CN101843812A - 一种接骨七厘组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药组合物，具体涉及接骨七厘组合物及其制备方法。本发明提供的接骨七厘组合物，包括自然铜、土鳖虫、骨碎补、龙血竭、乳香、没药、当归、大黄、硼砂。本发明通过缺单味药材的接骨七厘组合物与全处方量组合物进行主要药效作用——促骨折愈合作用的比较，发现乳香、没药、骨碎补、龙血竭等六味药材对组合物的功效有重要贡献。本发明还创造性地选择了以上六味药材中可控的主要药效成分，并以该成分作为鉴别质量的依据。用不同标准限度的药材制备接骨七厘组合物进行药效比较，发现上述六味药材中任一单味或数味药材满足一定标准限度制备的接骨七厘组合物，药效明显优于均不满足要求的组合物。

Description

一种接骨七厘组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，具体涉及接骨七厘组合物及其制备方法。

背景技术

急性软组织扭挫伤及骨折是骨伤科临床常见病，随着工伤、交通事故的日趋增多，其发病率呈逐年上升趋势，迫切需要安全有效的内服及外用药物。治疗该类疾病主要采用中药(中成药)或手术疗法，目前国内治疗该类病的中成药众多，但见效快、疗效确切、用药疗程短的品种尚少。本发明所述接骨七厘制剂是湖南金沙药业有限公司(以下称金沙药业)独家生产的中药保护品种接骨七厘片，该药品经湖南省中医药研究院、湖南中医学院第一附属医院及湖南中医学院第二附属医院大量的临床研究观察表明，具有良好的消肿止痛，活血化瘀及接骨止痛的作用，作用迅速，服用携带方便，对于急性软组织扭挫伤和骨折愈合具有较好的治疗作用。该药品1997年被列为国家中药保护品种，1999年被列为国家基本医疗保险药品。

目前国内的中药复方制剂在制备时一般仅控制其中便于测定的单味药材中的单一指标，没有科学的对处方中药味应该控制的指标进行系统的药效贡献研究，而单个的指标成分并不能全面代表处方的功效，也不能通过控制单个成分来保证药品的疗效。

本发明所述接骨七厘制剂已列入国家法定标准，由自然铜(煅)、土鳖虫、骨碎补、龙血竭、乳香(炒)、没药(炒)、当归、大黄(酒炒)、硼砂制成。接骨七厘片的原质量标准收载于国家药品部颁标准，仅有显微鉴别和化学鉴别各1项，经金沙药业增加当归、大黄的薄层鉴别提高质量标准后重新申请修订了国家标准。

发明内容

本发明提供一种治疗骨伤科疾病疗效确切的中药品种接骨七厘组合物的制备方法，研究发现通过采用本发明中的方法控制处方中对药效有重要贡献的六味药材的质量，制备出的接骨七厘组合物，较不符合要求的组合物疗效有显著性的提高。

本发明的提供的接骨七厘组合物，包括自然铜(煅)、土鳖虫、骨碎补、龙血竭、乳香(炒)、没药(炒)、当归、大黄(酒炒)、硼砂；其中乳香、没药、骨碎补、龙血竭、大黄、当归6位药材中至少一位的质量要求如下：

乳香药材中11-羰基-β-乙酰乳香酸重量百分含量(下同)不得少于1.0％，组合物中不得低于0.08％；

没药药材中β-榄香烯含量不得少于0.1％，组合物中不得低于0.008％；

骨碎补药材中柚皮苷含量不得少于0.3％，组合物中不得低于0.038％；

龙血竭药材含龙血素A和龙血素B含量之和不得少于0.6％，组合物中不得低于0.075％；

大黄药材含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量之和不得少于1.5％，组合物中不得低于0.125％；

当归中阿魏酸含量应不得低于0.05％，组合物中不得低于0.006％。

本发明还提出该六位药材的质量鉴别方法和质量控制成分的分析方法。

1)乳香质量要求

(1)药材或组合物中定性TLC鉴别

取组合物粉末2g，加无水乙醇10ml，密塞，振摇20min，置50℃水浴上温浸1h，取出，冷却，吸取上清液，作为供试品溶液；另取乳香药材和乳香对照药材0.2g；同供试品溶液制法制成药材溶液和对照药材溶液；吸取以上3种溶液各5～10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60℃-90℃)-醋酸乙酯-甲苯(20∶3∶3)为展开剂，展开取出，晾干，喷3％香草醛硫酸乙醇溶液，105℃加热约5min至斑点显色清晰。供试品色谱和药材色谱在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；

(2)乳香药材或组合物中11-羰基-β-乙酰乳香酸的含量

色谱条件：HPLC法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％水(79∶21)为流动相，检测波长为249nm；

对照品溶液制备：

精密称取11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品适量，加甲醇溶解制成约60μg/ml的溶液，即得；

供试品溶液制备：

取组合物粉末约4g或乳香药材粉末0.4g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇40mL，超声处理30min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

乳香药材中11-羰基-β-乙酰乳香酸含量不得少于1.0％，组合物中不得低于0.08％，制成制剂如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)以损耗20％计则不低于0.2mg/片。

2、没药

(1)药材和组合物中定性TLC鉴别

取组合物粉末约2g，加无水乙醇10ml，密塞，振摇20min，置50℃水浴上温浸1h，取出，冷却，吸取上清液，作为供试品溶液。另各取没药药材和没药对照药材0.2g，同供试品溶液制法制成药材溶液和对照药材溶液。吸取以上3种溶液各5～10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60℃-90℃)-乙酸乙酯-甲苯(20∶3∶3)为展开剂，展开取出，晾干，喷3％香草醛硫酸乙醇溶液，105℃～110℃加热5min。供试品色谱和药材色谱在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。

(2)没药药材或组合物中β-榄香烯的含量

色谱条件气相色谱仪，FID检测器，载气氮气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：150℃，20℃/min，250℃；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃；进样量2μl。

对照品溶液的制备：精密称取β-榄香烯对照品适量，以丙酮溶解制成1mg/ml的溶液，即为对照品溶液。

供试品溶液的制备：称组合物粉末约10g或没药药材粉末1.0g，精密称定，依2005年版《中国药典》一部提取没药挥发油，用无水Na₂SO₄脱水，取所得挥发油用丙酮溶解并稀释至10ml，作为供试品溶液。

制成制剂如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)以损耗20％计则β-榄香烯不低于0.02mg/片。

3、骨碎补

(1)药材和组合物中定性TLC鉴别

取组合物粉末约3g或骨碎补药材粉末0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml，回流提取2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1.0ml使溶解，作为供试品溶液和药材溶液。另取骨碎补对照药材粉末0.4g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液20μl、药材溶液和对照药材溶液各10μl，分别点于同硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水(1∶12∶2.5∶3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱和药材色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(2)骨碎补或组合物中的柚皮苷含量

色谱条件与系统适用性实验HPLC法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2％磷酸溶液(28∶72)为流动相；检测波长为283nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备  精密称取在110℃干燥至恒重的柚皮苷对照品10mg，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1ml含柚皮苷40μg)。

供试品溶液的制备  取组合物粉末约3g或骨碎补药材粉末0.4g，精密称定，取约1g，置具塞锥形瓶中，加水饱和的正丁醇40ml，超声处理(功率500W，频率40kHz)2次，每次20分钟，滤过，用适量水饱和的正丁醇洗涤滤渣及容器，合并滤液及洗涤液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液5μl、供试品溶液和药材溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

制成制剂如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)以损耗20％计则柚皮苷不低于0.09mg/片。

4、龙血竭

(1)龙血竭或组合物粉末中定性TLC鉴别

取组合物粉末约1.5g，加乙醇50ml，水浴回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取龙血竭药材和龙血竭对照药材0.2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述3种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇(97∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点清晰。供试品色谱和药材色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)龙血竭或组合物中龙血素A和龙血素B含量测定条件

色谱条件：HPLC法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液(34∶66)为流动相；检测波长为278nm。理论板数按龙血素B峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备分别精密称取龙血素A和B对照品适量，加甲醇制成每1ml各含15μg的溶液，作为对照品混合溶液。

供试品溶液的制备：取组合物粉末约6g或龙血竭药材粉末0.8g，精密称定，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇40ml，加热回流提取2小时，放冷，滤过，用少量甲醇分次洗涤药渣及锥形瓶，洗液一起并入50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和药材溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，并计算含量。

制成制剂如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)以损耗20％计则龙血素A和龙血素B含量不低于0.018mg/片。

5、大黄

(1)药材和组合物粉末中定性TLC鉴别

取组合物约4g或大黄药材0.4g，加稀盐酸25ml、氯仿40ml，置水浴上加热回流1小时，放冷，分取氯仿层，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液和药材溶液。另取大黄素、大黄酚对照品，分别加甲醇制成每1ml中各含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录VI B)试验，吸取上述3种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。置氨气中熏后，目光下检视，供试品色谱和药材色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)大黄或组合物中蒽醌类化合物的含量测定条件

色谱条件HPLC法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-水-醋酸(90∶10∶1)；检测波长：254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各80μg，大黄素甲醚40μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得(每1ml中含芦会大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16μg，含大黄素甲醚8μg)。

供试品溶液的制备取组合物粉末约2g或大黄药材0.2g，置烧瓶中，精密加甲醇50mL，称重，浸泡1h，置水浴上回流1h，取下烧瓶，放至室温，称重，补足损失的重量，混匀，过滤，滤液即为供试品溶液或药材溶液。

测定法分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液与药材溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

制成制剂如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)以损耗20％计则蒽醌类化合物不低于0.3mg/片。

6、当归

(1)药材和组合物粉末中定性TLC鉴别

定性方法：以当归对照药材为对照或者以阿魏酸对照品为对照，进行TLC薄层研究。

取组合物粉末约8g，加乙醚30ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另各取当归药材和当归对照药材1g，加乙醚10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液作为药材溶液和对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液5～10μl、药材和对照药材溶液各2～3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品和药材色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(2)当归或组合物中阿魏酸的含量测定条件

色谱条件与系统适用性试验  高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-5％醋酸溶液(30∶70)为流动相；检测波长为320nm，理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制  备取经五氧化二磷减压干燥24小时后的阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备  取组合物粉末约3g或当归药材粉末0.4g，精密称定，研细，精密称取适量(约1.0g)，置具塞锥形瓶中，加水50ml，回流提取1小时，滤过，滤液浓缩至约30ml时，加稀盐酸调节pH1～2，用乙醚振摇提取4次，每次30ml，合并乙醚液，挥干，残渣用甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

制成制剂如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)以损耗20％计则阿魏酸不低于0.015mg/片。

本发明还提供接骨七厘制剂的制备方法：

(1)接骨七厘药物组成及重量配比

乳香(炒)、没药(炒)、硼砂、自然铜(煅)、大黄(酒炒)各占8.3％，当归、骨碎补、龙血竭各占12.5％，土鳖虫20.8％。

(2)通过合并粉碎或各味药材单独粉碎；

(3)取粉碎过100目的接骨七厘药物粉末，混合均匀，制成接骨七厘散剂；或加入蜂蜜制成接骨七厘蜜丸；或加入蜂蜜水制成水蜜丸；或加入黄酒、蔗糖水、水制成接骨七厘水丸；或加入米粉、米护、面糊制成接骨七厘糊丸；

(4)取粉碎过80目的接骨七厘药物粉末，混合均匀，加入辅料，制粒，干燥，压片，包衣，制成接骨七厘片剂；

(5)取粉碎过80目的接骨七厘药物粉末，混合均匀，加入辅料，制粒，干燥，填充胶囊，制成接骨七厘胶囊。

本发明首先通过缺单味药材的接骨七厘组合物与全处方量组合物进行主要药效作用——促骨折愈合作用的比较，发现乳香、没药、骨碎补、龙血竭等六味药材对组合物的功效有重要贡献。

本发明还创造性地选择了以上六味药材中可控的主要药效成分，并以该成分作为鉴别质量的依据。用不同标准限度的药材制备接骨七厘组合物进行药效比较，发现上述六味药材中任一单味或数味药材满足一定标准限度制备的接骨七厘组合物，药效明显优于均不满足要求的组合物。

具体实施方式

实施例1

缺味接骨七厘组合物对促骨折愈合作用的影响试验

1.实验材料：

1.1.受试药物：缺味接骨七厘组合物，共10种。

接骨七厘组合物全组方药材

乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g，全组方共计120g。

缺味样品制备

接骨七厘缺味样品制备步骤：①分别粉碎各味药材过80目筛。②除缺味药材外，其余药材按全组方数量称取粉末混合，加入微晶纤维素补足120g，合并研匀即可。

样品组1(缺乳香)

样品组2(缺没药)

样品组3(缺当归)

样品组4(缺土鳖虫)

样品组5(缺骨碎补)

样品组6(缺硼砂)

样品组7(缺龙血竭)

样品组8(缺自然铜)

样品组9(缺大黄)

对照组：不缺味的接骨七厘组合物

1.2.试验动物：健康雄性SD大鼠(200-220g)。

2.实验方法：

2.1.骨折动物模型制作：每只大鼠称重，记录，编号，以10％水合氯醛麻醉，切开大鼠左前臂前面桡侧皮肤(切口长1.5cm)及皮下组织，显露旋前圆肌和部分桡骨，在旋前圆肌止点远端用剪刀剪断桡骨，保留尺骨作为支撑作用，缝合切口，不做任何外固定，分笼饲养。术后进行3天抗感染治疗。

2.2.动物给药：造模后随机分成模型组(灌胃给予生理盐水)和药物处理组(10组，分别接骨七厘片不同缺味制剂，每日灌胃给予0.3g/kg)。术后第1天开始给药，连续4周。每组12只。术后在相同条件下，分组按常规饲养管理，观察各组动物术后精神、饮食、活动情况及患肢肿胀瘀斑的出现和消退时间，术后第6日起采用伤口间断拆线观察伤口愈合时间。各组动物在第14天和试验结束时空气栓塞法每组处死3只，检测骨痂重量、病理学观察及血血液流变学指标测定。

2.3.骨痂测定：桡骨重量差异即可反映骨痂重量，用药后大鼠骨折前2周为骨折恢复期，2周时为骨痂形成高峰期，后2周为骨痂吸收期，4周后桡骨重量差异应变小。测定时于腕关节处离断，取下左前臂，4％多聚甲醛4℃下固定48h，相同方法取下右前臂，固定，保存。仔细修剪剔除标本的骨骼肌、软组织，以丙酮与乙醚液(1∶1)浸泡24h脱脂，流水冲洗后放置入烘箱110℃烘干至恒重，称量骨折侧、健侧桡骨重量。

3.实验结果

表1接骨七厘片不同缺味制剂对骨痂重量的影响(均数±标准差，n＝12)

注：所有样品组2周后桡骨重量差与模型组比较，P＜0.05以上；

样品组2周桡骨重量差与对照组比较：***表示P＜0.001，**表示P＜0.01，#表示P＞0.10。

试验结果表明，全处方接骨七厘组合物在第2周时骨痂增重较大，后2周为恢复吸收期，桡骨重量差减少。服用不同缺味接骨七厘组合物的大鼠2周后骨愈合速度均明显快于未用药的模型大鼠，样品组1、2、3、5、7、9在前2周的骨痂增重显著慢于不缺味对照组，且后2周骨痂基本上仍继续增重，恢复吸收期较慢，说明这6个样品组缺药味后的骨愈合速度明显受到影响。亦即表明，缺味药材乳香、没药、当归、骨碎补、龙血竭和大黄六味药材是对接骨七厘处方功能药效贡献较大的主要药味。

实施例2

不同质量要求的乳香对接骨七厘组合物促骨折愈合作用的影响试验

根据接骨七厘制剂活血化瘀，接骨止痛的主要功效，分析乳香中相关化学成分，选择11-羰基-β-乙酰乳香酸为代表的定量指标，同时与乳香对照药材比较薄层鉴别是否一致也作为等级指标。将乳香药材分为五等：(1)薄层鉴别符合要求，11-羰基-β-乙酰乳香酸含量大于2.0％；(2)薄层鉴别符合要求，11-羰基-β-乙酰乳香酸含量在1.0％～2.0％之间；(3)薄层鉴别符合要求，11-羰基-β-乙酰乳香酸含量在0.5％～1.0％之间；(4)薄层鉴别符合要求，11-羰基-β-乙酰乳香酸含量低于0.5％；(5)薄层鉴别不符合要求。

1.实验材料：

1.1.受试药物：5组全方接骨七厘组合物

乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g，全组方共计120g。

样品制备步骤：①除乳香其他各味药材均采用统货，分别粉碎过80目筛。②乳香按上述等级称取规定数量，其余药材粉末按组方数量称取粉末混合，合并研匀即可。

1.2.试验动物：健康雄性SD大鼠(200-220g)，6组，每组12只。

2.实验方法：同实施例1。

3.实验结果

表2不同质量乳香对接骨七厘组合物促骨愈合作用的影响(均数±标准差，n＝12)

注：所有样品组2周后桡骨重量差与模型组比较，P＜0.01；

每个样品组与质量要求较低的相邻组比较2周后的桡骨重量差异，*表示P＜0.05，#表示P＞0.10。

试验结果表明，随着乳香质量要求的逐步提高，接骨七厘组合物的促骨愈合作用增强，当乳香质量要求符合样品组2要求时，与质量较低样品第3组比较，组合物的促骨愈合作用显著增强，有统计学差异，因此可拟定乳香中含11-羰基-β-乙酰乳香酸含量符合第2组要求，即不得少于1.0％，作为接骨七厘组合物疗效较好的保证。根据乳香在组合物中比例，拟定组合物中不得低于0.08％；制成制剂过程中以有效成分损失20％计，如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)，则应含11-羰基-β-乙酰乳香酸不低于0.2mg/片。

实施例3

不同质量要求的没药对接骨七厘组合物促骨折愈合作用的影响试验

根据接骨七厘制剂的主要功效，分析没药中相关化学成分，选择β-榄香烯为代表作为定量指标，同时与没药对照药材比较薄层鉴别是否一致也作为等级指标，将没药药材分为五等：(1)薄层鉴别符合要求，β-榄香烯含量大于0.4％；(2)薄层鉴别符合要求，β-榄香烯在0.2％～0.4％之间；(3)薄层鉴别符合要求，β-榄香烯含量在0.1％～0.2％之间；(4)薄层鉴别符合要求，β-榄香烯含量低于0.1％；(5)薄层鉴别不符合要求。

1.实验材料：

1.1.受试药物：5组全方接骨七厘组合物

乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g，全组方共计120g。

样品制备步骤：①除没药外其他各味药材均采用统货，分别粉碎过80目筛。②没药按上述等级称取规定数量，其余药材粉末按组方数量称取粉末混合，合并研匀即可。

1.2.试验动物：健康雄性SD大鼠(200-220g)，6组，每组12只。

2.实验方法：同实施例1。

3.实验结果

表3不同质量没药对接骨七厘组合物促骨愈合作用的影响(均数±标准差，n＝12)

注：所有样品组2周后桡骨重量差与模型组比较，P＜0.01；

每个样品组与质量要求较低的相邻组比较2周后的桡骨重量差异，*表示P＜0.05，#表示P＞0.10。

试验结果表明，随着没药质量要求的逐步提高，接骨七厘组合物的促骨愈合作用增强，当没药质量要求符合样品组3要求时，与质量较低样品第4组比较，组合物的促骨愈合作用显著增强，有统计学差异，其余各样品组间均无显著性差异，因此拟定没药药材中β-榄香烯应符合第3组要求，即不得少于0.1％，以作为接骨七厘组合物疗效较好的保证。根据没药在组合物中比例，应规定组合物中不得低于0.008％；制成制剂过程中以有效成分损失20％计，如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)则应含β-榄香烯不低于0.02mg/片。

实施例4

不同质量要求的骨碎补对接骨七厘组合物促骨折愈合作用的影响试验

根据接骨七厘制剂的主要功效，分析骨碎补中相关化学成分，选择柚皮苷为代表作为定量指标，同时与骨碎补对照药材比较薄层鉴别是否一致作为等级指标(实际检测结果购入骨碎补药材薄层鉴别均符合要求)，将骨碎补药材分为四等：(1)薄层鉴别符合要求，含量大于0.6％；(2)薄层鉴别符合要求，柚皮苷在0.3％～0.6％之间；(3)薄层鉴别符合要求，柚皮苷含量在0.1％～0.3％之间；(4)薄层鉴别符合要求，柚皮苷含量低于0.1％。

1.实验材料：

1.1.受试药物：4组全方接骨七厘组合物

乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g，全组方共计120g。

样品制备步骤：①除骨碎补外其他各味药材均采用统货，分别粉碎过80目筛。②骨碎补按上述等级称取规定数量，其余药材粉末按组方数量称取粉末混合，合并研匀即可。

1.2.试验动物：健康雄性SD大鼠(200-220g)，5组，每组12只。

2.实验方法：同实施例1。

3.实验结果

表4不同质量骨碎补药材对接骨七厘组合物促骨愈合作用的影响(均数±标准差，n＝12)

注：所有样品组2周后桡骨重量差与模型组比较，P＜0.01；

每个样品组与质量要求较低的相邻组比较2周后的桡骨重量差异，*表示P＜0.05，#表示P＞0.10。

试验结果表明，随着骨碎补质量要求的逐步提高，接骨七厘组合物的促骨愈合作用增强，当骨碎补质量要求符合样品组2要求时，与质量较低样品第3组比较，组合物的促骨愈合作用显著增强，有统计学差异，其余各样品组间均无显著性差异，因此拟定骨碎补药材中柚皮苷应符合第2组要求，即不得少于0.3％，以作为接骨七厘组合物疗效较好的保证。根据骨碎补在组合物中比例，应规定组合物中不得低于0.038％；制成制剂过程中以有效成分损失20％计，如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)则应含柚皮苷不低于0.09mg/片。

实施例5

不同质量要求的龙血竭对接骨七厘组合物促骨折愈合作用的影响试验

根据接骨七厘制剂的主要功效，分析龙血竭中相关化学成分，选择龙血素A和龙血素B总含量为代表作为定量指标，同时与对照药材比较薄层鉴别是否一致作为等级指标，将龙血竭药材分为五等：(1)薄层鉴别符合要求，龙血素A和龙血素B总含量大于1.2％；(2)薄层鉴别符合要求，龙血素A和龙血素总含量在0.6％～1.2％之间；(3)薄层鉴别符合要求，龙血素A和龙血素B总含量在0.3％～0.6％之间；(4)薄层鉴别符合要求，龙血素A和龙血素B总含量低于0.3％；(5)薄层鉴别不符合要求。

1.实验材料：

1.1.受试药物：5组全方接骨七厘组合物

乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g，全组方共计120g。

样品制备步骤：①除龙血竭外其他各味药材均采用统货，分别粉碎过80目筛。②龙血竭按上述等级称取规定数量，其余药材粉末按组方数量称取粉末混合，合并研匀即可。

1.2.试验动物：健康雄性SD大鼠(200-220g)，6组，每组12只。

2.实验方法：同实施例1。

3.实验结果

表5不同质量龙血竭对接骨七厘组合物促骨愈合作用的影响(均数±标准差，n＝12)

注：所有样品组2周后桡骨重量差与模型组比较，P＜0.01；

每个样品组与质量要求较低的相邻组比较2周后的桡骨重量差异，**表示P＜0.01，#表示P＞0.10。

试验结果表明，随着龙血竭质量要求的逐步提高，接骨七厘组合物的促骨愈合作用增强，当龙血竭质量要求符合样品组2要求时，与质量较低样品第3组比较，组合物的促骨愈合作用有非常显著的统计学差异，其余各样品组间均无显著性差异，因此拟定龙血竭药材中龙血素A和龙血素B总含量应符合第2组要求，即不得少于0.6％，以作为接骨七厘组合物疗效较好的保证。根据龙血竭在组合物中比例，应规定组合物中不得低于0.075％；制成制剂过程中以有效成分损失20％计，如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)则应含龙血素A和龙血素B总量不低于0.18mg/片。

实施例6

不同质量要求的大黄对接骨七厘组合物促骨折愈合作用的影响试验

根据接骨七厘制剂的主要功效，分析大黄中相关化学成分，选择五种蒽醌类化合物(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚)的总含量为代表作为定量指标，同时与对照药材比较薄层鉴别是否一致作为等级指标，将大黄药材分为五等：(1)薄层鉴别符合要求，五种蒽醌含量大于3.0％；(2)薄层鉴别符合要求，五种蒽醌含量在1.5％～3.0％之间；(3)薄层鉴别符合要求，五种蒽醌含量在0.8％～1.5％之间；(4)薄层鉴别符合要求，五种蒽醌含量低于0.8％；(5)薄层鉴别不符合要求。

1.实验材料：

1.1.受试药物：5组全方接骨七厘组合物

乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g，全组方共计120g。

样品制备步骤：①除大黄外其他各味药材均采用统货，分别粉碎过80目筛。②大黄按上述等级称取规定数量，其余药材粉末按组方数量称取粉末混合，合并研匀即可。

1.2.试验动物：健康雄性SD大鼠(200-220g)，6组，每组12只。

2.实验方法：同实施例1。

3.实验结果

表6不同质量大黄对接骨七厘组合物促骨愈合作用的影响(均数±标准差，n＝12)

注：所有样品组2周后桡骨重量差与模型组比较，P＜0.01；

每个样品组与质量要求较低的相邻组比较2周后的桡骨重量差异，*表示P＜0.05，#表示P＞0.10。

试验结果表明，随着大黄质量要求的逐步提高，接骨七厘组合物的促骨愈合作用增强，当大黄质量要求符合样品组2要求时，与质量较低样品第3组比较，组合物的促骨愈合作用有显著统计学差异，其余各样品组间均无显著性差异，因此拟定大黄药材中五种蒽醌含量应符合第2组要求，即不得少于1.5％，以作为接骨七厘组合物疗效较好的保证。根据大黄在组合物中比例，应规定组合物中不得低于0.125％；制成制剂过程中以有效成分损失20％计，如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)则应含五种蒽醌量不低于0.3mg/片。

实施例7

不同质量要求的当归对接骨七厘组合物促骨折愈合作用的影响试验

根据接骨七厘制剂的主要功效，分析当归中相关化学成分，选择阿魏酸为代表作为定量指标，同时与对照药材比较薄层鉴别是否一致作为等级指标(经检测市场各种含量药材的薄层鉴别符合要求)，将当归药材分为四等：(1)薄层鉴别符合要求，阿魏酸含量大于0.10％；(2)薄层鉴别符合要求，阿魏酸含量在0.05％～0.10％之间；(3)薄层鉴别符合要求，阿魏酸含量在0.02％～0.05％之间；(4)薄层鉴别符合要求，阿魏酸含量低于0.02％。

1.实验材料：

1.1.受试药物：4组全方接骨七厘组合物

乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g，全组方共计120g。

样品制备步骤：①除当归外其他各味药材均采用统货，分别粉碎过80目筛。②当归按上述等级称取规定数量，其余药材粉末按组方数量称取粉末混合，合并研匀即可。

1.2.试验动物：健康雄性SD大鼠(200-220g)，5组，每组12只。

2.实验方法：同实施例1。

3.实验结果

表7不同质量当归药材对接骨七厘组合物促骨愈合作用的影响(均数±标准差，n＝12)

注：所有样品组2周后桡骨重量差与模型组比较，P＜0.01；

每个样品组与质量要求较低的相邻组比较2周后的桡骨重量差异，*表示P＜0.05，#表示P＞0.10。

试验结果表明，随着当归质量要求的逐步提高，接骨七厘组合物的促骨愈合作用增强，在当归质量要求符合样品组2要求时，与质量较低样品第3组比较，组合物的促骨愈合作用显著增强，有统计学差异，其余各样品组间均无显著性差异，因此拟定当归药材中阿魏酸应符合第2组要求，即不得少于0.3％，以作为接骨七厘组合物疗效较好的保证。根据当归在组合物中比例，应规定组合物中不得低于0.006％；制成制剂过程中以有效成分损失20％计，如接骨七厘片(含组合物0.3g/片)则应含阿魏酸不低于0.015mg/片。

实施例8

同时控制数味关键药材的质量对接骨七厘组合物促骨折愈合作用的影响试验

根据以上试验的结果，发现在其他药材采用市场统货的情况下，控制单味关键药材能显著提高组合物的药效，因此分别规定了6味关键药材的质量控制标准。现同时控制数味关键药材，观察对接骨七厘组合物药效的影响。

1.实验材料：

1.1.受试药物：5组全方接骨七厘组合物

样品制备步骤：①根据以上实验结果及规定的药材控制限度，6味关键药材均取2种，一种薄层鉴别和指标成分均符合规定，另一种薄层鉴别符合，指标成分低于规定限度；②其余3味药材均采用统货，所有药材分别粉碎过80目筛；③按表8中规定及数量组合各味药材粉末，合并研匀即可。样品1为6味关键药材均低于规定限度，样品2～6为分别有2～6味关键药材符合质量控制限度。

组合物称取数量：乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g，全组方共计120g。

表8同时控制数味关键药材的接骨七厘组合物样品制备表

注：“√”为符合规定限度药材，“○”为低于限度药材，其他3味统货药材亦采用“○”表示。

1.2.试验动物：健康雄性SD大鼠(200-220g)，7组，每组12只。

2.实验方法：同实施例1。

3.实验结果

表9控制数味关键药材对接骨七厘组合物促骨愈合作用的影响(均数±标准差，n＝12)

注：所有样品组2周后桡骨重量差与模型组比较，P＜0.01；

样品2～6组均与样品1组比较，2周时桡骨重量差异，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。

试验结果表明，同时控制接骨七厘组方六味关键药材中的2至6味制成的组合物，相对于六味药材均不符合要求的组合物，其促骨愈合作用有明显增强，均具有统计学意义；而同时控制2味及以上的关键药味，组合物的药效有增加的趋势，但不明显。

通过以上试验表明，在接骨七厘制剂中按本发明规定的质量控制限度，控制乳香、没药、骨碎补、龙血竭、大黄、当归六味药材中的单味或多味，能显著的提高接骨七厘组合物的药效作用。

实施例9

控制2味关键药材制成优质接骨七厘片

处方：乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g

药材质量要求：其中乳香的薄层鉴别与对照药材相符，含11-羰基-β-乙酰乳香酸为3.8％；没药薄层鉴别与对照药材相符，含β-榄香烯为0.24％；其余药材采用市场统货。

制法：取以上药材，分别粉碎过80目筛，称取规定数量，混合均匀，加入蔗糖粉10g，15％淀粉浆制软材，过16目筛制粒，70℃烘干，整粒，加入崩解剂羧甲基淀粉钠4g，润滑剂硬脂酸镁0.6g，压片，制成400片，即可。

制剂检测结果：①薄层鉴别与乳香对照药材相符；②薄层鉴别与没药对照药材相符；③含11-羰基-β-乙酰乳香酸为0.78mg/片；④含β-榄香烯为0.051mg/片。

实施例10

控制4味关键药材制成的优质接骨七厘丸

处方：乳香(炒)100g、没药(炒)100g、当归150g、土鳖虫250g、骨碎补150g、硼砂100g、龙血竭150g、自然铜(煅)100g、大黄(酒炒)100g

药材质量要求：其中骨碎补的薄层鉴别与对照药材相符，含柚皮苷为0.47％；龙血竭薄层鉴别与对照药材相符，含龙血素A和龙血素B总量为0.92％；大黄的薄层鉴别与对照药材相符，含五种蒽醌的总量为2.4％；当归的薄层鉴别与对照药材相符，含阿魏酸量为0.065％；其余药材采用市场统货。

制法：取以上药材，分别粉碎过100目筛，称取规定数量，混合均匀，配制15％的蔗糖水，制软材，挤压成条，制丸，70℃干燥，抛光，制成1200g水丸，即可。

制剂检测结果：①薄层鉴别与骨碎补、龙血竭、大黄、当归对照药材相符；②含柚皮苷0.51mg/g；③含龙血素A和龙血素B总量为1.07mg/g；④含大黄中五种蒽醌总量为1.71mg/g；⑤含阿魏酸量为0.07mg/g。

实施例11

控制1味关键药材制成优质接骨七厘散

处方：乳香(炒)10g、没药(炒)10g、当归15g、土鳖虫25g、骨碎补15g、硼砂10g、龙血竭15g、自然铜(煅)10g、大黄(酒炒)10g

药材质量要求：其中骨碎补的薄层鉴别与对照药材相符，含柚皮苷为0.47％；其余药材采用市场统货。

制法：取以上药材，分别粉碎过100目筛，称取规定数量，混合均匀，即可。

制剂检测结果：①薄层鉴别与骨碎补对照药材相符；②含柚皮苷0.54mg/g。

Claims (4)

1.接骨七厘组合物，包括自然铜、土鳖虫、骨碎补、龙血竭、乳香、没药、当归、大黄、硼砂；其中乳香、没药、骨碎补、龙血竭、大黄、当归6位药材中至少一位的质量要求如下：

乳香药材中11-羰基-β-乙酰乳香酸含量不得少于1.0％，组合物中不得低于0.08％；

没药药材中β-榄香烯含量不得少于0.1％，组合物中不得低于0.008％；

骨碎补药材中柚皮苷含量不得少于0.3％，组合物中不得低于0.038％；

龙血竭药材含龙血素A和龙血素B含量之和不得少于0.6％，组合物中不得低于0.075％；

大黄药材含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量之和不得少于1.5％，组合物中不得低于0.125％；

当归中阿魏酸含量应不得低于0.05％，组合物中不得低于0.006％。

2.根据权利要求1所述的接骨七厘组合物，其特征在于：

1)乳香药材或组合物中11-羰基-β-乙酰乳香酸的含量测定条件如下：

色谱条件：HPLC法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％水(79∶21)为流动相，检测波长为249nm；

对照品溶液制备：精密称取11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品适量，加甲醇溶解制成约60μg/ml的溶液，即得；

供试品溶液制备：取组合物粉末约4g或乳香药材粉末0.4g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇40mL，超声处理30min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

2)没药药材或组合物中β-榄香烯的含量测定条件

色谱条件：气相色谱仪，FID检测器，载气氮气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：150℃，20℃/min，250℃；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃；进样量2μl；

对照品溶液的制备：精密称取β-榄香烯对照品适量，以丙酮溶解制成1mg/ml的溶液，即为对照品溶液；

供试品溶液的制备：称组合物粉末约10g或没药药材粉末1.0g，精密称定，依2005年版《中国药典》一部提取没药挥发油，用无水Na₂SO₄脱水，取所得挥发油用丙酮溶解并稀释至10ml，作为供试品溶液；

3)骨碎补或组合物中柚皮苷的含量测定条件

色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2％磷酸溶液(28∶72)为流动相；检测波长为283nm，理论板数按柚皮苷峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取在110℃干燥至恒重的柚皮苷对照品10mg，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每1ml含柚皮苷40μg；

供试品溶液的制备：取组合物粉末约3g或骨碎补药材粉末0.4g，精密称定，取约1g，置具塞锥形瓶中，加水饱和的正丁醇40ml，超声处理2次，每次20分钟，滤过，用适量水饱和的正丁醇洗涤滤渣及容器，合并滤液及洗涤液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

4)龙血竭或组合物中龙血素A和龙血素B含量测定条件

色谱条件：HPLC法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸溶液(34∶66)为流动相；检测波长为278nm，理论板数按龙血素B峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：分别精密称取龙血素A和B对照品适量，加甲醇制成每1ml各含15μg的溶液，作为对照品混合溶液；

供试品溶液的制备：取组合物粉末约6g或龙血竭药材粉末0.8g，精密称定，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇40ml，加热回流提取2小时，放冷，滤过，用少量甲醇分次洗涤药渣及锥形瓶，洗液一起并入50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得；

5)大黄或组合物中蒽醌类化合物的含量测定条件

色谱条件：HPLC法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相∶甲醇-水-醋酸(90∶10∶1)；检测波长：254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各80μg，大黄素甲醚40μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得每1ml中含芦会大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16μg，含大黄素甲醚8μg；

供试品溶液的制备：取组合物粉末约2g或大黄药材0.2g，置烧瓶中，精密加甲醇50mL，称重，浸泡1h，置水浴上回流1h，取下烧瓶，放至室温，称重，补足损失的重量，混匀，过滤，滤液即为供试品溶液或药材溶液；

6)当归或组合物中阿魏酸的含量测定条件

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-5％醋酸溶液(30∶70)为流动相；检测波长为320nm，理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取经五氧化二磷减压干燥24小时后的阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取组合物粉末约3g或当归药材粉末0.4g，精密称定，研细，精密称取适量，置具塞锥形瓶中，加水50ml，回流提取1小时，滤过，滤液浓缩至约30ml时，加稀盐酸调节pH1～2，用乙醚振摇提取4次，每次30ml，合并乙醚液，挥干，残渣用甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3.根据权利要求1所述的接骨七厘组合物，其特征在于：制备成制剂后，各位药材中控制成分的含量要求是：

11-羰基-β-乙酰乳香酸含量不低于0.2mg/片；

β-榄香烯不低于0.02mg/片；

柚皮苷不低于0.09mg/片；

龙血素A和龙血素B含量不低于0.018mg/片；

蒽醌类化合物不低于0.3mg/片；

阿魏酸不低于0.015mg/片。

4.接骨七厘制剂的制备方法：

(1)接骨七厘药物组成及重量配比：

乳香、没药、硼砂、自然铜、大黄各占8.3％，当归、骨碎补、龙血竭各占12.5％，土鳖虫20.8％；

(2)通过合并粉碎或各味药材单独粉碎；

(3)取粉碎过100目的接骨七厘药物粉末，混合均匀，制成接骨七厘散剂；或加入蜂蜜制成接骨七厘蜜丸；或加入蜂蜜水制成水蜜丸；或加入黄酒、蔗糖水、水制成接骨七厘水丸；或加入米粉、米护、面糊制成接骨七厘糊丸；

(4)取粉碎过80目的接骨七厘药物粉末，混合均匀加入辅料，制粒，干燥，压片，包衣，制成接骨七厘片剂；

(5)取粉碎过80目的接骨七厘药物粉末，混合均匀，加入辅料，制粒，干燥，填充胶囊，制成接骨七厘胶囊。