CN101850167A - 一种提高pva降解速度的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高PVA降解速度的发酵方法。通过在发酵过程中添加1，4-丁二醇，提高了PVA降解速度。通过分批补料发酵方法和连续补料发酵方法，平均PVA降解速度分别达到了0.073g/L/h、0.150g/L/h和0.547g/L/h，与不添加1，4-丁二醇相比，平均降解速度分别提高了1.5倍、3.1倍和11.2倍，为消除PVA所导致的环境污染提供了一种可行的方法。本发明还具有操作简单、原料价格便宜等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高PVA降解速度的发酵方法，属于发酵工程领域，具体来说是一种通过添加1，4-丁二醇提高PVA降解速度的发酵方法。
背景技术
PVA是一种可生物降解的化工高分子聚合物。它具有良好的应用性能，例如：良好的热稳定性、很强的粘性和抗溶剂性等。但由于在自然环境下PVA的降解速度很低，大量废弃的PVA导致了严重的环境污染。关于提高PVA降解速度的研究主要分为两大类：(1)对PVA进行化学修饰。例如：Takasu曾报道用葡萄糖对PVA上的部分羟基进行糖基化修饰，可以加速PVA主链的生物降解；但也有报道称用邻苯二甲酸苷或乙醛修饰PVA的部分羟基后，PVA降解速度反而下降。(2)筛选能高效降解PVA的微生物。但结果显示各研究小组筛选得到的微生物对PVA的降解速度都处于较低的水平。所以仍然有必要寻找新的方法来提高PVA的降解速度。一种可行的方法就是用发酵的方法提高细胞对PVA的降解活力和细胞的生长活力，从而从整体上提高PVA的降解速度。在混合微生物相对高效降解PVA的基础上，本技术通过一种与PVA结构类似的小分子碳源(1，4-丁二醇)显著提高了PVA的降解速度。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种提高PVA降解速度的发酵方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：在混合微生物降解PVA的过程中，添加1，4-丁二醇。
所述1，4-丁二醇的添加方式为：在发酵36h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇；
所述1，4-丁二醇的添加方式为：在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇；
所述1，4-丁二醇的添加方式为：在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇，然后在发酵30h向发酵液中连续流加1，4-丁二醇，流加速度为0.3g/L/h。
所述混合微生物为从无锡太平洋纺织厂PVA退浆车间下水道口筛选出一个可以彻底降解培养基中1g/L PVA的混合微生物体系(Chen J，Zhang Y，Du G-C，Hua Z-Z，Zhu Y，Biodegradation of polyvinyl alcohol by a mixed microbial culture，Enzyme Microb.Technol.，2007，40(7)，1686-1691)。
混合微生物降解PVA的培养基组成为：
基础培养基(g/L)：酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
混合微生物降解PVA的过程为：
液体种子培养方法：500mL三角瓶装50mL基础培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养36h；
分批补料发酵法1：3L发酵罐装1.5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/LPVA1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)，接种150mL液体种子后，pH通过添加2.0mol/L HCl和2.0mol/L NaOH控制在7.20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min-3L/min)控制在60％饱和度，温度控制在30℃，在发酵36h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇；
分批补料发酵法2：3L发酵罐装1.5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/LPVA1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)，接种150mL液体种子后，pH通过添加2.0mol/L HCl和2.0mol/L NaOH控制在7.20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min-3L/min)控制在60％饱和度，温度控制在30℃，在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇；
连续补料发酵法：3L发酵罐装1.5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)，接种150mL液体种子后，pH通过添加2.0mol/L HCl和2.0mol/LNaOH控制在7.20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min-3L/min)控制在60％饱和度，温度控制在30℃，在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇，然后在发酵30h向发酵液中连续流加1，4-丁二醇，流加速度为0.3g/L/h。
PVA含量测定采用Finley法，具体方法为：
将发酵液离心(10000r/min，10min)，弃去沉淀，收集上清液。将上清液经微孔滤膜(孔径0.45μm，直径50mm)过滤，然后用0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)透析24h，即为粗酶液。在5×15试管中加入0.5mL粗酶液和0.5mL底物(1g/L PVA1799溶于pH 8.0的磷酸钾缓冲液中)，将此混合体系于35℃反应6h，分别测定反应前后反应混合液所对应PVA含量的吸光度。每分钟吸光度下降0.001定义为一个酶活单位。
1，4-丁二醇测定方法为：
首先向发酵液中添加65g/L的乙酸钙，然后将样品进行离心(10,000×g、10min)去除沉淀，收集上清液。将上清液经微孔滤膜(孔径0.45μm，直径50mm)过滤。然后用Waters 600HPLC System(Waters Corp.，USA)with an 2487UV detector检测1，4-丁二醇。固定相是WatersSugar-Pak1，流动相是0.4mL/min的去离子水。柱温为85℃。
细胞干重测定方法为：
将发酵液进行适当稀释后，在600nm下检测吸光值(OD)；细胞干重(DCW)的计算公式为：(DCW＝0.153×OD+0.014)。
混合微生物静止细胞降解PVA：
混合微生物在不同条件下进行培养，在发酵60h通过离心发酵液(10,000×g，10min)收集细胞，然后用磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH 7.0)清洗3次细胞，将含有1.0g/L(DCW)细胞和1.0g/L PVA的5mL反应液，在150rpm和30℃的条件下培养10h，检测培养前后PVA含量。
本发明采用的1，4-丁二醇是PVA的结构类似物，它在细胞内的代谢途径和PVA类似，因此它不会抑制PVA的降解。同时它作为一种小分子容易进入细胞并被代谢，能提高菌体的生长和代谢活力。所以1，4-丁二醇能提高细胞对PVA的降解活力和细胞的生长活力，从而从整体上提高PVA的降解速度。
本发明提高混合微生物对PVA的降解速度，平均PVA降解速度从0.049g/L/h提高到了0.547g/L/h，这为消除PVA所导致的环境污染提供了一种方法。本发明还具有操作简单、原料价格便宜、效果明显等优点。
附图说明
图1PVA降解速度曲线(■PVA(对比)/●PVA+1，4-丁二醇)和单位细胞PVA降解速度曲线(□PVA(对比)/○PVA+PVA+1，4-丁二醇)。
图2细胞生长曲线(DCW：-□-实施例3/---□---实施例2)和PVA降解曲线(PVA：-△-实施例3/---△---实施例2，单位细胞PVA降解速度：■实施例3/●实施例2/▲对比)。
具体实施方式
对比例：
1.培养基组成：
基础培养基(g/L)：酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
微生物培养方法：
3L发酵罐装1.5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)，接种150mL液体种子后，pH通过添加2.0mol/L HCl和2.0mol/L NaOH控制在7.20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min-3L/min)控制在60％饱和度，温度控制在30℃。
结果见表1，在不添加1，4-丁二醇的情况下，混合体系发酵结束后，平均PVA降解速度为0.049±0.0013g/L/h。在此发酵条件下，静止细胞对PVA的平均降解速度为0.025±0.0005g/L/h。
表1不同发酵条件下1，4-丁二醇对混合微生物体系降解PVA的影响
实施例1：分批补料发酵法1
培养基组成：
基础培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl20.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
1，4-丁二醇补料培养基(g/L)：1，4-丁二醇7.65，酵母粉3.0
微生物培养方法：
3L发酵罐装1.5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)，接种150mL液体种子后，pH通过添加2.0mol/L HCl和2.0mol/L NaOH控制在7.20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min-3L/min)控制在60％饱和度，温度控制在30℃，在发酵36h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇；
结果见表1，在发酵36h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇的情况下，混合体系发酵结束后，平均PVA降解速度为0.073±0.0015g/L/h，是对比的1.5倍。在此发酵条件下，静止细胞对PVA的平均降解速度为0.029±0.0003g/L/h，和对比基本一致。
实施例2：分批补料发酵法2
培养基组成：
基础培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
1，4-丁二醇补料培养基(g/L)：1，4-丁二醇7.65，酵母粉3.0
微生物培养方法：
3L发酵罐装1.5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)，接种150mL液体种子后，pH通过添加2.0mol/L HCl和2.0mol/L NaOH控制在7.20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min-3L/min)控制在60％饱和度，温度控制在30℃，在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇；
结果见表1，在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇的情况下，混合体系发酵结束后，平均PVA降解速度为0.150±0.0021g/L/h，是对比的3.1倍，是实施例1的2.1倍。如图1所示，在此发酵条件下，细胞对PVA的总降解速度显著高于对比；但单位细胞对PVA的降解速度和对比无显著差异。
实施例3：连续补料发酵法
培养基组成：
基础培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
1，4-丁二醇补料培养基(g/L)：1，4-丁二醇7.65，酵母粉3.0。
1，4-丁二醇流加培养基(g/L)：1，4-丁二醇7.65，酵母粉3.0。
微生物培养方法：
3L发酵罐装1.5L基础培养基，在基础培养基中加入5g/L PVA1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)，接种150mL液体种子后，pH通过添加2.0mol/L HCl和2.0mol/L NaOH控制在7.20，溶氧通过调节搅拌桨转速(200rpm-400rpm)和通气量(2L/min-3L/min)控制在60％饱和度，温度控制在30℃，在发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇，然后在发酵30h向发酵液中连续流加1，4-丁二醇，流加速度为0.3g/L/h。
如图2所示，在连续补料发酵法的情况下，在0h到48h实施例3和实施例2在PVA降解速度上无明显差距。但在48h到60h，实施例3单位细胞PVA降解速度得到了显著提高，这说明实施例3显著提高了细胞对PVA的降解活力，同时实施例3也显著提高了总的细胞量，所以混合微生物对PVA的总降解速度得到了显著的提高。结果见表1，实施例3的平均PVA降解速度为0.547±0.0027g/L/h，是对比的11.2倍。
Claims (4)
1.一种提高PVA降解速度的发酵方法，其特征在于，在混合微生物降解PVA的过程中添加1，4-丁二醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4-丁二醇的方法为：在混合微生物发酵36h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4-丁二醇的方法为：在混合微生物发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4-丁二醇的方法为：在混合微生物发酵21h向发酵液中一次性添加7.65g/L 1，4-丁二醇，然后在发酵30h向发酵液中连续流加1，4-丁二醇，流加速度为0.3g/L/h。
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