CN101932606A - 对冯维勒布兰德氏因子特异的人源化抗体 - Google Patents

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CN101932606A CN 200980102891 CN200980102891A CN101932606A CN 101932606 A CN101932606 A CN 101932606A CN 200980102891 CN200980102891 CN 200980102891 CN 200980102891 A CN200980102891 A CN 200980102891A CN 101932606 A CN101932606 A CN 101932606A
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Abstract

本发明是关于具有冯维勒布兰德氏因子特异性的人源化抗体或其结合片段、其制备及用途,包含vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法。

Description

对冯维勒布兰德氏因子特异的人源化抗体

技术领域

[0001] 本公开基本涉及具有冯维勒布兰德氏(von ffillebrand)因子特异性的人源化抗 体或其结合片段。更特别地,本公开基本涉及包含CDR的具有冯维勒布兰德氏因子特异性 的人源化抗体或其结合片段,该CDR对应于存在于鼠类抗体NMC-4中的CDR。

背景技术

[0002] 血小板附着至血管创伤部位的调节涉及若干蛋白质的协调良好的相互作用,且其 在止血及血栓形成两方面均扮演重要角色。一种促成血小板附着的此类蛋白质为冯维勒 布兰德氏因子(vWF),其为存在于血浆中的大型多体(multimeric)糖蛋白。假说认为:vWF 可经由其Al结构域而与血小板受体GPIb-α产生相互作用,从而促进血小板滚动及附着 (Moake等,(1986) J. Clin. Invest. 78 : 1456-61)。在血小板滚动及附着之后,可形成导致出 血停止的血小板/纤维蛋白栓(plug);然而,过度的血小板及/或凝血反应可能导致病理 性血栓状态。

[0003] 由于现今针对抑制血小板活化(例如GPIIbIIla、ADP受体、环加氧酶 (cyclo-oxygenase)或磷酸二酉旨酶拮抗齐Ll (phosphodiesteraseantagonist))或凝血(例如 凝血酶及Xa因子抑制剂)的治疗方式与出血并发症相关联,有需要开发出在不严重削弱止 血反应的情况下而能够实质上抑制血栓形成的物质。

[0004] 发明_既述

[0005] 本发明基本涉及具有人类冯维勒布兰德氏因子(vWF)特异性的人源化抗体或其 结合片段、其制备及使用方法,包含vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法。具有人类vWF特异 性的人源化抗体或其结合片段可包含来自非人类抗体的互补决定区(CDR)(例如小鼠CDR) 及人类框架区。

[0006] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含如SEQ IDNO :19中 所示的重链可变区序列及如SEQ ID NO :28中所示的轻链可变区序列。

[0007] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含如SEQ IDNO :237中 所示的重链序列及如SEQ ID NO :238中所示的轻链序列。

[0008] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:(a)重链及轻链互 补决定区(⑶R),其对应于存在于鼠类抗体NMC-4重链及轻链可变区(分别为SEQ ID N0: 1及2)中的CDR;(b)重链框架区和/或轻链框架区,前者对应于存在于VH 4-59衍生人类 抗体(例如抗体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4))的可变区中的框架区,后者对应于存在于人类 抗体AAK94808 (VL 018) (SEQ ID NO :6)的可变区中的框架区。

[0009] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列重链CDR其中 一种或多种:HCDR1 :GFSLTDYGVD (SEQ ID NO :7) ,HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8), 和 / 或 HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQID NO :9)。

[0010] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含HCDRl : GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7), HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS(SEQ ID NO :8), HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQ ID NO :9)。在一些实施方案中,该人源化抗体或其结合片段还可包含 来自人类抗体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区。

[0011] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列轻链CDR其 中一种或多种:LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID N0:10)、LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID 而:11)、和/ 或 LCDR3 =QQYEKLPffT(SEQ ID NO :12)。

[0012] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列轻链 CDR :LCDR1 :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10)、LCDR2 :YTSSLHS (SEQID N0:11)、及 LCDR 3 : QQYEKLPffT (SEQ ID N0:12)。在某些实施方案中,人源化抗体或其结合片段还可包含:来自 人类抗体AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区的轻链框架区。

[0013] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:重链⑶R, HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7)、HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8)、及 HCDR3 : DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9);及轻链 CDR,LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10)、LCDR2 : YTSSLHS(SEQ ID N0:11)、&LCDR3:QQYEKLPWT(SEQ ID N0:12)。在某些实施方案中,人源 化抗体或其结合片段还可包含来自人类抗体MK94808(SEQ ID NO :6)的可变区的轻链框架 区、和/或来自人类抗体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区。

[0014] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列重链可变区 其中一种或多种:H2 (SEQ ID NO :13)、H4(SEQ ID NO : 14)、H5 (SEQ ID NO : 15)、H6 (SEQ ID NO :16)、H7(SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQID NO : 18)、H9 (SEQ ID NO : 19)、H12 (SEQ ID NO :20)、 H13(SEQ ID NO :21)、H14(SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ ID N0:145)、或H 16 (SEQ ID N0:146)。

[0015] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列轻链可变区其 中一种或多种:L5(SEQ ID NO :23)、L4(SEQ ID NO :24)、L6(SEQ ID NO :25)、L7(SEQ ID NO : 26)、L8(SEQ ID NO :27)、L9 (SEQID NO:28)、LlO(SEQ ID NO :29)或 Lll(SEQ ID NO :30)。

[0016] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含(1)下列重链可变 区其中一种或多种:H2(SEQ ID NO :13)、H4(SEQ ID NO : 14)、H5(SEQ ID NO : 15)、H6(SEQ ID NO :16)、H7(SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQID NO : 18)、H9 (SEQ ID NO : 19)、H12 (SEQ ID NO :20)、 H13(SEQ ID NO :21)、H14(SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ ID NO : 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146); 及(2)下列轻链可变区其中一种或多种:L5(SEQ ID NO :23)、L4 (SEQID NO :24)、L6 (SEQ ID NO :25)、L7(SEQ ID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID NO :28)、LlO (SEQ ID NO :29) 或 Lll (SEQ ID NO :30)。

[0017] 举例而言,人源化抗体或其结合片段可包含:L5(SEQ ID NO :23)和H2(SEQ ID NO : 13) ;L5(SEQ ID NO :23)禾口 H4(SEQ ID NO :14) ;L5 (SEQID NO :23)禾口 H5 (SEQ ID N0:15); L5 (SEQ ID NO :23)和 H6(SEQ ID NO :16) ;L5(SEQ ID NO : 23)禾口 H7 (SEQ ID NO :17) ; L5(SEQ ID NO :23)和 H8(SEQ ID NO :18) ; L4(SEQ ID NO :24)禾口 H2 (SEQ ID NO :13) ; L6(SEQ ID NO :25)禾口 H2(SEQ ID NO :13) ;Lll (SEQ ID NO :30)和 H2 (SEQID NO :13) ; L7(SEQ ID NO: 26)禾口 H2(SEQ ID NO :13) ;L9 (SEQ ID NO :28)和 H9 (SEQ ID NO :19) ; L8(SEQ ID NO :27) 和 H9(SEQ ID NO :19) ;L7(SEQ ID NO :26)和 H9(SEQ ID NO :19) ;L6(SEQ ID NO :25)和 H9 (SEQID NO :19) ;L4(SEQ ID NO :24)和 H9 (SEQ ID NO :19) ;L5(SEQ ID NO :23)禾口 H9 (SEQ ID NO: 19) ;LlO (SEQ ID NO :29)和 H9 (SEQ ID NO :19) ; L9(SEQ ID NO :28)和 H9 (SEQ ID NO :19) ; L9(SEQ ID NO :28)和 H12(SEQID NO :20) ; L9(SEQ ID NO :28) ^P Hl 3 (SEQ ID NO:

1021) ; L9(SEQ ID NO :28)和 H14(SEQ ID NO :22) ;Lll (SEQ ID NO :30)和 H 9 (SEQ ID NO: 19);或 Lll (SEQ ID NO :30)和 H14(SEQ ID NO :22)。

[0018] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含(1)下列重链 CDR 其中一种或多种:HCDR1 :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7), HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8),禾口 / 或 HCDR 3 =DPADYGNYDYALDY (SEQID NO :9);及(2)下列轻链 CDR 其中一禾中 或多种=LCDRl =SASQDI NKYLN (SEQID NO :10),LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID NO :11),禾Π / 或 IXDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID N0:12)。在某些实施方案中,人源化抗体或其结合片段还可包 含来自人类抗体AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区的轻链框架区、和/或来自人类抗体 AAC18165. KSEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区。

[0019] 本发明提供如此处所述的结合至vWF的人源化抗体或结合片段,其对vWF具有 IOnM或更小的亲和力(Kd),优选为5nM或更小,更优选InM或更小,最优选为至少约0. 2nM 至约0. 4nM。本发明还提供如此处所述的可竞争结合至vWF的人源化抗体或结合片段,其具 有IOOnM或更小的亲和力(Ki),优选为50nM或更小,更优选IOnM或更小,最优选为至少约 0. 2nM 至约 5. OnM。

[0020] 本发明还提供结合至vWF的Al结构域的人源化抗体或结合片段,其具有IOnM或 更小的亲和力(Kd),优选为5nM或更小,更优选InM或更小,最优选为至少约0. 2nM至约 0. 4nM。本发明还提供可竞争结合至vWF的Al结构域的人源化抗体或其结合片段,其对vWF 具有IOOnM或更小的亲和力(Ki),优选为50nM或更小,更优选IOnM或更小,最优选为至少 约 0. 2nM 至约 5. OnM。

[0021] 本发明还提供Fab片段热稳定温度大于65°C的人源化抗体或结合片段。

[0022] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含: HCDRl (GFSLTDYGVD ;SEQ ID NO :7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS ;SEQ ID NO :8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY ;SEQ ID NO :9);及轻链 CDRl、轻链 CDR2 及 LCDR3 (QQYEKLPWT ;SEQ ID NO :12),附带条件为LCDl和/或LCD2至少其中一者分别不为SASQDINKYLN(SEQ ID NO: 10)或 YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)。

[0023] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含: HCDRl (GFSLTDYGVD ;SEQ ID NO :7) , HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS ;SEQ IDNO :8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY ;SEQ ID NO :9), LCDRl(SASQDINKYLN ;SEQ ID NO :10), LCDR2 (YTSSLHS ; SEQ ID NO : 11)及 LCDR 3 (QQYEKLPWT ; SEQ ID NO :12);对应于人类抗体种 系家族VH4的框架区1、2和3的重链框架区1、2和3 ;以及对应于人类抗体种系家族VKl的 框架区1、2和3的轻链框架区1、2和3。

[0024] 本发明总体还涉及分离核酸,其编码本发明所公开的具有人类vWF特异性的人源 化抗体。在某些实施方案中,载体可包含本发明所公开的核酸;在另一实施方案中,宿主细 胞可包含所公开的核酸。

[0025] 本发明总体还涉及具有vWF特异性的人源化抗体的制造方法,包含:培养本发明 的宿主细胞,使得核酸被表达并产生抗体。在某些实施方案中,该方法还包含自宿主细胞培 养物回收抗体;在某些实施方案中,抗体从宿主细胞培养基(medium)中回收;在某些实施 方案中,于培养之前,用包含编码重链可变区的核酸的载体及包含编码轻链可变区的核酸 的载体共同转染宿主细胞。[0026] 本发明基本涉及包含具有vWF特异性的人源化抗体及可药用载体的组合物。

[0027] 本发明还提供这样的组合物,其包含如此处所述的第一人源化抗体或其结合片 段、及结合至vWF的Al结构域的第二抗体。在某些实施方案中,第二抗体为AJW200。

[0028] 本发明总体还涉及对受试者(例如病患)的vWF介导的疾病或紊乱(例如血栓病 或紊乱)的治疗方法,其通过给予该受试者有效治疗量的具有vWF特异性的人源化抗体或 其片段进行。在某些实施方案中,受试者为人类;在某些实施方案中,治疗有效量足以抑制 血小板聚集但并不足以引发明显的临床出血迹象。

[0029] 本发明还提供如此处所述的人源化抗体或其结合片段作为药物的用途;本发明还 提供如此处所述的人源化抗体或其结合片段在制备治疗vWF介导的疾病或紊乱的药物中 的用途。在某些实施方案中,治疗有效量足以抑制血小板聚集但并不足以引发明显的临床 出血迹象。

[0030] 在某些实施方案中,vWF介导的疾病或紊乱为血栓性疾病或紊乱;在某些实施方 案中,血栓性异常为心血管疾病或例如局部缺血性中风(ischemic stroke)的脑血管疾病; 在某些实施方案中,心血管疾病为动脉粥状硬化症、再狭窄、心绞痛(angina)、急性心肌梗 塞、急性冠状动脉综合症(acute coronary syndrome)、或与糖尿病相关联的心血管异常; 在某些实施方案中,血栓性疾病或紊乱为血管发炎、静脉血栓形成、镰刀形细胞病、异种移 植排斥、外周血管病、血栓性血小板减少性紫癜症、囊性纤维化、血管性痴呆、雷诺病、类风 湿性关节炎、或糖尿病;在某些实施方案中,脑血管疾病为血管性痴呆、缺血性卒中、或预防 再发性中风。

[0031] 在某些实施方案中,具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段缺乏效应子功 能;在某些实施方案中,人源化抗体包含源自于I gG4的Fc区。

[0032] 在某些实施方案中,具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段结合至冯维勒布 兰德氏因子的Al结构域。

[0033] 在某些实施方案中,具有vWF特异性的抗体结合片段为Fab,Fab,,Fab,-SH, Fv, scFv,F(ab,)2 或双链抗体(diabody)。

[0034] 在某些实施方案中,具有vWF特异性的抗体结合片段不为Fab。

[0035] 在某些实施方案中,具有vWF特异性的人源化抗体为全长抗体。

[0036] 在某些实施方案中,人源化抗体可在HCDRl中包含一个或多个取代,例如F27G, L29I,T30S和/或V34W取代;在某些实施方案中,人源化抗体可在HCDR2中包含一个或多个 取代,例如S61P和/或A62S取代;在某些实施方案中,人源化抗体可在IXDRl中包含一个 或多个取代,例如S24Q,N30S和/或K31N取代;在某些实施方案中,人源化抗体可在IXDR2 中包含一个或多个取代,例如Y50D,T51A,S53N, H55E和/或S56T取代。在某些实施方案 中,人源化抗体可包含:(1)在HCDRl中的一个或多个的取代,例如?276丄2913305和/或 V34W取代;(2)在HCDR2中的一个或多个的取代,例如S61P和/或A62S取代;(3)在LCDRl 中的一个或多个的取代,例如S24Q,N30S和/或K31N取代;及(4)在IXDR2中的一个或多 个的取代,例如Y50D, T51A, S53N, H55E和/或S56T取代。

[0037] 附图简述

[0038] 图1显示NMC-4嵌合抗体在瑞斯特霉素诱导的vWF介导的血小板凝集测定中的抑 制活性,相较于原始NMC-4单株抗体及另一抗vWF抗体AJW200。[0039] 图2A-B显示以单独及组合使用无标记NMC-4嵌合抗体(同源竞争)及AJW200,对 以Eu标记的NMC-4结合的竞争(图2A)。图2A为以无标记的NMC-4单克隆抗体、同种型 对照IgG、AJW200及具有称为H9,L9的可变区的NMC-4抗体的人源化衍生物对以Eu标记 的NMC-4嵌合抗体的竞争;图2B为在20nM AJW200存在或不存在时的NMC-4竞争的希尔图 (Hill plot)。

[0040] 图3A-E显示NMC-4在剪切流情形下阻断血小板附着至内皮vWF的能力,包括附着 至HUVEC细胞的血小板的显微照片。以PBS (图A)或25 μ M组胺(图B-E)、加上10 μ g/ml 抗 vWF 抗体、NMC-4 (图 C)、18 μ g/ml 抗 GPIb- α 抗体、ΑΚ2 (图 D)、或 18 μ g/ml 小鼠 IgG (图 E)处理HUVEC细胞单层。在灌注单层各处之前,还立即将不同抗体包含于对应的血小板悬 浮液中。

[0041 ] 图4A-C显示相较于AJW200 (图4C),在动脉血栓形成的大鼠氯化铁模型中的 NMC-4嵌合体(图4A)及具有名为H14,L10的可变区的人源化抗体(图4B)的活性。将此 三抗体在剂量应答研究中比较。

[0042] 图5显示递增剂量(0. 03-10mg/kg)的GBR 600在狒狒中的周期性血流减少(CFR) 上的效应。

[0043] 图6显示递增剂量(0. 01-10mg/kg)的GBR 600在狒狒中的CFR中的效应。

[0044] 图7显示累积剂量(0. 005-0. 07mg/kg)的GBR 600在狒狒中的CFR中的效应。

[0045] 图8显示累积剂量的GBR 600在狒狒中的CFR中的剂量应答曲线。

[0046] 图9显示递增剂量(l-10mg/kg)的氯吡格雷(clopidogrel)在狒狒中的效应。

[0047] 图10显示递增剂量的GBR 600及氯吡格雷输注在切口出血测试上的效应比较。已 将剂量表成有效剂量的倍数(例如CFR降至零时的累积剂量)。

[0048] 图11显示由示差扫描量热法所测量的人源化NMC-4变体的热稳定性。

[0049] 发明详述

[0050] 本发明提供具有人类冯维勒布兰德氏因子(vWF)特异性的人源化抗体或其结合 片段,包括具有对应于存在于鼠类抗体NMC-4中的一个或多个CDR或部分CDR的CDR区; NMC-4抗体结合vWF的Al结构域上的GPlb- α结合部位(见例如Fujimura等,Blood,77 : 113-20,1991 ;Shima 等,J NaraMed Assoc. ,36 :662,1985)。本发明的人源化抗体还可包含 修饰或未修饰人类框架区,例如对应于人类抗体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)的可变区中的 框架区的重链框架区,及对应于人类抗体AAK94808(SEQ ID NO :6)的可变区中的框架区的 轻链框架区。有极多种人类框架区被视为NMC-4⑶R的潜在受体分子,包含对鼠类NMC-4重 链及轻链区所属的亚科(subfamily)展现高度同源性的那些。最令人意外地,在无额外改 变的情况下,将NMC-4CDR移植至所选择的重链可变区人类架构其中一者及轻链可变区人 类架构其中一者上,就足以维持人源化抗体在阻断vWF介导的血小板应答上的能力。

[0051] “嵌合抗体”一词包含可变区序列源自于一个物种而恒定区序列源自于另一物种 的抗体,例如可变区序列源自于小鼠抗体而恒定区序列源自于人类抗体的抗体。

[0052] “人源化抗体”一词包含其中已经将源自于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系 的CDR序列移植至人类构架序列上的抗体。在人类构架序列及源自于另一哺乳动物物种的 种系的CDR序列内可对框架区进行额外修饰。

[0053] “人类抗体” 一词包含具有其中框架区及CDR区两者均源自于人类种系免疫球蛋

13白序列的可变区的抗体;此外,若抗体包含恒定区,则恒定区也源自于人类种系免疫球蛋白 序列。本发明的人类抗体可包含非由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如 由体外随机或定点诱变、或由体内体细胞突变所引入的突变);然而,如此处所使用的术语 “人类抗体”并不包含已将源自于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列移植至 人类构架序列上的抗体。

[0054] 如此处所使用,若抗体的可变区得自于利用人类种系免疫球蛋白基因的系统,则 人类抗体包含“源自于”特定种系序列的重链或轻链可变区。此种系统包含利用目的抗原使 带有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫,或者利用目的抗原来筛选展示于噬菌体上的 人类免疫球蛋白基因库。通过比较人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸 序列,并选择在序列上最接近(最大同一性% )人类抗体序列的人类种系免疫球蛋白序列, 可如此鉴定出“源自于”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体。例如,由于自然发生的体细 胞突变或有意的引入定点突变,“源自于”特定人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体可能含 有相较于种系序列的氨基酸差异;然而,所选择的人类抗体或其片段一般而言至少有80% 与由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸序列相同,且包含在与其它物种的种系免疫 球蛋白氨基酸序列(例如鼠类种系序列)相较时将人类抗体识别为人类的氨基酸残基。在 某些情况下,人类抗体的氨基酸序列可以有至少90 %、或甚至至少95 %,96 %,97 %,98 %, 或99 %的与由种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列的同一性,例如包含80 %,81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%,98%,99%,R IOOV0o

[0055] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段(例如Fab,Fab', Fab,-SH,Fv,scFv,F(ab,)2,双链抗体或单链抗体),包含如SEQ IDNO :19中所示的重链可 变区序列及如SEQ ID NO :28中所示的轻链可变区序列;本发明还提供具有vWF特异性的人 源化抗体或其结合片段,包含如SEQ ID NO :237中所示的重链序列及如SEQ ID NO :238中 所示的轻链序列。

[0056] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含(1)下列重链⑶R 其中一种或多种:HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 :MIWGDGSTDYNSALKS(SEQ ID NO :8),禾口 / 或 HCDR 3 :DPADYGNYDYALDY (SEQID NO :9);及(2)下列轻链 CDR 其中一种或多 种=LCDRl :SASQDINKYLN(SEQID NO :10),LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID NO :11),禾Π / 或 LCDR3 : QQYEKLPffT(SEQ ID NO :12)。

[0057] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含(1)下列重链⑶R 其中一种或多种:HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 :MIWGDGSTDYNSALKS(SEQ ID NO :8),和 / 或 HCDR3 =DPADYGNYDYALDY(SEQID NO :9);或(2)下列轻链 CDR 其中一种或多 种=LCDRl :SASQDINKYLN(SEQID NO :10),LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID NO :11),禾Π / 或 LCDR3 : QQYEKLPffT(SEQ ID NO :12)。

[0058] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含(1)重链⑶R, HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS(SEQ ID NO :8),及 HCDR3 : DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9);及(2)轻链 CDR,LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10), LCDR2 :YTSSLHS (SEQ IDNO :11),及 LCDR3 =QQYEKLPffT (SEQ ID NO :12)。

[0059] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含(1)重链⑶R,HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS(SEQ ID NO :8),及 HCDR3 : DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9);或(2)轻链 CDR,LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10), LCDR2 :YTSSLHS (SEQ IDNO :11),及 LCDR3 =QQYEKLPffT (SEQ ID NO :12)。

[0060] 在某些实施方案中,人源化抗体或其结合片段可包含重链可变区框架区,其中该 框架区包含存在于来自人类VH4家族的抗体中的一个或多个(例如1,2,3和/或4)重链 构架序列(例如构架1 (Fffl)、构架2 (FW2)、构架3 (FW3)、和/或构架4 (FW4))。

[0061] 在某些实施方案中,人源化抗体或其结合片段可包含轻链可变区框架区,其中该 框架区包含存在于来自人类VKl家族的抗体中的一个或多个(例如1,2,3和/或4)轻链 框架区序列(例如构架1 (Fffl)、构架2 (FW2)、构架3 (FW3)、和/或构架4 (FW4))。

[0062] 在某些实施方案中,人源化抗体或其结合片段可包含一个或多个(例如一、二、 三、和/或四)存在于来自人类VH4家族的抗体中的重链框架区序列(例如构架1(FW1)、构 架2 (FW2)、构架3 (FW3)、和/或构架4(FW4))、以及一个或多个(例如一、二、三、和/或四) 存在于来自人类VK 1家族的抗体中的轻链框架区序列(例如构架I(FWl)、构架2 (FW2)、构 架 3 (FW3)、和 / 或构架 4 (FW4))。

[0063] VH4家族的成员及其各自重链框架区1、2和3包含:4_04(分别为SEQID NO -.Ul, 148 及 149),4-28 (分别为 SEQ ID NO : 150,151 及 152),4-30. 1 (分别为 SEQ ID NO: 153,154 及 155),4-30. 2 (分别为 SEQ ID NO : 156,157 及 158),4-30. 4 (分别为 SEQ ID NO: 159,160 及 161),4-31 (分别为 SEQ ID NO : 162,163 及 164),4-34 (分别为 SEQ ID NO: 165,166 及 167),4-39 (分别为 SEQ ID NO : 168,169 及 170),4-59 (分别为 SEQ IDNO : 171,172 及 173), 4-61 (分别为 SEQ ID NO: 174,175 及 176)及 4-b(分别为 SEQ ID NO : 177,178 及 179)。

[0064] VKl家族的成员及其各自轻链框架区1、2和3包含:012(分别为SEQID NO: 180, 181 及 182),02 (分别为 SEQ ID NO : 183,184 及 185),018 (分别为 SEQ ID N0:186,187 及 188),08 (分别为 SEQ ID NO : 189,190 及 191),A20 (分别为 SEQ ID NO : 192,193 及 194), A30(分别为 SEQ IDNO : 195,196 及 197),L14(分别为 SEQ ID NO : 198,199 及 200),Ll (分 别为 SEQ ID NO : 201,202 及 203),L15(分别为 SEQ ID NO : 204,205 及 206),L4 (分别为 SEQ ID NO :207,208 及 209),L18(分别为 SEQ IDNO :210,211 及 212),L5 (分别为 SEQ ID NO :213,214 及 215),L19(分别为 SEQ ID NO :216,217 及 218),L8 (分别为 SEQ ID NO :219, 220 R 221), L23 (分别为 SEQ ID NO :222,223 及 224),L9 (分别为 SEQ ID NO :225,226 及 227),L24(分别为 SEQ ID NO :228,229 及 230),Lll (分别为 SEQ ID NO :231,232 及 233) 及 L12 (分别为 SEQ ID NO :234,235 及 236)。

[0065] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列重链CDR其中 一种或多种:HCDR1 :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8), 和 / 或 HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQID NO :9)。

[0066] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列重链CDR其中 一种或多种:HCDR1 :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8), 和 / 或HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQID NO :9)以及来自人类抗体 AAC18165. 1 (SEQ ID NO: 4)的重链框架区。

[0067] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列重链CDR其中 一种或多种:HCDR1 :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8),和 / 或HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQID NO :9)以及来自人类抗体 AAC18165. 1 (SEQ ID NO: 4)的重链框架区,其中该重链框架区不包含一个或多个鼠类残基。

[0068] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列重链CDR其中 一种或多种:HCDR1 :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8), 和 / 或HCDR 3 :DPADYGNYDYALDY(SEQID NO :9)以及来自人类抗体 AAC18165. 1 (SEQ ID NO: 4)的重链框架区,其中该重链框架区还包含一个或多个的鼠类残基。

[0069] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:HCDR1 : GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7), HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS(SEQ IDNO :8),及 HCDR 3 : DPADYGNYDYALDY(SEQ ID NO :9)。

[0070] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:HCDR1 : GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7), HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS(SEQ IDNO :8),及 HCDR3 : DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9)以及来自人类抗体 AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)的重链框架区。

[0071] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:HCDR1 : GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7), HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS(SEQ IDNO :8),及 HCDR 3 : DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9)以及来自人类抗体 AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)的重链框架 区,其中该重链框架区不包含一个或多个鼠类残基。

[0072] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:HCDR1 : GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7), HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS(SEQ IDNO :8),及 HCDR3 : DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9)以及来自人类抗体 AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)的重链框架 区,其中该重链框架区还包含一个或多个鼠类残基。

[0073] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列轻链CDR其 中一种或多种:LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID N0:10),LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID 而:11),和/ 或 LCDR3 =QQYEKLPffT(SEQ ID NO :12)。

[0074] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列轻链CDR其 中一种或多种:LCDR1 :SASQDINKYLN(SEQ ID N0:10),LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID 而:11),和/ 或 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO : 12)、以及来自人类抗体 AAK94808 (SEQ ID NO :6)的轻链 框架区。

[0075] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列轻链CDR其 中一种或多种:LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID N0:10),LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID 而:11),和/ 或 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO :12)以及来自人类抗体 AAK94808 (SEQ ID NO :6)的轻链 框架区,其中该轻链框架区不包含一个或多个鼠类残基。

[0076] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列轻链CDR其 中一种或多种:LCDR1 :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10) ,LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID 而:11),和/ 或 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO: 12)以及来自人类抗体 AAK94808 (SEQ ID NO :6)的轻链 框架区,其中该轻链框架区还包含一个或多个鼠类残基。

[0077] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含轻链CDRLCDR1 : SASQDINKYLN(SEQ ID NO : 10),LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID NO :11),及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO :12)。[0078] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含轻链CDRLCDR1 : SASQDINKYLN(SEQ ID NO : 10),LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID NO :11),及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO :12)以及来自人类抗体AAK94808(SEQID NO :6)的轻链框架区。

[0079] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含轻链CDRLCDR1 : SASQDINKYLN(SEQ ID NO : 10),LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID NO :11),及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO :12)以及来自人类抗体AAK94808(SEQID NO :6)的轻链框架区,其中该轻链框架区不 包含一个或多个鼠类残基。

[0080] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含轻链CDRLCDR1 : SASQDINKYLN(SEQ ID NO : 10),LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID NO :11),及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO :12)以及来自人类抗体AAK94808(SEQID NO :6)的轻链框架区,其中该轻链框架区还

包含一个或多个鼠类残基。

[0081] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:重链⑶R HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQID NO :8),及 HCDR 3 : DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9);轻链 CDR LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10),LCDR2 : YTSSLHS (SEQ ID NO :11),及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO :12);以及任选地包含来自人类 抗体AAK94808(SEQ ID NO :6)的可变区的轻链框架区和/或来自人类抗体AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区。

[0082] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的氨基酸序列变体。通 常具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的氨基酸序列变体将具有重链和/或轻链框 架区的氨基酸序列,其分别有至少80% (具有至少80%氨基酸序列同一性)与具有重链或 轻链(例如具有SEQ ID N0:19或SEQ ID NO :28中的重链及轻链可变区序列)的原始人 源化抗体的重链和/或轻链框架区的氨基酸序列相同。优选为重链和/或轻链框架区序 列的氨基酸序列同一性为至少85%,更优选至少90%,最优选至少95%,尤其96%、更尤 其 97%、再更特别 98%,最特别为 99%,包含例如 80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%, 87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,及 100 %。此 处将关于此序列的同一性及同源性定义为:在比对序列及若有必要引进空位(gap)以得到 最大百分比序列同一性之后,候选序列中与具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段相 同的氨基酸残基的百分比。如此,可通过一般用以比较两多肽的氨基酸的位置相似性的标 准方法来决定序列同一性。利用计算机程序例如BLAST或FASTA,针对其各自氨基酸的最 佳匹配(沿着一或两序列的全长,或者沿着一或两序列的预定部分)而排列两多肽。该程 序提供默认开口罚分(opening penalty)及默认空位罚分(gap penalty),且可结合计算 机程序而使用例如PAM250(标准得分矩阵;见Dayhoff等,Atlas of Protein Sequence andStructure,卷5,supp. 3(1978))的得分矩阵。例如可以下列方式计算同一性百分比:将 相同匹配的总数乘以100后,再除以匹配跨距(span)内的较长序列的长度加上为比对两序 列而引进至较长序列中的空位的数目的总和。

[0083] 因此,本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗 体或其结合片段包含重链可变区序列,该重链可变区序列包含至少80%与SEQ ID NO :19 的框架区相同的框架区、和/或具有至少80%与SEQ ID NO :28的框架区相同的框架区的 轻链可变区序列。本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,其中该人源

17化抗体或其结合片段包含重链可变区序列,该重链可变区序列包含至少80%与SEQ ID NO: 237的框架区相同的框架区、和/或具有至少80%与SEQ ID NO :238的框架区相同的框架 区的轻链可变区序列。

[0084] 人源化抗体可任选地包含一个或多个的取代,例如在HCDRl中的F27G,L29I,T30S 和/或V34W取代;在某些实施方案中,人源化抗体可包含一个或多个的取代,例如在HCDR2 中的S61P,和/或A62S取代;在某些实施方案中,人源化抗体可包含一个或多个的取代,例 如在IXDRl中的S24Q,N30S和/或K31N取代;在某些实施方案中,人源化抗体可包含一个 或多个的取代,例如在LCDR2中的Y50D,T51A,S53N,H55E和/或S56T取代。在某些实施方 案中,人源化抗体可包含:(1) 一个或多个的取代,例如在HCDRl中的F27G,L29I,T30S和/ 或V34W取代;(2) 一个或多个的取代,包含在HCDR2中的S61P和/或A62S取代;(3) —个 或多个的取代,包含在IXDRl中的S24Q,N30S和/或K31N取代;(4) 一个或多个的取代,例 如在 LCDR2 中的 Y50D, T51A, S53N, H55E 和 / 或 S56T 取代。

[0085] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列重链可变区其 中之一 :H2(SEQ ID NO :13)、H4(SEQ ID NO : 14)、H5 (SEQID NO :15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、 H7 (SEQ ID NO :17)、H8(SEQ ID NO :18)、H9 (SEQ ID NO :19)、H12 (SEQ ID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14(SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ ID NO : 145)、或H16 (SEQ ID NO : 146)(编码上述 重链可变区的多核苷酸分别由 SEQ ID NO :128,129,130,131,132,133,134,135,136,137, 138及139加以提供)。

[0086] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列轻链可变区其 中之一 :L5(SEQ ID NO :23)、L4(SEQ ID NO :24)、L6 (SEQID NO :25)、L7 (SEQ ID NO :26)、 L8 (SEQ ID NO :27)、L9(SEQ ID NO :28)、LlO (SEQ ID NO :29)或 Lll (SEQ ID NO :30)(编码 上述轻链可变区的多核苷酸分别由SEQ ID NO :120,121,122,123,124,125,126,及127加 以提供)。

[0087] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:(1)下列重链 可变区其中之一:H2 (SEQ ID NO :13)、H4(SEQ ID NO : 14)、H5 (SEQ ID NO : 15)、H6 (SEQ ID NO :16)、H7(SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQID NO : 18)、H9 (SEQ ID NO :19)、H12 (SEQ ID NO :20)、 H13(SEQ ID NO :21)、H14(SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ ID NO : 145)、或 H16 (SEQ ID NO : 146); (2)下列轻链可变区其中之一 :L5(SEQ ID NO :23)、L4(SEQ ID NO :24)、L6(SEQ ID NO :25)、 L7 (SEQ ID NO :26)、L8(SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID NO :28)、L10(SEQ ID NO :29)或Lll(SEQ ID NO :30)。

[0088] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:L5 (SEQID NO :23) 和 H2(SEQ ID NO: 13) ;L5 (SEQ ID NO :23)禾口 H4(SEQ ID NO: 14) ; L5(SEQ ID NO :23)和 H5 (SEQ ID NO :15) ;L5 (SEQ ID NO :23)和H6 (SEQ ID NO :16) ;L5(SEQ ID NO :23)禾口 H7 (SEQ ID NO :17) ;L5(SEQ ID NO :23)和 H8(SEQ ID NO :18) ;L4(SEQ ID NO :24)禾口 H2(SEQID NO: 13) ;L6 (SEQ ID NO :25)和 H2 (SEQ ID NO: 13) ;Lll (SEQ ID NO :30)和 H2 (SEQ ID NO: 13) ;L7(SEQ ID NO :26)禾口 H2 (SEQ ID NO :13) ;L9(SEQ ID NO : 28)禾口 H 9 (SEQ ID NO :19); L8 (SEQ ID NO :27)和H9(SEQID NO :19) ;L7 (SEQ ID NO :26)和H9 (SEQ ID NO :19) ;L6 (SEQ ID NO :25)和 H9(SEQ ID NO: 19) ;L4(SEQ ID NO :24)和 H9 (SEQ ID NO: 19) ; L5(SEQ ID NO :23)和 H9(SEQ ID NO :19) ;LlO (SEQ ID NO :29)和 H9 (SEQID NO :19) ;L9 (SEQ ID NO:28)和 H9(SEQ ID NO: 19) ; L9(SEQ ID NO :28)和 H12(SEQ ID NO :20) ; L9(SEQ ID NO :28) 和H13(SEQ ID NO :21) ;L9(SEQ ID NO :28)和H14(SEQ ID NO :22) ;L11(SEQ ID NO :30)和 H9 (SEQ ID NO: 19);或 Lll (SEQ ID NO :30)和 H14(SEQ ID NO :22)。

[0089] 本发明提供如此处所述的结合至vWF的人源化抗体或结合片段,其对vWF具有 IOnM或更小的亲和力(Kd),优选为5nM或更小,更优选InM或更小,最优选为至少约0. 2nM 至约0. 4nM(例如自约0. 21,0. 28或0. 34至约0. 25,0. 32或0. 38nM)。本发明还提供如此 处所述的竞争结合至vWF的人源化抗体或结合片段,其对vWF具有IOOnM或更小的亲和力 (Ki),优选为50nM或更小,更优选IOnM或更小,最优选为至少约0. 2nM至约5. OnM (例如自 约 0. 22,0. 28 或 0. 34 至约 2. 3,3. 5 或 4. 7nM)。

[0090] 本发明还提供此处所述结合至vWF的Al结构域的人源化抗体或结合片段,其 对vWF的Al结构域具有IOnM或更小的亲和力(Kd),优选为5nM或更小,更优选InM或更 小,最优选为至少约0. 2nM至约0. 4nM(例如自约0. 21,0. 28或0. 34至约0. 25,0. 32或 0. 38nM)。本发明还提供竞争结合至vWF的Al结构域的人源化抗体或其结合片段,其对vWF 具有IOOnM或更小的亲和力(Ki),优选为50nM或更小,更优选IOnM或更小,最优选为至少 约 0. 2nM 至约 5. OnM (例如自约 0. 22,0. 28 或 0. 34 至约 2. 3,3. 5 或 4. 7nM)。

[0091] 本发明还提供Fab片段的热稳定性温度大于65°C的人源化抗体或结合片段,优选 为大于70°C,更优选大于75°C,最优选大于80°C。分析Fab片段热稳定性使用示差扫描量 热法,而识别出在全长IgG的情境中的Fab片段的中点熔解温度。此类量热法为技术人员所 已知,且可根据例如Garber和Demarest (2007),BBRC 355 :751_7加以实施。令人意外地, 已发现本发明的人源化抗体具有大于亲本非人源化抗体的Fab片段热稳定性温度,该亲本 非人源化抗体通常为鼠类抗体,尤其是鼠类抗体NMC-4。本发明还提供Fab片段热稳定性温 度大于亲本非人源化抗体的具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段。

[0092] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含下列高变区氨基 酸序列=HCDRl (GFSLTDYGVD ;SEQ ID NO :7),HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS ;SEQ ID NO :8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY ;SEQ ID NO :9);及 LCDR3 (QQYEKLPWT ;SEQ ID N0:12),附带条件 为 LCDl 和 / 或 LCD2 至少其中之一分别不为 SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10)或 YTSSLHS (SEQ IDNO : 11)。令人意外地,缺乏NMC-4IXDR1和/或IXDR2的人源化匪C-4抗体保有对于vWF 的纳摩尔结合亲和力。

[0093] 在某些实施方案中,人源化抗体还可包含人类抗体重链框架区。在某些实施方案 中,重链框架区对应于存在于4-59衍生人类抗体中的重链框架区。在某些实施方案中,存 在于4-59衍生人类抗体中的重链框架区还包含一个或多个鼠类残基;在某些实施方案中, 存在于4-59衍生人类抗体中的重链框架区不包含一个或多个鼠类残基。

[0094] 在某些实施方案中,人源化抗体还可包含人类抗体轻链框架区;在某些实施方案 中,轻链框架区对应于存在于018衍生人类抗体中的轻链框架区;在某些实施方案中,存在 于018衍生人类抗体中的轻链框架区还包含一个或多个鼠类残基;在某些实施方案中,存 在于018衍生人类抗体中的轻链框架区不包含一个或多个鼠类残基。

[0095] IXDRl和/或IXDR2可由人类来源获得。在某些实施方案中,IXDRl和/或IXDR2 可由相同抗体(例如一个人类抗体)而获得;在其它实施方案中,LCDRl和/或LCDR2可由 不同抗体(例如两个人类抗体)而获得。若LCDR2得自人类来源,其优选为DASNLET(SEQID NO :118)。

[0096] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含: HCDRl (GFSLTDYGVD ;SEQ ID NO :7) , HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS ;SEQ IDNO :8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY ;SEQ ID NO :9), LCDRl(SASQDINKYLN ;SEQ ID NO :10), LCDR2(YTSSLHS ;SEQ ID NO :11)及 LCDR3(QQYEKLPWT ; SEQ ID NO :12);对应于人类 抗体重链种系序列4-59中的框架区的重链框架区1、2和3,其中重链框架区1为 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ IDNO : 171),重链框架区 2 为 WI RQPPGKGLEffIG (SEQ ID NO : 172),且重链框架区 3 为 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :173);以及 对应于存在于人类抗体轻链种系序列018中的框架区的轻链框架区1、2和3,其中轻链框架 区 1 为DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITC(SEQ ID NO :186),轻链框架区 2 为 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO :187),且轻链框架区 3 为 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(SEQ ID NO: 188)。

[0097] 本发明提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,包含: HCDRl (GFSLTDYGVD ;SEQ ID NO :7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS ;SEQ ID NO :8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY ;SEQ ID NO :9), LCDRl(SASQDINKYLN ;SEQ ID NO :10), LCDR2 (YTSSLHS ; SEQ ID NO :11)及 LCDR3 (QQYEKLPWT ; SEQ ID NO : 12);对应于人类 抗体重链种系序列4-34中的框架区的重链框架区1、2和3,其中重链框架区1为 QVQLQQffGAGLLKPSETLSLTCAVY (SEQ ID NO : 165),重链框架区 2 为 WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO : 166),且重链框架区 3 为 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :167);以及 对应于存在于人类抗体轻链种系序列018中的框架区的轻链框架区1、2和3,其中轻链框架 区 1 为DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITC(SEQ ID NO : 186),轻链框架区 2 为 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO :187),且轻链框架区 3 为 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(SEQ ID NO: 188)。

[0098] 本发明还提供对vWF的Al结构域具有特异性的人源化抗体或其结合片段, 包含:HCDRl (GFSLTDYGVD ; SEQ ID NO :7) , HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS ; SEQ ID NO: 8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY ; SEQ ID NO :9), LCDRl(SASQDINKYLN;SEQ ID NO: 10), LCDR2 (YTSSLHS ; SEQ ID NO :11)及 LCDR3 (QQYEKLPWT ; SEQ ID NO :12);对应于存在于来自 人类抗体种系家族VH4的抗体中的框架区1、2和3的重链框架区1、2和3 ;以及对应于存 在于来自人类抗体种系家族VKl的抗体中的框架区1、2和3的轻链框架区1、2和3。

[0099] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-04中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 禾口 3(例如 Fffl :QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS (SEQ ID NO :147), FW2 =WVRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :148)及 FW3 :RVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :149))。

[0100] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-28中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 Fffl :QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVS (SEQ ID NO :150), FW2 =WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO: 151)及 FW3 :RVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCAR(SEQ ID NO :152))。

[0101] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-30. 1中的框 架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 FWl :QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS (SEQ ID NO: 153), FW2 =WIRQHPGKGLEffIG(SEQ ID NO :154)及 FW3 :RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ IDNO :155))。

20[0102] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-30. 2中的框 架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 FWl :QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVS (SEQ ID NO: 156), FW2 =WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :157)及 FW3 :RVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :158))。

[0103] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-30. 4中的框 架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 FWl :QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS (SEQ ID NO: 159), FW2 =WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :160)及 FW3 :RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :161)。

[0104] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-31中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 禾口 3(例如 Fffl :QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS (SEQ ID NO :162), FW2 =WIRQHPGKGLEffIG(SEQ ID NO: 163)及 FW3 : RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :164))。

[0105] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-34中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3 (例如 Fffl =QVQLQQffGAGLLKPSETLSLTCAVY (SEQ ID NO :165), FW2 =WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID N0:166)及 FW3 :RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :167))。

[0106] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-39中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 禾口 3(例如 Fffl :QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO :168), FW2 =WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO: 169)及 FW3 : RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :170))。

[0107] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-59中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 Fffl :QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO :171), FW2 =WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO: 172)及 FW3 : RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :173))。

[0108] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-61中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 禾口 3(例如 Fffl :QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO :174), FW2 :ffl RQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :175)及FW3 :RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :176))。

[0109] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于重链可变种系序列4-b中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 禾口 3(例如 Fffl :QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVS(SEQ ID NO :177), FW2 =WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :178)及 FW3 :RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :179))。

[0110] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列012中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 FWl :DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO : 180) ,Fff 2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO: 181)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :182))。

[0111] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于K链可变种系序列02中的框架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 禾口 3(例如 Fffl :DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :183),FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO : 184)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ IDNO :185))。

[0112] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列018中的框架 区 1、2和 3 的框架区 1、2和 3(例如FWl :DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :186) ,FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO : 187)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(SEQ ID NO :188))。

[0113] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列08中的框架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 禾口 3(例如 Fffl :DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :189),FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO : 190)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(SEQ ID NO :191))。

[0114] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列A20中的框架 区 1、2和 3 的框架区 1、2和 3(例如FWl :DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :192) ,FW2 : WYQQKPGKVPKLLIY(SEQID NO : 193)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO :194))。

[0115] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列A 30中的框 架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 禾口 3(例如 Fffl :DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :195), FW2 :WYQQKPGKAPKRLIY(SEQID NO :196)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :197))。

[0116] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L14中的框架 区 1、2和 3 的框架区 1、2和 3(例如FWl :NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :198) ,FW2 : WFQQKPGKVPKHLIY(SEQID NO : 199)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :200))。

[0117] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列Ll中的框架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 Fffl :DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :201),FW2 : WFQQKPGKAPKSLIY (SEQID NO : 202)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO :203))。

[0118] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L15中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 FWl :DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO : 204) ,Fff 2 : WYQQKPEKAPKSLIY(SEQID NO :205)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :206))。

[0119] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L4中的框架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 Fffl :AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :207),FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO : 208)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :209))。

[0120] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L18中的框架 区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 FWl :AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO :210) ,FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO :211)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :212))。

[0121] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L5中的框架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 Fffl :DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :213),FW2 :WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO : 214)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :215))。

[0122] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L19中的框架 区 1、2和 3 的框架区 1、2和 3(例如FWl :DIQMTQSPSSVSASV⑶RVTITC(SEQ ID NO :216) ,FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO :217)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :218))。

[0123] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L8中的框架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 FWl :DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :219),FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO : 220)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :221))。

[0124] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L23中的框架 区 1、2和 3 的框架区 1、2和 3(例如FWl :AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :222) ,FW2 : WYQQKPAKAPKLFIY(SEQID NO :223)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :224))。

[0125] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L9中的框架区 1、2 和 3 的框架区 1、2 和 3(例如 Fffl :AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITC(SEQ ID NO :225),FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO :226)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYC(SEQ ID NO :227))。

[0126] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L24中的框架 区 1、2和 3 的框架区 1、2和 3(例如FWl :VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISC(SEQ ID NO :228) ,FW2 : WYQQKPGKAPELLIY (SEQID NO :229)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYC(SEQ ID NO :230))。

[0127] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列Lll中的框架 区 1、2和 3 的框架区 1、2和 3(例如FWl :AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :231) ,FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO :232)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :233))。

[0128] 人源化抗体或其结合片段可包含对应于存在于κ链可变种系序列L12中的框架 区 1、2和 3 的框架区 1、2和 3(例如FWl :DIQMTQSPSTLSASV⑶RVTITC(SEQ ID NO :234) ,FW2 : WYQQKPGKAPKLLIY(SEQID NO :235)及 FW3 :GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(SEQ ID NO :236))。

[0129] 本发明还提供对vWF的Al结构域具有特异性的人源化抗体或其结合片段,包含: HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 :MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8),及 HCDR3 : DPADYGNYDYALDY(SEQ ID NO :9),LCDRI :SASQDINKYLN(SEQ ID N0:10),LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID N0:11),&LCDR3:QQYEKLPWT(SEQ ID NO :12);对应于存在下列人类抗体中的框架区 1、2和3的重链框架区1、2和3 :4-04(分别为SEQ ID NO :147,148及149),4_28 (分别为 SEQ ID N0:150,151 及 152),4-30. 1(分别为 SEQ ID NO : 153,154 及 155),4-30. 2 (分别为 SEQ ID NO :156,157 及 158),4-30. 4(分别为 SEQ ID NO :159,160 及 161),4-31 (分别为 SEQ IDNO : 162,163 及 164),4-34 (分别为 SEQ ID NO : 165,166 及 167),4-39 (分别为 SEQ ID NO : 168,169 及 170),4-59 (分别为 SEQ ID NO : 171,172 及 173),4-61 (分别为 SEQ IDNO : 174,175及176)或4_b(分别为SEQ IDNO : 177,178及179);及对应于存在下列人类抗 体中的框架区1、2和3的轻链框架区1、2和3 :012(分别为SEQ ID NO : 180,181及182), 02 (分别为 SEQ ID NO : 183,184 及 185),018 (分别为 SEQ ID NO : 186,187 及 188),08 (分别 为 SEQ ID NO :189,190 R 191), A20(分别为 SEQ IDNO :192,193 及 194),A30(分别为 SEQ ID NO : 195,196 及 197),L14(分别为 SEQ ID NO : 198,199 及 200),Ll (分别为 SEQ ID NO: 201,202 及 203),L15(分别为 SEQ ID NO :204,205 及 206),L4 (分别为 SEQ ID NO :207, 208 及 209),L18(分别为 SEQ ID NO :210,211 及 212),L5(分别为 SEQ ID NO :213,214 及 215),L19 (分别为 SEQ ID NO :216,217 及 218),L8 (分别为 SEQ ID NO :219,220 R 221), L23(分别为 SEQ ID NO :222,223 及 224),L9 (分别为 SEQ ID NO :225,226 及 227),L24 (分 别为 SEQ ID NO :228,229 及 230),Lll (分别为 SEQ ID NO :231,232 及 233)及 L12 (分别 为 SEQ ID NO :234,235 及 236)。

[0130] 本发明还提供如此处所述的人源化抗体或其结合片段,其保留与亲本非人源化抗 体或包含来自亲本非人源化抗体及人类Fc区的嵌合抗体相同的活性。亲本非人源化抗体 通常为鼠类抗体,尤其为鼠类抗体NMC-4 ;包含来自亲本非人源化抗体的嵌合抗体通常为 包含来自鼠类抗体(尤其来自鼠类抗体NMC-4)的可变区及人类Fc区的抗体。优选以本发 明所述的人类Fc区作为人类Fc区。

[0131] 亲本非人源化抗体及嵌合抗体的如此处所述的人源化抗体或其结合片段的活性, 可通过例如实施例1中所述判定EC5tl活性而以瑞斯特霉素诱导血小板凝集活性加以测量。 当如此处所述的人源化抗体或其结合片段的EC5tl活性与EC5tl活性相同,或有高达50%、优 选为高达30%、优选为高达20%不同于(例如更高或更低)亲本非人源化抗体或嵌合抗体 的EC5tl活性时,如此处所述的人源化抗体或其结合片段可被视为保留着与亲本非人源化抗 体或嵌合抗体相同的活性。

[0132] 在本发明的优选实施方案中,如此处所述的人源化抗体或其结合片段还包含来自 人类抗体的重链框架区,其中人类重链框架区不包含一个或多个鼠类残基。

[0133] 在本发明的其他优选实施方案中,如此处所述的人源化抗体或其结合片段还包含 来自人类抗体的轻链框架区,其中人类轻链框架区不包含一个或多个鼠类残基。

[0134] “不包含一个或多个鼠类残基的人类重链框架区”或“不包含一个或多个鼠类残基 的人类轻链框架区”指不包含一个或多个仅存在于鼠类中的鼠类残基的人类重链或轻链框 架区,例如不包含回复突变(backmutation)至仅存在于鼠类且不存在于人类中的残基。由 此定义,并不排除包含也存在于鼠类中的人类残基的人类重链或轻链框架区;并且,由此定 义,不排除残基已突变至一般人类(例如大多数人类框架区共同的残基)、但还存在于鼠类 中的人类重链或轻链框架区。

[0135] 在本发明来自人类抗体的重链或轻链框架区还包含一个或多个鼠类残基的实施 方案情况中,其通常包含10个或更少的鼠类残基,优选为9个或更少,更优选为8个或更 少,又更优选7个或更少,最优选为6个或更少,特别5个或更少,更特别4个或更少,又更 特别3个或更少,最特别2个或更少,最特别优选1个。

[0136] 本发明提供编码具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的分离核酸,其包含 如SEQ ID NO :19中所述的重链可变区序列及如SEQ ID NO :28中所述的轻链可变区序列。

[0137] 本发明提供编码具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的分离核酸,其包含如SEQ ID NO :237中所述的重链序列及如SEQ ID NO :238中所述的轻链序列。

[0138] 本发明还提供编码具有对人vWF的特异性的人源化抗体或其结合片段的分离 核酸,其包含:对应于存在于鼠类抗体NMC-4中的CDR的CDR区;对应于存在于人类抗体 AAC18165. KSEQ ID NO :4)的可变区中的框架区的重链框架区;及对应于存在于人类抗体 AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区中的框架区的轻链框架区。

[0139] 本发明还提供编码具有对人vWF的特异性的人源化抗体或其片段的分离核酸,其 包含=HCDRl :GFSLTDYGVD (SEQ ID NO :7)、HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8)、HCDR3 : DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9)、以及来自人类抗体AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)的可变区的 重链框架区。例示性人类重链框架区的核苷酸序列公开于SEQ ID N0:116中。

[0140] 本发明还提供编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的分离核酸,其 包含下列轻链CDR :LCDR1 :SASQDINKYLN(SEQ ID N0:10)、LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID N0:11)、 及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO : 12)、及来自人类抗体 AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区 的轻链框架区。例示性人类轻链框架区的核苷酸序列公开于SEQ ID N0:117中。

[0141] 本发明还提供编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的分离核酸,其 包含下列重链可变区其中之一 :H2 (SEQ ID NO :13)、H4(SEQID NO :14)、H5(SEQ ID NO :15)、 H6 (SEQ ID NO :16)、H7(SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQ ID NO :18)、H9 (SEQ ID NO : 19)、H12 (SEQ ID NO :20)、H13(SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ ID NO : 145)、或 H16 (SEQ ID NO :146)。

[0142] 本发明还提供编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的分离核酸,其 包含下列轻链可变区其中之一 :L5(SEQ ID NO :23)、L4(SEQID NO :24)、L6(SEQ ID NO :25)、 L7 (SEQ ID NO :26)、L8(SEQ ID NO :27)、L9(SEQ ID NO :28)、L10(SEQ ID NO :29)或Lll(SEQ ID NO :30)。

[0143] 本发明还提供编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的分离核酸, 其包含(1)下列重链可变区其中之一:H2 (SEQ ID NO :13)、H4(SEQID NO : 14)、H5 (SEQ ID NO :15)、H6(SEQ ID NO : 16)、H7 (SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQ ID NO : 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、 H12(SEQ ID NO :20)、H13(SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ ID N0:145)、或 H16(SEQ ID NO :146);及(2)下列轻链可变区其中之一:L5 (SEQ ID NO :23)、L4 (SEQ ID NO :24)、L6 (SEQ ID NO :25)、L7 (SEQ ID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID NO :28)、 LlO (SEQ ID NO :29)或 Lll(SEQ ID NO :30)。

[0144] 本发明还提供包含载体GS264的编码轻链的核酸序列的分离核酸,载体GS264已 在2008年1月23日在DSMZ保藏于微生物中,其登记号为DSM21059。

[0145] 本发明还提供包含载体GS 265的编码重链的核酸序列的分离核酸,载体GS265已 在2008年1月23日在DSMZ保藏于微生物中,其登记号为DSM21060。

[0146] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,其由载体GS264的编 码轻链的核酸序列、及载体GS265的编码重链的核酸序列所编码。

[0147] 本发明提供包含分离核酸的载体,该分离核酸编码具有vWF特异性的人源化抗体 或其结合片段,该人源化抗体或其结合片段包含如SEQ ID N0:19中所述的重链可变区序列 及如SEQ ID NO :28中所述的轻链可变区序列。

[0148] 本发明提供包含分离核酸的载体,该分离核酸编码具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,该人源化抗体或其结合片段包含如SEQ ID NO :237中所述的重链序列及如 SEQ ID NO :238中所述的轻链序列。

[0149] 本发明提供包含核酸的载体,该核酸编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其结 合片段,该人源化抗体或其结合片段包含:对应于存在于鼠类抗体NMC-4中的CDR的CDR 区;对应于人类抗体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)的可变区中的框架区的重链框架区;及对 应于人类抗体AAK94808 (SEQID NO :6)的可变区中的框架区的轻链框架区。

[0150] 本发明还提供包含核酸的载体,该核酸编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其 结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 : MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8),HCDR3 :DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9),以及来自人类 抗体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区。

[0151] 本发明还提供包含核酸的载体,该核酸编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其 结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含轻链⑶R =IXDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID NO: 10)、LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID NO :11)、及 LCDR3 =QQYEKLPffT (SEQ ID NO :12)、及来自人类抗 体AAK94808 (SEQ IDNO :6)的可变区的轻链框架区。

[0152] 本发明还提供包含核酸的载体,该核酸编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其 结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含下列重链可变区其中之一:H2 (SEQ ID NO: 13)、H4(SEQ ID NO : 14)、H5 (SEQ ID NO : 15)、H6(SEQ ID NO : 16)、H7 (SEQ ID NO :17)、H8 (SEQ ID NO :18)、H9(SEQID NO :19)、H12 (SEQ ID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ IDNO :

22)、H15(SEQ ID NO : 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)。

[0153] 本发明还提供包含核酸的载体,该核酸编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其 结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含下列轻链可变区其中之一:L5 (SEQ ID N0:

23)、L4(SEQ ID NO :24)、L6(SEQ ID NO :25)、L7(SEQ ID NO :26)、L8(SEQ ID NO :27)、L9(SEQ ID NO :28)、LlO(SEQID NO :29)或 Lll(SEQ ID NO :30)。

[0154] 本发明还提供包含核酸的载体,该核酸编码具有人vWF特异性的人源化抗体或其 结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含(1)下列重链可变区其中之一:H2 (SEQ ID NO :13)、H4(SEQ ID NO : 14)、H5 (SEQ ID NO : 15)、H6 (SEQ ID NO : 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、 H8 (SEQ ID NO :18)、H9(SEQ ID NO : 19)、H12(SEQ ID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14(SEQ ID NO :22)、H15(SEQ ID NO : 145)、或 H16 (SEQ ID NO : 146);及(2)下列轻链可变区其中之 一:L5(SEQ ID NO :23)、L4(SEQ ID NO :24)、L6 (SEQ ID NO :25)、L7 (SEQ ID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9(SEQID NO :28)、LlO (SEQ ID NO :29)或 Lll (SEQ ID NO :30)。

[0155] 本发明还提供包含分离核酸的载体,该分离核酸包含载体GS 264的编码轻链的 核酸序列,载体GS264已在2008年1月23日在DSMZ保藏于微生物中,其登记号为DSM 21059。

[0156] 本发明还提供包含分离核酸的载体,该分离核酸包含载体GS265的编码重链的核 酸序列,载体GS265已在2008年1月23日在DSMZ保藏于微生物中,其登记号为DSM 21060。

[0157] 本发明提供包含核酸的宿主细胞,该核酸编码具有vWF特异性的人源化抗体或其 结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含如SEQ ID NO :19中所述的重链可变区序列及 如SEQ ID NO :28中所述的轻链可变区序列。

[0158] 本发明提供包含核酸的宿主细胞,该核酸编码具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含如SEQ ID NO :237中所述的重链序列及如SEQ ID NO :238中所述的轻链序列。

[0159] 本发明还提供包含分离核酸的宿主细胞,该分离核酸编码具有人vWF特异性的 人源化抗体或其结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含:对应于存在于鼠类抗体 NMC-4内的⑶R的⑶R区;对应于存在于人类抗体AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)的可变区中 的框架区的重链框架区;及对应于存在于人类抗体AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区中的 框架区的轻链框架区。

[0160] 本发明还提供包含分离核酸的宿主细胞,该分离核酸编码具有人vWF特异性的人 源化抗体或其结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含:HCDR1 :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7)、HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ IDNO :8)、HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQ ID NO :9)、 以及来自人类抗体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区。

[0161] 本发明还提供包含分离核酸的宿主细胞,该分离核酸编码具有人vWF特异性 的人源化抗体或其结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含下列轻链CDR =LCDRl : SASQDINKYLN (SEQ ID NO :10) ,LCDR2 :YTSSLHS (SEQID NO :11)、及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO :12)、及来自人类抗体AAK94808(SEQ ID NO :6)的可变区的轻链框架区。

[0162] 本发明还提供包含分离核酸的宿主细胞,该分离核酸编码具有人vWF特异性的 人源化抗体或其结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含下列重链可变区其中之一: H2 (SEQ ID NO :13)、H4(SEQ ID NO :14)、H5 (SEQID NO :15)、H6 (SEQ ID NO :16)、H7 (SEQ ID NO :17)、H8(SEQ ID NO :18)、H9(SEQ ID NO :19)、H12(SEQ ID NO :20)、H13(SEQ ID NO :21)、 H14(SEQ ID NO :22)、H15(SEQ ID NO : 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)。

[0163] 本发明还提供包含分离核酸的宿主细胞,该分离核酸编码具有人vWF特异性的 人源化抗体或其结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含下列轻链可变区其中之一: L5 (SEQ ID NO :23)、L4(SEQ ID NO :24)、L6(SEQID NO :25)、L7 (SEQ ID NO :26)、L8(SEQ ID NO :27)、L9(SEQ ID NO :28)、LlO (SEQ ID NO :29)或 Lll(SEQ ID NO :30)。

[0164] 本发明还提供包含分离核酸的宿主细胞,该分离核酸编码具有人vWF特异性的 人源化抗体或其结合片段,而该人源化抗体或其结合片段包含下列重链可变区其中之一: H2 (SEQ ID NO :13)、H4(SEQ ID NO :14)、H5 (SEQID NO :15)、H6 (SEQ ID NO :16)、H7 (SEQ ID NO :17)、H8(SEQ ID NO :18)、H9 (SEQ ID NO :19)、H12 (SEQ ID NO :20)、H13 (SEQ ID N0:21)、 H14(SEQ ID NO :22)、H15(SEQ ID NO : 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146);及(2)下列轻链可变 区其中之一 :L5 (SEQ ID NO :23)、L4 (SEQ ID NO :24)、L6 (SEQ ID NO :25)、L7 (SEQ ID NO : 26)、L8(SEQ ID NO :27)、L9(SEQID NO :28)、LlO (SEQ ID NO :29)或 Lll(SEQ ID NO :30)。

[0165] 本发明还提供包含分离核酸的宿主细胞,该分离核酸包含载体GS264的编码轻链 的核酸序列,载体GS264已在2008年1月23日在DSMZ保藏于微生物中,其登记号为DSM

21059。

[0166] 本发明还提供包含分离核酸的宿主细胞,该分离核酸包含载体GS265的编码重链 的核酸序列,载体GS265已在2008年1月23日在DSMZ保藏于微生物中,其登记号为DSM

21060。

[0167] 本发明还提供具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的生产方法,包含培养 本发明的宿主细胞,以表达核酸及制造抗体;本发明的人源化vWF抗体或其结合片段的生

27产方法还可包含自宿主细胞培养物回收抗体。在某些实施方案中,抗体可自宿主细胞培养 基加以回收;在某些实施方案中,于培养之前,可用包含编码重链可变区的核酸的载体及包 含编码轻链可变区的核酸的载体共同感染宿主细胞。

[0168] 本发明提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该人源化 抗体或其结合片段包含如SEQ ID NO : 19中所述的重链可变区序列及如SEQ ID N0:28中所 述的轻链可变区序列。

[0169] 本发明提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该人源化 抗体或其结合片段包含如SEQ ID NO :19中所述的重链可变区序列、如SEQ ID NO :28中所 述的轻链可变区序列、及可药用的载体(carrier)。

[0170] 本发明提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该人源化 抗体或其结合片段包含如SEQ ID NO :237中所述的重链序列及如SEQ ID N0:238中所述的 轻链序列。

[0171] 本发明提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该人源化 抗体或其结合片段包含如SEQ ID NO :237中所述的重链序列、如SEQ ID NO :238中所述的 轻链序列、及可药用的载体。

[0172] 本发明提供包含具有人类冯维勒布兰德氏因子(vWF)特异性的人源化抗体或其 结合片段的组合物,该人源化抗体或其结合片段包含:对应于存在于鼠类抗体NMC-4中的 ⑶R的⑶R区;对应于人类抗体AAC18165. 1 (SEQID NO :4)的可变区中的框架区的重链框架 区;对应于人类抗体AAK94808(SEQ ID NO :6)的可变区中的框架区的轻链框架区;及可药 用的载体。

[0173] 本发明还提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合 物,该人源化抗体或其结合片段包含HCDRl :GFSLTDYGVD (SEQ ID NO :7)、HCDR2 : MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8)、HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQID NO :9)、来自人类抗体 AAC18165. KSEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区、以及可药用的载体。

[0174] 本发明还提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该 人源化抗体或其结合片段包含下列轻链CDR =LCDRl :SASQDI NKYLN (SEQ ID N0:10)、 LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID NO :11)、及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO : 12)、及来自人类抗体 AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区的轻链框架区、以及可药用的载体。

[0175] 本发明还提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该 人源化抗体或其结合片段包含:重链CDR,HCDRl :GFSLTDYGVD (SEQID NO :7)、HCDR2 : MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8)、及 HCDR3 :DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9);及轻链 CDR, LCDRl :SASQDINKYLN(SEQID NO :10)、LCDR2 :YTSSLHS(SEQ ID NO : 11)、及 LCDR3 : QQYEKLPffT (SEQID NO: 12);任选地,来自人类抗体AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区的轻 链框架区和/或来自人类抗体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区;以及可 药用的载体。

[0176] 本发明还提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该人源 化抗体或其结合片段包含下列重链可变区之一:H2 (SEQ ID N0:13)、H4(SEQ ID N0:14)、 H5 (SEQ ID NO :15)、H6(SEQ ID NO : 16)、H7 (SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQ ID NO : 18)、H9 (SEQ ID NO :19)、H12(SEQID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ IDNO :145)、或H16(SEQ ID NO : 146)以及可药用的载体。

[0177] 本发明还提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该人源 化抗体或其结合片段包含下列轻链可变区之一:L5 (SEQ ID N0:23)、L4(SEQ ID NO :24)、 L6 (SEQ ID NO :25)、L7(SEQ ID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID NO :28)、LlO (SEQ ID NO :29)或Lll (SEQ ID NO :30)以及可药用的载体。

[0178] 本发明还提供包含具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段的组合物,该人源 化抗体或其结合片段包含:下列重链可变区其中之一:H2(SEQID NO :13)、H4(SEQ ID NO: 14)、H5(SEQ ID NO :15)、H6(SEQ ID NO :16)、H7 (SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQ ID NO :18)、H9(SEQ ID NO :19)、H12(SEQ ID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ ID NO :145)、或 H16(SEQ ID NO : 146);下列轻链可变区其中之一 _L5 (SEQ ID NO :23)、L4 (SEQ ID NO :24)、L6(SEQ ID NO :25)、L7 (SEQID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID N0:28)、 LlO (SEQ ID NO :29)或 Lll (SEQ ID NO :30);以及可药用的载体。

[0179] 本发明还提供包含如此处所述的第一人源化抗体或其结合片段及结合至vWF的 Al结构域的第二抗体的组合物。

[0180] 在一些实施方案中,第二抗体是AJW-200。

[0181] 本发明还提供在一受试者(例如人类)中的vWF介导的疾病或紊乱(例如血栓形 成疾病或紊乱)的治疗方法,该方法包含给予该受试者治疗有效量的具有人vWF特异性的 人源化抗体或其结合片段,其包含如SEQ ID N0:19中所示的重链可变区序列及如SEQ ID NO :28中所示的轻链可变区序列。

[0182] 本发明还提供在一受试者(例如人类)中的vWF介导的疾病或紊乱(例如血栓形 成疾病或紊乱)的治疗方法,该方法包含给予该受试者治疗有效量的具有人vWF特异性的 人源化抗体或其结合片段,其包含如SEQ ID NO :237中所示的重链序列及如SEQ ID NO :238 中所示的轻链序列。

[0183] 本发明还提供在一受试者(例如人类)中的vWF介导的疾病或紊乱(例如血栓形 成疾病或紊乱)的治疗方法,该方法包含给予该受试者治疗有效量的具有人vWF特异性的 人源化抗体或其结合片段,其包含:对应于存在于鼠类抗体NMC-4中的CDR的CDR区;对应 于人类抗体AAC18165. 1(SEQ IDNO :4)的可变区中的框架区的重链框架区;对应于人类抗 体AAK94808 (SEQID NO :6)的可变区中的框架区的轻链框架区。

[0184] 本发明还提供在一受试者(例如人类)中的vWF介导的疾病或紊乱(例如血 栓形成疾病或紊乱)的治疗方法,该方法包含给予该受试者治疗有效量的具有vWF特 异性的人源化抗体或其结合片段,其包含:HCDR1 :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7)、HCDR2 : MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8)、HCDR3 :DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9)、及来自人类抗 体AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)的可变区的重链框架区。

[0185] 血栓形成疾病或紊乱可为心血管疾病或例如缺血性卒中的脑血管疾病。在某些实 施方案中,心血管疾病为动脉粥状硬化症(atherosclerosis)、再狭窄(restenosis)、心绞 痛(angina)、急性心肌梗塞(acute myocardialinfarction)、急性冠状动脉综合症(acute coronary syndrome)、或与糖尿病(diabetes)相关联的心血管异常;在某些实施方案中, 血栓性疾病或紊乱为血管发炎、静脉血栓(venous thrombosis)、镰刀形细胞病、异种移植 排斥(xenograft rejection)、夕卜周血管病(peripheral vasculardisease)、血栓性血小板

29减少性紫癜症(thrombotic thrombocytopenicpurpura)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、 血管性痴呆(vasculardementia)、雷诺病(Raynaud,s disease)、类风湿性关节炎、或糖尿 病;在某些实施方案中,脑血管异常可包含由于大脑动脉梗塞(cerebralartery infarct) 以及小腔隙梗塞(small lacunar infarct)的缺血性卒中及血管性痴呆(vascular dementia) 0人源化vWF抗体还可用于预防再发性中风、或由脑血管发炎所引起的初期中 风。

[0186] 在某些实施方案中,血栓形成疾病或紊乱可包含癌症。

[0187] 本发明还提供在一受试者(例如人类)中的vWF介导的疾病或紊乱(例如血栓 形成疾病或紊乱)的治疗方法,该方法包含给予该受试者治疗有效量的具有vWF特异性的 人源化抗体或其结合片段,其包含:下列轻链CDR =LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10)、 LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID NO : 11)、及 LCDR3 =QQYEKLPffT (SEQ ID NO : 12)、及来自人类抗体 AAK94808 (SEQ IDNO :6)的可变区的轻链框架区。

[0188] 本发明还提供在一受试者(例如人类)中的vWF介导的疾病或紊乱(例如血栓 形成疾病或紊乱)的治疗方法,该方法包含给予该受试者治疗有效量的具有vWF特异性的 人源化抗体或其片段,其包含:下列重链可变区其中之一:H2 (SEQ ID N0:13)、H4(SEQ ID NO :14)、H5(SEQ ID NO : 15)、H6 (SEQ ID NO : 16)、H7 (SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、 H9 (SEQID NO :19)、H12(SEQ ID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ IDNO :22)、H15 (SEQ ID NO :145)、或 H16(SEQ ID NO: 146)。

[0189] 本发明还提供在一受试者(例如人类)中的vWF介导的疾病或紊乱(例如血栓 形成疾病或紊乱)的治疗方法,该方法包含给予该受试者治疗有效量的具有vWF特异性的 人源化抗体或其片段,其包含:下列轻链可变区其中之一:L5 (SEQ ID N0:23)、L4(SEQ ID NO :24)、L6(SEQ ID NO :25)、L7 (SEQ ID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID NO :28)、 LlO (SEQID NO :29)或 Lll (SEQ ID NO :30)。

[0190] 本发明还提供在一受试者(例如人类)中的vWF介导的疾病或紊乱(例如血栓 形成疾病或紊乱)的治疗方法,该方法包含给予该受试者治疗有效量的具有vWF特异性的 人源化抗体或其片段,其包含:下列重链可变区其中之一:H2 (SEQ ID N0:13)、H4(SEQ ID NO :14)、H5(SEQ ID NO : 15)、H6 (SEQ ID NO : 16)、H7 (SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、 H9 (SEQID NO :19)、H12(SEQ ID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ IDNO :22)、H15 (SEQ ID NO :145)、或 H16(SEQ ID NO : 146);下列轻链可变区其中之一:L5 (SEQ ID NO :23)、 L4 (SEQ ID NO :24)、L6(SEQ IDNO :25)、L7 (SEQ ID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID NO :28)、L10(SEQ ID NO :29)或 Lll (SEQ ID NO :30)。

[0191] 在某些实施方案中,具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段缺乏效应子 (effector)功能;在某些实施方案中,人源化抗体包含源自于IgG4的Fc区。

[0192] 本发明提供具有冯维勒布兰德氏因子(vWF)特异性的人类抗体或其结合片段,其 可以自EDiqq的约1至约250倍的治疗有效量来提供,而不致引发明显的临床出血迹象。人 类抗体或其结合片段优选地为具有人类vWF的Al结构域特异性,具有vWF特异性的人类抗 体或其结合片段更优选地为具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段。

[0193] 本发明还提供vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法,其通过给予一受试者(优选人 类)治疗有效量的如此处所述的人源化抗体或其结合片段。该治疗有效量从约0.001至约100mg/kg,优选为自约0. 002至约20mg/kg,更优选为自约0. 002至约10mg/kg,又更优选为 自约0. 002至约0. 4mg/kg,再更优选为自约0. 005至约0. 2mg/kg,最优选为自约0. 01至约 0.lmg/kg0

[0194] 本发明还提供一种vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法,其通过给予一需要的受试 者治疗有效量的如此处所述的人源化抗体或其结合片段来达成。该治疗有效量从EDiciq的 约1至约250倍,优选为自EDltltl的约1至约200倍,更优选自EDltltl的约1至约100倍。

[0195] 本发明还提供一种vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法,其通过将单一或多次小剂 量(sub-dose)的治疗有效量的如此处所述的人源化抗体或其结合片段施予需要此类处理 的受试者来达成。

[0196] 本发明还提供一种vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法,其通过将治疗有效量的如 此处所述的人源化抗体或其结合片段以皮下方式施予需要此类处理的受试者来达成。

[0197] 本发明还提供一种vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法,其通过将治疗有效量的如 此处所述的人源化抗体或其结合片段透过静脉方式施予需要此类处理的受试者来达成。

[0198] 本发明还提供一种vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法,其通过连续地或结合 放射性治疗法(例如照射或引入放射性物质,如UICC(编),Klinische Onkologie, Springer-Verlag (1982)),将治疗有效量的如此处所述的人源化抗体或其结合片段通过静 脉方式施予需要此类处理的受试者来达成。

[0199] 在实施或测试本发明时,虽然类似或等同于此处所述的任何方法及材料均可使 用,但以下仍说明优选方法及材料。

[0200] 人源化冯维勒布兰德氏因子抗体的生产

[0201] 此处提供人源化冯维勒布兰德氏因子(vWF)抗体(例如鼠类NMC-4)或其结合片 段的生产方法。具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,可通过自非人类动物(例如 小鼠)的VH和/或VL区转移一个或多个CDR或其部分至人类VH和/或VL区的一个或多 个框架区。任选地,当需要或期望维持结合亲和力时,如此存在于VH和/或VL区中的人类 构架残基,可用对应的非人类(例如小鼠)残基加以替代。任选地,存在于CDR中的非人类 氨基酸残基可以人类残基加以替代。

[0202] 如此处所述的构架及⑶R的分类(除了 HFRl及⑶Rl以外)基于卡巴记数 制(Kabat numbering system)。在此定义中,重链的 CDR 包含残基 31-35 (HCDRl), 50-65 (HCDR2),及 95-102 (HCDR3);轻链的 CDR 被定义成包含残基 24-34 (LCDRl), 50-56 (LCDR2),及89-97 (LCDR3)。将VH(例如重链框架区1 (HFRl)、重链框架区2 (HFR)、重 链框架区3(HFR3)和/或重链框架区4(HFR4))中的框架区定义成包含残基1_30 (HFRl), 36-49 (HFR2),66-94 (HFR3),及 103-113 (HFR4),而 VL 中的框架区包含残基 1-23 (LFRl), 35-49(LFR2),57-88(LFR 3)及 98-107 (LFR4) (Wu和 Kabat,1970 J. Exp. Med. 132 :211)。然 而,基于CDR的结构,Chothia将CDRl-H定义成包含残基26-32 (Chothia等,1992 J. Mol. Biol. 227 :799),AbM(抗体模拟)定义为 CDR1-H 包含残基 26-35 的 Oxford Molecular,s AbM抗体模拟软件所使用的两者之间的折衷。此为此处所述的利用NMC-4的人源化方法所 用的定义。

[0203] 具有冯维勒布兰德氏因子(vWF)特异性的人源化抗体或其结合片段,可通过 下列方式加以生产:将来自NMC-4的重链互补决定区(OTR)转移至对应于人类抗体AAC18165. KSEQ ID NO :4)的可变区中的框架区的重链框架区;以及将来自匪C-4的轻链 ⑶R转移至对应于人类抗体AAK94808 (SEQID NO :6)的可变区中的框架区的轻链框架区。

[0204] 具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段还可通过下列方式加以生 产:将来自鼠类匪C-4 的重链 CDR(例如 HCDRl :GFSLTDYGVD (SEQ ID NO :7), HCDR2 : MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8),及 HCDR 3 =DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO :9))其中一禾中 或多种转移至人类框架区(例如来自AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)的可变区)。

[0205] 具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段还可通过下列方式加以生产:将轻链 CDR (例如 LCDRl :SASQDINKYLN (SEQ ID N0:10),LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID NO :11),及 LCDR3 : QQYEKLPffT (SEQ ID NO :12))其中一种或多种转移至人类框架区(例如来自AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区)。

[0206] 具有vWF特异性的人源化抗体可通过下列方式加以生产:将来自鼠类NMC-4的重 链CDR(例如 HCDRl :GFSLTDYGVD (SEQ ID NO :7) ,HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8), 及HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQ IDNO :9))其中一种或多种转移至人类框架区(例如来自 AAC18165. 1(SEQ IDNO :4)的可变区);及将轻链 CDR (例如 LCDRl : SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10),LCDR2 :YTSSLHS (SEQ ID NO :11),及 LCDR 3 =QQYEKLPffT (SEQ ID NO :12))其中一种或 多种转移至人类框架区(例如来自AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变区)。

[0207] 具有vWF特异性的人源化抗体可通过下列方式加以生产:将包含存在于NMC-4及 人类框架区中的CDR的修饰重链可变区(例如H2 (SEQ ID NO : 13)、H4 (SEQ ID NO :14), H5 (SEQ ID NO :15)、H6(SEQ ID NO : 16)、H7 (SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQ ID NO :18)、H9 (SEQ ID NO :19)、H12(SEQID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ IDNO : 145)、或H16(SEQ ID NO: 146))转移至人类恒定区。

[0208] 具有vWF特异性的人源化抗体还可通过下列方式加以生产:将包含存在于NMC-4 及人类框架区中的CDR的修饰轻链可变区(例如L5 (SEQ ID NO :23)、L4 (SEQ ID NO :24)、 L6 (SEQ ID NO :25)、L7(SEQ ID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID NO :28)、LlO (SEQ ID NO :29)或Lll (SEQ ID NO :30))转移至人类恒定区。

[0209] 具有vWF特异性的人源化抗体可通过下列方式加以生产:将包含存在于NMC-4及 人类框架区中的CDR的修饰重链可变区(例如H2 (SEQ ID NO : 13)、H4 (SEQ ID NO :14), H5 (SEQ ID NO :15)、H6(SEQ ID NO : 16)、H7 (SEQ ID NO : 17)、H8 (SEQ ID NO :18)、H9 (SEQ ID NO :19)、H12(SEQID NO :20)、H13 (SEQ ID NO :21)、H14 (SEQ ID NO :22)、H15 (SEQ IDNO : 145)、或H16(SEQ ID NO : 146))转移至人类恒定区;以及将包含存在于NMC-4及人类框架 区中的 CDR 的修饰轻链可变区(例如 L5(SEQ ID NO :23)、L4 (SEQ ID NO :24)、L6 (SEQ ID NO :25)、L7(SEQ ID NO :26)、L8 (SEQ ID NO :27)、L9 (SEQ ID NO :28)、LlO (SEQ ID NO :29) 或Lll (SEQ ID NO :30))转移至人类恒定区。

[0210] 为试图进一步降低人源化抗体的抗原性,可将CDR中的残基(例如鼠类残基)变 为(例如取代为)人类氨基酸残基。举例而言,人源化抗体可包含HCDRl中的F27G,L29I, T30S和/或V34W取代其中一种或多种。在某些实施方案中,人源化抗体可包含HCDR2中的 S61P和/或A62S取代其中一种或多种;在某些实施方案中,人源化抗体可包含IXDRl中的 S24Q,N30S和/或K31N取代其中一种或多种;在某些实施方案中,人源化抗体可包含一个 或多个的取代,例如LCDR2中的Y50D,T51A,S53N, H55E和/或S56T取代。在某些实施方案中,人源化抗体可包含:HCDR1中的F27G,L29I,T30S和/或V34W取代其中一种或多种; HCDR2中的S61P和/或A62S取代其中一种或多种;LCDRl中的S24Q,N30S和/或K31N取 代其中一种或多种;及LCDR2中的Y50D,T51A,S53N, H55E和/或S56T取代其中一种或多 种。

[0211] 考虑了各种形式的人源化抗体。举例而言,人源化抗体可为例如Fab的抗体片段, 其任选地与一个或多个的细胞毒性物质缀合以产生免疫缀合物(immunoconjugate)。可选 地,人源化抗体或亲和力成熟抗体可为完整(intact)抗体,例如完整IgGl抗体。

[0212] 已开发出生产人源化抗体的抗体片段的各种技术。传统上,这些片段系通过完整 抗体的蛋白水解消化而获得(见例如Morimoto等,Journal ofBiochemical和Biophysical Methods,24 :107-117 (1992);及 Brennan 等,Science,229 :81 (1985));然而,如今这些片 段可通过重组宿主细胞来直接产生,例如抗体片段可由以上所讨论的抗体噬菌体文库分 离出来;可选地,Fab' -SH片段可直接由大肠杆菌回收并将其化学交联以形成F(ab’)2片 段(Carter 等,Bio/Technology,10 : 163-167 (1992))。根据另一方法,F(ab,)2 片段可直 接由重组宿主细胞培养物中分离出来,而其它生产抗体片段的方法对技术人员将为显而易 见。在其它实施方案中,选定的抗体为单链Fv片段(scFv),见WO 1993/16185 ;美国专利第 5,571,894号;及美国专利第5,587,458号。抗体片段还可为“线性抗体”,例如在美国专利 第5,641,870中所述。

[0213] 根据不同方法,可将具有期望的结合特异性(抗体_抗原结合位点)的抗体可变 结构域融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。该融合优选地为利用免疫球蛋白重链恒定结构 域,其包含至少部分铰链区、CH2区及CH3区。优选使包含轻链结合所必须的位点的第一重 链恒定区(CHl)存在于至少一融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物及(若有需要)免 疫球蛋白轻链的DNA插入于分别的表达载体内,并共同转染至一适当宿主生物。当建构时 所使用的不等比率的三多肽链提供最优选化产率时,此在调整三多肽片段的相互比例的实 施方案中可提供灵活性;然而,当等比例的至少两多肽链的表达导致高产率或是当比率不 具特殊意义时,可在一表达载体中插入该两或三多肽链的编码序列。

[0214] 本发明还涉及包含抗体的免疫缀合物,该抗体缀合至细胞毒性物质(例如化疗 剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素,包含其片段和/或 变体))或放射性同位素(即放射性缀合物)。

[0215] 本发明进一步考虑形成于抗体与具有核溶解(nucleolytic)活性的化合物(例如 核糖核酸酶或例如脱氧核糖核酸酶的DNA核酸内切酶(DNase))之间的免疫球蛋白。

[0216] 有多种放射性同位素可用于生产辐射缀合(radioconjugated)的人源化vWF抗 体,例子包含 At211,I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153,Bi212,P32 及 Lu 的放射性同位素。

[0217] 抗体及细胞毒性物质的缀合物可利用多种双功能蛋白质交联剂加以生产,例 如 3-(2-吡啶二硫代)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio 1)propionate (SPDP))、4_(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸琥珀酰亚胺酯(sue cinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate)、亚氨基硫烧盐酸盐 (iminothiolanedT))、亚氨酸酯(imidoesters)的双官能基衍生物(例如二亚胺代己二 酸二甲酯盐酸盐(dimethyladipimidate HCl))、活性酯类(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯 (disuccinimidyl suberate))、酸类(例如戊二酸(glutaraldehyde))、叠氮(bis-azido)化合物(例如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺(bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine))、双 重氮(bis-diazonium)衍生物(例如双_(对重氮苯酰基)_乙二胺(bis-(p-diazoniumbe nzoyl)-ethylenediamine))、二异氰酸酯类(diisocyanates)(例如 2,6_ 二异氰酸甲苯酯 (toluene2,6-diisocyanate))、及双活性氟(bis-active fluorine)化合物(例如 1,5_ 二 氟-2,4- 二硝基苯(1, 5-dif luoro-2,4-dinitrobenzene)) „ 举例而言,可如 Vitetta 等, Science, 238 =1098(1987)中所述般制备蓖麻毒蛋白(ricin)免疫毒素。碳14标记的1-异 氰硫苯基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(l-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetri aminepentaacetic acid(MX-DTPA))为例示的放射性核苷酸(radionucleotide)缀合至抗 体的螯合剂,见WO 1994/11026。接头可为在细胞中辅助细胞毒性物质药物的释放的“可切 割接头”(cleavablelinker),例如可使用酸敏感接头、肽酶敏感性接头、二甲基接头、或含 二硫化物接头(Chari 等,Cancer Research,52 : 127-131 (1992))。

[0218] 可选地,可例如通过重组技术或肽合成来生产包含人源化vWF抗体及细胞毒性物 质的融合蛋白。

[0219] 在又一实施方案中,可将人源化vWF抗体缀合至“受体”(例如抗生蛋白链菌素), 以用于肿瘤预定位,其中将抗体-受体缀合物给予病人,接着利用清除剂而由循环中移除 未结合的缀合物,且接着施用缀合至细胞毒性物质(例如放射性核苷酸)的“配体”(例如 抗生物素蛋白)。

[0220] 还可通过将人源化vWF抗体缀合至转化前药(例如肽基化疗剂,见W01981/01145) 为活性抗癌药(见例如WO 198807378及美国专利第4,975,278号)的前药活化酶上,而将 本发明的抗体使用于ADEPT中。

[0221] 可用于ADEPT的免疫缀合物的酶成分包含能够以将其转换成更具活性和细胞毒 性的方式作用于前药的任何酶。

[0222] 可使用的酶包含但不限于:有助于将含磷酸盐的前药转化成游离药(free drug) 的碱性磷酸酶(phosphatase);有助于将含硫酸盐的前药转化成游离药的芳基硫酸酯酶 (arylsulfatase);有助于将无毒5_氟胞嘧啶(5_fluorocytosine)转化成抗癌药5_氟 尿嘧啶(5-f luorouracil)的胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase);有助于将含肽前 药转化成游离药的蛋白酶(protease),例如沙雷菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白 酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶(carboxypeptidase)及组织 蛋白酶(cath印sin)(例如组织蛋白酶B及L);可用以转化包含β-氨基酸取代基的前 药的D-丙氨酰羧肽酶(D-alanylcarboxyp印tidase);有助于将糖基化(glycosylated) 前药转化成游离药的糖类切割酶(carbohydrate-cleaving enzyme),例如β-半乳糖 苷酶(β -galactosidase)及神经氨酸酶(neuraminidase);有助于将以β _内酰胺 (β-lactam)衍生的药物转化成游离药的β _内酰胺酶(β-lactamase);及有助于分别将 以苯氧乙酰基或苯乙酰基在其胺氮上加以衍生的药物转化成游离药的青霉素酰胺酶,例如 为青霉素V酰胺酶及青霉素G酰胺酶。可选地,可利用具有酶活性的抗体(在此领域中还称 为“催化性抗体”(abzyme)),将本发明的前药转化成游离活性药(见例如Massey,Nature, 328 :457-458 (1987))。可如此处所述来制备抗体-催化性抗体缀合物,以将催化性抗体递 送至肿瘤细胞族群。

[0223] 通过本领域中所熟知的技术,例如上述使用异双功能(heterobifunctional)交

34联剂,可使酶共价结合至人源化vWF抗体。可选地,可利用本领域中所熟知的重组DNA技术, 建构至少包含本发明的抗体的抗原结合区的融合蛋白,该抗原结合区连结至一适当酶的至 少功能活性部分(见例如 Neuberger 等,Nature, 312 :604-608 (1984))。

[0224] 此处考虑抗体的其它修饰。举例而言,可将抗体连结至各种非蛋白质类聚合物 其中之一,例如聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙二醇(polypropylene glycol)、 聚氧化烯烃类(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇及聚丙二醇的共聚合物;举例而言,还可使 抗体埋入于通过例如凝聚(coacervation)技术或界面聚合(例如分别为羟甲基纤维素 (hydroxymethyIcellulose)或明胶-微胶囊(gelatin—microcapsule)及聚甲基丙烯酸甲 酯(poly-Onethylmethacylate))微胶囊)所制备的微胶囊内,埋入胶体药物递送系统(例 如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或巨乳液中。此类技术公开于 Remington' sPharmaceutical Sciences (第 16 版,由 Oslo, Α·所编(1980))中。

[0225] 还可将此处所公开的人源化vWF抗体配制成免疫脂质体。通过本领域中已知的方 法,制备包含抗体的脂质体,例如:Epstein 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 :3688 (1985); Hwang 等,Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77 :4030 (1980);美国专利第 4,485,045 及 4,544,545 号;及1997年10月23日公开的WO 1997/38731中所述。具有增加的循环时间的脂质体则 公开于美国专利第5,013,556号中。

[0226] 特别有用的脂质体可利用包含卵磷脂(phosphatidylcholine)、胆固醇、及PEG衍 生磷脂酰乙醇胺(PEG-derived phosphatidylethanolamine,PEG-PE)的脂质组合物并通过 反相蒸发法加以产生。透过确定孔径的过滤器来挤出脂质体,以产生具有期望直径的脂质 体。可透过二硫化物互换反应,将本发明的抗体的Fab’片段缀合至如Martin等,J.Biol. Chem.,257 :286-288(1982)中所述的脂质体。可任选地将化疗剂包含于脂质体内。见 Gabizon 等,J. National Cancer Inst. ,81(19) : 1484 (1989)。

[0227] 载体、宿主细胞及重组方法

[0228] 本发明提供编码具有vWF特异性的人源化抗体及其结合片段的分离核酸、载体、 及包含该核酸的宿主细胞、及生产抗体或其结合片段的重组技术。

[0229] 就抗体的重组生产而言,可将编码该抗体的核酸分离出来或将其插入可复制载体 中,以更进一步进行克隆(扩增DNA)或用于表达。可利用传统方法(例如利用能够特定地 结合至编码抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)分离并测序编码单株抗体的DNA。 可利用许多载体。载体组成通常包含但不限于下列其中一种或多种:信号序列、复制起点、 一个或多个的标记基因、增强子元件(enhanced element)、启动子(promoter)、及转录终止 序歹lj (transcription-termination sequence)。

[0230] (i)信号序列组成

[0231] 如此处所述的人源化vWF抗体不仅可直接以重组方式生产,还可为具有异源 (heterologous)多肽的融合多肽形式,其优选为在成熟蛋白质或多肽的N端(N-terminus) 上具有特定断裂位点。异源讯号序列优选地可为宿主细胞所识别及加工(即由信号肽 酶加以断裂)。就未能识别及处理天然人源化vWF抗体信号序列的原核生物宿主细胞而 言,可利用由例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或耐热性肠毒素II前导区(enterotoxin IIleader)中所选择出的原核生物信号序列来取代信号序列;就酵母菌分泌而言,天然信 号序列可通过例如酵母菌转化酶前导区、α-因子前导区(包含酵母菌属(Saccharomyces)及克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)的α -因子前导区)、酸性磷酸酶前导区、白色念珠菌 (C. albicans)葡糖淀粉酶前导区、或WO 1990/13646中所述的信号加以取代。在哺乳类细 胞表达中,可使用哺乳类细胞信号序列以及病毒分泌前导区(viral secretoryleader),例 如单纯疱疹病毒(herpes simplex) gD信号。

[0232] 此类前体区所用的DNA可在读码框中被连接至编码人源化vWF抗体的DNA。

[0233] (ii)复制元件的起点

[0234] 表达及克隆载体两者皆包含能够使载体在一个或多个的选定宿主细胞中复制的 核酸序列。一般而言,在克隆载体中,此序列可使载体独立于宿主染色体DNA而复制,且包 含复制的起点或自发性复制序列(autonomously!·印licating sequences)。已熟知许多细 菌、酵母、及病毒的此类序列。来自质粒PBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性菌, 2 μ质粒起点适用于酵母,且各种的病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于 在哺乳动物细胞的克隆载体。一般而言,哺乳动物表达载体(一般可使用SV40起源,仅因 为其含有早期启动子)并不需要复制元件的起点。

[0235] (iii)筛选基因元件

[0236] 表达及克隆载体可包含筛选基因,还称为筛选标记(selectablemarker)。代 表性筛选基因编码下列蛋白质:(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新 霉素(neomycin)、甲氨蝶呤、或四环霉素)的抗性、(b)补充营养缺陷(auxotrophic deficiency)、或(c)供应无法由复合培养基中得到的必须或期望营养,例如编码杆菌 (Bacilli)的 D-丙胺酸(D-alanine)消旋酶(racemase)的基因。

[0237] 筛选方案的实例为利用药物以阻止宿主细胞的生长。这些成功地以异源基因加以 转化(transformed)的细胞生产提供抗药性的蛋白质,因此在选择方案中存活下来。此种 显性选择的实例使用新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、及潮霉素(hygromycin)等药 物。

[0238] 哺乳动物的适当筛选标记的另一例为可识别能够占有人源化vWF抗体编 码核酸的细胞者,例如DHFR、胸腺激酶(thymidine kinase)、重金属蛋白质-I及 II (metallothionein-I&II)(优选为灵长类重金属蛋白质基因)、腺核苷脱胺酶 (adenosine deaminase)、鸟月安■去·_ (ornithinedecarboxylase)等。

[0239] 举例而言,通过在含有灭杀除癌(methotrexate,Mtx)培养基中培养转化体 (transformant),首先识别出以DHFR筛选基因加以转化的细胞。当使用野生型DHFR时的 适当宿主细胞为缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢细胞株(CH0 cell line)。

[0240] 可选地,可通过在含有筛选标记的选择剂(像是胺基糖苷类抗体,例如康霉素 0^皿!^(^11)、新霉素、或6418,见美国专利第4,965,199号)的培养基中的细胞生长,选择 以编码人源化vWF抗体、野生型DHFR蛋白质、及另一筛选标记(例如胺基糖苷3’ -磷酸转 移酶(aminoglycoside 3' -phosphotransferase,ΑΡΗ))加以转化或共转化的 DNA 序列宿 主细胞(尤其是包含内生DHFR的野生型宿主)。

[0241] 用于酵母菌中的适当筛选基因可为存在于酵母菌质粒YRp7中的trpl基因 (Stinchcomb 等,Nature, 282 :39 (1979)),trpl 基因为在色胺酸(tryptophen)中缺乏生长 能力的酵母菌突变株(例如 ATCC 44,076 或 PEP4-1. Jones,Genetics,85 : 12 (1997))提供 筛选标记。酵母菌宿主细胞染色体组(genome)中trpl损伤(lesion)的存在接着为通过

36在无色胺酸下的生长而检测转化(transformation)提供了一有效环境;同理,可利用带有 Leu2基因的已知质粒,补充缺乏Leu2(Leu2-deficeient)的酵母菌株(ATCC 20,622或38, 626)。

[0242] 此外,可利用衍生自1.6μπι圆形质粒pKDl的载体,进行克鲁维酵母菌的转化;可 选地,K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8 :135(1990)中有描述大规模生产重组 小牛凝乳酶的表达系统。吾人已公开用于以克鲁维酵母菌属的工业菌株来分泌成熟重组 人类血清蛋白的稳定多复制数(multi-copy)表达载体,见Fleer等,Bio/Technolog,9 : 968-975(1991)。

[0243] (iv)启动子组成

[0244] 表达及克隆载体通常包含可由宿主生物加以识别的启动子,且可被操作以连结至 vWF抗体编码核酸。原核生物宿主适用的启动子包含PhoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启 动子系统、碱性磷酸酶、色胺酸(trp)启动子系统、及例如tac启动子的嵌合(hybrid)启动 子;然而,其它已知的细菌启动子还为合适。用于细菌系统的启动子还可包含可被操作连结 至编码人源化vWF抗体DNA的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。

[0245] 已知真核生物的启动子序列。真核生物基因具有位于转录起始的位点上游约25 至30个碱基(bases)的富AT(AT_rich)区,在许多基因的转录起始点上游70至80个 碱基所发现的另一序列为CNCAAT(SEQ ID NO :31)区,其中N可为任何核苷酸。在大多 数真核生物的3’端为AATAAA(SEQ IDNO :32)序列,此序列可能为附加多A尾部(poly A tail)至编码序列的3’端的信号。可将这些序列适当地插入真核生物的表达载体 内,用于酵母菌的适当启动序列(promoting sequences)包含:用于3_磷酸甘油酸激酶 (3-phosphoglycerate kinase)或其它糖解酶(例如烯醇酶(enolase)、甘油醛_3_磷 酸去 S1 BS (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、己 H 激 Sl (hexokinase)、 丙 Sl 酸去幾 Bl (pyruvate decarboxylase)、ΐ舞酸果 H ■ Bl (phosphofructokinase)、 葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase)、3-磷酸甘油酸变位酶 (3-phosphoglycerate mutase) > M ® # Bl (pyruvate kinase) > H H ΐ^ ^ I^J g| (triosephosphate isomerase)、憐酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase)、及葡萄 糖激酶(glucokinase))的启动子。

[0246] 其它为具有由生长条件加以控制的额外转录优势的可诱导启动子的酵母菌启动 子可为下列蛋白质的启动子区:乙醇去氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关联 的降解酶、重金属蛋白质、甘油醛-3-磷酸去氢酶、及负责麦芽糖及半乳糖利用的酶。更进 一步说明用于酵母菌表达中的适当载体及启动子,见例如欧洲专利第73,657号。酵母菌增 强子(enhancer)与酵母菌启动子一同使用还相当有利。

[0247] 由哺乳类宿主细胞中的载体转录人源化vWF抗体,可例如通过由多瘤(polyoma) 病毒、禽痘(fowlpox)病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳突状瘤病毒、禽类肉瘤病毒、细胞巨 大病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒且最优选为猿猴病毒40(SV40)的染色体组所得到的启 动子、异源哺乳类启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、热休克启动子加以 控制,条件是此类启动子可兼容于宿主细胞系统。

[0248] 吾人可便利地取得SV40病毒的早期及晚期启动子,以作为还包含复制的SV40病 毒起源的SV40限制片段;吾人可便利地取得人类细胞巨大病毒的立即早期(immediateearly)启动子,以作为HindIII E限制片段。已揭示利用牛乳突状瘤病毒作为载体而表达 哺乳类宿主中的DNA的系统,见例如美国专利第4,419,446号,此系统的修饰系说明于例如 美国专利第4,601,978号中。Reyes等,Nature,297 :598-601 (1982)描述在控制来自单纯 疱疹病毒的胸腺激酶(thymidine kinase)启动子的下,将人类β _干扰素cDNA表达于鼠 类细胞中。

[0249] (ν)增强子元素组成

[0250] 通过较高等真核生物而转录编码本发明的人源化vWF抗体的DNA,可利用将增强 子序列插入于载体中来提升。今已知来自哺乳动物基因(血球蛋白、弹性蛋白酶、蛋白素、 甲型胎儿蛋白及胰岛素)的有用增强子序列;然而,一般来说,吾人可使用来自真核生物细 胞病毒的增强子,例子包括:在复制起点的晚期侧上的SV40增强子(bp 100-270)、细胞巨 大病毒早期启动子的增强子、在复制起点的晚期侧上的多瘤增强子、及腺病毒增强子。还说 明用于活化真核生物增强子的增强元素。可在人源化vWF抗体编码序列的5’或3’位置将 增强子切成载体,但优选为在由启动子起算的5’位点。

[0251] (vi)转录终止组成

[0252] 用于真核生物宿主细胞(例如酵母菌、真菌、昆虫、植物、动物、人类、或来自其它 多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体可包含终止转录或稳定mRNA所必须的序列,此类 序列一般可得自于真核生物或病毒DNAs或cDNAs的未转译区的5’端(有时为3’端),这 些未转译区包含在编码人源化vWF抗体的mRNA的未转译部分中经转录成为多聚腺苷酸化 (polyadenylated)片段的核苷酸节段。一有用的转录终止组成为牛生长荷尔蒙多聚腺苷酸 化(polyadenylation)区(见例如WO 1994/11026及其中所公开的表达载体)。

[0253] (vii)宿主细胞的筛选及转化

[0254] 用于克隆或表达载体中的DNA的适当宿主细胞包含各种的原核生物、酵母菌、 或较高等的原核生物细胞,用于此目的的当适原核生物包含真细菌类(eubacteria)(例 如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体,像是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠菌属 (Escherichia)(例如大肠杆菌))、肠杆菌属(Enterobacter)、伊文氏杆菌属(Erwinia)、 克留氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌数(Proteus)、沙门杆菌属(Salmonella)(例如 Salmonella typhimurium)、锯杆菌属(Serratia)(例如 Serratiamarcescans)、志贺杆 菌属(Shigella)、以及杆菌(Bacilli)如 B. subtilis 及 B. licheniformis、假单孢菌属 (Pseudomonas)如P. aeruginosa及链霉菌(Sti^ptomyces)0大肠杆菌克隆宿主包含大肠 杆菌294 (ATCC31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌Xl776 (ATCC 31,537)及大肠杆菌W3110 (ATCC 27,325)。

[0255] 除了原核生物以外,真核微生物(例如丝状真菌或酵母菌)为适合的人源 化vWF抗体编码载体的克隆或表达宿主,可将Saccharomycescerevisiae或常见的面 包酵母菌用于表达。此外,其它若干属、种、及菌株还为一般可得到且可使用者,例如; Schizosaccharomyces pombe ;克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)宿主,例如 K. Iactis, K. fragilis(ATCC12,424) , K. bulgaricus(ATCC 16,045), K. wickeramii(ATCC 24, 178), K. waltii(ATCC 56,500), K. drosophilarum(ATCC 36,906), K. thermotolerans, R K. marxianus ;yarrowia(EP 402,226) ;Pichiapastoris(EP 183,070);念珠菌属 (Candida) ;Trichoderma reesia(EP244, 234);粗厚神经孢子菌(Neurospora crassa);Schwanniomyces 例如 Schwanniomyces occidentalis ;及丝状真菌,例如红霄菌属 (Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、Tolypocladium、及曲菌属(Aspergillus)宿主如 A. nidulans及 A. niger。

[0256] 用于表达糖化(glycosylated)的人源化vWF抗体的适当宿主细胞可得自于多 细胞生物体,真核生物细胞的例子包含植物、昆虫及脊椎动物细胞。吾人已识别出许多昆 虫病毒(baculoviral)株及变体、以及来自例如Spodoptera frugiperda(毛虫)、Aedes aegypti (岐子)、Aedes albopictus (岐子)>Drosophila melanogaster (果妮)、及 Bombyx mori等宿主的对应可容许的昆虫宿主细胞。有许多种转染(transfection)用的病毒株可 资公众利用,例如 Autographa californica NPV R Bombyx mori NPV 的 Bm_5 株,且可利用 此类病毒作为此处根据本发明的病毒,尤其用于Spodoptera frugiperda细胞的转染上。

[0257] 还可利用棉花、玉米、马铃薯、黄豆、牵牛花、蕃茄、及烟草的植物细胞培养作为宿 主。

[0258] 然而,最大的兴趣已经在脊椎动物细胞,且在培养(组织培养)中的脊椎细胞 的繁殖已成为例行程序。可使用的哺乳类宿主细胞株的范例包含:ChK2细胞(Chromos Molecular Systems Inc.);由 SV40 (COS-7,ATCC CRL1651)加以转化的猴子肾脏 CVl 细胞 株;人类胚胎肾脏细胞株(293或用以在悬浮培养基中生长而加以次克隆(subcloned)的 293 细胞,Graham 等,J. Gen Virol. ,36 :59(1977));幼仓鼠肾脏细胞(BHK,ATCC CCL 10); 人类胚胎肾脏(HEK) 293 细胞(Simmons, 1990 Exp Physiol. 75 :309) ;SP2 脾脏-骨髓瘤 融合细胞(Haas 和 Wabl,1984,PNAS 81 :7185);中国仓鼠卵巢细胞/_DHFR(CH0,Urlaub 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4216(1980),包含 DG44(Urlaub 等,Som. Cell 和 Mol. Gen. , 12 :555_566 (1986))及 DP12 细胞株);小鼠赛特利(Sertoli)细胞(TM4, Mather, Biol.Reprod. ,23 =243-251(1980));猴子肾脏细胞(CVl ATCC CCL 70);非洲绿猴肾脏 细胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);人类子宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2);犬肾脏细胞 (MDCK,ATCC CCL 70);水牛鼠肝脏细胞(BRL3A, ATCC CRL 1442);人类肺脏细胞(W138, ATCC CCL 75);人类肝脏细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳房瘤细胞(MMT 060562,ATCCCCL 51) ;TRI 细胞(Mather 等,Annals N. Y. Acad. Sci.,383 :44_68 (1982)) ;MRC 5 细胞;FS4 细 胞;及人类肝肿瘤细胞株(Hep G2)。利用上述用于生产人源化vWF抗体的表达或克隆载 体而将宿主细胞转化,并于视需要而调整的传统培养基中培养,以诱发启动子、筛选转化体 (transformant)、或放大编码期望序列的基因。

[0259] 还可使用表达高水平抗体的稳定细胞株,以生产本发明的人源化抗体。例如,可 利用突变的“整合酶(integrase)(例如ACE整合酶)结合穿梭载体(shuttle vector), 以异源基因序列载入基于鼠类人工染色体表达(ACE)平台的高产量哺乳类蛋白质表达 系统中,该ACE平台已被设计成含有多个具位点特异性的重组受体位点(recombination acceptor sites) (Lindenbaum 等,(Nucl. Acid Res. 32(21) :el72(2004);美国专利申请案 第2003/0119104 Al号及第2006/0246586 Al号)。可利用此系统产生用于表达所筛选的 人源化变体及NMC-4嵌合体的稳定细胞株。

[0260] (viii)培养宿主细胞

[0261] 可将可用于生产人源化vWF抗体的宿主细胞培养于多种培养基中。商品化培养 基例如 Ham' s FlO(Sigma)、最低必需培养基(Minimal EssentialMedium, MEM(Sigma)),RPMI-1640 (Sigma)、及 Dulbecco ‘ s ModifiedEagle ‘ s Medium ((DMEM),Sigma)均适 合用来培养宿主细胞;此外,在例如:Ham等,Meth. Enz. 58 :44(1979) ;Barnes等,Anal. Biochem.,102 :255 (1980);美国专利第 4,767,704 号、第 4,657,866 号、第 4,927,762 号、第 4,560,655 号、或第 5,122,469 号;WO 1990/03430 ;WO 1987/00195 ;或美国专利第 Re. 30,985号中所述的任何培养基,皆可用作宿主细胞的培养基。可视需要以荷尔蒙和/或 其它生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白(transferrin)或表皮生长因子)、盐类(例如氯化 钠、钙、镁、及磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸)、抗 生素(例如GENTAMYCIN 药物)、微量元素(定义成通常以微莫耳范围的最终浓度存在的 无机化合物)、及葡萄糖或等量能源补充至任何这些培养基;还可包含技术人员已知的适 当浓度的任何其它必需补充料。可对所筛选的表达用宿主细胞使用各种培养条件,例如温 度、pH。

[0262] (ix)人源化vWF抗体的纯化

[0263] 当使用重组技术时,抗体可产生于胞内或间膜区域(periplasmicspace)中、或者 直接分泌至培养基内。若抗体产生于胞内,第一步可通过例如离心或超过滤而移除宿主细 胞或细胞溶解片段的微粒碎片。Carter等,Bio/Technology,10 : 163-167 (1992)描述分泌 至大肠杆菌间膜区域的抗体的分离程序;要言的,于醋酸钠(PH 3.5)、EDTA、及苯甲磺酰基 氟(phenylmethylsulfonylf luoride (PMSF))存在下将细胞糊(cell paste)解冻约 30 分 钟,可通过离心而移除细胞碎片。在抗体分泌至培养基内的情况下,通常首先浓缩来自此类 系统的上澄液,包含利用商品化蛋白质浓缩过滤器,例如AMICON或MILLIP0RE PELLIC0N超 过滤单元。可将如苯甲磺酰基氟(phenylmethylsulfonylf luoride (PMSF))的蛋白酶抑制 剂包含于前述步骤任一者中以抑制蛋白质分解(proteolysis),且可包含抗生素以防止偶 发性污染扩大。

[0264] 可利用例如氢氧磷灰石层析法(hydroxylapatite chromatography)、凝胶电泳 法、透析法、及亲和层析法而纯化出由细胞制备而来的抗体成分,其中亲和层析法为优选 的层析技术。蛋白质A作为亲和力配位体(Iigand)的适合性系取决于存在于抗体中的 任何免疫球蛋白Fc结构域的物种及同种型(isotype)。可利用蛋白质A来纯化基于人 类 Y 1> Y 2、或 Y 4 重链的抗体(Lindmark 等,J. Immunol. Meth, 62 : 1-13 (1983));可利用 蛋白质G作为小鼠抗体同种型及人类γ 3(Guss等,EMBO J.,5 : 15671575 (1986))。亲和 力配位体黏附的基质(matrix)可为洋菜糖(agarose),但还可使用其它基质。机械上稳 定的基质,例如可控孔径玻璃(controlled-pore glass)或聚(苯乙烯-二乙烯基苯) (polyktyrenedivinyl-benzene)),容许比使用洋菜糖所能达到者更快的流速及更短的 处理时间。在抗体包含CH3结构域的情形中,可将BAKERB0ND ABX 树脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.)用于纯化;还可根据待回收的抗体而使用其它的蛋白质纯化技术, 例如离子交换管柱分馏、乙醇沉淀、逆相HPLC、硅土层析(chromatography on silica)、 肝素(heparin) SEPHAR0SE层析、阳离子或阴离子交换树脂层析(例如聚天门冬胺酸 (polyasparticacid)管柱)、色层焦集(chromatofocusing)、SDS-PAGE、及硫酸铵沉淀法。

[0265] 药物制剂

[0266] 兹提供包含具有vWF特异性的人源化抗体的药物配方。可通过混合具有期 望纯度的抗体与非必须的药物上可接受的载体、赋形剂、或安定剂(Remington' s 40Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A. Ed. (1980)),而制备具有冷冻干燥配 方或水溶液形式的人源化vWF抗体的储存用配方。可接受的载体、赋形剂、或安定剂为 在所使用的剂量及浓度下对接受者不具毒性者,且其含有:缓冲剂,例如磷酸盐、柠檬酸 盐、及其它有机酸;抗氧化剂,包含抗坏血酸、甲硫胺酸(methionine);防腐剂,例如十八 烧基二甲基节基氯化铵(octadecyldimethylbenzyl ammoniumchloride)、氯化六轻季 铵(hexamethonium chloride)、轻基氯苯胺(benzalkonium chloride)、氯化苯胺松宁 (benzethonium chloride)、酷(phenol)、丁酉享(butyl alcohol)或节酉享(benzyl alcohol)、 如对羟基苯甲酸甲酯(methyl paraben)或对羟基苯甲酸丙酯(propyl paraben)的烷基 对羟基苯甲酸酯(alkyl parabens)、儿茶酚(catechol)、间苯二酚(resorcinol)、环己醇 (cyclohexanol)、3-戊醇(3-pentanol)、及间甲苯酚(m-cresol);低分量(小于约 10 个 残基)多肽;蛋白质,例如血清蛋白、白明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,例如聚乙烯四氢 吡咯酮(polyvinylpyrrolidone);氨基酸,例如甘胺酸(glycine)、麸酰胺(glutamine)、天 门冬酰胺酸(asparagine)、组胺酸(histidine)、精胺酸(arginine)或离胺酸(lysine); 单糖、双糖及其它包含葡萄糖、甘露糖(marmose)、或糊精(dextrins)的碳水化合物;螯 合剂,例如EDTA ;糖类,例如蔗糖、甘露醇(marmitol)、海藻糖(trehalose)或山梨醇 (sorbitol);盐类形成相对离子(coimter-ion),例如钠;金属错合物(例如锌-蛋白质错 合物);和/或非离子性界面活性剂,例如TWEEN、PLUR0NICS、或聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG) 0优选的冷冻干燥人源化vWF配方说明于WO 1997/04801中,其以参考数据并 入于此。

[0267] 此处的配方还可包含一种以上特定的治疗症状所必须的活性化合物,优选为 具有不会彼此产生不利影响的互补活性者;可选地,或此外,组成还可包含化疗剂、细胞 毒性剂、细胞介素(cytokine)、生长抑制剂、抗激素剂、人源化vWF药物、抗血管新生剂 (anti-angiogenic agent)、和/或保心药(cardioprotectant),此类分子适合以能够针对 需要目的发挥效用的量的组合存在。

[0268] 还可将有效成分网罗在通过例如凝块(coacervation)技术或接口聚合(例如分 别为羟甲基纤维素(hydroxymethylcellulose)或明胶-微胶囊(gelatin-microcapsule) 及聚甲基丙烯酸甲酯(poly-Onethylmethacylate))微胶囊)而在胶体药物传递系统(例 如脂质粒、卵蛋白微球体、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)或巨乳液中加以制备的微胶囊 内。此类技术公开于 Remington' s Pharmaceutical Sciences (第 16 版,由 Oslo,Α.所 编着(1980))的专书中。

[0269] 可制备持续释放(sustained-release)制剂。持续释放制剂的例子包括含有 抗体的固态疏水性聚合物的半透性基质,其中基质用成型物品的形式存在,例如薄膜或 微胶囊。持续释放基质的例子包含聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或 聚乙烯醇)、聚乳酸交酯(polylactide)(美国专利第3,773,919号)、L-麸胺酸及-乙 基-L-麸胺酸的共聚物、非可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、可降解的乳酸__甘醇酸 (lacticacid-glycolic acid)共聚物(例如LUPRON DEPO(由乳酸__甘醇酸共聚物及柳菩 林(leuprolide acetate)所组成的可注射微球体)及聚_D_(-) _3_羟丁酸)。

[0270] 待用于活体内(in vivo)服用的配方必须为无菌,此系透过经由无菌过滤膜的过 滤加以完成。[0271] 利用人源化vWF抗体的治疗

[0272] 可利用人源化vWF抗体或其结合片段来治疗各种的vWF相关疾病或紊乱,例示的 疾病或病症包含血栓性疾病或紊乱。血栓性疾病或紊乱可包含心血管疾病或例如缺血性卒 中的脑血管疾病。在某些实施方案中,心血管疾病可为动脉粥状硬化症、再狭窄、心绞痛、急 性心肌梗塞、急性冠状动脉综合症、或与糖尿病相关联的心血管异常;在某些实施方案中, 血栓性疾病或紊乱为血管发炎、静脉血栓、镰刀形细胞病、异种移植排斥、外周血管病、血栓 性血小板减少性紫癜症、囊性纤维化、血管性痴呆、雷诺病、类风湿性关节炎、或糖尿病;在 某些实施方案中,脑血管疾病包含由大脑动脉梗塞及小腔隙梗塞两者所引起的缺血性卒中 以及血管性痴呆。还可利用人源化vWF抗体来预防再发性中风或由脑血管发炎所引发的中 风起始。在急性冠状动脉综合症的情况中,人源化vWF抗体或其结合片段尤其适合用来治 疗ST段(ST-segment)诊断的受试者;还可将人源化vWF抗体或其结合片段用于术后治疗, 以预防血块形成。

[0273] 再者,可利用体内诊断测定法来评估vWF的过表达或扩增,例如通过施用结合待 测分子且以可检测的标记(例如放射性同位素)加以标记的分子(例如抗体),并在外部扫 描病患以定位该标签。

[0274] 在某些实施方案中,可将包含与细胞毒性物质缀合的人源化vWF抗体的免疫 缀合物给予病患;优选免疫缀合物和/或其结合的人源化vWF抗体被细胞内化,从而提 升了免疫缀合物在杀死其所结合的癌细胞上的治疗效用。在一优选实施方案中,细胞 毒性物质(包含例如美登醇(maytansinoid)、卡奇霉素、核糖核酸酶及DNA内切酶)靶 定或干扰癌细胞内的核酸;在另一实施方案中,细胞毒性物质(例如紫杉烷(taxane) 或埃博霉素(印othilone))可靶定或干扰癌细胞内的微管及依赖微管的有丝分裂 (microtubule-dependent mitosis)0

[0275] 可根据已知的方法,例如以团注方式或通过一段时间内的连续式输注的静脉内施 用,通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入等途径, 将人源化vWF抗体或免疫缀合物施用于病患。抗体的静脉内、腹膜内、或皮下给药为优选; 特别优选腹膜内或皮下途径。优选的给药计划可为针对急性疾病单一剂量,而针对慢性疾 病则约每三至四周一次,取决于接受治疗的特定哺乳动物、抗体类型、及行医者熟知的其它 因素;然而,此处可采用其它的给药计划。

[0276] 可将其它治疗方针结合人源化vWF抗体的施用方式。结合的给药方式包含同时用 药(co-administration)、利用各自制剂或单一药物制剂、及以任一次序连续给药,其中优 选两种(或全部)活性剂同时展现其生物活性的时段。

[0277] 在一实施方案中,治疗方式可包括人源化抗vWF抗体与纤维蛋白溶解剂 (fibrinolytic agent)和/或抗血小板剂的结合施用,纤维蛋白溶解剂的例子如阿替普酶 (alt印Iase)、去氨普酶(desmot印Iase)或微纤微蛋白溶酶(microplasmin),抗血小板剂 的例子如用于治疗由心肌梗塞或脑梗塞或其它脑血管异常所诱发的局部缺血的阿司匹林、 双嘧达莫(dipyridamol)或氯吡格雷(clopidogrel)。

[0278] 还可期望结合人源化vWF抗体的施用及针对另一肿瘤相关抗原的抗体的施用。

[0279] 在一实施方案中,本发明的治疗方式涉及人源化vWF抗体、哺乳动物中的免疫功 能的一个或多个调节剂(例如细胞因子)、以及化疗剂或生长抑制剂的组合给药,包括不同

42化疗剂的鸡尾酒疗法的组合用药;优选的化疗剂包含紫杉烷(例如帕尼特西(paclitaxel) 及多西紫杉醇(docetaxel))和/或蒽环抗生素。可根据生产厂的用法说明或由熟悉的行医 者依经验判定,而使用此类化疗剂的制剂及剂量计划;此类化疗剂的制剂及剂量计划还说 明于 Chemotherapy Service,编,Μ· C. Perry,Williams & ffilkins,Baltimore,Md. (1992)。

[0280] 可以已知剂量的抗激素化合物,将人源化vWF抗体与此类分子相结合。抗 激素化合物的例子包含:例如他莫昔芬(tamoxifen)的抗雌激素化合物或例如阿那 曲唑(anastrozole)的芳香族酶抑制剂;例如奥那司酮(onapristone)的抗黄体 酮(anti-progesterone)(见 EP 616 812);或例如氟他胺(flutamide)的抗雄性素 (anti-androgen)。若欲治疗的癌症为非激素依赖性的,病患先前可能已接受过抗激素疗 法,且在癌症变成非激素依赖性之后,可对病患施用人源化vWF抗体(及如此处所述的其它 非必须剂方)。

[0281] 就疾病的预防或治疗而言,抗体的适当剂量将取决于如上定义的待治疗疾病的类 型、疾病的严重性及病程(不论施用抗体系为预防或治疗的目的)、先前的治疗、病患的临 床病史与对抗体的反应、及主治医师的判断。可将抗体一次或在一系列治疗中适当地对病 患施用。根据疾病的类型与严重性以及抗体的清除速率,对病患施用的起始候选剂量为约 1 μ g/kg〜15mg/kg (例如0. l_20mg/kg)的抗体,不论例如通过一次或多次的分别给药或 通过连续输注。一般的日剂量范围可自约1 μ g/kg〜100mg/kg或以上,依据上述的因子而 定。根据状况,为了若干天或更久的重复给药,可持续治疗至产生疾病症状的期望抑制效果 为止。

[0282] 人源化vWF抗体的优选剂量可在自约0. 05mg/kg〜约10mg/kg的范围内,因此,可 对病患施用约 0. 3mg/kg、0. 5mg/kg、2. 0mg/kg、4. 0mg/kg、或 lOmg/kg(或其组合)的一个或 多个的剂量。可间歇性地施用此剂量,例如每周、每两周、每三周或每四周(例如使病患接 受自约2至约20 (如6)剂量的人源化vWF抗体);可在开始时施用较高起始剂量(loading dose),接着施用一次或多次较低剂量。例示性的剂量方案包含施用人源化vWF抗体或其结 合片段约4mg/kg的起始剂量,接着维持每周约2mg/kg的剂量;然而,还可使用其它剂量方 案。此种疗法的进行可通过传统技术及方法加以监测。

[0283] 在评估如此处所述的人源化vWF抗体或其结合片段在狒狒上的有效性及安全性 的研究中,已出人意表地发现此种抗体可以极低的剂量(例如在低μ g/kg的范围内)有效 地预防(例如降低、减轻、或改善)体内的血小板凝集,此为治疗vWF介导的疾病或紊乱的 未预期且前所未有的结果。在这些浓度下,皆未观察到出血的临床症状,除了小伤口的出血 增加以外(例如在切口出血测试中所测量到的模板出血时间延长和/或出血量);甚至更 令人惊讶的是,在自EDiqq的约1至250倍的剂量下,还未观察到明显的临床出血迹象,尽管 有观察到小伤口的出血增加。因此,如此处所述的人源化vWF抗体或其结合片段似乎可有 效地治疗人类的vWF介导的疾病或紊乱。

[0284] 因此,可以范围自约0.001至约100mg/kg的治疗有效量,将如此处所述的人源 化vWF抗体或其结合片段施用于一受试者(优选为人类);优选的治疗有效量范围为自约 0. 002至约20mg/kg,更优选自约0. 002至约10mg/kg,特别是自约0. 002至约0. 4mg/kg、更 特别自约0. 005至约0. 2mg/kg,最优选是施用受试者自约0. 01至约0. lmg/kg的治疗有效 量,优选的受试者为人类。可以一或多个有效治疗剂量,将治疗有效量人源化vWF抗体或其结合片段施用于一受试者,所施用的有效治疗剂量通常不足以引发明显的临床出血迹象, 但却足以抑制血小板凝集;换言之,可施用有效治疗剂量而不会引发明显的临床出血迹象 (例如不会产生出血的临床症状,除了小伤口的出血增加以外)。

[0285] 可以范围自约0. 002至约0. 4mg/kg或特别为自约0. 005至约0. 2mg/kg、更特别为 自约0. 01至约0. lmg/kg的治疗有效量,将如此处所述的人源化VWF抗体或其结合片段施 用于一受试者(优选为人类),以在受试者上产生治疗效果(例如减少血栓形成)。

[0286] 可以范围自EDiqq的约1至250倍、优选为自EDltltl的约1至200倍、更优选自EDltltl 的约1至100倍的治疗有效量,施用如此处所述的人源化VWF抗体或其结合片段,而不致引 发明显的临床出血迹象(例如不会产生出血的临床症状,除了小伤口的出血增加以外)。可 以单一或多个亚剂量(sub-dose),将如此处所述的治疗有效量人源化vWF抗体或其结合片 段施用至受试者。优选使用静脉注射方式施用上述有效治疗剂量。在透过皮下途径的给药 中,优选的给药总量可在经由静脉注射的给药量的约1至3倍的范围内,优选为约2倍。

[0287] 出血的临床症状可参考由Serebruany及Atar所述(American Journalof Cardiology, 2007,卷99,册2,15,01,2007,页288-290)并加以应用至动物模型的 BleedScore分级,已将BleedScore具体地开发成可就出血的类型计分,出血的类型系抗血 小板疗法的特征。BleedScore基于根据出血的严重性来分派点数至临床发现(finding) 上,通过加总所有发现的点数,便可获得所产生的分数。出血症状依渐增的严重性被分成三 类:1)表浅(supreficial)出血(每事件1得分点数);2)内部(internal)出血(每事件3 得分点数);3)警示性(alarming)出血或以上的组合(每事件6得分点数),此方法在判定 并记述与现代抗血小板及抗血栓疗法相关联的缓和至中等的出血事件时尤其有用,同时还 说明了最严重的出血并发症。表浅出血包含下列准则:容易瘀血(bruising)、小伤口的出 血(例如延长的模板出血时间)、出血点(petechia)、瘀斑(ecchymosis);内部出血包含下 列准则:血肿(hematoma)、流鼻血(印istaxis)、来自口腔或阴道的失血、黑粪症(melena)、 眼睛出血、血尿症(hematuria)、吐血(hematemesis);警示性出血包含下列准则:需要输血 (transfusion)、卢页内出il (intracranial)

[0288] 在通过监测血液流经动脉所测量的动脉创伤的动物模型中,血小板凝集的抑制 (抑制血小板凝集或足以抑制血小板凝集)可表示所施用的治疗有效量足以抑制闭塞性血 栓形成于人为损伤的动脉中。一种以定量方式决定体内血小板凝集抑制的方法为透过在动 脉创伤模型中的循环流减缩量(cyclic flow reductions,CFR)的测量,如此,例如,血小板 凝集的抑制可表示所施用的治疗有效量足以减少动物中的CFR的数目。

[0289] 治疗有效量或有效量可指可有效地改善或预防症状、或延长所治疗受试者的存活 时间的剂量,而判定治疗有效量在技术人员的能力范围内,特别是根据此处所提供的详细 公开内容。如此处所述的治疗有效量包含可有效地治疗受试者的vWF介导的疾病或紊乱的 vWF抗体量;vWF抗体的治疗有效量包含治疗或抑制血小板凝集(例如在主动脉、末梢动脉、 小动脉、静脉的血栓形成过程中)所需要的用量。

[0290] 有效治疗剂量或有效剂量可指可有效地改善或预防症状、或延长所治疗受试者的 存活时间的剂量。如此处所述的有效治疗剂量包含可有效地治疗受试者的vWF介导的疾病 或紊乱的vWF抗体量;如此处所述的有效治疗剂量包含治疗或抑制血小板凝集(例如在主 动脉、末梢动脉、小动脉、静脉的血栓形成过程中)的剂量。有效治疗剂量包含ED·,其为足

44以将如同由血管中的血流减少量所测量的血栓形成降低约100%的有效剂量;如此处所述 的EDiqq包含足以在30分钟的时间内将由血管中的血流减少量降至零的vWF抗体量。有效 治疗剂量包含能够减少如同由血管中的血流减少量、或由测量血小板凝集减少量的适当离 体测试加以测量的血栓形成的剂量,例如至少足以减少约15%,优选为减少至少30%,更 优选为减少至少50%,最优选为减少至少80%,特别是减少至少100%的血栓形成。

[0291] 可选地,可将人源化vWF抗体连续地或结合放射性治疗(例如照射或引进放射性 物质,像是参照 UICC(编),Klinische Onkologie, Springer-Verlag(1982)中所述而适当 地施用。

[0292] 如此,本发明更提供具有冯维勒布兰德氏因子(vWF)特异性的人类抗体或其结合 片段,其可以范围自EDltltl的约1至约250倍的治疗有效量来施用,而不致引发明显的临床 出血迹象。优选人类抗体或其结合片段具有人类vWF的Al结构域的特异性,具有vWF特异 性的人类抗体或其结合片段更优选地为具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段。

[0293] 制剂

[0294] 在本发明的另一实施方案中,提供了包含可用于治疗上述疾病的材料的制剂(例 如人源化vWF抗体)。制剂可包含容器及在容器上或与容器相关联的标签(label)或包装 说明书;适当的容器包含例如瓶子、小玻璃瓶(vial)、或注射器。容器可由多种材料形成, 例如玻璃或塑料;容器盛装了可有效地治疗疾病的组合物,且可具有无菌的接取口(例如 容器可为点滴液袋(intravenous solution bag)或者具有可被皮下注射针刺穿的瓶塞的 小玻璃瓶)。在该组合物中的至少一活性剂可为此处所述的人源化vWF抗体,标签或包装说 明书可指出可使用该组合物来治疗特定的疾病,例如癌症。在一实施方案中,标签或包装说 明书可指出可使用包含人源化vWF抗体的该组合物来治疗vWF相关的疾病。

[0295] 再者,制剂可包含:(a)其中含有组合物的第一容器,其中该组合物包含此处的人 源化抗体;及(b)其中含有组合物的第二容器,其中该组合物包含除了人源化抗体以外的 治疗剂。在本发明的此实施方案中的制剂还可包含指出可组合使用第一及第二组合物以治 疗vWF相关疾病或紊乱的包装说明书,此治疗剂可为前面段落中所述的任何附加疗法(例 如血栓溶解剂、抗血小板剂、化疗剂、抗血管生成剂、抗激素化合物、保心药、和/或哺乳动 物中的免疫功能调节剂,包含细胞因子)。可选地,或此外,制剂还可包含第二(或第三) 容器,其具有可药用的缓冲剂,例如注射用的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲的盐水、林格溶液 (Ringer' s solution)及葡萄糖液;其还可包含其它由商业及使用者立场看来为合宜的材 料,包含其它缓冲液、稀释液、过滤器、注射针、及注射器。

[0296] 人源化vWF抗体的非治疗性用途

[0297] 人源化vWF抗体及其结合片段具有其他的非治疗性应用。举例而言,可将抗体作 为亲合力纯化剂;在此程序中,可利用本领域中已知的方法,将抗体固定化在固相上,例如 SEPHADEX™树脂或滤纸。可使固定化抗体与含有待纯化的人源化vWF蛋白质(或其片段)相 接触,之后,可以实质上将移除样本中除了人源化vWF蛋白质(其可结合至固定化抗体)以 外的所有物质的适当溶剂来洗涤支持物(support)。最后,可以另一适当溶剂(例如pH5.0 的甘氨酸缓冲液)来洗涤支持物,此溶剂将人源化vWF蛋白质与抗体脱离。

[0298] 人源化vWF抗体还可用于人类vWF蛋白质的诊断测定上,例如检测特殊细胞、组 织、或血清内的表达。就诊断应用而言,可以可检测部分来标记抗体。有一般可归类成下列种类的多种标签可使用:

[0299] (a)放射性同位素,例如35S、14C、125I、3H、及1311。举例而言,可利用Current Protocols in Immunology,卷 1&2, Coligen 等,编 WiIey-Interscience, New York, N. Y.,Pubs. (1991)中所述的技术用放射性同位素来标记抗体,例如,可利用闪烁计数法 (scintillationcounting)来测量放射性。

[0300] (b)可使用荧光标签例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或荧光素(fluorescein)及其 衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹磺酰基(dansyl)、丽丝胺(Lissamine)、藻红蛋 白(phycoerthrin)及德克萨其Jf红。可禾1J用例如 Current Protocols in Immunology,同上 中所公开的技术,将荧光标记缀合至抗体;可利用荧光计来定量荧光标记。

[0301] (c)可使用各种的酶-底物标记(例如见美国专利第4,275,149号),这些酶 通常催化可利用各种技术加以测量的显色底物的化学变化作用。例如,酶可催化底物中 的颜色变化,其可以分光光度测定方式加以测量;可选地,酶可以改变荧光性或化学发光 (chemiluminescence),定量荧光变化的技术如上所述。化学发光底物可通过化学反应电子 激发,且其接着可发出可被测量的光(例如用化学发光光度计)或供给能量至荧光受体。酶 标记的例子包含荧光素酶(luciferases,例如萤火虫荧光素酶及细菌荧光素酶;美国专利 第 4,737,456 号)、荧光素(Iuciferin)、邻苯二甲腈(2, 3-dihydrophthalazinediones)、 苹果酸脱S酶(malatedehydrogenase)、尿素酶(urease)、过氧化酶(peroxidase,例如辣 根过氧化物酶(horseradish peroxidase) (HRPO))、碱性磷酸酶(alkalin印hosphatase)、 β -半乳糖苷酶(β -galactosidase)、葡糖淀粉酶(glucoamylase)、溶菌酶(lysozyme)、糖 类氧化酶(saccharide oxidases)(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、及葡萄糖_6_磷酸 脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶(uricase)及黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase))、乳 过氧化酶(Iactoperoxidase)、及微过氧化酶(microperoxidase)。将酶缀合至抗体的技术 说明于O' SulIivan"Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzymelmmunoassay, "Methods in Enzym.(编,J. Langone & H. Van Vunaki s), Academic Press, New York,73 :147-166(1981)。

[0302] 酶-底物组合的例子包含:

[0303] (i)以过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶(HRPO),其中过氧化氢酶氧化染料 前体(例如邻苯二胺(orthophenylene diamine)或3,3,,5,5,-四甲基联苯胺盐酸盐(3, 3,,5, 5,-tetramethyl benzidine hydrochloride (TMB)));

[0304] (ii)以对硝苯磷酸盐(para-nitrophenyl phosphate)为显色底物的碱性磷酸盐 (AP) •’及

[0305] (iii)具有显色底物(例如对硝苯-β-D-半乳糖酶)或荧光底物4-甲基伞形 酮-β-D-半乳糖苷酶(4-methylumbelliferyl-^-D-galactosidase)的 β _D_ 半乳糖苷 酶(β -D-Gal)。

[0306] 技术人员可使用多种其它酶-底物组合(见例如美国专利第4,275,149号及第 4,318,980 号)。

[0307] 有时可使标记间接地缀合至抗体,技术人员应知达成此目的的各种技术。举例而 言,可使抗体与生物素(biotin)缀合,且可将上述三大范围的任一标记与抗生物素蛋白 (avidin)缀合,反之亦然。生物素选择性地与抗生物素蛋白结合,故可以此间接方式将标记与抗体相缀合;可选地,为达到标记与抗体的间接缀合,可将抗体与小型半抗原(hapten) (例如地高辛(digoxin))缀合,且可将上述不同种类标记其中之一与抗半抗原抗体(例如 抗地高辛抗体)相缀合。如此,可完成标记与抗体的间接缀合。

[0308] 在本发明的另一实施方案中,人源化vWF抗体不需要被加上标记,且其存在可利 用结合至人源化vWF抗体的标记抗体加以检测。

[0309] 可将本发明的抗体使用于任何已知的测定方法中,例如竞争性结合测定、直接及 间接夹心式测定(sandwich assays)、及免疫沉淀(immunoprecipitation)测定,见Zola, Monoclonal Antibodies :A Manualof Techniques,页 147-158 (CRC Press, Inc.1987)。

[0310] 就免疫组织化学而言,肿瘤样本可为新鲜或冷冻或经埋置于石蜡中并以例如福尔 马林的防腐剂加以固定。

[0311] 还可将抗体用于体内的诊断测定上。一般而言,可以放射性核素(radionuclide) (例如mIn,99Tc,14C,mI,125I,3H,32P或35S)将抗体加上标记,使例如可利用免疫闪烁成像 (immunoscintigraphy)而将月中瘤定位。

[0312] 为方便,本发明的抗体可以试剂盒的形式来提供(例如预定量的试剂与用以施行 诊断测定的使用说明书的套装式组合)。若为抗体用酶来标记的情况,试剂盒可包含酶所需 要的底物及辅因子(cofactor),例如提供可检测的发色团或荧光团的底物前体;此外,可 包含其它添加剂,例如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液(block buffer)或细胞溶解缓冲 液(Iysisbuffer))等。可大范围地改变各种试剂的相对量,以提供溶液中实质上将测定的 灵敏度最优选化的试剂浓度;尤其,试剂可以干粉末(通常为冷冻干燥)的形式加以提供, 包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。

[0313] 人源化vWF抗体还可用于体内成像,其中可将标记抗体施用于宿主(优选为 血流),并测定宿主中标记抗体的存在及位置;此成像技术可适用于血管栓塞的定位 (localization)或肿瘤的分级及治疗上。抗体可以用在宿主中可检测到的任何部分适当 地标记,包括例如可由如核磁共振或其它本领域中已知的装置加以检测的非放射性指示 齐ϋ。然而,优选标记可为放射性标记,包括碘(例如125I及131D、硒、双功能螯合剂、铜(例如 67Cu)、锝(例如99mTc)、及铼(例如186Re及188Re)等。可通过任何方法将放射性同位素缀合 至蛋白质,包括例如金属螯合化合物或乳过氧化酶、或碘化(iodination)用的iodogen技 术。

[0314] 材料的保藏:

[0315] 下列材料已经保藏于德国不伦瑞克(Braunschweig)的国家菌种保存中心 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)):

[0316] (1)2008年1月23日保藏于DSMZ、登记号为DSM 21059的微生物(大肠杆菌), 其包含载体GS264,而GS264包含具有编码人源化NMC-4变体H9L9IgG4轻链的核酸序列 的分离核酸;(2) 2008年1月23日保藏于DSMZ、登记号为DSM 21060的微生物(大肠杆 菌),其包含载体GS265,而GS265包含具有编码人源化NMC-4变体H9L9IgG4重链的核酸 序列的分离核酸。此等保藏皆基于微生物有机体保藏专利程序的国际认可布达佩斯协议 (International Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurpose of Patent Procedure)及其(布达佩斯协议)下的规定而为。

[0317] 在无进一步说明之下,人们相信:在此领域中普通技术人员使用前述说明及下列例示性实施例,可生产并利用本发明的试剂且实施权利要求的方法。提供下列工作实施例 以辅助本发明的实施,且其不应被解释为限制性。

实施例

[0318] 实施例1 :嵌合抗体的建构

[0319] 产生NMC-4-人类Fc的嵌合体:包含来自鼠类抗体NMC-4的可变区及人类Fc区的 嵌合抗体用下述方式加以建构。在一例示方法中,是利用抗vWF抗体NMC-4(例如具有已被 公开的可变区氨基酸序列的IgGl κ )作为模板来产生NMC-4的VH及VL区的合成基因序列 (Celikel 等,1997,BloodCells,Molecules 和 Diseases 23 :123_134)。举例而言,NMC-4 的 VH及VL所用的合成基因序列通过采用Celikel等中所述的氨基酸序列及利用VECTOR NTI 软件产生对应的核苷酸序列而产生。

[0320] 表1用来产生NMC-4嵌合表达质粒的引物(primers)

[0321]

48

[0322] 在一例示方法中,是利用Accuprime PFX DNA聚合酶试剂盒(Invitrogen)来进行 PCR反应;例如,组合包含下列的50 μ 1反应混合物(mix) =IXPFX缓冲液、0. 2 μ M dNTP混 合物、1单位的PFX聚合酶、ΙμΜ正向引物、IyM反向引物及IOOng的DNA模板。标准的PCR 程序包含:在94°C下开始进行变性(denaturation)持续1分钟,接着以每一循环为94°C持 续30秒、55°C持续30秒、68°C持续1分钟进行30个循环,以及在68°C下持续10分钟的最 后延长(extension)步骤。以在0. 8% TAE胶上的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物,切除一条 或多条的期望大小的条带,并以Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。室温下,在包含1 XT4DNA连接酶(Iigase)缓冲液(NEB)、0. 5 μ 1 Τ4 DNA 连接酶(NEB)及各 DNA IOOng 的 10 μ 1 体积 中,连接(Iigate)DNA片段持续30分钟;接着,利用1 μ 1的连接反应物来转化JM109大肠 杆菌细胞,且通过利用贝克曼(Beckman)CEQ 8000DNA分析仪加以测序,以验证PCR所产生 的插入物(inserts)。

[0323] 此等包含来自鼠类抗体NMC-4的VH和/或VL以及人类Fc的嵌合抗体,是根据本 领域中已知的标准规则(protocol)利用PCR加以合成。在一例示方法中,通过以NMC-4专 用的引物及人类Fc专用的引物,将来自NMC-4的VH和/或VL融合至人类Fe。

[0324] 任选地,将氨基酸取代(例如突变)引入IgGlFc区,以破坏Fc及补体结合位点 (complement binding sites)而消除假设由野生型Y 1 Fc恒定区介导的细胞毒性(见 例如 SEQ ID NO : 143)。例如,衍生自 I. M. A. G. E. cDNA 克隆 #4764579 (ATCC) (SEQ ID NO : 33)人类 IgGl 恒定区(如 Fe)是利用引物 hIgG-F(SEQ ID NO :36) ^P HIgG-R (SEQ ID NO: 37)(表1)加以扩增。通过进行例如定点突变(site directed mutagenesis) (Duncan& Winter ;Nature. 332(6166) :738_40 (1988)),将氨基酸取代(例如 L235E (FcR 结合区)及 E318A,K320A,K332A(在Clq补体结合位点))引入IgGl Fc区。举例而言,利用引物对 hFc-L235E-F(SEQ ID NO :39)及 hFc_L235E_R(SEQ ID NO :40)将 L235E 突变引入恒定区; 利用引物对 CH2-Clq(-)_F(SEQ ID NO :41)及 CH2_Clq(-)-R) (SEQ ID NO :42)(表 1)引入 补体位点突变(complement site mutations)。利用两外部引物 hlgG-F (SEQ ID NO :36) 及IgGl-BamHI-R(SEQ ID NO :38)来连结包含四种突变的合成的PCR产物,以产生编码修饰 IgGl Fc 区(称为 IgGl (dm))的 PCR 产物。

[0325] 在一例示方法中,通过本领域中已知的重组技术而将NMC-4的重链可变区融合 至修饰IgGl Fc区(例如IgGl (dm))。例如,利用在NMC-VH的N端上游引入EcoRI克隆 位点的引物匪C-VH-EcoRI-F (SEQ ID NO :34)及匪C-VH-IgGl-R(SEQ ID N0:35),扩增编 码NMC-4的重链可变区(SEQ IDNO=I)的核苷酸序列;简言之,通过两步骤的重组PCR,可 使PCR产物与重链恒定区(例如IgGl (dm))连接,首先利用引物对NMC-VH-EcoRI-F(SEQID NO :34)和 HIgG-R (SEQ ID NO :37),接着利用引物对匪C-VH-EcoRI_F(SEQ ID NO :34)及 IgGl-BamHI-R(SEQ ID NO :38)进行 PCR 反应。以 EcoRI 及 BamHtI 来消化(digest)最终 的 PCR 产物,并将 PCR 产物克隆至 pIRES2-EGFP-IgK 载体(Clontech,Palo Alto, CA)的 EcoRI及BamHI位点中,该载体经过修饰成包含被克隆至XhoI及EcoRI位点的Ig κ先导 序歹Ij (METDTLLLWVLLLWVPGSTGD) (SEQ ID NO :107))(由 SEQ ID NO :140 的多核苷酸加以编 码)。

[0326] 在一例示方法中,通过如下所述的重组技术而将NMC-4的轻链可变区融合至修 饰IgGl Fc区(例如IgGl (dm))。例如,利用在IgK轻链恒定区的3’端更进一步引入 BamHI 限制位点的引物 κ -F(SEQ ID NO :47)及 κ -BamHI-R(SEQ ID N0:48),扩增来自由 I. Μ. A. G. E 克隆 #4704496 (ATCC) (SEQ ID NO : 108)所制成的 DNA 中的 Ig κ 轻链恒定区(例 如 κ Cl (SEQ ID NO :141));同理,利用在 5,端引入 EcoRI 位点的引物 NMC-VL-EcoRI-F (SEQ IDNO :45)及NMC-VL-κ-R (SEQ ID NO :46)(表1),扩增来自合成VL基因的轻链可变区;接 着,利用引物匪C-VL-EcoRI-F (SEQ ID NO :45)及 κ -BamHI-R (SEQ ID NO :48),以重组 PCR 来连结NMC-4可变区及κ Cl片段。以EcoRI及BamHI来分解最终的PCR产物,并将其克隆 至pIRES2-DsRed2-Ig κ载体中的相同位点。[0327] 相较于表达轻链小鼠-人类嵌合体的pIRES-DsRed质粒,在pIRES2_EGFP载体中 的重链的表达水平可能较低,尽管对于轻链及重链两者皆使用相同的IgK先导序列。因 此,为改善重链的表达水平,利用引物对4-59前导-HindIII-NMC-4(SEQ ID NO :43)和 IgGl-BamHI-R(SEQ ID NO :38)并以 pIRES2-EGFP-WC4_IgG(mut)载体作为模板(表 1),以 来自人类种系4-59VH的前导序列(MKHLWFFLLLVAAPRWVLS) (SEQ ID NO :109)取代Ig κ前导 序列;片段则以HindIII及PmeI加以消化,并亚克隆至pcDNA6-cMyc_A载体(Invitrogen, Carlsbad, CA) Hindi 11 及 PmeI 的位点。

[0328] AJW200参考抗体的建构:AJW200为针对vWF的Al结构域的另一抗体,其具有阻 断vWF Al结构域与GPIb α之间的相互作用的能力。AJW200参考抗体通过改造美国专利 第6,228,360中所述的VH及VL序列,以包含例如改善表达用的额外功能性Kozak序列而 产生。举例而言,合成的AJW200VH基因是利用引物Hind III-Ko-AJff-F (SEQ ID NO :49)和 HuFab-H-R(SEQ IDNO :50)(表2)加以扩增,并将其克隆至包含人类IgGl (dm)重链恒定区 的以HindIII-ApaI消化的pcDNA6-cMyc_A载体的HindIII及ApaI位点中(以取代匪C-4 的 VH);而 AJW200VL 是利用引物对 XhoI-Ko-AJW-F (SEQ ID NO :51)及 κ -BamHI-R(SEQ ID NO :48)加以扩增,并将其亚克隆至带有NMC-4轻链嵌合体的pIRES-DsRed载体的XhoI及 BamHI位点中(藉以取代NMC-4的VL)。

[0329] 表2用以产生AJW200表达质粒的引物

[0330]

[0331] 抗体生产:嵌合抗体可通过本领域中已知的任何方法加以产生。在一例示方法中, HEK239F 细胞在 120rpm,37°C,8% CO2 的摇瓶中以 Freestyle293 表达培养基(Invitrogen) 来培养,细胞在IOOxg下离心沉淀,悬浮于30ml的Freestyle 293表达培养基中,并施以涡 旋(vortexed)达20秒,以得到单细胞悬浮液。计算细胞数目,且以3. 3 X IO8细胞接种于含 有总体积330ml的Freestyle 293表达培养基的2L摇瓶中。转染混合物是由等量的DNA/ OptiMEM (例如165 μ g的HC表达质粒、165 μ g的LC表达质粒、及室温OptiMEM (Invitrogen) 至总体积 Ilml)及 293fectin/0ptiMEM(例如 433 μ 1 的 293fectin (Invitrogen)及室温 OptiMEM(Invitrogen)至总体积11ml)所组成。将DNA混合物添加至293fectin混合物中, 接着加以混合并在室温下培养20分钟,且将其添加至含有293F细胞的现存培养基中;以 37°C,8% CO2,120rpm的振荡速率培养细胞。于转染后72小时时,在IOOxg下离心悬浮液5 分钟,以使细胞沉淀;利用0. 2 μ m滤膜过滤含Mab (单克隆抗体)上清液,且利用蛋白质-A 亲和柱纯化的。

[0332] 将来自瞬时转染HEK-293F细胞的少量条件培养基(CM)施用于已以PBS来平衡的 0. 3ml 蛋白质-A SEPHAR0SE 滴注柱(drip column),以 IOml PBS 清洗柱并以 0. 1M, pH 2. 7的甘氨酸洗脱蛋白质。将Iml的级分收集至0. Iml的1M,pH 8. 0 Tris-HCl,而大部分 抗体会在前两个洗脱级分中洗脱;利用例如Vivaspin 0. 5ml离心装置,合并浓缩此两级分 至最终体积(例如0. 2-0. 3ml)。在此浓缩步骤期间,利用PBS进行中间稀释,以将缓冲液 由Tris-甘氨酸换成PBS。利用透过例如0. 2 μ m注射器式滤器的过滤而使最终浓缩液无菌 化,并利用劳里(Lowry)蛋白质测定法(BioRad DC蛋白质测定法)来决定含抗体样本的蛋 白质浓度。

[0333] 就大规模纯化而言,以超过滤在中空纤维柱(例如AmershamBiosciences 30,000NMWC/290cm2的中空纤维柱UFP-30-C-3X2MA)上浓缩来自瞬时转染粘附细胞(例如 HEK-293T)的2L条件培养基,直至体积降至〜200ml为止。将此浓缩物质(或用于较小型 转染,则为纯CM)抽取通过已利用0. ΙΜ,ρΗ 8.0的Tris-HCl加以平衡的12m 1蛋白质A的 SEPHAR0SE柱,再以0. 1M,pH 8. 0的Tris-HCl清洗柱,直至UV280的读数确立基线为止。以 0. ΙΜ,ρΗ 2. 7的甘氨酸洗脱抗体并收集3ml的级分,通过加入0. ΙΜ,ρΗ 8. 0的Tris-HCl至 0. IM的最终浓度来调整含峰蛋白质(peakprotein)的级分的pH值;集合峰级分,通过超过 滤(例如在Amicon Ultral5ml离心装置上)将其浓缩至小于7ml的体积,接着利用在PD-10 柱上(Amersham Biosciences/GE-Healthcare)的两独立进程进行去盐化至PBS中。

[0334] 通过本领域中已知的方法(例如劳里(Lowry)蛋白质测定法(BioRadDC蛋白 质测定法)),定量并分析得自于培养上清液的蛋白质。在一例示方法中,用SDS-PAGE分 析培养上清液;简言之,将蛋白质转移至硝酸纤维素膜,在室温下以5%牛奶/PBS阻断持 续1小时,并与缀合有HRP的小鼠抗人类IgG(例如γ -链特异性(Y -chain specific), 1 : 10,000)及小鼠抗人类 κ (例如 κ -链特异性,1 : 1,000) (Southern Biotech, Cat#9042-05 和 #9220-05,Birmingham, AL) 一起培养,以 ECL 试剂盒检测讯号。

[0335] 在瑞斯特霉素诱导血小板凝集测定中的体内抑制活性:在一例示方法中,测试嵌 合NMC-4人类Fc抗体的活性,包括例如对于vWF的结合特异性。举例而言,血小板凝集测 定用标准血小板凝集测定仪(aggregometer) (Bio/Data, model PAP-4)、利用冷冻干燥的 人类血小板(Bio/Data,Horsham PA)来进行。简言之,将50 μ 1的瑞斯特霉素(例如原液 (stock)浓度=15mg/mL) (Bio/Data)及48. 5 μ 1的TBS或测试抗体添加至在400 μ 1体积 中含有1 X IO8个冷冻干燥血小板的试管内,在将1. 5 μ 1的纯化vWF (例如终浓度1. 5 μ g/ mL)加入至试管以启动凝集反应前10秒,记录基线读数。估算测试抗体的EC5tl值,其为抑 制50%血小板凝集的浓度;与亲本单克隆抗体相较,嵌合体表达出等同于亲本鼠类NMC-4 抗体的效力。

[0336] 再者,为更精确地判定EC5tl值,利用例如改自微孔板(microplate)法的读板器 法来测定嵌合抗体。在一例示方法中,利用96孔COSTAR 3603板添加每孔150ml TBS (pH 7. 5)中包含4. 5X IO7个经低聚甲醛固定的血小板,并添加纯化人类vWF(Calbi0Chem,San Diego, CA)至每孔1.5 μ g/mL的最终浓度。添加一连串浓度的测试抗体后,加入瑞斯特霉 素至每孔1. 5mg/mL的最终浓度,以启动凝集反应,并利用设定于37°C下持续6分钟、而读 取循环之间有20秒机载振荡(on-board shaking)的SPECTRAMAXPLUS读板器(Molecular Devices)监测浊度(例如在405nm下的吸收度)。加入(例如20 μ 1/孔)抑制剂化合物 或参考MAb (例如AVW-3),培养且监测该混合物达2分钟。最后,加入瑞斯特霉素或美洲予

52头蝮毒蛋白(botrocetin)(例如20 μ 1/孔)培养且监测该混合物达40分钟。监测吸收度 减少的程度(例如吸收度)作为凝集讯号。

[0337] 比较NMC-4-人类Fc嵌合体与原始NMC-4单克隆抗体、以及所克隆的AJW200抗 体。如图1所示,在瑞斯特霉素诱导血小板凝集测定中,NMC-4嵌合体在活性方面类似于原 始匪C-4MAb,且略优于AJW200,其EC5tl值分别为0. 1,0. 17,及0. 27nM。

[0338] 实施例2 :人源化抗体的构建

[0339] 人类受体构架的筛选:可利用数据库(例如人类种系数据库、V区数据库(V base)、或卡巴(Kabat)数据库)或公开发表物(例如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1992)来识别鼠类重链及轻链V区所属的亚科(subfamily), 并判定最适的人类种系构架,以用作受体分子。其中可利用此等亚科内的VH及VL序列作 为受体序列的筛选,可基于序列同源性和/或CDRl及CDR2区的规范结构的匹配性,以帮助 保持六个CDR在移植后的适当相对呈递。

[0340] 举例而言,假定识别出NMC-4VL构架与κ亚科1 (VKl)的成员之间具有良好同源 性,则使用人类V区数据库表示NMC-4的κ轻链属于κ 1亚科。观察到:种系序列018 (SEQ ID NO :5)具有⑶R环的规范结构的最高同源性及最佳保存性,就上至⑶R3的全部序列而 言,其具有78%的序列同一性(sequence identy);就框架区而言,其具有84%的序列同一 性。NMC-4轻链、人类轻链018(SEQ ID NO :5)、及AAK94808 (得自于018的成熟抗体,用来提 供IXDR3及构架4序列,以与此区中的NMC-4相比较)(SEQ IDNO :6)的比对(alignment)显 示于表3中,NMC-4与人类抗体之间的差异用粗体字表示(编号是基于卡巴记数制(Kabat, 1978))。

[0341 ] 同样地,使用人类V区数据库指出直至构架3的VH序列落在VH亚科IV中。在人 类VH的IV亚科内,NMC-4VH显示与4_59种系序列(SEQ ID NO :3)具有最高序列同源性, 就直至⑶R3的整个VH而言,其展现对鼠类VH 56%的序列同一性;单就框架区而言,则展 现67%的同一性(表4)。在不受限于本发明的理论下,选择AAC18165. 1(SEQ ID NO :4)以 提供HCDR3及构架4比较序列(comparator sequence),因为其在构架1至3与HCDRl及 HCDR2中具有与人类种系4-59VH相同的氨基酸序列。已知HCDR3为高度分歧的,且FW4为 取自于独立基因产物(J)的不同结构域,于是HCDR3及构架4并未被包含在人类V区数据 库的VH种系序列中。在表4中,将NMC-4VH与AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)序列之间的氨基 酸差异以粗体字、其位置加星号以强调。

[0342] 表3NMC-4VL与人类抗体AAK94808的比对,后者具有与人类种系VL,018相同的氨 基酸构架、⑶Rl及⑶R2序列

[0343]

53名称 FWl CDRl FW2

—. — — —------ i —---——申 ~ — — — 2 — * ι ■ — — — * ^― — — — 1 1 “— — - * * * — ^― *

卡巴号: 1 2345678901234567890123 45678901234 56789012 3456789 NMC-4 VL

(SEQ ID NO: 2) DIOMTOSPSSLSASLGDRVTISC SASQDlNKYLN WYQQKPDGAVKLLIF

018 (ΛΛΚ948ΰ8)

iSEO ID NO: 6) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY 名称 FW 3 CDR 3 FW4

卡巴号: 78901 234567890123456789012345678 901234567 8901 234567 NMC-4 VL GVPSRFSC.SGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYC QQYEKLPWT FGGGTKLEVK 018(ΑΛΚ94808) GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQYDNLPLT FGGGTKVEIK

[0344] 表4NMC-4VH与人类抗体AAC18165. 1的比对,后者具有与人类种系4_59相同的构 架、⑶Rl及⑶R2氨基酸序列

[0345]

名称 FWl CDRl FW2 CDR 2

----本------1—水—Jj4 Jjs—;J4------* 一 ψ 3 样 一 4: ^c 一 ^c—4-------中 一 5 _ * 氺尔----木 一 5 * *---

卡巴号: 1234567890123456789012345 6789012 345 67890123456789 0123456789012 345

NMC-4 VH

(SEQ ID NO: 1) QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVDWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKS

4-59(ACC18165. 1)

(SEQ ID NO: 4) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKS 名称 FW 3 CDR 3 FW4

—*本一7*—*—***一—♦ 9—泽—*一·— ———一一11 ——

卡巴号: 6789012 3456789012abc3456789 01234 567890abcdef 12 34567890123 NMC-4 VH RLSITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCVR DPADYGNYDYALDY WGQGTSVTVSS 4-59(ΑΛ€18165. 1) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GYRPGVAAHSPFDY WGQGTLVTVSS

[0346] 由于假设来自小鼠抗体的⑶R直接移植至人类抗体构架造成了抗原结合亲和力 的损失(Foote 和 Winter J. Mol. Biol. 224 :487-499 (1992) ;Xiang 等,J Mol Biol. 253 : 385-90(1995) ;Homes 等,J. Immunol. 167 :296_301 (2001)),故可能期望使构架中的某些残 基突变回到在该等位置上的小鼠残基,此程序称为回复突变(back-mutation)。例如,表5 显示可能影响CDR构象且可能为回复突变至鼠类残基的潜力候选者的残基(例如以斜粗体 字来强调NMC-4与人类构架之间在这些位置上的氨基酸差异)。

[0347] 表5影响⑶R的构象的构架残基;比较NMC-4及人类受体可变区

[0348]

CDR 2

$氺一* 一冰*

0123456 YTSSLHS DASNLET

[0349]

[0350] 已识别出可能涉及重链及轻链的配对以协调⑶R呈递的氨基酸残基(Holmes等, J Immunol. 167 :296-301 (2001)),且其可能为回复突变的候选者。在不受限于本发明的理 论下,VL区内的残基44,96及98被认为具有重要性,尚有来自残基34,36,38,46,87,89及 91的额外贡献。在这些残基中,关于VL区的NMC-4与受体018之间唯一有显著不同为残基 44,其在NMC-4VL中为缬氨酸(valine),而在人类018构架中为脯胺酸(proline)。在不受 限于本发明的理论下,就VH而言,残基45及103具有重要性,残基35,37,39,47,91,93及 95还对VH与VL的界面堆积(interface packing)有贡献。在NMC-4及受体4-59构架的 这些界面残基中,唯一差异仅在残基93,其中存在NMC-4中的缬氨酸相较于4-59中的丙氨 酸的保守差异(表5)。

[0351] 比较鼠类及人类种系4-59VH序列的构架序列可得知:在假设对⑶R呈递及界面堆 积重要的残基中,许多差异群集在构架3中(残基67,71,73,78,93),额外的差异则在构架 2中的残基37及48 ;这些残基在原型(prototype)人源化序列中为回复突变的推定候选 者。然而,两构架2残基(37V vs 371及48L vs 481)的差异具保守性,因此,第一原型VH 序列可集中于构架3区中的差异,且载有下列由人类至小鼠的回复突变:¥671^,¥711(373队 F78V及A93V (表6)。合成基因是由Retrogen (加州圣地亚哥)定制合成且被表示为H2,并 被克隆入细菌载体pRSFDuet (Novagen,威斯康星州麦迪逊)的NheI及XhoI位点,且被用 作以4-59-hu匪C-F (SEQID NO : 54)和Hu-VH-R (SEQ ID NO : 55)引物来扩增插入物的模板 (表7及9)。以ApaI来消化所合成的片段,以HindIII及ApaI来消化包含在实施例1中 所产生的NMC-4嵌合重链的质粒pcDNA6-NMC-HC,且在NTP存在下以克列诺夫片段(Klenow fragment)对含有pcDNA-IgGldm片段的DNA片段进行钝端处理。将含VH的PCR产物缀合 至经钝端处理的pcDNA-IgGldm片段,接着利用质粒DNA来转化大肠杆菌宿主菌株JM 109。 利用贝克曼(Beckman) CEQ 8000DNA测序仪来测序各自克隆(clones),以识别出以正确位 向表达插入物且具有正确序列的克隆(克隆pcDNA-huVH-IgGldm)。利用此载体作为H4,H5,H6,H7及H8变体的模板,此等变体被用来评估单独地将各残基回复成人类残基的效果(总 结于表6中)。利用表7中所述的引物对(对应序列显示于表9)来构建这些变体。

[0352] 表6对不同VL及VH变体,并入种系4_59及018种系受体序列的构架残基突变

[0353]

[0354] 表7用来构建人源化重链变体的模板及引物总结

[0355]

[0356]

[0357] 比较假设可影响规范结构及界面堆积的残基可知:在NMC-4VL与018人类VL受 体构架之间有三处差异(例如残基44,49,及71),因此,可设计出带有三个至鼠类残基的 回复突变(例如P44V,Y49F,及F71Y)的原型人源化变体L5 ;此外,此变体被设计成具有由 苯丙氨酸改变成亮氨酸(leucine)的残基73,因为在人类抗体谱中,亮氨酸为在此位置上 更常见的残基。为产生此变体,便定制合成称为VL4、带有构架变化(例如Y49F,F71Y,及 F73V)的变体(Regrogen),并利用表8所列的引物对将其克隆入pETDuet载体内。以所得的 L4-pETDuet载体作为模板,利用表8所列的引物对引进L5的P44V突变;接着将L5变体亚 克隆入pIRES DsRed2载体的EcoRI及BamHI位点,以取代鼠类NMC-4VL ;接着利用L5_pIRES DsRed载体作为模板,利用表8所列的引物对来产生L6及L7载体。

[0358] 表8用来构建人源化轻链变体的模板及引物总结

[0359]

[0360]

[0361] 表9用来构建各种的可变区的引物序列

[0362]

[0364] 平行于克隆这些第一组变体,利用在BLAST搜索中经识别为具有上至HCDR3的 所有序列的最高序列同一性(88% )及框架区的89%序列同一性的lDNO.pdb结构(例 如2. 3埃分辨率),建立计算机产生的4-59受体种系序列的三维模型。选择结构1A0K.Pdb作为具有81%序列同一性的人源化VH序列的模板。可利用鼠类NMC-4FV的两结晶 结构:lA0K.pdb (例如2. 2人分辨率),其已结合抗原(Celikel等,Nat. Struct. Biol. 5 : 189-194 (1998))且还被选为在原型人源化变体的VH结构域中的最佳适配;及1FNS. Pdb (2. O A分辨率),已结合至突变抗原。1A0K. pdb及1FNS. pdb两者具有实质上相同的 VH/VL界面角(interface angle),故将1A0K. pdb用于重迭人类受体的模型及人源化VH及 VL序列的模型。

[0365] 当重迭NMC-4VH及4-59的骨架结构时,可观察到三区差异。第一,差异存在于残 基H27至H33,其包含HCDRl的一部分。不受限于本发明的理论,这些残基接触共同形成抗 原结合位点的一部分的HCDR2及HCDR3。预测残基34(在鼠类NMC-4VH中为Val,在4_59 序列中为Trp)可能为H27-33环的构象改变的原因,且因此为回复突变的候选者。第二,差 异存在于残基H52至H55,其形成⑶R2环的一部分。认为构架残基71 (小鼠中的Lys,4_59 中的Val)可能与此差异有关,且因此为回复突变的候选者。在4-59结构中的三额外残基 被识别出可能阻碍抗原结合:H37,相较于小鼠中的Val,其为IIe的保守性变化;H73(相较 于小鼠中的Asp,其代表4-59中的和缓变化Thr);及H78,相较于小鼠中的Val,其代表4_59 中的较大变化Phe。第三,差异存在于CDR3中,可预期其中的多样性。

[0366] 对于种系018及原型人源化抗体VL结构域的模拟,结构1IGM. pdb (例如2. 3人 分辨率)与018具有优异的序列同一性(例如95% ),有四处差异在残基L34,L45,L47, 及L92。选择OlBJl.pdb (例如2. 4 A分辨率)作为原型人源化VL的模板,因为其可匹配 97/107残基(例如91%序列同一性)。

[0367] NMC-4的VL骨架及018VL结构的良好适配性符合序列同一性,唯一明显的结构差 异在由残基L39-L45所组成的环中,其接触VH且因此影响堆积接着影响结合口袋(binding pocket)的形状。不受限于本发明的理论,残基44(例如小鼠中的Val、4-59中的Pro)可能 为此差异的原因,因此基于计算机模拟而可能为回复突变的候选者。

[0368] 在瑞斯特霉素诱导血小板凝集测定中的体外(in vitro)抑制活性:为测试计算 机模拟预测是否可准确地预测在活性上的效应,将VH2原型变体与VL变体(例如L4,5,6 及7)配对,且将原型L5与VH变体(例如H2,H4,H5,H6,H7及H8)组合。通过HEK293T细 胞的瞬时转染来产生抗体变体,并如同针对实施方案1中的NMC-4嵌合抗体所述,将其由经 过滤的培养上清液中纯化出来。

[0369] 瑞斯特霉素诱导血小板凝集测定是利用如实施例1中所述的冷冻干燥血小板加 以施行。针对抗体(一式两份)的一连串稀释液,利用Spectromax读板器(Molecular Devices)测量吸收度的变化、并利用Prism软件来分析数据,以判定各种的纯化抗体变体 的EC50值(见例如表9)。

[0370] 人源化抗体的第一型(由H2及L5所组成)展现与亲本嵌合体(例如EC5。为 0. 18nM)相同的活性(例如EC5tl为0. 13)(表10),接着测试具有回复至人类构架残基的连 续点突变的重链变体(例如变体H2-H6)。变体展现极相似的活性,除了显示出低1. 5倍的 EC5_L5-H8变体以外(表9)。有趣的是,此变体的产率不高(例如其它变体的1/10),此 显示人源化重链与轻链之间的相互作用应该已受到此突变组合的负面影响,因为抗体的稳 定性取决于重链及轻链的正确组装。同理,生产并测试L5变体抗体,同样地,回复至人类的变化似乎不影响活性,此出人意表地显示着:不需要改变构架。这些结果显示:本预期会产 生问题的受体构架与NMC-4可变区构架之间的差异,包括被认为引起由计算机模拟所观察 到的结构差异的最显著差异、包括被视为诱导最大的构象差异的差异(例如VH的V71K及 T73N与VL的P44V),在效力上完全无影响。以这些结果作为前提,构建带有完全人类构架 的重链变体(例如H9),其代表简单的⑶R-移植VH。测试此变体、以及组合轻链变体、代表 将移植至完全人类构架上的简单⑶R的额外变体L9。出人意表地,直接(straight)⑶R-移 植的抗体保留了完整的活性(EC5tl为0. OSnM ;表10)。出乎意料之外,这些资料说明:直接 由鼠类抗体将CDR移植至所选择的人类构架上,保留了原始鼠类抗体的完整活性,即使所 公开的数据显示多个CDR对抗原结合起作用(Celikel等,Blood Cells Mol Dis. 23:123; Celikel等,Nat. Struct Biol 5 :189),因此,预期在6个CDR的相对呈递中的任何微扰皆 会影响亲和力。

[0371 ] 表10在瑞斯特霉素诱导血小板凝集测定中,亲本NMC-4嵌合抗体相较于人源化变 体的EC5tl值比较

[0372]

[0373] 人源化⑶R区:分子模拟显示:在NMC-4IXDR1 (例如残基24,30及31)及 NMC-4HCDR1 (例如残基27,29,30及34)中,可容忍经改造成人源化轻链及重链的⑶Rl的 额外变化;此外,还认为在HCDR2序列中的两残基(例如61及62)代表可容忍的变化(例 如残基61的Ser至Pro及残基62的Ala至Ser)。因此,一连串所谓的“超级人源化”变体 (Tan等,2002J Immunol. 169 :1119_1125)便由如表12中所列的模板及引物对(例如代表 具有完全人类IXDRl的变体的LlO ;部分代表人源化HCDRl区的H12及H13 (表11))构建 出来。

[0374] 表11改变鼠类⑶R残基至其4-59对应物的突变[0375]

超^lA源化 超MA源化VH (鼠类至又类) VL (鼠类至人类)

[0376]

[0377] 在一例示方法中,通过施行一个或多个的测定来测试计算机模拟预测,以判定人 源化抗体的活性。举例而言,H9与Lll变体共转染,且在瑞斯特霉素诱导血小板凝集测定 中测试抗体。如表14所示,可容忍引入三处变异以将IXDRl转化成完全为018的IXDRl,且 不致引发效力上的明显损失。当H12,13,及14变体与L9组合时,H12-L9变体抗体在效力 上显示出略有损失;但额外V34W突变恢复了完全的效力,且加入S61P及A62S突变在效力 上几无影响,此表示这些残基可在不影响活性的情况下被转化成4-59序列。其次,IXDR2在 维持vWF阻断活性上的重要性,通过构建LlO链的变体加以评价,在该LlO链的变体中,整 个LCDR2 (YTSSLHS) (SEQID NO :11)皆利用编码VL变体LlO的质粒作为模板及表11及12 中所列的引物对,而由人类种系018 IXDR2 (DASNLET) (SEQ ID NO : 118)加以取代。接着将 此新构建的变体Lll与H14配对,以产生抗体变体L11-H14。虽然此变体仍展现nM级效力, 但相较于嵌合体,血小板凝集测试中,其活性却降低10倍(EC5tl为1. 63ηΜ),此说明LCDR2可 能为人源化抗体达到最佳活性所不可或缺。

[0378] 表12如何构建“超级人源化”变体的总结

[0379]

[0382] 接着,剩余鼠类残基(例如H31,H33,及H35)在变体H14的人源化HCDRl中的重要 性,通过将这些残基改变至其在VH种系4-59序列中的人类对应部分(例如D31S,G33Y,及 D35S)检测。所得的构建体,H15相较于H14中的部分人源化序列GGSISDYGWD(SEQ ID NO: 111),具有HCDRl 的序列 GGSISSYYWS(SEQ ID NO :110);最后,将H15 的整个HCDR2转化成VH 4-59 中的人类对应部分(由 MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO :8)至 YIYYSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO :119),总计7个残基有差异),以建立另一具有完全的人类HCDRl及HCDR2的变体 H16。变体H15及H16各自与轻链变体LlO配对,以分别产生抗体变体H15-L10及H16-L10。

[0383] 以血小板凝集测定法评价这些变体,以判定其活性。表14中所示的数据显示:以 人类序列取代整个HCDRl破坏了抗vWF活性。此显示着HCDRl中剩余的三残基(例如在位置H31上的D、在位置H33上的G、及在位置H35上的D)对于保留活性而言具有重要性,即 使这些残基可能不会直接接触抗原,如同由Celikel,等(Nat. Struct Biol 5 :189)提出的 晶体结构所指示。

[0384] 表14 “超级人源化”变体的EC5tl值

[0385]

[0386] 实施例3 :抗体的同种型的重构(reformat)

[0387] 在一例示方法中,由于IgGl为关于补体(complement)活化及引发效应子应答 的活性同种型,可能期望将VH变体由突变的IgGl形式重构成IgG4形式,尽管IgG4相对 而言较不具活性。例如,将候选VH变体由突变的IgGl形式转化成IgG4形式(见例如 SEQ ID NO :144),以产生研发用的候选者;此外,重新改造轻链及重链开放阅读框架(open readingframes),以并入5,端(例如XhoI及HindIII位点)及3,端(例如BamHI及NotI 位点)上的限制核酸内切酶位点,以辅助将其亚克隆至表达载体PST0518的多重克隆位点, 而用于下游细胞系发展及大规模抗体生产(表15)。

[0388] 举例而言,通过以I gG4恒定区取代IgGl恒定区,并在重链表达盒(cassette) 的5,端上引入XhoI及BamHI位点、而在3,端上引入HindIII及NotI位点,将两人源化 VH变体H9及H14转化成IgG4形式。IgGl及IgG4两者在靠近可变区及恒定区的接合处 皆包含自然生成的ApaI位点,此位点被用来在IgG4(取代在IgGl)中克隆。将BamHI及 NotI限制位点置放于序列的3’端上,以辅助稍后至PST0518载体内的亚克隆。利用Blue HeronBiotechnology (Bothell,WA),定制化合成具有加入BamHI及NotI位点、由ApaI位点至终止密码子(termination codon)的内含子缺失(intron-deleted)的IgG4恒定区序列。 再者,通过以被改造成在重链可变区的5’端包含HindIII及XhoI且插入IgK信号序列的 引物进行重叠PCR(overlapping PCR),将pST0518载体中的信号序列变成IgK前导序列。

[0389] H9及H14重链序列有相同的引物区,因此两者均使用相同的引物及克隆策略。 产生两独立的PCR产物,各包含在huNMC4-H9 (及huNMC4_Hl 4)重链可变区中所必须的 变化其中之一。利用PlRESdsRed-HULlO作为模板以及引物IgKLF(SEQ ID N0:100)及 IgKHnmcR(SEQ ID NO :101)(见表15a及15b),进行在正向引物上包含XhoI及HindIII限 制位点且扩增IgK信号肽的PCR反应,接着进行利用ρ⑶NA6-H9(或ρ⑶NA6-H14)作为模 板以及引物 14VHF(SEQ ID NO : 102)及 14VHR(SEQ ID NO : 103)、并与第一 PCR 反应重叠 30 个核苷酸的第二反应步骤。PCR产物包含H9(或H14)可变区以及IgGl恒定区经过ApaI 位点的前五个氨基酸;恒定区的前五个氨基酸在IgGl与IgG4之间并无不同。该反应在 ApaI位点之后加入NotI位点,以辅助在插入IgG4恒定区之前的可变区的克隆。通过第 三PCR步骤(利用前两步骤的反应产物作为模板、第一反应之正向引物(IgKLF)、及第二 反应的反向引物(14VHR)),在上游加入κ前导区;以XhoI/NotI消化来自此反应的产物, 并将其插入以相似方式消化的质粒骨架PCIneo中,此连接(ligation)产生了克隆中间体 pCI-WC4-VH9var (或 pCI-WC4_VH14var),其含有 Ig κ 前导区及 NMC4-H9 (或 Η14)的可变 区。以ApaI及NotI消化来自于Blue Heron Biotechnology且含有重新(denovo)合成的 IgG4恒定区的质粒,以凝胶纯化(gel-purified) Ikb的IgG4恒定区片段并连接入ApaI/ NotI 消化的 pCI-NMC4-VH9var (或 pCI-WC4_VH14var)),如此便产生了 pCI_NMC4_VH9 及 PCI-NMC4-VH14。在转化成DH5 α细胞后,对来自各自克隆的质粒插入物进行测序以确认其 为正确。

[0390] 表15a用于重链PCR反应中的引物

[0391]

[0392] 表15b用于重链构建的PCR反应

[0393]

66

[0394] L9及LlO轻链中的变化通过PCR来完成。由于L9及LlO轻链有相同的引物区,因 此两者均使用相同的引物及克隆策略。每一轻链产生两独立的PCR模板。第一 PCR步骤并入 在5’端上的XhoI及HindIII限制位点;第二反应步骤与第一反应步骤重叠30个核苷酸,且 在片段的3’端并入BamHI及NotI位点,此两独立的重叠PCR产物在第三PCR反应中被用作 模板,以通过利用来自第一 PCR步骤的正向引物及来自第二步骤的反向引物将其扩增,而 产生包含这些变化的最终重叠PCR产物;来自第三PCR反应的产物以XhoI/NotI加以消化, 并将其插入于以类似方式消化的质粒pCI-neo (Invitrogen)中,产生质粒pCI-NMC4_VL9及 PCI-NMC4-VL10 (用于轻链构建的例示引物及策略见表16a及16b)。

[0395] 表16a用于轻链PCR反应中的引物

[0396]

[0397] 表16b用于轻链构建的PCR反应

[0398]

[0399] H9-L9及H14-L10的IgG4同种型是由以上在实施例1中所述的HEK293T细胞而产 生,且利用蛋白质A亲和层析法加以纯化;接着以vWF介导的血小板凝集测定法来测试纯化抗体,以判定相对效力。如表17所示,转化至IgG4同种型对效力不生影响。

[0400] 表17前导抗vWF IgGl及IgG4变体的瑞斯特霉素诱导血小板凝集活性的比较

[0401]

[0402] 实施例4 :抗体至vWF或Al结构域的结合

[0403] 克隆His标记(His-tagged)的Al结构域抗原:不受限于本发明的理论,假设 NMC-4结合至vWF的Al结构域,此一般仅在vWF被活化时(例如在高剪切情况下)方可达 到。另一方法,可能期望表达vWF的分离Al结构域,其被揭示可以等于完全活化vWF者的 效力结合GPIb-α (Celikel等,1997),因此,克隆Al结构域以作为微孔结合研究的底物。 包含全长人类vWF cDNA的质粒克隆是购自于ATCC (目录编号67122),vWF Al结构域(例 如残基 499-729)是利用引物 vWF-Al-For(5,-CCCAGGAATTCCTCGGAACCGCGTTGCAC-3,) (SEQ ID NO: 112)及 vWF-Al-Rev(5,-CCGATGCGGCCGCTCACCTCTTGGGCCC CAG-3,)(SEQ ID NO: 113)而自此克隆加以扩增。将PCR产物以凝胶纯化、再以EcoRI及NotI消化,并将其克隆 入pETDuet-Ι载体内。将所连接成的产物转化成DH5 α感受态细胞(competent cell),以 产生Al结构域的氧化形式。

[0404] 为构建表达大鼠Al结构域的质粒,遵循产品生产商的说明(MolecularResearch Center, Inc.,Cat#DN127, Cincinnati, Ohio),利用DNAzol试剂由大鼠肝脏分离出大鼠染 色体 DNA ;接着,利用引物 Rat-vWF-Al-F(5,-AGCGAATTCCCCCGAACCCCCCCTGCAC AACTTC-3,) (SEQ ID NO: 114)及 Rat_vWF_Al-R(5,-AGTGCGGCCGCTTATCACCTTTTGGGTCCTGGTGATGAAACC-3,)(SEQ ID NO :115),将染色体DNA用于PCR反应。将PCR产物以EcoRI及NotI加以消 化,并克隆入pETDuct-Ι载体的相同位点中;将所连接成的产物转化入DH5 α感受态细胞。

[0405] 以25ml的过夜细菌培养物(例如带有质粒p35 [pET-Duet-Rat-A或 p36 [pET-Duet-human-A 的 Origami B 菌株),接种含有抗生素羧苄西林(Carbencillin)、 卡那霉素、四环素的1公升细菌培养基(LB或2XYT),使培养液在37°C下的摇瓶中生长至 OD600为0. 6-0. 8。通过加入IPTG至ImM的最终浓度来诱导重组蛋白质的表达;接着,在37°C 下继续培养培养液持续另外4-5小时;之后在JA-IO转子(贝克曼)中以6000rpm离心, 收集细菌。将细胞沉淀物(cell pellet)于-80°C下冷冻,或立即通过使沉淀物在含有两 片溶解的完全蛋白酶抑制剂(Roche)的20ml PBS中重新悬浮加以处理,对所得的细胞悬浮 液在冰块上施行两次2分钟的细胞破裂循环(例如使用在1-2的固定负载循环设定及输出 控制设定下、配备着微量滴管尖头(micro-tip)的Branson Sonifier 250)。在4°C下,以 16000rpm于JA-20转子(贝克曼)中离心这些细胞溶解产物(cell lysate)持续30分钟;以0. 45 μ m的针头过滤器过滤上清液,之后利用已在结合缓冲液(5mM的咪唑,0. 3M NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 8.0)中平衡过且填充着His-Select HF镍亲和性凝胶(Sigma)的柱, 以将流速调整于lml/min的注射泵来施行层析法。在以20ml的结合缓冲液冲洗柱后,以 250mM的咪唑,0. 3M NaCl, 50mM Tris-HCl,pH 8.0洗脱蛋白质,并收集Iml的级分;大多数 蛋白质在前4个洗脱馏分内便被洗脱。在经考马斯(Coomassie)蓝染色的SDS-聚丙烯酰 胺凝胶(polyacrylamide gel)上监测蛋白质的大小(〜28kD)及完整性。集合峰级分,若 有必要则将其浓缩至2. 5ml,接着利用PD-10柱(Amersham/GE-Healthcare)去盐化成PBS。 利用劳里(Lowry)蛋白质测定法(BioRad DC蛋白质测定法)来决定蛋白质浓度。

[0406] 结合动力学:施行敏感性测定以评估K。n、K。ff及&数值,从而合成并纯化铕(m 螯合剂)抗体缀合物。利用解离增强型镧荧光免疫测定法(DELFIA),测量这些以铕标记的 NMC-4嵌合体及同种型对照抗体至固定化Al抗原的结合。

[0407] 举例而言,以铕标记对照抗体(例如同种型对照组M0PC-21,来自人类骨髓瘤的 IgGl/κ ;Sigma-Aldrich, St Louis M0)及NMC-4嵌合体;简言之,将抗体加入经无菌过滤 处理的磷酸钠缓冲液(96mM,pH 7. 4),并广泛地透析成磷酸盐缓冲液(PBS,1. 47mM KH2PO4, 8. ImM Na2HPO4,pH 7. 4,138mM NaCl 及 2. 67mM KCl),以移除低分子量一级胺。在 4°C下,以 9500rpm (7000 X g)的JA-20转子在洗过的MicroS印浓缩器中浓缩经透析的抗体持续20分 钟,以含有最终浓度为IOOmM NaHCO3, pH 9. 3的PBS调整抗体至4. Omg/ml。通过以温和地上 下吸液,将mAb/碳酸氢盐(bicarbonate)混合物(0. 250ml)混合至含有以Eu3+(Eu-N1_ITC ; Perkin Elmer LifeSciences, Waltham MA)螯合的 0. 2mg Nl-(对异硫氰苄基)-二亚乙基 三胺-N1,N2,N3,N3-四乙酸(Ni-(p-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriamine-N1, N2, N3, N3-tetra acetic acid)中,使抗体及胺反应性螯合剂的混合物在4°C、不搅拌的情况下 反应过夜。

[0408] 将经标记的抗体混合物上样至以PBS预平衡的独立NAP-10柱(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ),利用作为柱缓冲液的PBS收集级分(例如0. 5ml); 利用SpectraMax 384吸收度读板器测定样本的总蛋白质(例如布莱德福试剂 (Bradford reagent) ;Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA);于 DELFIA 增 强 溶液(Perkin-Elmer)中以1 : 10,000稀释之后,通过利用Victor2多标记读板器 (Perkin-Elmer)的时间分辨荧光法(time-resolved fluorescence, TRF)测定铕。集合 对蛋白质及铕两者皆为阳性反应的级分,并将其上样至以电泳缓冲液(Running Buffer) (50mM Tris,pH 7. 4和138mM NaCl)预平衡的新NAP-10柱;集合来自这些柱的对蛋白质及 以铕标记两者皆为阳性反应的级分,并将其上样至以电泳缓冲液预平衡的PD-10柱,集合 对蛋白质及以铕标记两者皆为阳性反应的级分,并通过铕标准液(Perkin-Elmer)加以校 正的TRF来测定总蛋白质及铕含量。接着计算荧光:蛋白质比例。

[0409] 以来自人类(例如在100μ 1/孔中,30mM Tris,pH 7· 4及300mMNaCl或不含二价 阳离子的PBS中的25ng)或大鼠(例如50ng/孔)的vffF的His-Al结构域包被Immulon-4 板的孔,4°C下隔夜培养。在室温下,用清洗缓冲液(Wash Buffer,例如50mM HEPES,pH 7.4, 150mM NaCl,0. 5% Tween-20)清洗反应盘三次,利用以300 μ 1/孔阻断缓冲液(例如含有 3. 0mg/ml的无IgG的BSA及0. 叠氮化钠的清洗缓冲液)阻断1小时,且在使用前以清 洗缓冲液清洗5次。

69[0410] 如下施行平衡结合测定。将铕_抗体预先稀释入结合缓冲液(例如含有100 μ g/ ml的无IgG的BSA及0. 叠氮化钠的清洗缓冲液)中并上样至96孔板的各孔(例如 10 μ 1/孔),以SEALPLATE膜密封住反应盘。振荡反应盘(例如在室温下彡15秒或者60 秒,将Titer Plate Shaker速率设定在4),将其置入含有湿纸巾的Nalgene盒内,于37°C 下在封闭盒中培养2小时。就游离标记的测量而言,将上清液样本(4.0μ1)由含有结合混 合物的各孔转移至含有DELFIA增强溶液(ΙΟΟμΙ/孔)之一平行孔组中。为评估被结合 的抗体,以清洗缓冲液清洗具有剩余结合混合物的Al包被的孔五次,在纸巾上轻拍干,且 将DELFIA增强溶液(100 μ 1/孔)加入至空孔以测量被结合的抗体。就测定校正而言,将 DELFIA增强溶液(ΙΟΟμΙ/孔)加入未用孔并加入铕标准液(Ι.ΟμΙ/孔)。振荡反应盘 (例如在室温下将TiterPlate Shaker速率设定在5持续10分钟),利用Victor2多标记读 板器(Perkin-Elmer ffallac, Boston, MA)读取时间分辨荧光(TRF)强度,通过各自抗体的 荧光:蛋白质比例(F : P)而将结合情形就铕螯合物含量加以归一化。通过将总结合(例 如Eu-NMC-4的结合)扣除非特定结合(例如以Eu标记的同种型对照组的平均结合)计算 特定结合。以Scatchard (1949)法计算结合位点的数目及Kd值,通过将1 Og (「/ (/?~;7)) 对游离Eu-NMC-4浓度的对数作图以绘制出希尔图来估算结合状况,其中η为每孔的高亲和 性结合位点的数目,「为每孔的特异结合Eu-NMC-4mAb的平均数,且游离Eu-NMC-4嵌合体则 由溶液相中所测量的TRF读数加以计算。

[0411] 此分析揭示出两类结合位点:Kd为0. 37nm的高亲和性位点及Kd为5nM的低亲和 性位点;同理,对来自抗His mAb所捕获的大鼠vWF的His_rAl的结合还展现出具有0. 19 及3· 4nM的Kd值(表17)的两类结合位点。

[0412] 利用相同规则决定结合动力学,除了在不同时点以指示浓度(100μ 1/孔)的以铕 标记的抗体代替清洗缓冲液以外。立即封住反应盘、振荡(例如在室温下将Titer Plate Shaker速率设定在4持续15秒)、且在37°C下培养持续一段指定时间;以清洗缓冲液清 洗含有结合混合物的反应盘五次,在纸巾上轻拍干,记录每一反应盘的清洗时间。如上所 述,将DELFIA增强溶液(ΙΟΟμΙ/孔)添加空孔中以测量结合标记。通过利用Prism软件 (GraphPad Software Inc.,San Diego, CA)以下列方程式来对时间拟合特异结合,测量每 一抗体浓度的表观结合速率(apparent on-rate)k。n,app。

[0413] B = Bmm-(l_e-k。一.')

[0414] 将表观结合速率(k。n,app)对Eu-mAb浓度作图,数据用线性方程式拟合:

[0415] k。n,app = k。n[mAb]+koff

[0416] 其中结合速率常数k。n为拟合出的斜率,[mAb]为Eu-NMC-4的浓度,而解离速率k。ff 则为拟合出的截距。

[0417] 所计算出的与来自人类或大鼠vWF的His-Al结合的NMC-4嵌合体的解离半衰期 通过下列方程式加以计算:

_ In(2)

[0418] '\'2.dis.wc =T

Κ»ΰ

[0419] Eu-NMC-4至人类或大鼠vWF的His-Al的特异结合符合单指数结合方程式,由此 式可获得关于每一标记抗体的浓度的表观结合速率k。n, app(例如来自指数结合曲线拟合的常数k)。如k。n,app对Eu-NMC-4浓度的图式中所示:对两抗原的表观结合速率皆为剂量依赖 型的。结果整理于表17中,且揭示出NMC-4嵌合体对于人类Al结构域具有0. 32士0. 07nM 的Kd值,而对于大鼠Al结构域则具有0. 28士0. OlnM的Kd值。在两情况中,这些结果与由 平衡结合所测定的Kd值极为一致。这些结果还显示:两Al物种的抗原-抗体复合物皆可 长久存在,人类及大鼠抗原的体外解离半衰期则分别为44及69分钟。 [0420] 表18 Eu-NMC-4嵌合体与来自人类及大鼠vWF的His-Al结构域的动力及平衡结 合(37°C下)

[0423] tk。n app_t剂量依赖的截距

[0424] t tEU-NMC-4与直接包被的抗原(人vs.大鼠)的结合的Kd,对T检测的显著性为 不具统计学显著性(P = ο. 6892)。

[0425] 误差以SEM表示。

[0426] 可施行竞争结合研究以判定Ki值(例如抗原的相对亲合力的量度)。除了在此案 例中以外,如上所述施行结合动力的测定,施用80μ 1/孔的结合缓冲液(例如含有100μ g/ ml的无IgG的BSA及0. 1 %叠氮化钠的清洗缓冲液),接着施用10 μ 1/孔Eu-NMC-4或无铕 标记的竞争剂及10 μ 1/孔的无标记竞争抗体,范围自10_12Μ至10_7Μ的连续稀释一式两份; 以铕标记的抗体的最终浓度为为ΙΟΟρΜ。在螯合剂DTPA(1 μ Μ)存在下,非特异背景结合的 水平大幅降低,故此也包含在竞争结合测定中;此外,通过已利用碘乙酰基(iodoacetyl) 凝胶以从蛋白质制备液中移除任何还原的Al而加以纯化的His-Al令各孔的包被最优化。 培养混合物达3. 75小时,以使反应达到完全平衡,清洗并如上述以TRF判定结合的标记抗 体。利用Prism软件(GraphPad,Inc.),以“一位点竞争”模型拟合出抑制曲线以获得IC5tl 值;并利用由平衡结合实验的Scatchard分析所测量的Kd值,以Cheng & Prusoff (1973 Biochem Pharm. 22 :3099)的方程式计算&。

[0427] 通过比较由无标记的NMC-4嵌合体的同源竞争所获得的Ki值,与Eu-NMC-4结合 至抗原所测量到的亲和力(Kd),来说明竞争结合测定的标准化。就对人类His-Al的同源竞 争而言,NMC-4嵌合体为Eu-NMC-4结合的强力抑制剂,Ki值为0. 28士0. 06nM(表19),与所 观察到的Ki值0. 32士0. 07nM—致;同理,就对大鼠His-Al的同源竞争而言,NMC-4嵌合体 具有0.297士0. 128nM的&值(表18),与0. 276士0. OllnM的Kd值一致。相较之下,无标

71记的同种型对照(来自人类骨髓瘤血浆的IgGl/ κ )在Eu-NMC-4结合至Al抗原上并无抑 制效应。

[0428] 表19所选择的人源化NMC变体的结合活性(竞争测定的Ki)比较

[0429]

[0430] 接着利用竞争结合测定来测试人源化NMC-4变体H9L9IgGl及IgG4的效力。此两 同种型的⑶R-移植H9L9变体显现出相同nM活性,尽管效力上小于同源NMC-4嵌合体(表 19)。

[0431] 以竞争结合测定法来测试AJW200抗体。相较于与Eu-NMC-4结合至His-Al竞争 的人源化NMC-4变体,Eu-NMC-4结合至His-Al被AJW200强化,其EC50为2IOpM(图2)。 Eu-NMC-4结合至His-Al的希尔图显示出接近统一的希尔斜率(nH = 0. 984及0. 957),与 在无协同性(cooperativity)下与单一类型的结合位点的结合一致。相较之下,在1.8nM 或20nM AJW200存在时(分别见图2C及2D)的Eu-NMC-4结合至His-Al的希尔图显现大 于1的希尔斜率(nH = 1. 548及1. 201),此表示正协同性(cooperativity)。由AJW200介 导的正协同性在两不同日所进行的两独立实验中被观察到,这些结果不仅证实了 NMC-4结 合至与AJW200不同的vWF的Al结构域上的结合位点,还指出至少就分离的Al片段而言, AJW200使匪C-4能够结合至GPIb- α结合位点。

[0432] 实施例5 :抗体阻断血小板附着的能力

[0433] 抗体封闭在vWF上的GPIb-α受体结合位点的证实是其在天然流动条件下对抗 vWF-GPIb相互作用的能力。已由Moake及其同僚(1986, J ClinInvest. 78 : 1456-61)发展 出的一方法发现以下事实:当以组胺活化内皮细胞时,其分泌出超大型vWF(ULvWF),其中 Al结构域是处于开放(例如活性)构象中。因ADAMS-13介导的ULvWF的切割,ULvWF在引 入血菜时迅速瓦解(Dong等,2002 Blood 100:4033-9)。

[0434] 在一例示方法中,分出第一代(passage) (Pl)HUVEC,并以IX IO5细胞/培养皿的 密度接种至35mm的培养皿上,培养7天,且在第7天(在其100%汇合后2_3天)时使用。 在1. 2mL/min的流速下,以CFSE标记的人类血小板轻易地附着至HUVEC (图3A);当在室温 下以25 μ M的组胺预处理细胞达10分钟时,更多血小板附着至HUVEC (图3Β);当血小板在 含有浓度为10μ g/ml的NMC-4的缓冲液中灌注上单层时,此种血小板的附着被完全抑制 (图3C);而当血小板在浓度为18 μ g/ml的抗GPIb-α抗体(例如ΑΚ2)存在下被灌注时, 则血小板的附着受到部分阻断(图3D)。相较之下,浓度为18μ g/ml的小鼠对照IgG并未 阻止血小板附着至vWF聚合物上(图3E),此显示血小板附着至HUVEC确实是由内皮衍生的vWF与血小板GPIb- α之间的相互作用介导。当从每回合所截取的20个图像测量被血 小板所覆盖的面积并利用Compix软件加以定量时,相较于对照抗体所造成的可忽略效应, NMC-4将血小板附着性减少> 95%。

[0435] 实施例6 :抗体预防血管阻塞的能力

[0436] 利用动脉血栓的氯化铁模型,以评估NMC-4嵌合体及人源化衍生物(例如Η14, L10)相较于AJW200的抗血栓活性。对侧颈动脉是透过唾腺及随附脂肪组织重新定位至切 口的头颅侧而分离。使颈动脉外露,并将其置于折叠成可作为摆放颈动脉的支架且提供氯 化铁(7. 5% )溶液的表面的一片滤纸(例如4mmX5mm)上。在施加FeCl3溶液4分钟后, 置放流量探测器于颈动脉周围,并利用Transonic Systems Inc.流动系统(Ithaca,NY)测 量流量,直至阻塞时(在对照大鼠中一般为10分钟)或45分钟为止。在1 μ 1/g大鼠体重 的体积下,4只大鼠的各组(盐水的η = 6)皆投以范围例如由5至0. 01mg/kg的NMC-4嵌 合体、V14、L10、AJW200或对照IgG的4种剂量。无菌过滤抗体制备液,并在使用作动物研 究之前,在遵照生产商的规则下利用LIMULUS AM0EB0CYTE ASSAY试剂盒(BioWhittaker) 加以测试,以确保低内毒素含量;以HPLC分析估计单分散性(mono-dispersity)。

[0437] 如图4所示,NMC-4及AJW200两者大幅地抑制了血管阻塞。匪C-4在剂量为0. 03 及0. lmg/kg下显现出类似于AJW200的ED5tl,人源化衍生物H14,LlO还显现出类似的活性, ED50介于0. 03及0. lmg/kg剂量之间。

[0438] 实施例7 :抗体对出血时间及失血的影响

[0439] 失血有时为与抗血小板剂(例如抗vWF抗体)相关的有害副作用,因此,可能必须 评估人源化NMC-4抗体促成出血并发症的可能性。为此,实施标准出血时间测定,在施行尾 部横切之前先施用30分钟的抗体对照、NMC-4嵌合体、或AJW200。就尾部横切而言,切下 尾部的末端(例如0. 5mm)并将尾部置入已知体积的温盐水中,测量停止出血所需要的时 间;于估算出血时间过程中,还通过估算在盐水中所收集的血球的血红蛋白含量来测量失 血量。为此,以低速离心使红血球成粒状,将其悬浮于含有TritonXlOO的盐水中,调整 最终体积为5ml,通过测定在420nm下的吸收度而测量溶液的血红蛋白浓度。

[0440] NMC-4嵌合体显现出对于显著增加的出血时间,与人源化衍生物H14-L10相同 的ED5tl剂量0. 09mg/kg ;在与此两抗体在动脉血栓的FeCl3模型中的效力相关联的剂量 0. 03mg/kg,并未有出血时间延长或失血量增加的情形。NMC-4嵌合体及其人源化衍生物显 现出比AJW200 (其在大鼠中出血时间增加时的ED5tl更接近其抗血栓活性时的ED5tl剂量)略 高的ED5tl剂量应答(dose response),此显示NMC-4相较于AJW200提供了更加改良的治疗 窗口。

[0441] 表20 NMC-4嵌合体及其人源化衍生物H14,LlO相较于AJW200在大鼠中的出血 时间及失血量上的效应

[0442]

[0444] 这些抗体的有害副作用在止血上的另一参数为失血量,其是在测定出血时间时针 对所收集的血液加以测定。又,在剂量高于0. lmg/kg时,这些抗体诱发出明显的失血量; 然而,在剂量为0. 3及3mg/kg时,相同剂量下AJW200引发比NMC-4嵌合体高出更多的失血 量,尽管这些差异仅在3. Omg/kg组(其中n = 4而非η = 3)接近在统计上的显著性(表 20)。Η14,LlO抗体变体对亲本NMC-4嵌合体并未表达出明显的差异。

[0445] 实施例8 :抗体在血小板及白血球循环数量上的效应

[0446] 假设某些抗血小板剂可抑制血栓形成,而同时可能引发血小板减少症 (thrombocytopenia)(Hansen 等,J Pharmacol Exp Ther. 298 : 165-71 (2001))。为测 定NMC-4在被治疗动物中的白血细胞(WBC)及血小板循环数目上的效应,便以lmg/ml 的NMC-4注射(例如以静脉方式)至重量230-260g的5只大鼠的一组,而以载体对照 (vehicle control)(例如外科手术级PBS)注射至3只大鼠的对照组。在注射之前,以例如 HEMAVETHEMATOLOGY ANALYZER™(Drew Scientific),利用尾部出血测量基线血细胞数量。 注射入抗体或盐水后,在通过利用毛细吸管从未麻醉大鼠眼后抽取,在上至48小时(例如 30分钟、2,4,24,及48小时)的预定时间点时收集血液样本,接着将约40 μ L的血液转移至 含有L酸化柠檬酸葡萄糖抗凝液(ACD)的管中,并立即在HEMAVET细胞计数器中取样, 以测定血小板及白血细胞的数量。就各次抽血而言,两眼交替进行取样。

[0447] 在所分析的任何时间点,NMC-4对血小板数量的影响甚微;在注射后30分钟时,观 察到白血细胞短暂减少了 37. 5% (ρ = 0. 016),但在注射入PBS药物时,也观察到类似的减 少现象。在NMC-4及对照载体处理组两者中,白血细胞水平皆在注射后2-4小时之间回到 基线。

[0448] 实施例9 :抗体表达用的细胞系的建立

[0449] 可开发出基于鼠类人工染色体表达(ACE)平台的高产量哺乳类蛋白质表达系统, 该ACE平台已被改造成含有可利用突变的λ-整合酶(integrase)(例如ACE整合酶)结合

0. 094 + 0. 0350. 630 土 0. 2941. 883 土 0. 312靶向穿梭载体(targeting shuttlevector)而载入异源基因序列的多个具位点特异性的重 组受体位点(recombination acceptor sites) (Lindenbaum 等,(Nucl. Acid Res. 32 (21): el72(2004);美国专利申请第2003/0119104 Al号及第2006/0246586 Al号)。可利用此 系统产生用于表达所选的人源化变体及NMC-4嵌合体的稳定细胞系。

[0450] 以NotI加上HindiII (轻链载体)或XhoI及BamHI (重链载体)来消化质粒 PCI-WC4-VL10及pCI-WC4-VH14的插入物,随后将其克隆入pST0518载体的MCS 1 (轻链) 及MCS 2(重链)中。带有前后串联的重链及轻链插入物的PST0518载体作为用以递送至具 有不同抗性基因(resistance genes)的ACE靶向载体(ATV)内的穿梭载体,此是得自于由 Lindenbaum等人所说明的靶向载体(Nucl. Acid Res. 32(21) :el72(2004);美国专利申请: 2003/0119104A1 & 2006/0246586A1)。为了将含有抗体重链及轻链两者的盒(cassette) 递送至 ATV 内,以 I-Ceul 及 PI-Scel 寻靴内切酶(homing endonuclease) (New England Biolabs,MA)来消化pST0518-VH14,VLlO载体;凝胶纯化VH14加VLlO片段,并将其克隆入 以相同的I-Ceul及PI-Scel内切酶预先消化的pZeo及pHygro-ATV的相同位点中。此即 产生质粒 pNHT605-H14L10-IgG4 (hygE 基因)及 pNHT607-H14L10_IgG4 (ρ zeoE 基因)。

[0451] 同理,构建带有NMC_4IgG4嵌合体的pST0518靶向载体,并将前后串联插入物亚克 隆入pZeo及pHygro-ATV载体内,如此产生质粒pNHT623 (人类IgG4嵌合体加hygK基因) 及pNHT624 (人类IgG4嵌合体加zeoR基因)。

[0452] 为靶向整合至平台ACE,以6孔培养皿的每孔0. 4X IO5个细胞的密度接种宿主 ChK2 ACE平台细胞并隔夜培养。在转染前3小时,以无血清培养基更换培养基;3小时后,根 据生产商的使用说明,Wlyg的载体及1 μ g ACE整合酶表达载体用LipofectAMINE PLUS 试剂(Invitrogen)加以复合进行转染。24小时之后,将细胞扩充至15cm的培养皿上;第 二天,将3.0yg/ml的zeomycin或潮霉素(取决于所用的载体)加入培养基中;在14天的 筛选后,利用克隆环分离出抗药性菌落,扩增各自克隆以用于抗体生产的分析。

[0453] 实施例10 :NMC-4抗体的体内效力及安全性

[0454] 以一体内动物(例如狒狒)模型来测试人源化NMC-4抗体的效力及安全性。

[0455] 在一例示方法中,以盐酸氯胺酮(ketamine hydrochloride)(购自Premier制药公司 的Anaket-V™)麻醉狒狒(10mg/kg頂/30分钟或有必要时维持全身麻醉),并以加热桌将其体 温维持于37°C。其次,缓慢地解剖开一节4-5cm、周围无组织的股血管,连接所有在股动脉及股 静脉中的附近分支。接着,在股动脉及股静脉中切出一小切口,插入血管尖端并以外科手术线 固定,接将硅氧烷管贴附至血管尖端,以使动脉血液分流入股静脉;绕过毛细管而由动脉直接 至静脉循环的分流增加血液流量至约150-300mL/分钟。将管型超因波流量探针(Transonic Systems Inc, Maastricht, the Netherlands))贴附至硅氧烷管,容许血流稳定约20分钟;整个 实验中连续地测量平均及位向(phasic)血液流量,将分流用于给药以及血液取样。

[0456]其次,利用马丁针持针器(Hegar-Baumgartner TC Gold 14cm,产品码 20. 634. 14),通过以最大凹陷程度重压内皮层持续10秒钟,在极靠近血管尖端处损伤股动 脉的内皮层。生产出两重叠创伤,并将一可调式塑料缩窄器置于创伤位点上方,以将血液流 量减少至基线值的10% -20%。观察到因血栓形成而使血液流量逐渐减少,当血液流量减 少至彡5mL/min时,打开缩窄器以取出富含血小板的血栓;其次,再度使外部变狭窄并重新 开始血栓形成的程序。此种在机械复位之后的血液流量减少的重复模式被称为循环流减缩(CFR)。测量为时间的函数的CFR数目,用三十分钟记录基线循环流减缩量;注射盐水后并 监测CFR持续另一个三十分钟。使用如实施例3中所述的人源化NMC-4变体H9L9 IgG4 (此 处还称为GBR 600)。

[0457] 可利用两方法来评估给药时的出血状况。在第一方法中,于前臂表面处测定皮肤 模板出血时间。在手臂附近使用压力袖并在40mmHg下膨胀,接着以Surgicut装置(ITC, Edison, NJ)诱导伤口。将表皮出血时间定义为伤口的诱发与视觉观察出血中止之间的时 间。每15秒钟以滤纸小心地轻擦血液,而勿碰触伤口。当表皮出血时间超过900秒(例如 15分钟)时停止测量,并将出血时间视为900秒。

[0458] 在第二方法中,通过重组armexin V而以兔颈动脉创伤模型来估算切口的失血量(见 例如 P. Thiagarajan 等,(1997)Circulation96(7) :2339-47)。在腹股沟上切出 2cmX0. 8cm 切 口,并埋入预先秤重的纱布消毒棉块,在每三十分钟剂量注入周期结束或其充满血液时更换纱 布消毒棉块;在研究结束时将所有纱布秤重,以得到失血量。以盐水对照状态纱布的比例来表 示每一剂量的数值。在整个研究期间,以10分钟为间隔连续地监测心跳速率及血压。

[0459] 在每一剂量周期结束时,抽取Iml的EDTA血液及IOml的含柠檬酸血液,并判定 FBC血小板数量、凝血酶原(prothrombin)时间、部分促凝血酶原时间(activated partial thromboplastin time)、因子VIII及vWF。若有必要,于_80°C下冷冻两管300 μ 1的小剂 量,以递送至研究者处供额外体外实验室研究用。同理,在流量研究结束后0. 5,1,2,8,24 及48小时进行抽血,而在最终剂量结束时,以测试及对照样本施行血小板凝集测试。

[0460] 在累积剂量(例如当观察到CFR的完全抑制时)之后,以2. 2 μ g/kg/min的剂量 注入肾上腺素(Intramed)持续20分钟并再度测量CFR。仅有肾上腺素不会在狒狒中引发 血小板凝集,但可通过强化其它血小板凝集因子而恢复已遭破坏的循环流量变化(见例如 G.Anfossi 等,(1996)Eur J ClinInvest. 26 :353_370)。

[0461] GBR 600的效力及安全性研究:进行下述的研究1至4以判定GBR 600的效力及

安全性。

[0462] 研究1 :以η = 1动物进行先导研究,建立含量递增的GBR 600的剂量应答(dose response)曲线,并识别出观察到最大CFR抑制时的有效剂量。针对所有的测试剂量判定模 板出血及切口出血;在高达48小时内取出血液样本,以建立最高剂量下的抗体药物动力学。

[0463] 间隔30分钟注射下列递增剂量的GBR 600,并在研究的持续时间内记录流量:剂 量 1,0. 03mg/kg ;剂量 2,0. lmg/kg ;剂量 3,0. 3mg/kg ;剂量 4,lmg/kg ;及剂量 5,0. 03mg/kg。 接着在每一剂量的注射之后10分钟时施行出血测试。

[0464] 图5及表21说明递增剂量的GBR 600对CFR的效应。若CFR并未稳定,在接近 三十分钟基线阶段结束时再度损伤动脉。相较于盐水阶段的8/30分钟,0. 03mg/kg的GBR 600将CFR的数目降低至5/30分钟;注入额外的0. lmg/kg可完全地抑制CFR,此现象是由 动脉再度受损伤并未使得CFR回复的事实加以确认。就下列递增剂量而言,有观察到抑制 现象。在注入最高剂量的GBR 600(10mg/kg)后,在2. 2 μ g/kg/min的速率下注入肾上腺素, 以建立究竟达到血小板沉积的强力或微弱抑制。由于肾上腺素在血压上的效应,注入肾上 腺素导致血液流量的短暂增加,但并未逆转CFR的抑制。

[0465] 表21递增剂量的GBR 600在CFR中的效应(0. 03_10mg/kg)

[0466]

[0467]

[0468] 研究2 :研究2用类似于研究1的方式进行,除了在开始逐步升高剂量时(0.03mg/ kg剂量之前)使用0. 01mg/kg的剂量以外,因为在研究1中已观察到在剂量0. 03mg/kg下 存在CFR的部分抑制。

[0469] 在研究2中(见例如图6及表22),观察到0. 01mg/kg的GBR 600在CFR中的效应 (7CFR/30分钟,相较于盐水的9CFR/30分钟);然而,注入额外的0. 03mg/kg(累积剂量=0. 04mg/ kg)造成CFR的完全抑制,GBR 600的EDltltl因此为0. 04mg/kg。动脉的再度损伤并未逆转CFR的 抑制,表示此为真实抑制。抑制效应维持于较高剂量下,上至最大剂量10mg/kg。由于肾上腺素 在血压上的效应,注入肾上腺素导致血液流量的短暂增加,但并未逆转CFR的抑制。

[0470] 表22递增剂量的GBR 600在CFR中的效应(0. Ol-lOmg/kg)

[0471]

[0472] 研究3 :研究3用类似于研究1的方式进行,除了施用0. 005mg/kg的起始剂量、接 着施用另一次0. 005mg/kg剂量(累积剂量=0. 01mg/kg)、且接着以增量0. Olmg/kg的方式 增加6次以外。

[0473] 在研究3中(见例如图7),观察到注入0. 005mg/kg的GBR 600在CFR中的效应 (8CFR/30分钟降至7CFR/30分钟)。CFR随着GBR 600的剂量增加而呈线性方式减少,每 剂量周期的CFR数目显示于表23与图8中;图8说明与递增剂量的GBR 600相关联的CFR 数目的线性减少。CFR数目与GBR 600剂量之间的关系是由下列方程式表示的,数据拟合此 方程式时的R2 = 0. 9901。

[0474] CFR的数目/剂量周期=-109 XGBR 600的剂量+7. 4517

[0475] 相较于研究2中因累积剂量.04mg/kg所引起的完全抑制,研究3中的EDltltl为 0. 07mg/kg。在研究3中,递增剂量之间的时间为30分钟,而所观察到的此EDltltl上的差异 可能由血液中因药物的起始清除结果导致的GBR 600浓度下降所引发。注入肾上腺素逆转 了 CFR的抑制,此可能与在0. 07mg/kg累积剂量时的CFR曲线的形状有关。在0. 07mg/kg 累积剂量下,抑制情形被缓慢地逆转,其显示血栓正在发展中。在这些特殊条件下,肾上腺 素似乎能够逆转CFR。

[0476]表 23 累积剂量的 GBR 600 在 CFR 中的效应(0. 005-0. 07mg/kg)

[0477]

[0478] 研究4:研究4用类似于研究1的方式进行,除了在三只狒狒中以氯吡格雷 (clopidogrel)作为阳性(positive)对照外,目的是为比较GBR600在1,1. 5,2. 5,5及10mg/kg剂量下对抗氯吡格雷的效力及出血倾向。

[0479] 在研究4中,氯吡格雷于狒狒1中在10mg/kg累积剂量下、于狒狒2&3中在5mg/kg 累积剂量下完全地抑制了 CFR,如表24及图9(显示表24中的狒狒3的结果)所示。注入 肾上腺素逆转了 CFR的抑制。

[0480] 表24氯吡格雷在狒狒中的递增剂量(l-10mg/kg)的效应

[0482] 模板出血时间:在研究1及2中,所有高于0. 04mg/kg剂量下的模板出血时间皆 长于 15 分钟;在包含氯吡格雷(Bristol-Myers Squibb/Sanof!Pharmaceuticals)的阳性 (positive)对照研究中,模板出血时间延长至与大于2. 5mg/kg累积剂量时相同的程度;在 研究3中,模板出血时间从未延长至超过15分钟。由于模板出血时间呈现高基线变化性 (见例如氯吡格雷中狒狒1,2,3的基线值),故其并非极精准的出血倾向量度,模板出血时 间本身不被视为可极准确地预测临床上相关出血,例如在手术前调整中(见例如Lind等, Platelets,第二版,p485-493,Michelson AD 编,Academic Press)。切口出血测试显示较 少变化性,因其是定量经由切口的实际失血量且具有较大动态范围。因此,除了模板出血测 试以外尚执行切口出血测试。这些数据整理于表25及26中。

[0483] 表25GBR 600的模板失血时间[分钟]

[0484]

[0485]

[0486] 表26氯吡格雷的模板失血时间[分钟]

[0487]

[0488] 表27及28显示以氯吡格雷及GBR 600的切口出血测试所获得的结果。由纱布所 吸收的血液量起初随剂量增加,而在高剂量时呈现自限性。在所有研究中,所观察到的最高 失血量为在第四剂量时,其后由纱布所吸收的血液量便减少,且似乎发生伤口的愈合;在研 究1及2中,最大出血量类似于氯吡格雷者,尽管氯吡格雷用2-4倍的EDltltl、而GBR 600用 高达250的倍数加以测试;在研究3中,观察到全部的注射剂量下的出血情况微不足道。

[0489] 表27GBR 600的切口失血测试[盐水值的倍数单位]

[0490]

[0491] 表28氯吡格雷的切口失血测试[盐水值的倍数单位]

[0492]

[0493]

[0494] GBR 600 的治疗窗口(therapeutic window)及出血得分(bleedscore):在图 10 中,将来自研究1及2及三项氯吡格雷研究的切口测试结果对GBR600及氯吡格雷的剂量作 图(将剂量表示成其EDltltl的倍数并在对数标度上作图)。

[0495] 即使在大于其EDltltl的100倍的剂量下,GBR 600仍导致氯吡格雷中在仅高至其 EDltltl的4倍下可见的出血程度。令人意外地,GBR 600关于出血风险是具有前所未见的安 全性的治疗窗口。

[0496] 此项研究中所观察到出血的唯一临床上相关的增加为来自表皮伤口的自限性出 血的增加,如同由模板出血及切口出血法所判定。在外科手术后密切地观察动物达48小 时,并未检测到额外的表皮出血信号,例如容易瘀血、出血点、瘀斑等;更重要的是,未检测 到内部出血的信号,例如血肿(hematoma)、流鼻血(印istaxis)、来自口腔或阴道的失血、 黑粪症(melena)、眼睛出血、血尿症(hematuria)、或吐血(hematemesis)等,这些手术伤口 不会出血且可正常地愈合。

[0497] 如表29所示,氯吡格雷及GBR 600两者在BleedScore计分方案中的得分皆为1。 除了表皮伤口上的出血增加外,在实验期间或得出研究的结论后48小时的观察期期间,并 未在动物上检测到其它症状。

[0498] 表29氯吡格雷及GBR 600的BleedScore判定

[0499]

[0501] 效力及安全性研究的发现:表30-32显示在研究1-3中的GBR 600在下列方面的 效应:vWF水平、因子VIII水平、白血细胞数量、血红蛋白浓度(Hb)、血小板数量(Pit)、凝 血酶原时间(PT)、激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。

[0502] 关于在研究1-3中所获得的冯维勒布兰德氏水平,于研究1中并未观察到任何模 式;但于研究2&3中清楚地观察到冯维勒布兰德氏水平降低。在使用更高剂量的研究2中, 效应比使用相对低剂量的研究3更加显著;在使用未与vWF结合的对照人源化单克隆IgG4 抗体的研究中,未观察到对于冯维勒布兰德氏水平的效应,在未来研究中应仔细监测其此 类效应及涵义。在所有研究中,GBR 600对于因子VIII水平均无显著效应。

[0503] 虽然观察到WBC增加,但此为侵入性程序的已知效应,且至目前为止,此结果与针 对未结合vWF的对照人源化单克隆IgG4抗体、及在此模型中所测试的一切其它药物所观察 到的结果具有良好关联性;未能观察到因注入GBR 600所引发的对于血红蛋白浓度的显著 效应;注入GBR 600对于血小板数量有一效应,由于血小板沉积为CFR期间动脉阻塞的原 因,故血小板在这些程序期间被消耗掉,因此,CFR的有效抑制将减少血小板的消耗量。此 解释了在未结合vWF的对照人源化单克隆IgG4抗体中所观察到的较大血小板消耗量,其中并未观察到CFR的抑制。

[0504] GBR 600对于指示凝血蛋白的完整性的PT及aPTT似乎无显著效应,在未结合vWF 的对照人源化单克隆I gG4抗体中还观察到类似结果。

[0505]表 30.研究 1

[0511]

表31.研究2

此抑制反应,对氯吡格雷也是。使用GBR 600时未发现严重的有害出血,即使当药物以目前 看来像是高达有效剂量的250倍的剂量被输注时也是。在这些剂量下,通过切口出血模型 所测量的出血量,产生与以有效剂量4-8倍加以输注的氯吡格雷类似的结果。GBR 600对于 凝血蛋白不具影响力,此由PT及aPTT结果加以显示;然而,存在冯维勒布兰德氏因子水平 降低的情形,但在因子VIII水平上却未观察到清楚的效应。由于杀鼠灵(warfarin)通过 降低机能性维生素K依赖的凝血蛋白的循环水平来抑制凝血系统,故此方面并非问题。在 此研究中,对于全血计量参数并未观察到意料之外的效应。

[0512] 实施例11 :人源化NMC-4变体的热稳定性

[0513] 利用量热法比较鼠类NMC-4的Fab片段的人源化NMC-4变体及NMC—4-IgGl嵌合 体的热稳定性。单克隆抗体的熔融谱为其同种型的特征(Garber和Demarest (2007), BBRC 355 :751-7);然而,即使在全长IgG的情况中,仍可轻易地识别出Fab片段的中点熔融温 度。利用此种Fab片段的中点熔融温度来监测人源化候选者的单克隆抗体稳定性。

[0514] 在VP-DSC示差高灵敏度扫描热量计(differential scanningmicrocalorimeter, MicroCal, Northampton, UK)上进行量热法。槽(cell)体禾只 为0. 128ml ;加热速率为1°C /min ;且将超压(excess pressure)维持于64psi ;所有蛋白质 片段皆于PBS(pH 7.4)中l-0.5mg/mL(74yM)浓度下使用。通过与含有相同缓冲液的一式 两份样本(蛋白质以从中去除)相比较,估计每一蛋白质的摩尔热容量;利用标准程序分析 部分摩尔热容量及熔融曲线。在进一步于软件Origin v7. 0中利用非两状态模型(Non-Two State model)分析温度记录图之前,以基线校正的并将浓度归一化。针对如实施例3中提 及的H14L10-IgG4所获得的数据的例子显示于图11。鼠类NMC-4的Fab片段在74. 7°C时显 现单一转化,而H14L10-IgG4的Fab片段转化则在81. 1°C时显现,其对应于稳定性上的明显 差异(6. 4°C)。为了探知人类Fab稳定结构域的影响,制备由经移植至人类IgGl(最稳定的 人类同种型;Garber和Demarest (2007),BBRC 355 :751_7)上的鼠类NMC-4可变结构域所 组成的嵌合体。就HH-LlOFab而言,H14L10-IgG4及NMC-4-IgGl嵌合体的表观(apparent) Fab Tm值仍显示出稳定性上的明显增加(ΔΤπι> 1°C )

[0515] 实施例12 :编码GBR 600重链(VH9)及轻链(VL9)的基因的克隆

[0516] 用于克隆编码GBR 600的基因的材料及方法列出如下:

[0517] PfuUltra(Stratagene,Cat.-No. :600380)

[0518] SpeI (NEB, Cat. -No. :R0133)

[0519] HindIII (NEB, Cat. -No. :R0104)

[0520] CIP (NEB, Cat.-No. :M0290)

[0521] pCR-钝端(Invitrogen,Cat.-No. :44_0302)

[0522] 弓丨物:Operon, Cologne, Germany

[0523] GLNPR107 :TAACTAGTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC

[0524] GLNPR108 :AAGCTTACGGCTAGCTCACGACACCTGAAATGGAAG

[0525] GLNPRl39 :CCTCAGACAGTGGTTCAAAG

[0526] GLNPRl76 :GCTAGCGCCACCATGGAGACAGACACAC

[0527] GLNPRl77 :TAAGCTTCTATCATTTACCCAGAGACAGGG

[0528] GLNPRl78 :TAAGCTTCTATCAACACTCTCCCCTGTTG[0529] BGHREV :由 Fasteris 所提供

[0530] TMC 载体 pCI-WC4-VL9 (pl56)及 pCI_WC4_VH9 (pl58)(由 Chromos 所提供)

[0531] Qiaquick 凝胶提取试剂盒(Qiagen,Cat.-No. :28706)

[0532] lkb+ladder (Fermentas, Cat. -No. :R0491)

[0533] pcDNA3. 1(-)(Invitrogen, Cat.-No. :V795_20)

[0534] pEF-Dest51[CDl(RZPD, Cat. -No. :RZPDo839G0167-pEF_DEST51)

[0535] IlJj^ :Fasteris SA(Geneva, Switzerland)

[0536] Gigapr印试剂盒(Macherey-Nagel, Cat. -No. :Nucleobond PC10000)

[0537] 表达载体pEFcDNA3. 1的克隆

[0538] 表达载体pEFcDNA通过以来自pEF_DEST51的EFl - α启动子取代来自 pcDNA3. 1 (-) (Invitrogen)的CMV启动子而加以构建。为此目的,故利用引物GLNPR107,108 及PfuUltra (Stratagene,退火温度55°C,30个循环)来扩增EFl-α启动子;引物扩增全 部的EFl-a启动子,并在所扩增片段的5’端贴附SpeI侧而在3’端贴附HindIII侧。将 PCR扩增子(amplicon)克隆入pCR-钝端(Invitrogen),并通过Spel/Hindlll消化来分析 克隆。切下来自克隆#4的Spel/Hindlll片段,并将其克隆入利用相同酶组合及CIPed加 以消化的pcDNA3. 1 (-)骨架中。利用SpeI及HindIII分析克隆,克隆#2似乎呈阳性;以骨 架及插入物进行第二次消化更证实了启动子片段的正确大小。

[0539]将 GBR 600 克隆至 pEFcDNA

[0540] 利用PfuUltra (标准条件,退火温度55°C,30个循环)及引物GLNPR176及177来 扩增GBR 600VH9,模板为TMC载体pl56 ;以如同对于重链所述,利用引物GLNPR176及178 来扩增GBR 600VL9,所使用的模板为TMC载体ρ 158。引物将NheI限制位点5,及HindIII 限制位点3’附加至各自扩增子,将所获得的PCR片段克隆入pCR-钝端,并利用NheI及 HindIII通过限制消化加以分析。切下轻链的克隆#1及重链的克隆#3,并将其克隆入利 用酶NheI及HindIII及CIPed打开的pEFcDNA中。该限制消化显示:轻链的克隆#6及重 链的克隆#1含有正确大小的片段,将此两克隆送至用作测序对照的Fasteris,以作为样本 GS256及GS257。测序结果比对参考序列。由于少量制备(minipr印)DNA的质量不佳,故重 链序列GS257无法确认至100%程度。利用编码GBR 600重链VH9 (GS257)及GBR 600轻链 VL9 (GS256)以制备多量制备(Gigapr印s)。将质粒制备再度送至Fasteris以进行序列确 认,此次的样本名为GS265(GBR 600重链VH9)及GSS264 (GBR 600重链VL9)。由于其DNA 质量较好,故可确认重链及轻链对于参考序列的序列同一性。

[0541] 虽然本发明于此已通过参照各种特定材料、程序、及实施例加以说明,但应了解技 术人员在阅读以上说明书及研究图式时将可实现各种的修改、增加、变更及其均等物。因 此,本发明实施例应被视为例示性而非限制性,其真实范围及精神是由下列权利要求书所 表示。本案中所参照的有参考数据、专利、专利申请通过参考文献方式将其整体并入于此。

Claims (118)

  1. 一种具有冯维勒布兰德氏因子(vWF)特异性的人源化抗体或其结合片段,包含:(a)如SEQ ID NO:19中所述的重链可变区序列;及(b)如SEQ ID NO:28中所述的轻链可变区序列。
  2. 2. 一种具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,该人源化抗体包含:(a)如SEQ ID NO :237中所述的重链可变区序列;及(b)如SEQ ID NO :238中所述的轻链可变区序列。
  3. 3. 一种具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,该人源化抗体包含:(a)重链及轻链互补决定区(CDR),其对应于存在于鼠类抗体NMC-4的重链及轻链可变 区(分别为SEQ ID NO :1及2)中的⑶R ;以及(b)重链框架区和/或轻链框架区,前者对应于存在于人类抗体AAC18165. 1 (SEQ ID NO :4)的可变区中的框架区,后者对应于存在于人类抗体AAK94808 (SEQ ID NO :6)的可变 区中的框架区。
  4. 4. 一种具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,该人源化抗体包含:选自于以下重链CDR其中一种或多种:HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7), HCDR2 : MIffGDGSTDYNSALKS(SEQ ID NO :8),及 HCDR 3 :DPADYGNYDYALDY(SEQ ID NO :9);和 / 或选自于以下轻链 CDR 其中一种或多种=LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10), LCDR2 : YTSSLHS(SEQ ID NO :11),及 LCDR3 :QQYEKLPWT(SEQ ID NO: 12)。
  5. 5. 一种具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,该人源化抗体包含:重链 CDR =HCDRl :GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7),HCDR2 =MIffGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO : 8),及 HCDR3 :DPADYGNYDYALDY(SEQ IDNO :9);禾口 / 或轻链 CDR=LCDRl :SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10),LCDR2 :YTSSLHS(SEQID NO :11),及 LCDR3 =QQYEKLPffT(SEQ ID NO :12)。
  6. 6.权利要求第4或5项的人源化抗体或其结合片段,还包含:来自人类抗体 AAC18165. KSEQ ID NO :4)的重链框架区;和/或来自人类抗体AAK94808 (SEQ ID NO :6) 的轻链框架区。
  7. 7.权利要求第6项的人源化抗体或其结合片段,其中该重链框架区还包含一个或多个鼠类残基。
  8. 8.权利要求第6项的人源化抗体或其结合片段,其中该重链框架区不包含一个或多个鼠类残基。
  9. 9.权利要求第6项的人源化抗体或其结合片段,其中该轻链框架区还包含一个或多个鼠类残基。
  10. 10.权利要求第6项的人源化抗体或其结合片段,其中该轻链框架区不包含一个或多 个鼠类残基。
  11. 11.权利要求第4或5项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体包含选自以 下的重链可变区:H2(SEQ ID NO: 13),H4 (SEQ ID NO: 14),H5 (SEQ ID NO: 15),H6 (SEQ ID NO : 16),H7 (SEQ ID NO : 17),H8 (SEQID NO : 18),H9 (SEQ ID NO : 19),H12 (SEQ ID NO :20), H13(SEQ ID NO :21),H14(SEQ ID NO :22),H15 (SEQ ID NO : 145),或 H16 (SEQ ID NO: 146)。
  12. 12.权利要求第4或5项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体包含选自以下 的轻链可变区:L5 (SEQ ID NO :23),L4(SEQ ID NO :24),L6 (SEQ ID NO :25),L7 (SEQ ID NO:26), L8 (SEQ ID NO :27), L9 (SEQID NO :28), LlO (SEQ ID NO :29),或 Lll (SEQ ID NO :30)。
  13. 13.权利要求第4或5项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体包含:选自以下的重链可变区:H2 (SEQ ID N0:13),H4(SEQ ID NO : 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO :16),H7(SEQ ID NO :17),H8(SEQID NO : 18),H9(SEQ ID NO : 19),H12(SEQ ID NO :20), H13(SEQ ID NO :21),H14 (SEQ ID NO :22),H15 (SEQ ID NO :145),或 H16 (SEQ ID NO :146);以及选自以下的轻链可变区:L5 (SEQ ID NO :23), L4(SEQ ID NO :24),L6 (SEQ ID NO -.25), L7 (SEQ ID NO :26),L8(SEQ ID NO :27),L9(SEQID NO :28),LlO (SEQ ID NO :29),或Lll(SEQ ID NO :30)。
  14. 14.权利要求第5项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体包含:重链可变区 序列,其含有至少80%与SEQ ID NO :19的框架区相同的框架区;和/或轻链可变区序列, 其含有至少80%与SEQ ID NO :28的框架区相同的框架区。
  15. 15.权利要求第5项的人源化抗体或其结合片段,还包含:对应于人类抗体家族VH4中的框架区的重链框架区;以及对应于人类抗体家族VKl中的框架区的轻链框架区。
  16. 16.权利要求第5项的人源化抗体或其结合片段,还包含:对应于人类抗体重链种系序列4-59中的框架区的重链框架区1、2和3,其中 重链框架区 1 为 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO :171),重链框架区 2 为 WIRQPPGKGLEffIG (SEQ ID NO : 172),且重链框架区 3 为 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA R (SEQ ID NO :173);以及对应于存在于人类抗体轻链种系序列018中的框架区的轻链框架区1、2和3, 其中轻链框架区1为DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO : 186),轻链框架区2为 WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO :187),且轻链框架区 3 为 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATY YC(SEQ ID NO :188)。
  17. 17.权利要求第5项的人源化抗体或其结合片段,还包含:对应于人类抗体重链种系序列4-34中的框架区的重链框架区1、2和3,其中 重链框架区 1 为 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY (SEQ ID NO :165),重链框架区 2 为 WIRQPPGKGLEffIG (SEQ ID NO :166),且重链框架区 3 为 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA R (SEQ ID NO :167);以及对应于存在于人类抗体轻链种系序列018中的框架区的轻链框架区1、2和3, 其中轻链框架区1为DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO : 186),轻链框架区2为 WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO :187),且轻链框架区 3 为 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATY YC(SEQ ID NO :188)。
  18. 18.权利要求第1-17项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体以 IOnM或更小的亲和力(Kd)结合至vWF。
  19. 19.权利要求第1-17项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体用 IOOnM或更小的亲和力(Ki)竞争结合至vWF。
  20. 20.权利要求第1-17项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体用 IOnM或更小的亲和力(Kd)结合至vWF的Al结构域。
  21. 21.权利要求第1-17项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体用 IOOnM或更小的亲和力(Ki)竞争结合至vWF的Al结构域。
  22. 22.权利要求第1-17项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体具有 大于65°C的FAB片段热稳定性温度。
  23. 23.权利要求第1-17项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体具有 高于亲本非人源化抗体的FAB片段热稳定性温度。
  24. 24. 一种具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体包含:重链 CDR1,为 GFSLTDYGVD(SEQ ID NO :7);重链 CDR2,为 MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ IDNO:8);重链 CDR 3,为 DPADYGNYDYALDY(SEQID NO:9);轻链 CDRl ;轻链 CDR2 ;及轻链 CDR3, % QQYEKLPffT (SEQ ID NO :12),条件为轻链 CDRl 非 SASQDINKYLN(SEQ ID NO :10)和 / 或轻 链 CDR2 非 YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)。
  25. 25.权利要求第24项的人源化抗体或其结合片段,还包含人类抗体重链框架区和/或 人类抗体轻链框架区。
  26. 26.权利要求第25项的人源化抗体或其结合片段,其中该重链框架区对应于存在于 4-59衍生人类抗体中的重链框架区。
  27. 27.权利要求第26项的人源化抗体或其结合片段,其中存在于4-59衍生人类抗体中的 该重链框架区还包含一个或多个鼠类残基。
  28. 28.权利要求第26项的人源化抗体或其结合片段,其中存在于4-59衍生人类抗体中的 该重链框架区不包含一个或多个鼠类残基。
  29. 29.权利要求第25项的人源化抗体或其结合片段,其中该轻链框架区对应于存在于 018衍生人类抗体中的轻链框架区。
  30. 30.权利要求第29项的人源化抗体或其结合片段,其中存在于018衍生人类抗体中的 该轻链框架区还包含一个或多个鼠类残基。
  31. 31.权利要求第29项的人源化抗体或其结合片段,其中存在于018衍生人类抗体中的 该轻链框架区不包含一个或多个鼠类残基。
  32. 32.权利要求第26项的人源化抗体或其结合片段,其中该4-59衍生人类抗体为 AAC18165. 1。
  33. 33.权利要求第29项的人源化抗体或其结合片段,其中该018衍生人类抗体为 AAK94808。
  34. 34.权利要求第24项的人源化抗体或其结合片段,其中LCDRl和/或LCDR2是来自于 人类抗体。
  35. 35.权利要求第34项的人源化抗体或其结合片段,其中IXDR2为DASNLET(SEQ ID NO : 118)。
  36. 36.权利要求第1-17及24项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中HCDRl包含一 个或多个选自F27G,L29I,T30S及V34W的氨基酸取代。
  37. 37.权利要求第1-17及24项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中HCDR2包含一 个或多个选自S61P及A62S的氨基酸取代。
  38. 38.权利要求第1-17及24项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中IXDRl包含一 个或多个选自S24Q,N30S及K31N的氨基酸取代。
  39. 39.权利要求第1-17及24项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中HCDRl包含 一个或多个选自F27G,L29I,T30S及V34W的氨基酸取代,HCDR2包含一个或多个选自S61P 及A62S的氨基酸取代,且IXDRl包含一个或多个选自S24Q,N30S及K31N的氨基酸取代。
  40. 40.权利要求第4或5项的人源化抗体或其结合片段,还包含来自人类抗体的重链框架 区,其中该人类重链框架区不包含一个或多个鼠类残基。
  41. 41.权利要求第4或5项的人源化抗体或其结合片段,还包含来自人类抗体的轻链框架 区,其中该人类轻链框架区不包含一个或多个鼠类残基。
  42. 42.权利要求第15-17项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该重链框架区不 包含一个或多个鼠类残基。
  43. 43.权利要求第15-17项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该轻链框架区不 包含一个或多个鼠类残基。
  44. 44.权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体保留 与亲本非人源化抗体、或包含来自亲本非人源化抗体的可变区及人类Fc区的嵌合体相同 的活性。
  45. 45.权利要求第44项的人源化抗体或其结合片段,其中该活性用瑞斯特霉素诱导血小 板凝集活性加以测量。
  46. 46.权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体缺乏 效应子功能。
  47. 47.权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体包含 源自于IgG4的Fc区。
  48. 48.权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该人源化抗体具有 对人类vWF的Al结构域的特异性。
  49. 49.权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体,其中该人源化抗体为全长抗体。
  50. 50.权利要求第1-43项中任一项的结合片段,其中该结合片段为选自Fab,Fab', Fab,-SH, Fv, scFv,F(ab' ) 2及双链抗体的抗体片段。
  51. 51.权利要求第50项的结合片段,其中该抗体片段不为Fab。
  52. 52. 一种分离核酸,编码权利要求第1-43项中任一项的抗体或其结合片段。
  53. 53. 一种分离核酸,其包含载体GS264的编码轻链的核酸序列,该载体GS264在DSMZ保 藏于微生物中,其登记号为DSM 21059。
  54. 54. 一种分离核酸,其包含载体GS265的编码重链的核酸序列,该载体GS265在DSMZ保 藏于微生物中,其登记号为DSM 21060。
  55. 55. 一种分离核酸,编码具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,该人源化抗体或 其结合片段包含如SEQ ID NO: 19中所述的重链可变区序列及如SEQ ID N0:28中所述的轻 链可变区序列。
  56. 56. 一种分离核酸,编码具有vWF特异性的人源化抗体或其结合片段,该人源化抗体或 其结合片段包含如SEQ ID NO :237中所述的重链序列及如SEQ ID NO :238中所述的轻链序 列。
  57. 57. 一种载体,其包含权利要求第52-56项中任一项的分离核酸。
  58. 58. 一种宿主细胞,其包含权利要求第52-56项中任一项的分离核酸或权利要求第57项的载体。
  59. 59. 一种人源化抗体或其结合片段的生产方法,包含:培养权利要求第58项的宿主细 胞,使得核酸被表达并产生抗体。
  60. 60.权利要求第59项的方法,还包含从宿主细胞培养物回收该抗体。
  61. 61.权利要求第59项的方法,其中该抗体是回收自宿主细胞培养基。
  62. 62.权利要求第59项的方法,其中,于该培养步骤之前,该宿主细胞用包含编码重链可 变区的核酸的载体及包含编码轻链可变区的核酸的载体共转染。
  63. 63. 一种组合物,包含:权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段、及可 药用的载体。
  64. 64. 一种组合物,包含:权利要求第1-43项中任一项的第一人源化抗体或其结合片段、 及结合至vWF的Al结构域的第二抗体。
  65. 65.权利要求第64项的组合物,其中该第二抗体为AJW200。
  66. 66. 一种受试者中的vWF介导的疾病或紊乱的治疗方法,该方法包含施用给该受试者 治疗有效量的权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或结合片段。
  67. 67.权利要求第66项的方法,其中该受试者为人类。
  68. 68.权利要求第66项的方法,其中该vWF介导的疾病为血栓性疾病或紊乱
  69. 69.权利要求第68项的方法,其中该血栓性疾病或紊乱为心血管疾病或脑血管疾病如 缺血性卒中。
  70. 70.权利要求第69项的方法,其中该心血管疾病为动脉粥状硬化症、再狭窄、心绞痛、 急性心肌梗塞、急性冠状动脉综合症、或与糖尿病相关联的心血管疾病。
  71. 71.权利要求第68项的方法,其中该血栓性疾病或紊乱为血管发炎、静脉血栓、镰刀 形细胞病、异种移植排斥、外周血管病、血栓性血小板减少性紫癜症、囊性纤维化、血管性痴 呆、雷诺病、类风湿性关节炎、或糖尿病。
  72. 72.权利要求第69项的方法,其中该脑血管疾病为血管性痴呆、缺血性卒中、或再发性 中风。
  73. 73.权利要求第66-72项中任一项的方法,其中该治疗有效量从约0. 001至约IOOmg/kg ο
  74. 74.权利要求第73项的方法,其中该治疗有效量从约0. 002至约20mg/kg。
  75. 75.权利要求第73项的方法,其中该治疗有效量从约0. 002至约10mg/kg。
  76. 76.权利要求第66-75项中任一项的方法,其中是将单一或多次小剂量的该治疗有效 量的该人源化抗体或其结合片段施用给受试者。
  77. 77.权利要求第66-75项中任一项的方法,其中该治疗有效量足以抑制血小板凝集,但 不足以引发明显的临床出血迹象。
  78. 78.权利要求第66-72项中任一项的方法,其中该治疗有效量从EDiqq的约1至约250 倍,而不致引发明显的临床出血迹象。
  79. 79. —种权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段作为药物的用途,包 含以治疗有效量施用该人源化抗体或其结合片段。
  80. 80. 一种权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段的用途,其是用于 制备vWF介导的疾病或紊乱的治疗药物,包含以治疗有效量施用该人源化抗体或其结合片段。
  81. 81.权利要求第79项的用途,其中该药物被用来治疗vWF介导的疾病或紊乱。
  82. 82.权利要求第80或81项的用途,其中该vWF介导的疾病或紊乱为血栓性疾病或紊乱。
  83. 83.权利要求第82项的用途,其中该血栓性疾病为心血管疾病或脑血管疾病如缺血性 卒中。
  84. 84.权利要求第83项的用途,其中该心血管疾病为动脉粥状硬化症、再狭窄、心绞痛、 急性心肌梗塞、急性冠状动脉综合症、或与糖尿病相关联的心血管疾病。
  85. 85.权利要求第82项的用途,其中该血栓性疾病包含:血管发炎、静脉血栓、镰刀形细 胞病、异种移植排斥、外周血管病、血栓性血小板减少性紫癜症、囊性纤维化、血管性痴呆、 雷诺病、类风湿性关节炎、或糖尿病。
  86. 86.权利要求第83项的用途,其中该脑血管疾病为血管性痴呆、缺血性卒中、或再发性 中风。
  87. 87.权利要求第79-86项中任一项的用途,其中该治疗有效量从约0. 001至约IOOmg/kg ο
  88. 88.权利要求第87项的用途,其中该治疗有效量从约0. 002至约20mg/kg。
  89. 89.权利要求第87项的用途,其中该治疗有效量从约0. 002至约10mg/kg。
  90. 90.权利要求第79-89项中任一项的用途,其中是将单一或多次小剂量的该治疗有效 量的该人源化抗体或其结合片段施用给受试者。
  91. 91.权利要求第79-89项中任一项的用途,其中该治疗有效量足以抑制血小板凝集,但 不足以引发明显的临床出血迹象。
  92. 92.权利要求第79-86项中任一项的用途,其中该治疗有效量从EDiqq的约1至约250 倍,而不致引发明显的临床出血迹象。
  93. 93.权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段,用作药物时,包含以一 治疗有效量施用该人源化抗体或其结合片段。
  94. 94.权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段,当其被用于治疗vWF介 导的疾病或紊乱时,包含以一治疗有效量施用该人源化抗体或其结合片段。
  95. 95.权利要求第93项的人源化抗体或其结合片段,其中该药物被用来治疗vWF介导的 疾病或紊乱。
  96. 96.权利要求第94或95项的人源化抗体或其结合片段,其中该vWF介导的疾病或紊乱 为血栓性疾病或紊乱。
  97. 97.权利要求第96项的人源化抗体或其结合片段,其中该血栓性疾病为心血管疾病或 脑血管疾病如缺血性卒中。
  98. 98.权利要求第97项的人源化抗体或其结合片段,其中该心血管疾病为动脉粥状硬 化症、再狭窄、心绞痛、急性心肌梗塞、急性冠状动脉综合症、或与糖尿病相关联的心血管疾 病。
  99. 99.权利要求第96项的人源化抗体或其结合片段,其中该血栓性疾病包含:血管发炎、 静脉血栓、镰刀形细胞病、异种移植排斥、外周血管病、血栓性血小板减少性紫癜症、囊性纤 维化、血管性痴呆、雷诺病、类风湿性关节炎、或糖尿病。
  100. 100.权利要求第97项的人源化抗体或其结合片段,其中该脑血管疾病为血管性痴呆、 缺血性卒中、或再发性中风。
  101. 101.权利要求第93-100项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该治疗有效量 从约 0. 001 至约 100mg/kg。
  102. 102.权利要求第101项的人源化抗体或其结合片段,其中该治疗有效量从约0. 002至 约 20mg/kg。
  103. 103.权利要求第101项的人源化抗体或其结合片段,其中该治疗有效量从约0. 002至 约 10mg/kg。
  104. 104.权利要求第93-103项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中是将单一或多 次小剂量的该治疗有效量的该人源化抗体或其结合片段施用该受试者。
  105. 105.权利要求第93-103项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该治疗有效量 足以抑制血小板凝集,但不足以引发明显的临床出血迹象。
  106. 106.权利要求第93-100项中任一项的人源化抗体或其结合片段,其中该治疗有效量 从EDiqq的约1至约250倍,而不致引发明显的临床出血迹象。
  107. 107. 一种具有冯维勒布兰德氏因子(vWF)特异性的人类抗体或其结合片段,其用范围 自EDiqq的约1至约250倍的治疗有效量加以投药,而不致引发明显的临床出血迹象。
  108. 108.权利要求第107项的人类抗体或其结合片段,其中该抗体或其结合片段具有人类 vWF的Al结构域的特异性。
  109. 109. 一种将权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段施用有此需要的 受试者的方法,包含:施用一治疗有效量的该人源化抗体或其结合片段,其足以抑制血小板 凝集而不致引发明显的临床出血迹象。
  110. 110.权利要求第66或109项的方法,其中该人源化抗体或其结合片段是经由皮下方式 加以施用。
  111. 111.权利要求第66或109项的方法,其中该人源化抗体或其结合片段是经由静脉方式 加以施用。
  112. 112.权利要求第66或109项的方法,其中该人源化抗体或其结合片段是经由静脉方式 结合放射性治疗法加以施用。
  113. 113.权利要求第66或109项的方法,其中该人源化抗体或其结合片段的该治疗有效量 从EDltltl的约1至约250倍。
  114. 114.权利要求第79项的用途,其中该人源化抗体或其结合片段用自EDltltl的约1至约 250倍的治疗有效量加以施用。
  115. 115. 一种制品,其是用以治疗vWF介导的疾病或紊乱,该制品包含权利要求第1-43项 中任一项的人源化抗体或其结合片段。
  116. 116. 一种试剂盒,其是用以治疗vWF介导的疾病或紊乱,该试剂盒包含权利要求第 1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段。
  117. 117. —种权利要求第1-43项中任一项的人源化抗体或其结合片段的用途,其是用于 非治疗性应用上。
  118. 118.权利要求第117项的用途,其中该非治疗性应用为诊断性测定。
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