CN101732589A

CN101732589A - 天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术及其应用

Info

Publication number: CN101732589A
Application number: CN201010106834A
Authority: CN
Inventors: 陶钧; 陈平
Original assignee: Changsha University of Science and Technology
Current assignee: Tibet And Rattan Pharmaceutical Development Ltd By Share Ltd
Priority date: 2010-02-09
Filing date: 2010-02-09
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2030-02-09
Also published as: CN101732589B

Abstract

本发明为天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术及其应用，涉及中药和天然药物的鉴定与品质评价技术。本发明提供了分离和检测天麻生化成分的关键技术参数：最佳流动相(梯度浓度乙腈溶液)和最佳检测波长(219nm)以及其他基本条件，提供了测定天麻生化指纹图谱的技术和计算天麻有效成分天麻素含量的公式和方法。本发明不仅能用于天麻生化指纹图谱的测定、天麻品种的分类、天麻品质的鉴定和评价，还能用于天麻适宜种植地区确定和天麻真伪鉴别。

Description

天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术及其应用

技术领域

本发明涉及中药和天然药物的鉴定与品质评价技术，具体涉及天麻的生化指纹图谱分类与品质鉴定和评价技术及其应用。

背景技术

在所有质量控制系统中，生化指纹图谱技术被公认为是鉴定和评价中药和天然药物质量最有效的科学方法。生化指纹图谱的主要特征是不仅能显示不同来源的同种药物的共性，而且能显示同种不同遗传类群天然药物的特殊性，并能根据药物某些成分的峰面积对其进行定量分析和评价。在构建生化指纹图谱的所有方法中，高效液相色谱(HPLC)方法更精确、更实用，是构建生化指纹图谱的最常用方法。中国国家食品药品监督管理局已将HPLC指纹图谱列为中药和天然药物的质控标准。

天麻是我国的名贵中药材。天麻及其有效成分天麻素具有许多药理作用。由于野生天麻越来越少，以劣质天麻冒充优质天麻，以非道地天麻冒充道地天麻，以人工种植天麻冒充野生天麻的事件时有发生。而天麻质量通常根据个体大小和成色，凭肉眼观察和经验确定。由于缺乏科学鉴定方法，有时将质量最差的天麻判定为最好的天麻。为了正确鉴定天麻真伪和质量，石上海等研究了天麻HPCL指纹图谱，王莉等研究了天麻指纹图谱模式识别，张炜等应用HPLC-DAD/MS技术建立了天麻质量评价方法。但是，这些方法测定天麻生化指纹图谱所化时间长，检出天麻素含量低，缺乏实用性，尤其不能用来对天麻进行分类和评价。陶钧等发明的天麻化学指纹图谱鉴定技术分离效果差，检出天麻生化成分少。因此，发明更加先进、实用的天麻生化指纹图谱分类与鉴定、评价技术具有重要意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种既能用于天麻植物分类和评价，又能对天麻产品质量进行鉴定和评价的先进、实用、快捷、灵敏高的生化指纹图谱技术。

本发明另一目的在于提供测定天麻生化指纹图谱的优化参数。

本发明还有一目的在于提供该技术在天麻适宜种植地区确定中的应用。

本发明还有一目的在于提供该技术在天麻真伪鉴别中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

1、新鲜天麻样本的处理：

采用传统方法将新鲜天麻样本蒸熟、烘干、研成粉末，过80目筛子，置80℃干燥箱中干燥1h。

2、天麻生化成分的萃取：

用电子天平精确地称取天麻粉末1g，置三角瓶中，加入70％乙醇溶液。将三角瓶与索氏萃取器相连，置97℃热水中热回流20min，用JY92-2D型超声波细胞破碎器处理20min(超声波处理9s；中间停顿2s；振幅功率250w)。超声波处理后称重，用70％乙醇溶液补充损失的重量。重复上述处理过程一次。萃取溶液用滤纸过滤。收集滤液，浓缩干燥后用10％乙腈溶液(流动相)定溶到10ml。用0.45μm滤膜过滤后，置冰箱中保存备用。

3、天麻素对照品溶液的制备：用电子天平精确称取天麻素对照品(80℃干燥1h)10mg，置10ml容量瓶中，用10％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜过滤；置冰箱中保存至检测。

4、天麻生化成分分离条件的优化筛选

以柱温25℃，流速1ml/min，进样量20μl为基本色谱条件，用Agilent 1100高效液相色谱仪，Eclipse XDB-C₈(4.6×150mm，5μm)色谱柱，221nm波长紫外光光，分别以10％乙腈溶液和梯度浓度乙腈溶液(0～1.5min为纯水，1.6～3.5min为5％乙腈，3.6～8min为10％乙腈)为流动相，测定天麻素对照品的液相色谱图，确定天麻素对照品在不同流动相洗脱过程中的保留时间和峰面积。结果表明：流动相为10％乙腈溶液时，天麻素对照品的保留时间为1.9min(见附图1)；流动相为梯度浓度乙腈溶液时，天麻素对照品的保留时间为5.4min(见附图2)。但它们的峰面积均为24565。用10％乙腈溶液和梯度浓度乙腈溶液以及上述其他条件和参数分别测定天麻样本的生化指纹图谱，结果见附图3和4。比较两种流动相的分离效果发现，梯度浓度乙腈溶液比10％乙腈溶液分离效果好。前者分离出18种成分(见附图3)，而后者只得到9种成分，分离效果差(见附图4)。

4、天麻生化成分检测条件的优化筛选

用优选的梯度浓度乙腈溶液为流动相，用5种波长(219nm、217nm、215m、213nm、221nm)紫外光测定天麻样本的生化指纹图谱(见附图5)。由测定结果可知，用219nm、217nm、215nm、213nm、221nm波长检测天麻样本获得的天麻素峰(其保留时间为5.419min)面积分别为：9565.9mAU*s(3次测定的平均值，最高)、9372.7mAU*s(与219nm相比降低2％)、9101.3mAU*s(降低4.9％)、8832.6mAU*s(降低7.7％)、9528.3mAU*s(降低0.4％)。比较不同波长紫外光的测定效果发现，219nm波长检测天麻样本能得到最大天麻素峰面积，检测波长减少或增加都会使天麻素峰面积减少。219nm波长是检测天麻素的最佳波长。

5、天麻样本的生化指纹图谱测定与分析：

采用优化参数(梯度浓度乙腈溶液、219m波长)、Agilent 1100高效液相色谱仪，EclipseXDB-C₈(4.6×150mm，5μm)色谱柱和选定的基本色谱条件(柱温25℃，流速1ml/min，进样量20μl)测定天麻标准品和其他天麻样本的生化指纹图谱。结果见附图6(天麻标准品)。比较分析生化指纹图谱发现，来自同一地区或不同地区的同种天麻具有十分相似的生化指纹图谱。来自不同地方的异种天麻具有不同形状的生化指纹图谱和不同数量(15-21个)的分离峰。但所有天麻样本都具有8个共有特征峰，分别位于1.28、2.70、4.88、5.44、5.83、6.37、6.60和7.09min。它们的平均RSD(相对偏差)为1.36％，其中天麻素峰最稳定，其RSD为0.36％。

6、天麻的有效成分天麻素含量的技术和评价：

天麻样本的天麻素含量根据天麻样本的天麻素峰面积，采用下列发明公式计算：

YYH = \frac{YYM \times YDZ}{HDM \times YZ}

公式中的YYH为单位重量(如1毫克)样本的有效成分含量，YZ为样本的被测重量，YYM为样本有效成分峰面积，YDZ为有效成分对照品的被测重量，YDM为有效成分对照品的峰面积，

经测定得知，2毫克天麻样本的天麻素峰面积为12583.7，0.02毫克天麻素对照品的峰面积为24565.8，将上述数据代入上述公式得：

YYH = \frac{12583.7 \times 0.02}{24565.8 \times 2}

天麻样本的天麻素百分比含量为：0.0051×100％＝0.51％。每克天麻样本含天麻素为5.1毫克。

天麻素是天麻主要有效成分。天麻样本含天麻素越高，其质量越好。

7.本发明的用途

本发明用于测定天麻样本的生化指纹图谱，根据样本的生化指纹图谱特征，可对天麻植物进行分类，根据不同天麻类群的天麻素平均含量和各种生化成分峰面积总和平均值，可对其品质进行评价，发现优良天麻种群。

本发明用于测定天麻产品的生化指纹图谱，根据天麻产品的天麻素含量和各种生化成分峰面积总和的大小，可对其质量进行鉴定和评价。

本发明用于比较分析不同地区天麻样本的质量，可确定天麻的适宜种植地区。

本发明用于测定天麻相似物的生化指纹图谱，根据它们的指纹图谱是否同时具有天麻的8个共有特征峰，可以区分真假天麻。

本发明的优点是：同以前报道的方法相比，可在更短的时间(1/6左右时间)内分离和检测到更多的天麻生化成分；灵敏度更高，检测到的天麻素含量比其他方法高2倍，其他成分峰面积更大，图谱更清晰。

附图说明

附图1.以10％乙腈为流动相，221nm为检测波长测定天麻素对照品得到的色图谱。天麻素对照品的保留时间为1.92min.

附图2.以梯度浓度乙腈为流动相，221nm为检测波长测定天麻素对照品得到的色图谱.天麻素对照品的保留时间为5.44min.

图3.以梯度浓度乙腈为流动相，221nm为检测波长测定天麻样本得到的生化指纹图谱。其中保留时间为5.42min的是天麻素峰。由图可见：梯度浓度乙腈溶液比10％乙腈溶液分离效果好，共分离检测到18种成分。

图4.以10％乙腈为流动相，221nm为检测波长测定同一天麻样本得到的生化指纹图谱。其中保留时间为1.98min的是天麻素。由图可见，10％乙腈溶液比梯度浓度乙腈溶液分离效果差，只分离检测到9个成分。

图5用优化的梯度浓度乙腈溶液为流动相、5种检测波长(用219nm、217nm、215nm、213nm、221nm)测定天麻标准品得到的生化指纹谱图。

图6以梯度浓度乙腈溶液为流动相，用219nm波长光测定天麻标准品得到的生化指纹图谱。

其中保留时间为5.45min的是天麻素峰。

图7以梯度浓度乙腈溶液为流动相，用219nm波长光测定湖北宜昌天麻获得的生化指纹图谱。

图8.湖南石门天麻的生化指纹图谱

图9贵州大方天麻的生化指纹图谱

图10安徽大别山天麻的生化指纹图谱

图11陕西略阳天麻的生化指纹图谱

图12西藏察愚天麻的生化指纹图谱

图13吉林长白山天麻的生化指纹图谱

图14云南彝良天麻的生化指纹图谱。

图15四川凉山天麻的生化指纹图谱。

具体实施例

实施例1：本发明用于测定各种天麻的生化指纹图谱：

采用传统方法将新鲜天麻样本蒸熟、烘干、研成粉末，过80目筛子，置80℃干燥箱中干燥1h。用电子天平精确地称取天麻粉末1g，置三角瓶中，加入70％乙醇溶液。将三角瓶与索氏萃取器相连，置97℃热水中热回流20min，用JY92-2D型超声波细胞破碎器处理25min(超声波处理9s；中间停顿2s；振幅功率250w)。超声波处理后称重，用70％乙醇溶液补充损失的重量。重复上述处理过程一次。萃取溶液用滤纸过滤。收集滤液，蒸发、浓缩、干燥后用10％乙腈溶液(流动相)定溶到10ml。用0.45μm滤膜过滤后，置冰箱中备用。设定基本色谱条件：柱温25℃，流速1ml/min，进样量20μl。用梯度浓度乙腈溶液(0～1.5min为纯水，1.6～3.5min为5％乙腈，3.6～8min为10％乙腈)为流动相，以219nm为检测波长，用Agilent 1100高效液相色谱仪，Eclipse XDB-C₈(4.6×150mm，5μm)色谱柱测定9种天麻样本的生化指纹图谱，见附图7-15。

实施例2，本发明用于天麻分类

通过测定天麻样本的生化指纹图谱，如上所述。然后，根据天麻生化指纹图谱的形状特征和特征峰的有无，对天麻进行分类。根据上述9种天麻的生化指纹图谱特征，可将它们分成3类：

第I类包括天麻标准品、湖南石门、湖北宜昌、安徽大别山、贵州大方、陕西略阳、西藏察愚天和吉林长白山天麻。这一类群天麻的生化指纹图谱特征是：天麻素分离峰比其他所有成分的分离峰都高大。

第II类包括云南彝良天麻，这一类天麻的指纹图谱特征是：在2.4min和7.0min处有两个高大的峰(分别占总峰面积的38.1％和25.2％)，而天麻素峰矮小(占5％左右)。

第III类包括四川凉山天麻。这一类天麻的指纹图谱特征介于第I类和第II类之间，其2.4min分离峰与II类天麻的对应峰一样大，7.0min分离峰比II类天麻的对应峰矮小。但其天麻素峰比II类天麻的对应峰高得多，接近I类天麻对应峰。

与其他分类方法相比，生化指纹图谱分类方法的优势是，既能正确反映药用植物的遗传本质，尤其能准确反映其基因表达及其调控水平，还能直接观察其表型数量性状的优劣，具有重要应用价值。

实施例3，本发明用于天麻品质的鉴定和评价

根据天麻样本的有效成分天麻素峰面积，运用本发明公式计算各种天麻样本的天麻素评均含量(见表1)。

表19种天麻样本的天麻素平均含量及其所有生化成分峰面积总和平均值

*HY＝湖北宜昌天麻，HS＝湖南石门天麻，SHL＝陕西略阳，GD＝贵州大方天麻，AD＝安徽大别山天麻，XC＝西藏察愚天麻，SL＝四川凉山天麻，JC＝吉林长白山天麻，YY＝云南彝良天麻。

湖北宜昌和湖南石门的天麻样本含天麻素最高，分别达到7.519mg/g、7.225mg/g，其他成分含量也很高(根据其峰面积推算)，质量最好。云南彝良天麻含天麻素最低，但其他成分峰面积很大。吉林长白山天麻样本的天麻素含量不高，其他成分含量也不高。后两种天麻质量较差。

将每类天麻的每一个样本的天麻素含量和总峰面积相加除以样本数得到每类天麻的天麻素平均含量和总峰面积平均值见表2。

表23类天麻的天麻素平均含量和总峰面积平均值

第I类天麻含天麻素最高(5.595mg/g±1.504)。第II类天麻含天麻素最低(1.703mg/g±0.357)，但各种成分总峰面积最大(67199mAU*s±7051)。第III类天麻的天麻素和其他成分含量象它的生化指纹图谱一样，介于第I和第II类之间。表现I型生化指纹图谱的天麻含有更高的天麻素，是优良的天麻种类，其中来自湖北宜昌和湖南石门的天麻质量最好，

采用非配对试验两样本均数差异显著性t检验，分析天麻各类群天麻素含量和峰面积总和平均值的差异显著性。结果表明第II类天麻的天麻素含量与第I类(t＝3.621，df＝22)和第III类(t＝2.630，df＝5)相比具有显著差异性(t＞t_0.05，p＜0.05).第I类天麻的天麻素含量与第III类相比没有显著差异(t＝1.175，df＝21，t＜t_0.05，P＞0.05)。

根据上述统计计算结果，我们可以判定：第I类天麻的品质最好，是优良的天麻种群。

实施例4本发明用于天麻适宜种植地区的确定

第I类天麻的生化指纹图谱相似，说明它们具有相似的遗传特性。但是，来自不同地区的I类天麻样本所含天麻素数量差异很大，说明地区自然条件对天麻表达合成有效成分天麻素具有明显的影响作用。在I类天麻中，来自湖北宜昌和湖南石门的天麻样本含天麻素最高，其他生化成分含量也很高，质量最好，说明湖南石门至湖北宜昌之间的山区比较适宜种植天麻；而来自吉林长白山的天麻样本含天麻素最低，其他成分含量也很少，质量较差。这可能与东北长白山长时间寒冷气候有关。

实施例5本发明用于天麻真伪鉴别

应用本发明技术鉴定天麻可疑物时，通过测定其生化指纹图谱，即可判断天麻真伪，其生化指纹图谱同时具有天麻8个共有特征峰的是真正的天麻，其生化指纹图谱不同时具有天麻8个共有特征峰的是伪天麻。

Claims

1.天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术，其特征包括以下步骤：

(1)天麻生化成分分离和检测的优化参数的确定

(2)天麻生化指纹图谱的测定与分析

(3)天麻有效成分天麻素含量的测定、计算与评价

2.如权利要求1所述的天麻生化成分分离和检测的优化参数包括：

最佳流动相为梯度浓度乙腈溶液(0～1.4-1.6min为纯水，1.5-1.7～3.4-3.6min为5％乙腈，3.5-3.7～7.9-8.1min为10％乙腈)；最佳检测波长为218-220nm。

3.如权利要求1所述的天麻生化指纹图谱的测定与分析包括以下步骤：采用梯度浓度乙腈溶液、219nm波长、Agilent 1100高效液相色谱仪，Eclipse XDB-C₈(4.6×150mm，5μm)色谱柱和选定的基本色谱条件((柱温25℃，流速1ml/min，进样量20μl))测定天麻标准品和其他天麻样本的生化指纹图谱，发现不同来源和不同品种的天麻样本具有不同数量的分离峰(15-21个峰)。但所有天麻样本都具有8个共有特征峰，分别位于1.28、2.70、4.88、5.44、5.83、6.37、6.60和7.09min，其中5.44min是天麻素峰。它们的平均RSD(相对偏差)为1.36％。

本发明的特点是：检测速度快，灵敏度高，能检测到更多的天麻生化成分和更高的天麻素含量，图谱更清晰。根据天麻的生化指纹图谱的形状特征可对天麻进行分类。

4.如权利要求1所述的天麻有效成分天麻素含量的测定、计算与评价包括下列步骤：通过天麻生化指纹图谱测定，获得天麻样本有效成分天麻素和天麻素对照品的相关数据(样本测定重量及其峰面积)；将相关数据代入下列公式；通过计算得到天麻素含量。天麻素含量高的天麻质量好。

YYH = \frac{YYM \times YDZ}{HDM \times YZ}

5.如权利要求1所述的天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术在天麻生化指纹图谱测定中的应用。

6.如权利要求1所述的天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术在天麻分类中的应用。

7.如权利要求1所述的天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术在天麻品质或质量鉴定和评价中的应用。

8.如权利要求1所述的天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术在天麻适宜种植地区确定中的应用。

9.如权利要求1所述的天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术在天麻真伪鉴别中的应用。