聚合物发生结构变化的pH没有特别限定，但优选pH4～10，进一步优选为pH5～9。
使用光响应性聚合物时，对装有混合液的容器照射能够凝集聚合物的波长的光即可。用于使聚合物凝集的优选的光根据光响应性聚合物所含的光响应性官能团的种类和结构而不同，但通常可以优选使用波长为190～800nm的紫外光或可见光。此时，光强度优选0.1～1000mW/cm2。需要说明的是，从可以提高测定精度的角度考虑，光响应性聚合物优选为照射用于测定浊度的光时不易发生分散、换言之发生凝集的光响应性聚合物。作为光响应性聚合物，当使用照射用于测定浊度的光时发生分散的光响应性聚合物时，通过缩短照射时间，可以提高测定精度。
若将第1结合物10和检验体的混合物置于所述条件下，则当存在检测对象50时，刺激响应性聚合物11被检测对象50的正电荷部分阻碍凝集而分散(图2(A))。而当不存在检测对象50时，刺激响应性聚合物11的凝集没有被阻碍而发生凝集(图2(B))。
需要说明的是，温度响应性聚合物的凝集可以在第1结合物和检测对象结合后进行，也可以同时并列进行，但从可以缩短处理时间的角度考虑，优选后者。
其中，下限临界溶液温度如下确定。首先，将试样装入吸光光度计的比色皿中，以1℃/分钟的速度将试样升温。其间，记录550nm处的透过率变化。在此，将聚合物溶解至透明时的透过率作为100％、将完全凝集时的透过率作为0％时，求出透过率达到50％时的温度，作为LCST。
另外，上限临界溶液温度的情形如下确定。以1℃/分钟的速度将试样冷却，与下限临界溶液温度的情形一样，记录550nm处的透过率变化。在此，将聚合物溶解至透明时的透过率作为100％、将完全凝集时的透过率作为0％时，求出透过率达到50％时的温度，作为UCST。
[磁力的施加、磁场的测定]
磁力的施加和磁场的测定可以按照常规方法来进行。以下，对一种方式进行说明，但本发明并不限于该方式。
图3是检查装置60的概略构成图。检查装置60具备：磁力施加系统70和磁场测定系统80。
磁力施加系统70具备支撑筒71，在该支撑筒71的内部沿支撑筒71的轴向插有试样管75。从注射泵77挤出的试样M在该试样管75的内部移动。其中，试样M是第1结合物和检验体的混合物。
另一方面，在支撑筒71的轴向两端支撑有亥姆霍兹线圈73a、73b。亥姆霍兹线圈73a、73b电连接在交流电源74上，由该交流电源74向亥姆霍兹线圈73a、73b供应交流电流时，在支撑筒71内部产生交流磁场。由此，对挤入支撑筒71内的试样M施加磁力后，其向支撑筒71外移动。
亥姆霍兹线圈73a、73b是将半径和圈数相等的一对圆筒线圈沿轴向间隔着配置且互相串联而成，适合于希望得到较单一线圈产生的磁场均匀的磁场的情形。需要说明的是，本实施方式中，两线圈73a、73b的缠绕方向相同，产生的磁场的极性相同。
磁场测定系统80具备SQUID磁传感器81，该磁传感器81设置在耐热容器83上。所谓SQUID(超导量子干涉装置)，是超导环通过一个或两个约瑟夫森结连接而成，适合于高灵敏度磁力计、近磁场天线、微弱电流或电压的测定。所述磁传感器81位于支撑筒71的下方，接收由通过磁传感器81内的试样M产生的磁场。此时，在试样M中存在检测对象的情况下，第1结合物分散，因此磁场并没有显著增加；当试样M中不存在检测对象时，第1结合物凝集，故磁场显著增加。
磁传感器81将所述磁场信号传送到SQUID驱动电路84中，SQUID驱动电路84将磁场信号转换成电压信号，并传送到锁定放大器85中。传送到锁定放大器85中的电压信号被放大后，输出到记录仪86中。
观测输出到记录仪86中的信号的变化，确认到其信号强度显著增加时，可以判断检验体中不存在检测对象；没有确认到其信号强度显著增加时，可以判断检验体中存在检测对象。其中，“显著增加”的幅度根据检测中所用系统的条件预先设定。
(检测对象)
作为按照上述检测方法可以检测的对象，可以列举用于临床诊断的物质，具体可以列举：体液、尿、咳痰、粪便中等所含的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白E、人白蛋白、人纤维蛋白原(纤维蛋白及其分解产物)、α-甲胎蛋白(AFP)、C反应性蛋白(CRP)、肌红蛋白、癌胎儿性抗原、肝炎病毒抗原、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘性催乳素(HPL)、HIV病毒抗原、变态反应原、细菌毒素、细菌抗原、酶、激素(例如人甲状腺刺激激素(TSH)、胰岛素等)、药物等。
在怀疑含有上述检测对象的检验体(血液等)中，往往混有多种且大量的夹杂物，但所测定的磁场并不会受到检测对象中的夹杂物的很大影响。因此，测定前未必需要进行除去夹杂物这样的预备程序。
[作用效果]
根据本发明的第1实施方式，得到以下的作用效果。
当存在检测对象时，第1亲和性物质与该结合对象结合。这样，检测对象的电荷部分或亲水性部分接近与第1亲和性物质结合的刺激响应性聚合物。由此，由于电荷部分或亲水性部分配置在刺激响应性聚合物附近，所以对刺激作出响应的刺激响应性聚合物所引起的第1物质的凝集依赖于检测对象的量而被阻碍。
此处，若对第1物质施加磁力，则其具备以下特性：处于凝集状态时显示出强磁性，具有大的残留磁；处于非凝集状态时显示出超常磁性，不具有残留磁。即，施加磁力后磁场的增加程度依赖于第1物质的凝集程度。
因此，施加磁力后磁场的增加程度依赖于检测对象的量，所以根据磁场的增加程度可以检测检测对象。
而且，以上程序均无需特别使用特殊试剂即可进行，廉价且简便。此外，由于只测定磁场，而不是利用被酶催化的反应的系统，所以可以快速且高精度地进行检测对象的检测。另外，所测定的磁场不会受到检测对象中的夹杂物的很大影响，因此测定前未必需要进行除去夹杂物这样的预备程序，即可高精度且更快速地进行全血试样等中的检验体的检测。
<第2实施方式>定量方法
在本发明的定量方法中，首先，将第1结合物和检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的预定条件下，之后施加磁力。接着，测定产生的磁场，根据检测对象的量与磁场在预定条件下的关系式，算出检验体中检测对象的量。由于前半部分的程序与前述的检测方法类似，故省略说明。
(关系式)
制作与上述预定条件相同条件下的、检测对象的量与磁场的关系式。构成该关系式的检测对象的量与磁场的测定只要涉及2个以上检测对象的量即可，但从得到可靠性高的关系式的角度考虑，优选涉及3个以上检测对象的量。
其中，检测对象的量与磁场的关系式，不仅是显示检测对象的量与磁场的直接相关的关系式，而且还可以是检测对象的量与反映磁场的参数(例如电压)之间的关系式。
(计算)
将磁场测定值代入制作好的关系式中，由此可以算出检验体中检测对象的量。
[作用效果]
根据本发明的第2实施方式，得到以下的作用效果。
与第1实施方式一样，施加磁力后磁场的增加程度依赖于检测对象的量，所以通过将磁场测定值代入检测对象量和磁场的关系式中，即可定量检测对象。
而且，该程序廉价且简便，可以快速且高精度地进行检测对象的定量。此外，测定前未必需要进行除去夹杂物这样的预备程序，即可高精度且更快速地进行全血试样等中的检测对象的定量。
<第3实施方式>第1物质的添加
本实施方式包括在施加磁力之前向混合物中进一步添加第1物质的步骤，这一点与第1～2实施方式不同。
即，本实施方式中，在第1结合物和检验体中进一步添加有第1物质的状态下，将混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下。这样，在第1结合物的凝集物中第1物质进一步凝集，凝集物变得肥大。之后，若施加磁力，则变得肥大的凝集物被强力磁化，具备更强的残留磁。
需要说明的是，在本实施方式中，虽然是向第1结合物和检验体的混合物中添加第1物质，但并不限于此，添加第1结合物、检验体、第1物质的顺序可以是任意的。此外，第1物质既可以单独添加，也可以以与其他物质复合的状态、例如以结合有第1亲和性物质的第1结合物的状态添加。
根据本实施方式，除上述实施方式外，还得到以下的作用效果。
由于向第1结合物和检验体中进一步添加第1物质，所以形成的凝集体变得肥大。由此，施加磁力后产生更强的磁场，所以检测对象的量的差异被扩大后再进行检测。因此，可以更高精度地检测或定量检测对象。
<第4实施方式>第2结合物的使用
在本实施方式中，将第1结合物和检验体与第2结合物混合，这一点与上述实施方式不同。以下具体说明。
[第2结合物]
第2结合物是具有电荷或亲水性的第2物质与对检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物。
(第2物质)
具有电荷的第2物质例如是具有电荷的高分子化合物，优选为聚阴离子或聚阳离子。聚阴离子是指具有多个阴离子基的物质，而聚阳离子是指具有多个阳离子基的物质。聚阴离子的例子有：DNA和RNA等核酸。这些核酸由于沿着核酸骨架存在多个磷酸二酯基而具有聚阴离子的性质。此外，聚阴离子还包括：含有多个羧基的多肽(包含谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的多肽)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、以及含有丙烯酸或甲基丙烯酸作为聚合成分的聚合物；羧甲基纤维素、透明质酸、以及肝素等多糖等。而聚阳离子的例子有：聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚烷基胺、聚乙烯亚胺和聚丙基乙烯亚胺等。需要说明的是，聚阴离子(羧基)或聚阳离子(氨基)的官能团数优选25个以上。
亲水性的第2物质例如是水溶性高分子化合物，可以列举：聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯等含有酯键的高分子；聚乙烯醇等含醇性羟基的高分子；葡聚糖、环糊精、琼脂糖、羟丙基纤维素等水溶性多糖类等。
这些具有电荷或亲水性的物质在高分子链中或末端可以具有用于结合第2亲和性物质的官能团等。
(第2亲和性物质)
第2亲和性物质可以在不同于第1亲和性物质的部位和第1亲和性物质同时与检测对象结合。第1亲和性物质和第2亲和性物质例如可以是识别检测对象的不同抗原决定簇的单克隆抗体。
[制作方法]
第2结合物通过使第2物质与第2亲和性物质直接或间接结合来制作。没有特别限定，例如在第2物质侧和第2亲和性物质(例如第2抗体)侧这两侧结合相互具有亲和性的物质(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶)，经由这些物质使第2物质和第2亲和性物质间接结合。
使第2物质和第2亲和性物质直接结合时，可以经由官能团使之结合，例如在使用官能团时，可以按照Ghosh等人的方法(Ghosh等人.：Bioconjugate Chem.、1、71-76、1990)的马来酰亚胺-硫醇偶联进行结合。具体可以列举以下两种方法。
在方法1中，首先，向核酸的5’末端导入巯基(别名：硫氢基)，另一方面，使6-马来酰亚胺己酸琥珀酰亚胺酯(例如“EMCS(商品名)”((株)同仁化学研究所制))与抗体反应而导入马来酰亚氨基。接下来，使这两种物质经由巯基和马来酰亚氨基而结合。
在方法2中，首先，进行与方法1相同的操作，向核酸的5’末端导入巯基，再使该巯基进一步与作为均二官能性试剂的N，N-1，2-亚苯基二马来酰亚胺反应，从而向核酸的5’末端导入马来酰亚氨基，另一方面，向抗体中导入巯基。接下来，使这两种物质经由巯基和马来酰亚氨基而结合。
此外，作为将核酸导入蛋白质中的方法，已知例如在Nucleic Acids Research第15卷5275页(1987年)和Nucleic Acids Research第16卷3671页(1988年)中记载的方法。这些技术可应用于核酸与抗体的结合。
根据Nucleic Acids Research第16卷3671页(1988年)，首先，通过使寡核苷酸与胱胺、碳化二亚胺和1-甲基咪唑反应，向寡核苷酸的5’末端的羟基中导入巯基。纯化导入有巯基的寡核苷酸，之后用二硫苏糖醇进行还原，然后加入2，2’-二吡啶基二硫醚，从而经由二硫键向寡核苷酸的5’末端导入吡啶基。另一方面，事先使亚氨基四氢噻吩(イミノチアレン)与蛋白质反应而导入巯基。将这些导入有吡啶基二硫醚的寡核苷酸和导入有巯基的蛋白质混合，使吡啶基和巯基发生特异性反应，从而使蛋白质与寡核苷酸结合。
根据Nulcleic Acids Research第15卷5275页(1987年)，首先，事先向寡核苷酸的3’末端导入氨基，并使其与作为均二官能性试剂的二硫-双-丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(简称：二硫-双-丙酰基-NHS)反应。反应后，通过添加二硫苏糖醇将二硫-双-丙酰基-NHS分子中的二硫醚键还原，从而向寡核苷酸的3’末端导入巯基。在蛋白质的处理中，使用日本特开平5-48100号公报所示的杂二官能性交联剂。首先，使具有能够与蛋白质中的官能团(例如氨基)反应的第1反应性基团(琥珀酰亚胺)和能够与巯基反应的第2反应性基团(例如马来酰亚胺等)的杂二官能性交联剂与蛋白质反应，从而向蛋白质中导入第2反应性基团，制成预活化的蛋白试剂。使如此操作而得到的蛋白试剂与硫醇化多核苷酸的巯基共价结合。
使用核酸以外的聚阴离子或聚阳离子时，也可以通过向它们的末端等中导入巯基，利用与上述相同的操作来制作第2结合物。
返回说明检测和定量方法的程序。在本发明的检测方法和定量方法中，将上述第2结合物与第1结合物和检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下。这样，当存在检测对象时，刺激响应性聚合物被第2结合物中的电荷阻碍凝集而分散；而当不存在检测对象时，刺激响应性聚合物的凝集没有被阻碍而发生凝集。参照图4～图5来说明该现象。
如图4所示，第2结合物20含有具有负电荷或亲水性的第2物质21，该第2物质21与抗检测对象50的第2抗体23结合。而且，第1抗体13和第2抗体23可以在检测对象50的不同部位同时与检测对象50结合。
如图5所示，若将第1结合物10、第2结合物20和检验体的混合物置于预定条件下，则当存在检测对象50时，刺激响应性聚合物11被第2结合物20中的电荷或亲水性部分阻碍凝集而分散(图5(A))。其中，第1结合物10的凝集阻碍的程度较上述实施方式大(参照图2(A))。
而当不存在检测对象50时，刺激响应性聚合物11的凝集没有被阻碍而发生凝集(图5(B))。
需要说明的是，温度响应性聚合物的凝集可以在第1结合物和第2结合物与检测对象结合后进行，也可以同时并列进行，但从可以缩短处理时间的角度考虑，优选后者。但是，当温度响应性聚合物凝集的条件、与第1结合物和第2结合物与检测对象结合的条件差别甚大时，优选前者。
根据本实施方式，除上述实施方式外，还得到以下的作用效果。
当存在检测对象时，第1亲和性物质和第2亲和性物质与该结合对象结合，所以与第1亲和性物质结合的刺激响应性聚合物和与第2亲和性物质结合的第2物质接近。由此，由于具有电荷的部分或亲水性部分被配置在刺激响应性聚合物附近，所以对刺激作出响应的刺激响应性聚合物的凝集被阻碍。因此，通过观察有无该凝集阻碍，即可检测是否存在检测对象。另外，通过测定凝集阻碍的程度，即可定量检测对象。
另外，凝集阻碍依赖于第2物质的具有电荷部分或亲水性部分，而对检测对象种类的依赖程度大幅降低。因此，可以进行所有检测对象的检测或定量，可以提高确实性和通用性。
实施例
在本实施例中，使用具有保护巯基的温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒(以后也称作TM-LPDP)作为第1结合物，使用结合有N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇(以后也称作NHS-PEG)“SUN BRIGHTME-400CS”(日油(株)制、重均分子量为40000)作为第2结合物，给出检测、定量谷胱甘肽(简写GSH)的例子。
本发明的实施例中使用的代表性的试剂如下。
PBS缓冲液：用纯净水将10倍浓度的市售PBS(8.1mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、2.7mM KCl、137mM NaCl、pH7.4、ニツポンジ一ン(株)制)稀释至1/10(V/V)后使用。
硼酸缓冲液ポリサイエンス社制硼酸盐缓冲液、100mM硼酸、pH8.5。
纯净水：经MILLIPORE社制“Direct-Q”(商品名)纯化的水。
(第1结合物的制备)
作为氨基结合-温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒，使用0.4％(质量)Magnabeat(社)制的Therma-Max LAm胺(以后称作TM-LAm)。取2mL TM-LAm到2mL微管中，将该微管加热至42℃，从而使TM-LAm凝集，用磁石回收后除去上清。向除去后的微管中加入2mL硼酸缓冲液以置换溶剂，使TM-LAm充分分散，由此得到含磁性微粒的硼酸缓冲液。
接着，将2mg N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯((株)同仁化学研究所制、SPDP)溶于100μL二甲基亚砜中，将所得溶液与上述含磁性微粒的硼酸缓冲液混合，在20℃下搅拌一夜。将搅拌的溶液加热至42℃，用磁石回收凝集体，之后除去上清。之后，向凝集体中加入2mL PBS缓冲液，使其充分分散。上述清洗进行2次，除去未反应的SPDP。将分散液再次加热至42℃，用磁石回收凝集体，并除去上清，之后将含保护巯基的温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒分散于PBS缓冲液中，由此制成第1结合物(颗粒含量为0.3％(质量))。
(使用含保护巯基的温度响应性聚合物表面修饰磁性颗粒和N-羟基琥珀酰亚胺结合聚乙二醇的谷胱甘肽的定量)
[试样的制备]
制备以下试样：将还原型谷胱甘肽(和光纯药工业(株)制)溶于ProMedDx LLC.(10Commerce Way North，MA 02766)制的人正常血清中的显著的乳糜检验体(Scan#：1228761)中，使达到12μg/mL和6μg/mL的浓度；以及不含谷胱甘肽的试样。
[定量]
(混合)
取500μL上述第1结合物的PBS缓冲液分散液到1.5mL管中，添加10μL 0.5M的EDTA溶液(pH8、ニツポンジ一ン社制)并混合，由此制成溶液。向该溶液中加入200μL上述试样，在4℃下搅拌12小时。之后，向管中加入700μL(200μM)NHS-PEG或PEG，在4℃下搅拌24小时。向400μL该搅拌物中加入800μL PBS缓冲液，得到混合物。
(关系式的制作1)
在以往通用的分光光度计用SEMIMICROCELL的光路外安装尺寸为5mm×9mm×2mm的钕(ネオジム)永久磁石73(ネオマグ(株)制)。将该比色皿设置在设有比色皿温度控制仪的紫外可见分光光度计V-660DS(日本分光(株)制)内，在37℃下保持10分钟以上。
将上述混合物分别注入比色皿内，按照附带的使用说明书对分光光度计进行零校正，使用波长420nm的光，直接以谱带(band)宽2.0nm连续测定1000秒。其结果见图6。
如图6所示，所有试样的吸光度在短时间内均超过检测限，无法进行测定。由此确认：当为象乳糜检验体那样原始浊度高的试样时，难以利用浊度来定量检测对象。
(关系式的制作2)
图7是本实施例中使用的计测系统160的模式图。需要说明的是，其中省略了施加在试样上的交流磁场施加装置。在图7中，151为搭载有试样的滑动基板，152为电线，153为驱动马达，154为控制装置，155为低温恒温器(低温保持容器)，156为磁屏蔽箱，157是位于低温保持容器155的上部且配置在滑动基板151附近的SQUID(超高灵敏度)磁传感器，158为驱动电路，159为放大器，161为个人计算机，163为X-Y笔记录仪。
该计测系统160由以下部分构成：(1)进行温度响应性磁性纳米颗粒的磁信号计测的SQUID(超高灵敏度)磁传感器157和驱动电路158；(2)用于将SQUID(超高灵敏度)磁传感器157保持在低温的低温恒温器(低温保持容器)155；(3)包含驱动马达153、电线152和控制装置154的基板移动装置；(4)用于屏蔽地磁等磁噪音的磁屏蔽箱156等。驱动电路158用于降低噪音。
将90μL上述混合物分别注入聚苯乙烯制的有孔平板(高为11mm、直径为8mm的圆筒容器。底的厚度为0.5mm)中，再添加90μLPBS缓冲液并混合。将各有孔平板置于37℃恒温槽内的磁石“ダルママグタツチ”(ベロス(株)制)上，静置3.5分钟(磁分离)。
之后，将各有孔平板放在滑动基板151上，通过设置在磁屏蔽箱156外的移动装置在SQUID(超高灵敏度)磁传感器157的正上方移动，计测磁传感器157通过时的磁信号并记录。其结果见图8(图8中的纵轴为作为磁信号的磁束)。需要说明的是，计测通过交流磁场法来进行，即边通过亥姆霍兹线圈对试样施加交流磁场，边用SQUID磁传感器进行计测。另外，励磁磁场为88μT，励磁频率为100Hz，样品移动速度为10mm/秒，间隙(SQUID磁传感器157与试样的距离)为1mm。
如图8所示，根据作为检测对象的谷胱甘肽的含量，磁信号的计测值差别很大。由此确认：即使使用象血清试样中浊度高的乳糜检验体那样在浊度测定中难以检测检测对象的检验体(图6)，也可以高精度地检测检测对象。由此可知：根据本实施例的方法，对于广泛的全血试样，可以高精度地检测检测对象。
将上述第1结合物、第2结合物和试样保存在4℃的暗室内，1日1次连续3天按照相同程序计测磁信号3次。显示谷胱甘肽含量与磁信号(pT)的平均值的关系式的图见图9。
如图9所示，求得的关系式为：y＝-30.208x+610.42(式中，x为谷胱甘肽的量，y为磁信号)。另外，相关系数R2高达0.94，由此可知：通过使用该关系式，即使使用象乳糜检验体那样在浊度测定中难以检测检测对象的检验体，也可以高精度地定量检测对象。
本发明并不限于上述实施方式，可达到本发明目的的范围内的变形、改良等也包含在本发明中。另外，在本发明中虽然必须使用刺激响应性聚合物，但并不限于聚合物，也可使用刺激响应性低分子。作为所述的低分子，例如有专利第3693979号公报、专利第3916330号公报、日本特开2002-85957号公报、专利第4071738号公报、专利第2869684号公报、专利第2927601号公报、专利第3845249号公报、日本特开2006-242597号公报等中公开的低分子。
Claims (6)
1.检测检验体中的检测对象的方法，该方法包括以下步骤：
将第1结合物和上述检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的条件下，之后施加磁力，所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物和微粒状磁性物质的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物；
测定产生的磁场，根据施加磁力后磁场的增加程度来检测上述检测对象。
2.权利要求1所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：在施加磁力之前向上述混合物中进一步添加第1物质。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，将第1结合物和上述检验体与第2结合物混合，所述第2结合物为具有电荷或亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物，
第1亲和性物质和第2亲和性物质可以在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
4.定量检验体中的检测对象的方法，该方法包括以下步骤：
将第1结合物和上述检验体混合，并将该混合物置于刺激响应性聚合物凝集的预定条件下，之后施加磁力，所述第1结合物为含有刺激响应性聚合物和微粒状磁性物质的第1物质与对上述检测对象亲和的第1亲和性物质结合的结合物，
测定产生的磁场，根据上述检测对象的量与磁场在上述预定条件下的关系式，算出上述检验体中检测对象的量。
5.权利要求4所述的方法，其中进一步包括以下步骤：在施加磁力之前向上述混合物中进一步添加第1物质。
6.权利要求4或5所述的方法，其中，将第1结合物和上述检验体与第2结合物混合，所述第2结合物为具有电荷或亲水性的第2物质与对上述检测对象亲和的第2亲和性物质结合的结合物，
第1亲和性物质和第2亲和性物质可以在上述检测对象的不同部位同时与上述检测对象结合。
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