CN101573135B - 犬莱姆病疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于犬莱姆病的疫苗以及单独或与其它保护剂联合制备及应用该疫苗的方法。

Description

犬莱姆病疫苗
与相关申请的交叉引用
本申请是非临时申请，其根据35U.S.C.§119(e)要求2006年11月3日提交的临时申请美国系列号60/864,258的优先权，所述临时申请的内容通过引用全文并入本文。
发明领域
本发明涉及用于犬莱姆病(Lyme disease)的疫苗。还提供了单独或与其它保护剂联合制备及应用该疫苗的方法。
背景
犬莱姆病是由疏螺旋体属(Borrelia)物种(spp.)螺旋体感染引起的，所述疏螺旋体属物种螺旋体主要包括美国的严格意义上的布氏疏螺旋体(B.burgdorferi sensu stricto(ss))和欧洲的严格意义上的布氏疏螺旋体(B.burgdorferi ss)、嘎氏疏螺旋体(B.garinii)和阿氏疏螺旋体(B.afzelii)(Baranton等，Int.J.Sys.Bacteriol.1992，42：378-383；Hovius等，J.Clin.Microbiol.2000，38：2611-2621)。当感染的硬蜱属(Ixodes)物种蜱获得血粉时，即传播了螺旋体，并且在犬中所发生的感染导致亚临床滑膜炎至急性关节炎和关节疼范围内的临床体征(Jacobson等，Semin.Vet.Med.Surg.1996，11：172-182；Summers等，J.Comp.Path.2005，133：1-13)。重要的是，在人类病例数量增加的同时，犬莱姆病病例的发生率每年也在持续增加(Haninkova等，Emerg.Infect.Dis.2006，12：604-610)。
针对疏螺旋体属物种感染发生反应产生的抗体具有两种不同的功能，然而迄今为止，两种反应对于从哺乳动物宿主中消除隐蔽的螺旋体都可能是无效的。对于在针对自然感染的正常免疫反应中的这一缺陷，已经假设了许多解释，包括抗原变异(Schwan，Biochem.Soc.Trans.2003，31：108-112；Tokarz等，Infect.Immun.2004，72：5419-5432)、宿主模仿(Barbour等，Microbiol.Rev.1986，50：381-400)和细胞内定位(Ma等，Infect.Immun.1991，59：671-678)。
最常见的体液免疫反应是产生非特异性结合/调理(包被)抗体，其“标记”螺旋体以使其被吞噬细胞摄取。不幸的是，调理抗体是由若干种与其它微生物共同的蛋白(即，包含细菌鞭毛的41kDa蛋白)诱导的，这使得它们对于接种疫苗诱导的抗体介导的免疫性的价值即使抱最乐观的看法也是可疑的。
第二常见的免疫反应是产生杀疏螺旋体属(borreliacidal)(致死)抗体。与调理抗体不同，杀疏螺旋体属抗体识别仅在少数疏螺旋体属物种蛋白质上的表位。在与螺旋体上的特定靶结合后，该杀疏螺旋体属抗体最通常诱导补体以形成膜攻击复合物，其杀死该生物，而不需要通过吞噬细胞的清除。
已开发了当前在疫苗中应用的犬莱姆病菌苗，以通过诱导OspA杀疏螺旋体属抗体(Hsien-Chu等，JAVMA 1992，201：403-411；Ma等，Vaccine 1996，14：1366-1374；Wikle等，Intern.J.Appl.Res.Vet.Med.2006，4：23-28；Straubinger等，Vaccine 2001，20：181-193)来提供保护，当寄生虫获得血粉时，所述抗体杀死该感染的蜱中表达OspA的螺旋体(Fikrig等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89：5418-5421)。Straubinger等(Vaccine 2002，20：181-193)报道了全细胞疫苗比重组OspA诱导显著更高滴度的杀疏螺旋体属抗体。尽管此类疫苗已经相当成功，但也报道了接种失败(Levy等，JAVMA 1993，202：1834-1838；Ma等，Vaccine 1996，14：1366-1374；Schutzer等，N.Engl.J.Med.1997，337：794-795)。
现在已理解所产生的OspA杀疏螺旋体属抗体通常不能对摄食的蜱进行灭菌，因为该抗体仅识别表达OspA的严格意义上的布氏疏螺旋体(Jobe等，J.Clin.Microbiol.1994，32：618-622；Lovrich等，Infect.Immun.1995，63：2113-2119)，而蜱通常感染不表达OspA的严格意义上的布氏疏螺旋体螺旋体(Fikrig等，Infect.Immun.1995，63：1658-1662；Ohnishi等，Proc.Natl.Acad.Sci.2001，98：670-675)。此外，蜱通常还感染其它病原性疏螺旋体属物种，包括阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体(Ornstein等，J.Clin.Microbiol.2001，39：1294-1298)，而OspA抗体是基因种特异的(Lovrich等，Infect.Immun.1995，63：2113-2119)。此外，即使当该螺旋体是敏感的，通过OspA杀疏螺旋体属抗体来保护的“机会窗口”也是有限的，因为在感染的蜱开始摄食之后，OspA(其介导与蜱中肠的吸附(Pal等，J.Clin.Invest.2000，106：561-569))的表达立即下调(Schwan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995，92：2909-2913)。
严格意义上的布氏疏螺旋体的OspC是对于杀疏螺旋体属抗体介导的免疫而言另一个潜在的靶(Rousselle等，J.Infect.Dis.1998，178：733-741)。这一蛋白质似乎具有负责诱导杀疏螺旋体属抗体的表位，并且在病原性疏螺旋体属物种中是保守的(Lovrich等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005，12：746-751)。尽管OspC蛋白的特异性功能仍然未知，但已暗示OspC的表达对于哺乳动物的感染是必需的，但对于蜱的感染不是必需的(Grimm等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.101(9)：3142-3147)。无论如何，在蜱开始摄食后不久，莱姆病螺旋体即表达OspC(Schwan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995，92：2909-2913)并且必须持续表达OspC，以建立哺乳动物中的感染(Stewart等，Infect.Immun.2006，74：3547-3553，Tilly等，Infect.Immun.2006，74：3554-3564)。因此，与OspA杀疏螺旋体属抗体相比较，OspC杀疏螺旋体属抗体的“有效性窗口”显著增加。
已显示OspC蛋白能够诱导保护性杀疏螺旋体属抗体(Rousselle等，J.Infect.Dis.1998，178：733-741，Ikushima等，FEMS Immunol.Med.Microbiol.2000，29：15-21)，然而一些之前的“作图”研究已将该表位定位至该蛋白质的高异质区域(Buckles等，Clin.Vacc.Immunol.2006，13：1162-1165)。因此，针对这些区域产生的杀疏螺旋体属OspC抗体仅能提供针对少数疏螺旋体属物种分离株的抗体介导的免疫性。Lovrich等(Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005，12：746-751)鉴定了在该蛋白质C端7个氨基酸之内的一个OspC杀疏螺旋体属抗体表位(OspC7)。最显著的是，该表位在病原性疏螺旋体属物种中是保守的。然而，不能在实验室操作表达OspA(即，含有ospA/ospB操纵子)的传统实验室严格意义上的布氏疏螺旋体分离株，以在不显著地减少它们诱导OspA杀疏螺旋体属抗体的能力的情况下，还诱导出显著水平的OspC杀疏螺旋体属抗体。此外，用灭活的表达OspA的传统实验室严格意义上的布氏疏螺旋体分离株接种不能诱导杀疏螺旋体属OspC抗体(Schwan等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：2909-2913，Obonyo等，1999，J.Clin.Microbiol.，37：2137-2141)。
Callister等(美国专利号6,210,676和6,464,985，在此通过引用并入本文)已建议单独或与OspA多肽联合应用OspC的免疫原性多肽片段，以制备保护人类和其它哺乳动物免于莱姆病的疫苗。Livey等(美国专利号6,872,550，在此通过引用并入本文)也提议用重组OspA、OspB和OspC蛋白联合制备用于针对莱姆病免疫的疫苗。然而，迄今为止，没有重组蛋白疫苗显示比当前市售疫苗更好。因此，本领域仍然有保护哺乳动物、尤其是犬免于莱姆病的改进疫苗的长期需要。
本文中任何参考文献的引用不应当解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”而可获得。
发明简述
因此，本发明提供了可用于疫苗的新的免疫原性组合物。在本发明的一个方面，疫苗针对莱姆病提供保护。在此类型的一个特定实施方案中，该疫苗的接受者是犬。在另一个实施方案中，该疫苗的接受者是家猫。其它家养哺乳动物也可能受到本发明的疫苗和/或方法的保护，诸如马和/或牛。本发明还提供了用于诱发针对莱姆病和其它疾病(例如，其它犬传染病)的保护性免疫的联合疫苗。还提供了制备和应用本发明疫苗的方法。
本发明的疫苗包含免疫有效量的表达OspC抗原的第一或单一菌株(任选灭活的)生物。该菌株是这样的菌株，即当在标准培养条件下生长时，在通过严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)接种的动物中诱发的OspC-特异杀疏螺旋体属抗体(任选需要补体)存在下，该菌株能被杀死，其中所述抗体包括针对保守的表位OspC7的杀疏螺旋体属抗体。在此类型的一个具体实施方案中，疏螺旋体属基因种的第一或单一菌株组成型表达OspC抗原。在一个更具体的实施方案中，该第一菌株是严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)。
本发明的疫苗组合物还可以包括免疫有效量的来自一种或更多种另外的菌株(在本文中可将其统称为第二菌株)的灭活生物，所述另外的菌株来自病原性螺旋体属基因种。在一个特定的实施方案中，该第二菌株呈现OspA和OspB抗原。
合适的第二菌株的实例包括以下的一种或更多种：严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)、严格意义上的布氏疏螺旋体B-31(ATCC No.35210)、阿氏疏螺旋体(例如可作为ATCC No.51567获得)和嘎氏疏螺旋体(例如可作为ATCC No.51383和51991获得)、严格意义上的布氏疏螺旋体DK7、严格意义上的布氏疏螺旋体61BV3、严格意义上的布氏疏螺旋体ZS7、严格意义上的布氏疏螺旋体Pka、严格意义上的布氏疏螺旋体IP1，IP2，IP3、严格意义上的布氏疏螺旋体HII、严格意义上的布氏疏螺旋体P1F、严格意义上的布氏疏螺旋体Mil、严格意义上的布氏疏螺旋体20006、严格意义上的布氏疏螺旋体212、严格意义上的布氏疏螺旋体ESP1、严格意义上的布氏疏螺旋体Ne-56、严格意义上的布氏疏螺旋体Z136、严格意义上的布氏疏螺旋体ia和/或其任意组合。
该疫苗组合物广泛地包括每毫升约1×104至约1×1010个生物体的每种菌株。在一个具体的实施方案中，该疫苗包括每毫升约1×106至约5×109个生物体的每种菌株。在另一个实施方案中，该疫苗包括每毫升约1×108至约5×108个生物体的第二菌株(或每种第二菌株)以及每毫升约5.0×108至约5×109个生物体的第一菌株。
该疫苗组合物还可以包括可药用佐剂，例如，诸如铝化合物(例如，磷酸铝、氢氧化铝)、可代谢和不可代谢油、嵌段聚合物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质，以及
Figure G2007800488742D00051
(例如，CARBOPOL 941)。在一个具体的实施方案中，可药用佐剂包含水乳化液中均匀分散的微米尺寸油滴(例如，以商标
Figure G2007800488742D00052
市售)。
该疫苗组合物任选地还包括可药用免疫刺激剂，例如细胞因子，生长因子，趋化因子，来自淋巴细胞、单核细胞或来自淋巴器官的细胞的细胞培养物上清液，细胞制备物和/或来自植物、细菌或寄生生物的提取物，或促细胞分裂剂。
本发明还提供了用于针对病原性疏螺旋体属物种，尤其是严格意义上的布氏疏螺旋体免疫犬或其它哺乳动物的方法，包括给犬注射免疫有效量的上述发明的疫苗。此类疫苗例如可包括约1×108至约3×109个生物体的每种分别的菌株。可通过诸如以下的途径施与疫苗：肌肉内注射、皮下注射、静脉内注射、皮内注射、口服施与、鼻内施与及其组合。在一个具体的实施方案中，在接种疫苗后，免疫的犬产生杀疏螺旋体属抗体。
本发明还提供了从接种疫苗的动物获得的血清，所述动物含有与严格意义上的布氏疏螺旋体的OspC结合的杀疏螺旋体属抗体。类似地，本发明提供与OspC结合的纯化的抗体。在一个具体的实施方案中，该血清含有显著比例的OspC7特异性杀疏螺旋体属抗体。
本发明还提供了包括与一种或更多种其它犬病原体和/或免疫原联合的一种或更多种本发明的疏螺旋体属基因种菌株的联合疫苗，所述其它犬病原体和/或免疫原包括，例如，用于诱发针对犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬流感病毒和/或钩端螺旋体属(Leptospira)血清型(例如Leptospira kirschneri感冒伤寒型血清型、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)犬血清型、肾脏钩端螺旋体出血性黄疸型血清型和/或肾脏钩端螺旋体pomona血清型)的免疫原。可以加入到本发明的联合疫苗中的另外的犬病原体包括利什曼原虫属(Leishmania)生物(诸如硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor)和婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum))；支气管败血性包特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；支原体属(Mycoplasma)物种(例如，犬支原体(Mycoplasma cynos))；狂犬病病毒；无形体属(anaplasma)生物(诸如anaplasma phagocytophilum和anaplasma platys)；以及犬埃里希氏体(Ehrlichia canis)。
通过参考以下附图和发明详述能更好地理解本发明的这些和其它方面。
附图简述
图1是正常狗血清对照(NS)或来自用测试产物(TP)接种后(研究的第43天)或用严格意义上的布氏疏螺旋体感染的蜱(NI)攻击后(研究的第134天)的狗的血清的Western印迹。注意针对具有约20kDa分子量的蛋白质的感染特异性抗体的存在。
图2A是正常狗血清对照(NS)或来自用安慰剂接种和用严格意义上的布氏疏螺旋体感染的蜱攻击后(研究的第134天)的各个狗(从1-15编号)的分离组群的血清的Western印迹。
图2B是正常狗血清对照(NS)或来自用测试产物接种后的各个狗(从1-15编号)的分离组群的血清的Western印迹。注意在14只(93％)用安慰剂接种的狗中(图2A)和0只(p＜0.0001)用测试产物接种的狗中(图2B)感染特异性20kDa抗体的存在。
图3A是用严格意义上的布氏疏螺旋体感染的安慰剂接种的狗的关节中组织病理学改变的代表示例。在矩形内的区域代表犬莱姆关节炎特点的嗜中性粒细胞和单核细胞的显著浸润。
图3B是用严格意义上的布氏疏螺旋体感染的测试产品接种的狗的关节中不存在组织病理学改变的代表示例。椭圆形内的区域中没有任何浸润的嗜中性粒细胞和单核细胞。
图4图示了应用来自没有莱姆病或莱姆病相关症状(图表回顾)的历史的个体(n＝36)的正常血清(N)，来自献血者(BD，n＝100)或进行胆固醇筛查的个体(CS，n＝100)的不特殊的血清；或来自具有通常与严格意义上的布氏疏螺旋体抗原交叉反应的血液因子或疾病(包括抗细胞核抗体(ANA，n＝20)、类风湿病因子(RF，n＝20)、单核细胞增多症(EBV，n＝10)、巨细胞病毒(CMV，n＝10)、梅毒(SYPH，n＝13)或落基山斑疹热(RMSF n＝4))的志愿者的血清的OspC7ELISA反应性的确定。实线表示比正常及潜在交叉反应血清平均吸附值高3个标准差。在该线之上的值对应于达99％可能性的阳性结果(1％背景值)。
图5图示了应用来自代表具有典型莱姆病损伤的患者的具有游走性红斑的极可能的(probable)莱姆病患者(n＝86)、具有“非典型损伤”的很可能的(likely)莱姆病患者(n＝22)和具有全身症状(最早的临床体征)的可能的(possible)莱姆病患者(n＝49)的血清的OspC7ELISA反应性。实线表示比正常及潜在交叉反应血清平均吸附值高3个标准差。
发明详述
本发明提供了包括免疫有效量的来自疏螺旋体属基因种一种或更多种菌株的生物体的疫苗组合物，其能在接受疫苗接种的动物中诱导有效的杀疏螺旋体属抗体介导的免疫。当在标准疏螺旋体属基因种生长条件下培养此类菌株的生物时，它们能在OspC特异性抗体存在下被杀死，所述抗体例如是在用严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)接种的动物中诱发的抗体。
在本发明的一方面，与常规的仅基于OspA杀疏螺旋体属抗体的疫苗相比，由本发明疫苗诱导的抗体的有效性窗口显著地增加了。在另一方面，本发明的疫苗提供了刺激有益免疫记忆反应的更好的机会(例如，由于体内表达OspC)和/或另外的和/或增强的针对多种疏螺旋体属物种病原株的保护。
在本发明的一个实施方案中，当在标准疏螺旋体属基因种培养条件下培养此类菌株生物体时，它们组成型地表达OspC抗原。在此类型的一个具体实施方案中，当在标准疏螺旋体属基因种培养条件下培养此类菌株生物体时，它们被补体特异性反应杀死。在另一个实施方案中，由包含此类菌株生物体的疫苗所诱导的血清中的显著比例的OspC特异性杀疏螺旋体属抗体对保守表位OspC7是特异的，并且由此提供了针对多种病原性疏螺旋体属基因种(例如，严格意义上的布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和/或嘎氏疏螺旋体)的保护。在另一个实施方案中，此类菌株生物体不呈现OspA或OspB抗原。在另一个实施方案中，此类菌株生物体具有任何两个或更多个这些特征。在另一个实施方案中，此类菌株生物体具有任何三个或更多个这些特征。在另一个实施方案中，此类菌株生物体具有任何四个或更多个这些特征。在一个特别的实施方案中，此类菌株生物体具有所有的这些特征。此类特定菌株之一是严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)。
在一个备选的实施方案中，本发明的疫苗是包括如上所述的第一菌株和有效量的至少一种第二菌株的生物体的组合物。第二菌株优选来自这样的病原性疏螺旋体属基因种，即当作为本发明疫苗的一部分施与时，其能诱导杀疏螺旋体属OspA抗体。在其中还可以包括一种或更多种另外的相容的疫苗基因种。此外，本发明的疫苗可以包括一种或更多种其它哺乳动物(例如犬)病原体和/或免疫原。
为更完全地理解本发明，提供了以下定义：
为了方便在说明书中使用的单数术语决不是意图限制于此。因此，例如，提及包含“一种多肽”的组合物包括提及一种或更多种此类多肽。此外，除非另外指出，提及一个“生物体”包括提及复数个此类生物体。
本文所使用的术语“大约”可与术语“约”互换使用，表示在所标明的值百分之五十之内的值，即，含有每毫升“大约”1×1010个生物体的组合物每毫升含有5×109至5×1010个生物体。
术语“基因种”由G.Baranton等，1992，International J.ofSystematic Bacteriology 42：378-383第一次使用并定义，本文中在描述非疏螺旋体属生物体分类学中与术语“物种”以相同的方式应用。
用于培养疏螺旋体属基因种的“标准培养条件”需要在约33℃至约35℃的温度下，在BSK(Barbour Stoenner Kelly)培养基中培养。本文描述的BSK培养基根据Callister等[Detection of BorreliacidalAntibodies by Flow Cytometry，第11.5.1-11.5.12节，Current Protocols inCytometry，John Wiley and Sons，Inc.Supplement 26，(2003)，在此通过引用全文并入本文]制备。(BSK培养基也可商购，例如，从Sigma，St.Louis，MO)。
本文所使用的“OspC7”是位于OspC C-端50个氨基酸之内7氨基酸区域中的免疫显性的OspC杀疏螺旋体属抗体表位(Lovrich等，2005，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，12：746-751，在此通过引用全文并入本文)，如Callister等(美国专利号6,210,676B1和6,464,985B1，在此通过引用全文并入本文)所公开的那样，其在已知的病原性疏螺旋体属物种中是绝对保守的。可通过BLAST检索编码由Lovrich等描述的该7个氨基酸的片段的密码子片段很容易地确认这一保守性。当在2006年10月9日进行该检索时，产生了含有上述OspC 7-mer表位编码片段的100个疏螺旋体属物种的结果列表。
“OspC特异性杀疏螺旋体属抗体”是例如在用严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)接种的动物血清中找到的抗体，并且是与OspC抗原的任意表位选择性结合并依赖或不依赖补体杀死该螺旋体的抗体。“OspC7特异性杀疏螺旋体属抗体”是例如在用严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)接种的动物血清中找到的抗体，并且是与如Lovrich等[Clin.Diagn.Lab.Immunol.，12：746-751，(2005)，在此通过引用全文并入本文]描述的OspC 7个C-端氨基酸选择性结合并杀死该螺旋体(通常通过诱导补体介导的膜攻击复合物)的抗体。已很好地建立了OspC杀疏螺旋体属抗体的特异性。例如，通常通过在杀疏螺旋体属抗体测试中测量严格意义上的布氏疏螺旋体50772的敏感性来在莱姆病血清中检测OspC杀疏螺旋体属抗体。来自患有密切相关疾病的人类患者的血清仅极少(2％)含有也能杀死菌株50772的交叉反应抗体(详细描述于Callister等，1996，Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3(4)：399-402)。此外，应用OspC7杀疏螺旋体属表位的肽ELISA精确地捕获莱姆病血清中的杀疏螺旋体属抗体，而来自患有其它密切相关疾病的患者的血清仅极少(＜2％)含有也与该OspC7肽结合的交叉反应抗体(图示于图4和5)。
当由疫苗诱导的血清中的“显著比例”的OspC特异性杀疏螺旋体属抗体对保守表位OspC7特异时，其意味着在用OspC7吸附该血清后，在血清中的OspC特异性杀疏螺旋体属抗体有可检测的减少。优选定义为在用OspC7吸附该血清后，通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772检测的血清的杀疏螺旋体属抗体滴度至少2倍的减少，更优选定义为血清的杀疏螺旋体属抗体滴度2至4倍或更多的减少。
“补体特异性反应”是需要血清补体存在以通过杀疏螺旋体属抗体杀死疏螺旋体属物种生物体的抗体反应。
为本发明的目的，“灭活的”严格意义上的布氏疏螺旋体生物体是这样的生物体，即其能够在动物中诱发免疫反应，但是不能感染动物。可通过选自由以下组成的组的试剂灭活严格意义上的布氏疏螺旋体分离株：二乙烯亚胺、福尔马林、β-丙内酯、硫柳汞或加热。在一个特定的实施方案中，通过二乙烯亚胺灭活严格意义上的布氏疏螺旋体分离株。
术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，其定义为一种或更多种引起免疫系统刺激的物质。在本文中，应用佐剂以增强针对一种或更多种疫苗抗原/分离株的免疫反应。可在施与疫苗之前、与施与疫苗联合、或在其之后向目标动物施与佐剂。可从许多来源中的任何来源获得本发明的佐剂，包括来自自然来源、重组来源和/或化学合成等。用作佐剂的化学化合物的实例包括但不限于铝化合物、可代谢和不可代谢油、嵌段聚合物、ISCOM’s(免疫刺激复合物)、维生素和矿物质(包括但不限于：维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、QuilA(皂甙)，以及与聚链烯醚或二乙烯乙二醇交联的丙烯酸聚合物(例如
Figure G2007800488742D00101
)。有时特别提及为免疫刺激剂的佐剂的其它实例包括细菌和真菌细胞壁组分(例如，脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、β-1，3/1，6-聚糖)、衍生自植物的各种复合碳水化合物(例如，聚糖、乙酰吗喃)、衍生自动物的多种蛋白质和肽(例如，激素、细胞因子、共刺激因子)、以及衍生自病毒和其它来源的新核酸(例如，双链RNA、CpG)。此外，上述物质任意数量的组合可提供佐剂效果，因此能够形成本发明的佐剂。一种优选的佐剂是
Figure G2007800488742D00111
在美国专利号6,210,676指出的严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)和在美国专利号6,316,005指出的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)分别在1999年7月30日和2000年4月11日保藏在美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection)，10801University Boulevard Manassas(VA)20110。本发明权利的共同拥有者分别地享有上述这两个专利的权利。
也应当理解，本发明不限于本文公开的特定构型、方法步骤和材料，因为此类构型、方法步骤和材料可以有些不同。还应当理解，本文使用的术语仅仅是用于描述特定实施方案的目的，并不意图用于限制，因为本发明的范围仅通过所附权利要求及其等同形式限定。
另外的疫苗菌株
另外的OspC菌株
在一方面，本发明提供了在针对莱姆病提供保护的疫苗中严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)的单独或与其它疏螺旋体基因种菌株联合的用途。值得注意的是，最开始拒绝把严格意义上的布氏疏螺旋体50772作为有用的疫苗候选者是因为错误地报道了这一菌株不表达OspC(Anderson等，1996，J.Clin.Microbiol.，34：524-529)。
本发明还提供了选择/鉴定对本发明的疫苗有用的其它此类分离株的独特且特异的标准。具体而言，可以选择/鉴定对通过OspC特异性抗体杀死敏感的分离株，并且优选地还具有一个或更多个或所有以下特性：(i)对通过补体特异性反应由OspC特异性抗体杀死的敏感性，(ii)在用该分离株接种的接受者中诱导OspC杀疏螺旋体属抗体的能力；(iii)显著比例的这样诱导以对C端7个氨基酸内的保守表位(OspC7)是特异的OspC杀疏螺旋体属抗体；(iv)缺乏表达OspA和OspB的能力；和/或(v)在体外组成型表达OspC的能力。
A.通过培养条件抑制OspA/B表达并增强OspC表达
Obonyo等(J.Clin.Microbiol.1999，37：2137-2141)已显示，通过将正常病原性疏螺旋体属物种菌株(严格意义上的布氏疏螺旋体菌株JMNT和N40)和蜱细胞系(肩突硬蜱(Ixodes scapularis)ISE6)共培养5天能够下调OspA表达并上调OspC表达。在37℃培养能观察到最显著的效果。因此，本方法能够将一种或更多种常规的疏螺旋体属菌株转化为可用于本发明疫苗的形式。
B.通过突变抑制OspA/B表达并增强OspC表达
在另一个实施方案中，应用对最初表达OspA和OspB的疏螺旋体属物种菌株的遗传操作以下调或缺失编码OspA和OspB表达的基因，其导致OspC表达的上调。预期可将任何本领域已知的遗传操作方法用于这一目的。例如，可以制备有抗生素选择标记的疏螺旋体属物种相容质粒的形式将失活的OspA/OspB基因类似物导入疏螺旋体属物种菌株的复数个生物体中(例如，参见Grimm等，2004，Proc.Nat′lAcad.Sci 101(9)：3142-3147，其报道了可通过将OspC失活和互补质粒插入到布氏疏螺旋体B31-A3菌株中封闭疏螺旋体属物种中OspC的表达)。在所导入的质粒和天然存在的携带OspA/OspB的质粒之间的重组事件将产生一定数量的成功重组的携带有突变OspA/OspB质粒的疏螺旋体属物种生物体。例如可通过连接的抗生素耐性及在相应抗生素的存在下培养以预先进行选择。预期具有选择性消除OspA/OspB表达的疏螺旋体属物种生物体上调OspC的表达。
在另一个任选的实施方案中，在疫苗组合物中可以包括一种或更多种表达OspA、OspB和/或一种或更多种其它Osp抗原的另外的严格意义上的布氏疏螺旋体或疏螺旋体属物种生物体作为另外的生物体。
每种灭活的生物体优选以约1×104至约1×1010生物体/mL的浓度范围存在于该疫苗中。具体而言，优选以不少于1.0×108生物体/mL的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10、以及不少于5.0×108生物体/mL的严格意义上的布氏疏螺旋体50772的剂量将疫苗施用于犬。
另外的OspA菌株
第二菌株，假设是OspA抗原，可以是常规的病原性实验室严格意义上的布氏疏螺旋体分离株(Barbour等，1985，J.Clin.Microbiol.52：478-484)，诸如严格意义上的布氏疏螺旋体B-31(ATCC No.35210)。特定的第二生物体的例子是严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10菌株(ATCC No.PTA-1680)。适于用作针对北美之外区域优化的疫苗组合物的第二生物体的另外的菌株包括例如以下菌株：严格意义上的布氏疏螺旋体B-31(ATCC No.35210)、阿氏疏螺旋体(例如，可作为ATCC No.51567获得)和嘎氏疏螺旋体(例如，可作为ATCC No.51383及51991获得)，以及在下表1中列出的那些。
表1
1Lagal等，J.Clin.Microbiol.2003，41：5059-5065.
2Heikkila等，J.Clin.Microbiol.2002，40：1174-1180.
疫苗组合物可以包括可药用佐剂。“佐剂”是这样的试剂，即其非特异地增加针对特定抗原的免疫反应，由此减少在任何给定疫苗中所需抗原的量，和/或为产生足够的针对目的抗原的免疫反应所需的注射频率。用于动物接种的合适的佐剂包括但不限于：佐剂65(含有花生油、一油酸二缩甘露醇酯(mannide monooleate)和单硬脂酸铝)；弗氏完全或不完全佐剂；矿物凝胶(诸如氢氧化铝、磷酸铝和明矾)；表面活性剂(诸如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵、N，N-双十八烷基-N′，N′-双(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油、以及pluronic多元醇)；聚阴离子(诸如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸以及
Figure G2007800488742D00141
(例如CARBOPOL 941))；肽(诸如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬肽(tuftsin))；以及油乳剂。关于佐剂的信息公开于，例如P.Tijssen的系列[Practice and Theory of EnzymeImmunoassays，第3版，1987，Elsevier，New York，通过引用在此并入]。
疫苗组合物任选地还可以包括可药用免疫刺激剂，诸如细菌和/或真菌细胞壁组分(例如，脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽)、多种衍生自植物的复合碳水化合物(例如聚糖、乙酰吗喃)、多种衍生自动物的蛋白质和肽(例如激素、细胞因子、共刺激因子)、以及衍生自病毒和/或其它来源的新核酸(例如双链RNA、CpG)。
可通过任意标准途径容易地施与疫苗组合物，包括：静脉内、肌肉内、皮下、口服、鼻内、皮内和/或腹膜内接种。技术人员能够理解优选针对每一类受体动物和施与途径恰当地配制疫苗组合物。
因此，本发明还提供了针对严格意义上的布氏疏螺旋体和其它疏螺旋体属物种免疫犬的方法。一种此类方法包括用免疫有效量的本发明的疫苗注射犬，由此该犬产生适当的OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体。
在一个实施方案中，本发明的皮下施与引起高浓度OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体的产生，所述抗体包括对OspC7特异的杀疏螺旋体属抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了有效针对有害疏螺旋体属物种的包含特定的、最小量的每种严格意义上的布氏疏螺旋体菌株的疫苗。在另一个实施方案中，本发明的疫苗对在狗中预防严格意义上的布氏疏螺旋体和其它病原性疏螺旋体属物种感染是有效的。在一个特定的实施方案中，该疫苗包含安全且免疫有效的两种本发明的严格意义上的布氏疏螺旋体菌株的组合及可药用佐剂。
本发明公开了包含特定最小量的两种严格意义上的布氏疏螺旋体分离株的疫苗保护狗在蜱攻击后免受疏螺旋体属物种感染。本发明还公开了在接种疫苗的狗中诱发特定最小量的严格意义上的布氏疏螺旋体特异性OspA和疏螺旋体属物种特异性OspC杀疏螺旋体属抗体的疫苗。本发明的疫苗还可以与可接受的免疫刺激剂和/或佐剂一起施与。
实施例
以下实施例用于提供本发明的进一步理解，但决不是意味着限制本发明的有效范围。
实施例1
用重组OSPA接种疫苗
A.材料和方法
动物
从Charles River Breeding Laboratories，Inc.(Wilmington，Mass.)获得5至10周龄的LVG仓鼠。在21℃的环境温度下每笼饲养3或4只仓鼠，并且无限制地提供食物和水。
接种仓鼠并收集血清
用0.5mL可商购的重组OspA(rOspA)疫苗
Figure G2007800488742D00151
Lyme(Merial Limited，Duluth，GA)在颈背皮下接种仓鼠，并且在初次接种3周后给予加强剂量。在初次接种3、7、9和15周后，通过吸入包含在鼻口杯中的乙醚适度麻醉每组5只仓鼠的组，并且通过心内穿刺取血。使血液凝固，分离血清并在-70℃储存直到使用。此外，汇集来自三只未接种仓鼠的仓鼠血清，并且用作正常血清对照。作为另外的对照，用0.25mL可商购的含有严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10的全细胞犬莱姆病疫苗(Galaxy，Solvay Animal Health，Inc.，MendotaHeights，Minn.，现在是Schering-Plough Animal Health，Elkhorn，Nebraska)同时在两条后股上接种20只仓鼠。给予该动物加强剂量，如上所述收集血清。
制备BSK培养基
将Barbour-Stoenner-Kelly(BSK)肉汤培养基用于体外培养布氏疏螺旋体，并且其为在杀疏螺旋体属抗体测试及本申请从头至尾描述的方法中所应用的主要基质。如Callister等[Detection of BorreliacidalAntibodies by Flow Cytometry，第11.5.1-11.5.12节，Current Protocolsin Cytometry，John Wiley and Sons，Inc.，Supplement 26，(2003)，在此通过引用全文并入本文]描述的那样制备BSK培养基。简而言之，通过以下方法制备BSK培养基：
材料：
HEPES(Sigma)
Neopeptone(Difco)
柠檬酸钠(Sigma)
葡萄糖(Sigma)
碳酸氢钠(Sigma)
TC酵母自溶液(TC yeastolate)(Difco)
丙酮酸(Sigma)
N-乙酰葡萄糖胺(Sigma)
牛血清白蛋白(Sigma)
明胶(微生物学级；Difco)
5N NaOH
10×含有L-谷氨酰胺且没有碳酸氢钠的Connaught MedicalResearch Laboratories(CMRL)1066(MP Biomedicals)或Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)1640培养基(Sigma)
兔血清(Life Technologies)，在56℃热灭活45分钟
56℃水浴
正压泵
微孔滤器多支管
预滤器(124mm)
0.2-、0.45-和0.8-μm滤器(142-mm直径)
0.2-μm钟形滤器(bell filter)
无菌100ml容器
暗视野显微镜
BSK培养基的制备
1.在2升烧瓶中合并以下物质，混合2至4小时。
900mL Mini-Q双重过滤或去离子蒸馏水：
6.0g HEPES
5.0g neopeptone
0.7g柠檬酸钠
5.0g葡萄糖
2.2g碳酸氢钠
2.5g TC酵母自溶液
0.8g丙酮酸
0.4g N-乙酰葡萄糖胺
50g牛血清白蛋白(级份V)
2.应用最慢的搅动板设置缓慢地混合上述组分，因为剧烈的搅拌可能导致对布氏疏螺旋体有毒的分解产物。
3.在混合BSK组分的同时，如下制备明胶溶液：在500ml烧瓶中，将200ml Mini-Q双重过滤或去离子蒸馏水和14g明胶合并，并在培养基设置上搅拌加热以溶解。然后将该溶液在121℃高压灭菌15分钟，之后置于56℃水浴中。
4.当BSK组分完全溶解时，用5N NaOH将该溶液调节至pH 7.5。
5.然后将200mL明胶溶液、100mL 10×CMRL 1066培养基和64mL热灭活兔血清(在56℃45分钟)与其它BSK组分合并，并充分混合。BSK培养基灭菌
6.应用正压泵，将BSK培养基泵送通过装载有124-mm预滤器和142-mm 0.2-、0.45-和0.8-μm孔直径滤器(按孔尺寸最小(底部)至最大(顶部)重叠滤器)的微孔滤器多支管。[不能通过高压灭菌对BSK培养基灭菌。在过滤灭菌之前需要预过滤以移除大的颗粒]。
7.然后应用正压泵和无菌0.2-μm钟形滤器将BSK培养基过滤灭菌至无菌容器中。
确认无菌
8.无菌操作移出1ml无菌BSK整分试样并转移至无菌1.5ml微量离心管中，并在35℃孵育过夜。将剩下的过滤灭菌的BSK储存在4℃。
9.在孵育后，应用暗视野显微镜检查无菌BSK以确认无菌。
10.然后将无菌BSK转移至无菌储存容器中。[在填装储存容器时，保持顶部空间最小，以减少无菌BSK培养基的氧化]。
Barbour-Stoenner-Kelly(BSK)培养基的质量控制
在应用BSK培养基之前，确保BSK支持少量疏螺旋体属物种的生长并且有活力的螺旋体不成团生长是很重要的。BSK培养基的高度可变组分是牛血清白蛋白(BSA)。本文应用的质量控制规程利用测试培养物以孵育并检查产生的培养物，如同上的Callister等，2003详细描述的那样。
OspA杀疏螺旋体属抗体的检测
应用流式细胞方法和严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10检测OspA杀疏螺旋体属抗体(Callister等，Arch.Intern.Med.1994，154：1625-1632)。用新鲜BSK将新鲜的螺旋体培养物稀释至约5×106螺旋体/ml的浓度。同时，用新鲜BSK 1∶40稀释血清样品并通过0.2微米(μm)孔大小的微量离心滤器灭菌。然后将200μL试样转移至无菌1.5mL螺旋盖微量离心管中，并在BSK中从1∶80至1∶20，480系列稀释。在56℃热灭活血清样品10分钟，并加入100μL螺旋体悬浮液试样(5×105螺旋体)和10μL无菌豚鼠补体(Sigma)。充分混合测试样品并在35℃温育16-24小时。
在温育后，将100μL每一测试悬浮液转移至含有400μL PBS和1μg/mL吖啶橙的聚丙烯管中。然后应用FACScan流式细胞仪(BectonDickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)检测杀疏螺旋体属活性。通过选通(gating)(CellQuest software，Becton Dickinson)分离螺旋体并用低流速设置分析1-2分钟。通过监测当吖啶橙嵌入起泡的、没有活力的螺旋体时所发生的增加的荧光密度间接检测OspA杀疏螺旋体属抗体。认为与正常血清对照相比平均荧光密度≥13％的变化是阳性的(Callister等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.2002，9：908-912)。然后通过暗视野显微镜确认起泡的、非运动性的布氏疏螺旋体的存在。每一测试包括阳性对照，并且需要来自运行之间相同的反应性(+/-1稀释度)，以最小化测试间变化性。此外，同时分析收集自每只狗的血清样品。
B.结果
用rOspA疫苗接种7周后仅诱导极小量(平均滴度＜61)的OspA杀疏螺旋体属抗体，其在15周后即检测不到(表2)。相反，用含有典型(Barbour等，J.Infect.Dis.1985，152-478-484)严格意义上的布氏疏螺旋体菌株(S-1-10)的犬疫苗接种的仓鼠诱导高水平的杀疏螺旋体属OspA抗体，其在第7周达到峰值(滴度＞2560)并在该研究的持续时间保持高水平。
表2.在用rOspA或GALAXYTM(S-1-10)犬莱姆病疫苗接种后OspA杀疏螺旋体属抗体b的平均滴度a
  疫苗   第3周   第7周  第9周   第15周
  rOspA   9   61   4   NDc
  S-1-10   1470   ＞2560   970   735
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10检测
cND＝未检测到
因此，犬重组OspA疫苗不能在仓鼠中诱发显著滴度的OspA杀疏螺旋体属抗体。
实施例2
用重组OSPC接种
A.材料和方法
动物
从Charles River Breeding Laboratories，Inc.(Wilmington，Mass.)获得5至10周龄的LVG仓鼠。在21℃的环境温度下每笼饲养3或4只仓鼠，并且无限制地提供食物和水。
重组(“r”)OspC疫苗的制备
如之前所描述的那样(Rousselle等，J.Infect.Dis.1998，178：733-741)从含有pX3-22的大肠杆菌(E.coli)JM109回收rOspC。简而言之，将该大肠杆菌在37℃培养于含有氨苄青霉素的2×TY肉汤培养基中，并在指数生长期添加异丙基-β-d-吡喃半乳糖苷(IPTG)(0.1mM)。细胞通过离心沉淀，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬，并通过声裂法裂解。加入Triton X-100(1％体积/体积)，然后在10,000×g下离心裂解产物5分钟。然后通过离心使声裂解的大肠杆菌细胞沉淀，并且使上清液通过含有SoftLink树脂(Promega)的柱，所述树脂通过在氨基端上的生物素化的纯化标签结合OspC。然后用还含有5mM生物素(Sigma)的纯化缓冲液洗脱结合的OspC。
仓鼠接种和血清收集
用0.1mL含有75μg rOspC的弗氏完全佐剂在颈背皮下接种仓鼠，然后在初次接种3周后给予在0.1mL弗氏不完全佐剂中的75μgrOspC的加强剂量。在初次接种后5周，通过吸入包含在鼻口杯中的乙醚适度麻醉仓鼠，并且通过心内穿刺取血。使血液凝固，分离血清并在-70℃储存直到使用。此外，汇集来自三只正常仓鼠的仓鼠血清，并且用作正常血清对照。
OspC抗体的检测
在包被缓冲液(0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH 9.6)中稀释rOspC到1000ng/mL，并将100μL量加入到各个平底的胺结合微量滴定孔(Costar，Cambridge，Mass.)中。在4℃孵育微量滴定板过夜。孵育后，用PBS(pH 7.2)洗涤板3次，并用含有0.05％TWEEN 20(Sigma)和1％牛血清白蛋白(Sigma)的PBS在室温下振荡封闭1小时。封闭后，用PBS再次洗涤板。随后，在各个孔中加入100μL量的在PBS/Tween中1∶80至1∶20，480系列稀释的仓鼠血清，并将该板在室温下孵育1小时。孵育后，用PBS洗涤板3次，将100μL在PBS/Tween中1∶3000稀释的抗-仓鼠IgG辣根过氧化物酶缀合物(Organon Teknika Cappel)加入到每一孔，将该板在室温下再孵育1小时。然后用PBS洗涤板3次，并将100μL磷酸化邻苯二胺(o-phenylenediamine phosphate)(0.4mg/ml；Sigma)加入到每一孔中，并且使其在室温下孵育30分钟。通过添加100μL 1N H2SO4终止反应，并立刻测定在490nm(model EL311；Bio-Tek Inc.Winooski，Vt.)处的吸光度。
OspC杀疏螺旋体属抗体的检测
除了应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772之外如上所述(实施例1)检测OspC杀疏螺旋体属抗体。
B.结果
用rOspC疫苗的接种诱导高水平的通过ELISA检测到的OspC抗体(下表3)，但是仅存在低水平(滴度80)的杀疏螺旋体属活性。因此用rOspC接种诱导高浓度的OspC抗体，但是该反应基本上完全是由不能提供针对感染的保护的抗体(例如，调理的)组成。当考虑到不将多种另外的非OspC蛋白的存在计算在内而在严格意义上的布氏疏螺旋体50772疫苗中计算出75μg蛋白浓度时，这尤其重要。因此共同结果(实施例1和2)证实了之前的发现(Straubinger等Vaccine 2003，20：181-193)，即重组Osps比完整的严格意义上的布氏疏螺旋体刺激显著更少量的杀疏螺旋体属抗体。
表3.在用rOspC接种后通过OspC ELISA或OspC杀疏螺旋体属抗体测试b检测的抗体平均滴度a
Figure G2007800488742D00211
a来自5只仓鼠的所汇集的血清的交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772检测
cND＝未检测到
因此，该犬重组OspC疫苗不能在仓鼠中诱发显著滴度的OspC杀疏螺旋体属抗体。
实施例3
用严格意义上的布氏疏螺旋体分离株S-1-10免疫
A材料和方法
生物体：
严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10是一种典型病原性菌株，一般难以和严格意义上的布氏疏螺旋体B31相区分(Barbour等，J.Infect.Dis.，1985，152：478-484)。该分离株最初由Dr.Steven M.Callister，Gundersen Lutheran Medical Foundation，La Crosse，WI从1988年二月从La Crosse，WI附近的地点捕获的白足鼠(Peromyscus leucopus)的肾中回收得到，并且由Solvay Animal Health允许掺入犬莱姆病疫苗。其后的商业化产品(GALAXYTM Lyme)由Schering Plough AnimalHealth于1997年4月17日获得。该生物体表达OspA、OspB和OspC。然而，如传染性严格意义上的布氏疏螺旋体分离株的典型特征那样，当将该螺旋体培养于实验室BSK培养基中时，产生了显著更高浓度的OspA和OspB。已显示可通过在35℃孵育最大化OspC表达(Schwan，Biochem.Soc.Trans.2003，31：108-112)。
动物
将8周龄的小猎狗(Ridglan Farms，Mount Horeb，WI)群居饲养，无限制地供给食物和水。该实验得到了Schering Plough Animal HealthAnimal Care and Use Committee(IACUC)的审核并批准。
严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10疫苗的制备
通过添加二乙烯亚胺(binary ethylenimine)(BEI)至10mM的终浓度并再孵育48小时灭活通过在35℃在BSK中孵育达到对数生长期的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10新鲜培养物。灭活后，通过添加无菌硫代硫酸钠中和BEI并在35℃孵育6至12小时。然后通过离心使螺旋体沉淀并重悬于含有≤30μg庆大霉素/mL及≤30单位制霉菌素/mL的无菌平衡盐溶液中。然后用5％
Figure G2007800488742D00221
(MVPLaboratories，Inc.)和1％HEPES混合该螺旋体，使得1.0mL剂量含有≥2.5×107螺旋体。
接种和血清收集
用1mL剂量的S-1-10疫苗在颈部皮下接种狗，并在21天后用另外的1mL剂量加强。在加强剂量接种即刻之前(研究的第21天)和研究的第28、35、47、83和113天通过颈内静脉静脉穿刺收集全血。通过离心分离血清并在-20℃储存直到测试。
杀疏螺旋体属抗体的检测
通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10和50772的流式细胞术检测OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体，如在实施例1和2中描述的那样。
B.结果
用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10接种切实地诱导了高水平的杀疏螺旋体属OspA抗体，其能在研究的第21天检测到，在研究的第28天达到峰值，并且在研究的第113天仍然能检测到(下表4)。相反，不能检测到OspC杀疏螺旋体属抗体(滴度少于1∶80)。因此，尽管通过在35℃孵育螺旋体最大化OspC表达，但常规严格意义上的布氏疏螺旋体菌株不能诱导OspC杀疏螺旋体属抗体的产生。
表4.用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10接种后OspA或OspC杀疏螺旋体属抗体的平均滴度a(n＝8)
  杀疏螺旋体属抗体   第21天   第28天   第35天   第47天   第83天   第113天
  OspAb   202   9481   9481   4740   1613   1382
  OspCc   NDd   ND   ND   ND   ND   ND
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10检测
c通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772检测
d ND＝未检测到
因此，应用严格意义上的布氏疏螺旋体分离株S-1-10的疫苗不能诱发显著滴度的OspC杀疏螺旋体属抗体。
实施例4
用严格意义上的布氏疏螺旋体分离株50772接种
A.材料和方法
生物体：
严格意义上的布氏疏螺旋体50772是最初由Anderson等(J.ofClin.Microbiol.，1996，34：524-529)报道的独特的ospA-/ospB-菌株，Anderson等没有鉴定其表达OspC抗原。美国专利号6,464,985描述50772菌株表达OspC抗原，该专利在此通过全文引用并入，并且由该美国专利报道的这一菌株以No.PTA-439保藏在ATCC中。
动物：
将8周龄的小猎狗(Ridglan Farms，Mount Horeb，WI)群居饲养，无限制地供给食物和水。该实验得到了Schering Plough Animal HealthAnimal Care and Use Committee(IACUC)的审核并批准。
严格意义上的布氏疏螺旋体50772疫苗的制备：
如上在实施例3中描述的那样制备严格意义上的布氏疏螺旋体50772疫苗。
接种和血清收集
用1mL剂量的50772疫苗在颈部皮下接种狗，并在21天后用另外的1mL剂量加强。在加强剂量接种即刻之前(研究的第21天)和研究的第28、35、47、83和113天通过颈内静脉静脉穿刺收集全血。通过离心分离血清并在-20℃储存直到测试。
杀疏螺旋体属抗体检测：
如上在实施例1和2中描述的那样通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772的流式细胞术检测OspC杀疏螺旋体属抗体。
B.结果
用严格意义上的布氏疏螺旋体50772接种切实地诱导了高水平的杀疏螺旋体属OspC抗体，其在研究的第35天达到峰值，并且在研究第113天仍然能检测到(下表5)。因此，与用rOspC或传统的严格意义上的布氏疏螺旋体分离株(S-1-10)接种不同，用独特的严格意义上的布氏疏螺旋体菌株50772接种诱导显著水平的OspC杀疏螺旋体属抗体。
表5.用严格意义上的布氏疏螺旋体50772接种后OspC杀疏螺旋体属抗体b的平均滴度a(n＝8)
  第21天   第28天   第35天   第47天   第83天  第113天
  NDc   5530   1097   435   274   202
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772检测
cND＝未检测到
因此，包含严格意义上的布氏疏螺旋体分离株50772的疫苗诱导高浓度的OspC杀疏螺旋体属抗体。
实施例5
包含严格意义上的布氏疏螺旋体分离株S-1-10和50772的疫苗的制 备
A.材料与方法
培养：
在标准条件下培养严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10和严格意义上的布氏疏螺旋体50772的冷冻储存培养物，即分别在33±2℃和35±2℃下在含有5至17ml BSK(Barbour Stoenner Kelly)培养基[根据Callister等，1990，J.of Clinical Microbiology 28：363-365制备，在此通过引用全文并入本文]的各个螺旋盖培养管中，在富集有5％CO2的大气中培养该储存培养物。达到对数生长后，用该培养物接种150至200mL新鲜BSK培养基，接下来对其进行孵育直到该培养物达到对数生长。然后应用该得到的悬浮液接种10至20升罐中包含的5至10升新鲜BSK(生产培养物)，然后再次孵育，如之前所描述的那样。
灭活
通过添加BEI至10mM的浓度并在缓慢搅拌下孵育24至48小时灭活生产培养物中的螺旋体。灭活螺旋体后，通过添加10.6mL无菌3.015M硫代硫酸钠至每升BSK/螺旋体悬浮液中并在缓慢搅拌下孵育6至12小时中和BEI。
浓缩并混合
灭活螺旋体通过离心沉淀并重悬于含有30.0μg/mL庆大霉素和30单位/mL制霉菌素的无菌平衡盐溶液中。将该测试疫苗与5％
Figure G2007800488742D00261
(MVP Laboratories，Inc.)混合并装至2.0mL玻璃小瓶中，因此每一剂量(1.0mL)含有≥2.5×107个生物体/mL的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10、≥5.0×108个生物体/mL的严格意义上的布氏疏螺旋体50772、1％HEPES、29μg/mL庆大霉素和29单位/mL制霉菌素。
实施例6
包含严格意义上的布氏疏螺旋体分离株S-1-10和50772的疫苗的安 全性和功效
A.材料与方法
动物
将8周龄的小猎狗(Ridglan Farms，Mount Horeb，WI)单独或群居饲养，无限制地供给食物和水。该实验得到了Schering Plough AnimalHealth Animal Care and Use Committee(IACUC)的审核并批准。
接种和血清收集
用1mL剂量的疫苗在颈部皮下接种狗，并在21天后用另外的1mL剂量加强。在开始之前(研究的第-3天)及加强剂量接种之前(研究的第21天)和研究的第28、35、43、78、106、134、162及197天通过颈内静脉静脉穿刺收集全血。通过离心分离血清并在-20℃储存直到测试。
接种后观察
每次接种后，每天触诊注射部位直到不能感觉到反应，并且在接种之后4-6小时以及在接种后1-3天记录直肠温度。
蜱攻击
在第二次接种3周后，剃掉狗胸腔右侧的毛，并且将10只雌性和10只雄性严格意义上的布氏疏螺旋体感染的肩突硬蜱(I.scapularis)放置于用带子和绷带卷与剃毛区域固定的橡皮碗中。允许该蜱进食7天。
检测蜱中的严格意义上的布氏疏螺旋体
通过解剖刀移除蜱口器，并且挑开中肠并将其涂片在玻璃载片上并使其在室温下干燥过夜。干燥后，在丙酮中固定该载片8-10分钟并风干。在PBS(pH 7.2)中1∶40稀释物种特异性小鼠OspA单克隆抗体H5332并用在PBS中1∶500稀释的山羊抗小鼠荧光素异硫氰酸盐标记的免疫球蛋白G抗体覆盖。孵育后，用PBS冲洗载片，风干，并通过荧光显微镜术检查。通过两个有经验的微生物学者独立地检查每一载片。
血液样品
在研究的第78、106、134、162和197天将全血收集在血清分离运输(SST)管中，分离血清并储存在-20℃直到使用。
OspA抗体的移除
如之前描述的那样(Callister等，J.Infect.Dis.1993，167：158-164)从表达OspA-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的大肠杆菌(″E.coli″)DH5α中回收重组(r)OspA。简而言之，将该大肠杆菌在37℃培养于含有氨苄青霉素的2×TY肉汤中，并在指数生长期添加异丙基-β-d-吡喃半乳糖苷(“IPTG”)(0.1mM)。细胞通过离心沉淀，在磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中重悬，并通过声裂法裂解。加入Triton X-100(1％体积/体积)，然后在10,000×g下离心裂解产物5分钟(min)。然后使含有该融合蛋白的上清液通过glutathione-Sepharose 4B柱(Pharmacia)，然后用50mM Tris-Cl(pH 8.0)加5mM还原型谷胱甘肽洗脱重组OspA，并将其重悬于纯化缓冲液(50mM Tris[pH 8]、50mM NaCl、2mM EDTA、0.1％Triton X-100)中。
然后通过溴化氰(CNBr)活化将该rOspA融合蛋白与Sepharose 4B结合。具体而言，用偶联缓冲液(0.1M NaHCO3-0.5M NaCl，pH 8.3)洗涤0.8g CNBr活化的Sepharose 4B(Pharmacia)，往凝胶中加入2mg量的在偶联缓冲液中的OspA，然后在室温下温柔地振荡该混合物2小时。在用偶联缓冲液洗涤该凝胶2次后，加入4mL乙醇胺(pH 9)，并且孵育该凝胶2小时以封闭未结合的位点。用50mL 0.1M醋酸钠-0.5M NaCl(pH 4.0)洗涤该凝胶3次，然后在PBS中平衡。将1ml在PBS中稀释10倍的免疫血清样品通过该柱4次。
OspC抗体的移除
如之前描述的那样(Rousselle等，J.Infect.Dis.1998，178：733-741)从含有pX3-22的大肠杆菌JM109中回收rOspC。如在上面描述rOspA那样诱导该重组蛋白的产生。然后通过离心使声处理的大肠杆菌细胞沉淀，并且使上清液通过含有SoftLink树脂(Promega)的柱，所述树脂通过在氨基端上的生物素化的纯化标签结合OspC。然后通过还含有5mM生物素(Sigma)的纯化缓冲液洗脱结合的OspC。
然后洗涤1mL体积的Tetralink四聚抗生物素蛋白树脂(Promega)，将其悬浮于40mL PBS中，并且将其加载至10-mm乘70-mm的聚丙烯柱上。将在1mL体积PBS中的0.5mg量的透析了的(dialized)rOspC通过该柱，并且通过蛋白测试法(Bio-Rad)确认结合。将1ml体积的在PBS中稀释10倍的免疫血清通过该柱四次。
OspC7-特异性抗体的移除：
如之前描述的那样(Lovrich等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005，12：746-751，在此通过引用全文并入本文)从含有pXT7的大肠杆菌JM109中回收含有OspC 7个C端氨基酸(OspC7)的融合蛋白。如在上面描述rOspA那样诱导该重组蛋白的产生。然后通过离心使声处理的大肠杆菌细胞沉淀，并且使上清液通过含有SoftLink树脂(Promega)的柱，所述树脂通过在氨基端上的生物素化的纯化标签结合OspC7。然后通过还含有5mM生物素(Sigma)的纯化缓冲液洗脱结合的OspC7。然后洗涤1mL体积的Tetralink四聚抗生物素蛋白树脂(Promega)，将其悬浮于40mL PBS中，并且将其加载至10-mm乘70-mm的聚丙烯柱上。将在1mL体积PBS中的0.5mg量的透析了(dialyzed)的rOspC通过该柱，并且通过蛋白测试法(Bio-Rad)确认结合。将1ml体积的在PBS中稀释10倍的免疫血清通过该柱四次。
杀疏螺旋体属抗体的检测
如上在实施例1和2描述的那样通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10和50772的流式细胞术检测OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体。
皮肤活组织检查
在研究的第78、106、134、162和197天用一次性的4mm穿刺装置从与蜱附着相邻的部位获得皮肤活组织检查样品。将该活组织检查样品置于含有补充有明胶(BSK+G)、40-50微克(μg)/mL利福平和8μg/mL卡那霉素的9mL BSK(Callister等，J.Clin.Microbiol.1990，28：363-365)的独立管中。在35±2℃下孵育培养物3周并每周通过暗视野显微镜术检查螺旋体。
免疫抑制
通过在攻击后13周开始每天一次施与地塞米松(0.4mg/lb体重)，施与5天，从而免疫抑制狗。
临床观察
每天对狗观察肢体/关节障碍，包括僵硬(不情愿将全部重量置于肢体)、跛行(limbing)(步行或奔跑时偏爱一肢)、或跛(lameness)(不能承重量)。通过至少两次观察的一致进行打分，并且通过主治兽医(attending veterinarian)检测以排除任何其它外部损伤。
尸体剖检
使在至少3次连续观察期内患有肢体/关节障碍的狗安乐死并进行尸体剖检。收集来自肘、腕、膝、踝、心脏、脾脏、膀胱和两个肾的组织样品，并进行处理用于通过培养分离布氏疏螺旋体。在含有9mL BSK+G的单独管中培养关节组织。将其它组织(心脏、脾脏、膀胱和肾)与9mL BSK+G合并，用stomacher彻底地使其匀质，并且将1mL的量转移至含有9mL新鲜BSK+G的独立管中。在35±2℃孵育培养物。
在研究的终点使其余的狗安乐死并进行尸体剖检。从肘、腕、膝和踝的关节囊和腱中收集来自这些狗的组织样品，并储存在10％缓冲福尔马林中用于组织病理学检查。此外，将来自肘、腕、膝和踝的关节囊的样品置于含有9mL BSK+G或具有抗生素的BSK+G的各个管中，并在35±2℃孵育3周。
Western印迹
应用标准技术进行Western印迹。在样品缓冲液中将严格意义上的布氏疏螺旋体297煮沸5分钟并且将150μg总蛋白质上样至0.1％SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶上(无梳的4％聚丙烯酰胺成层胶)。用蛋白质测定试剂盒确定蛋白质浓度，并且在一个电泳单位中同时运行两个凝胶。电泳后，将蛋白转移至硝化纤维素，将该硝化纤维素切成条片并在22℃用PBS-0.3％TWEEN 20封闭30分钟。用1∶100稀释的狗血清在22℃孵育条片1小时，并且用PBS-0.05％TWEEN 20洗涤3次。加入辣根过氧化物酶标记的抗狗IgG(Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)，并在22℃孵育该条片30分钟，然后用TMB膜过氧化物酶底物系统(Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)显影。
B.结果
疫苗的安全性
接种后，狗保持临床正常，包括没有直肠温度的升高。然而，用该疫苗接种的狗在注射部位产生了轻微地肿胀，其在8天内消退。最大的反应测得1×1×0.5cm(接种后24小时)。
接种后血清学
用安慰剂接种不能诱导对严格意义上的布氏疏螺旋体特异的抗体。相反，用该疫苗接种诱导了显著水平的通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体分离株S-1-10或50772检测到的杀疏螺旋体属抗体。通过应用S-1-10检测的杀疏螺旋体属抗体的平均滴度在加强剂量接种一周后(研究的第28天)达到峰值，并且在研究的第197天仍然能检测到(下表6)。类似地，在研究的第28天存在高浓度的对分离株50772特异的杀疏螺旋体属抗体，在研究的第43天仍然是高水平，并且在研究的第197天仍然能检测到(下表7)。
表6.用疫苗接种后杀疏螺旋体属活性b的平均滴度a(n＝15)
组   第-3天   第21天   第28天   第35天   第43天   第78天  第106天  第134天  第162天  第197天
  接种疫苗 NDc ＞211 ＞8128 ＞6160 ＞4889 1404 970 970 1016 220
  对照   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10的杀疏螺旋体属抗体测试检测
cND＝未检测到
表7.用疫苗接种后杀疏螺旋体属活性b的平均滴度a(n＝15)
组   第-3天   第21天   第28天   第35天   第43天   第78天  第106天  第134天  第162天  第197天
  接种疫苗 NDc ND 1470 884 221 50 48 46 42 42
  对照   ND   ND   ND   ND   ND   N/Ad   N/A   N/A   N/A   N/A
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772的杀疏螺旋体属抗体测试检测
cND＝未检测到
dN/A＝不可实施
OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体的确认
为确认该杀疏螺旋体属活性是由于OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体所致，将来自用疫苗接种的5只狗的免疫血清通过含有rOspA或rOspC的分离柱，并且检查对杀疏螺旋体属活性的影响。通过使血清与重组蛋白吸附移除OspA特异性或OspC特异性抗体分别显著(≥4倍减少)降低了通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10或50772分离株检测的杀疏螺旋体属活性。因此全部的发现确认了疫苗诱导了显著水平的OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体，并且通过严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10或50772检测的杀疏螺旋体属活性分别几乎完全是特异性OspA或OspC杀疏螺旋体属抗体。参见下表8。
表8.在来自用疫苗接种的狗(n＝5)的血清中移除OspA或OspC抗体对杀疏螺旋体属活性的影响
Figure G2007800488742D00321
a交互稀释
b在研究的第43天收集的血清
c在研究的第28天收集的血清
dND＝未检测到
OspC7-特异性杀疏螺旋体属抗体的确认
为确认该OspC杀疏螺旋体属抗体含有显著比例的对OspC7特异的杀疏螺旋体属抗体，使来自用该疫苗接种的5只狗的免疫血清通过含有rOspC7的柱，并检查对杀疏螺旋体属活性的影响。通过用重组OspC7蛋白吸附血清移除OspC7特异性抗体显著(2至4倍减少)降低了通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772分离株检测的杀疏螺旋体属活性。因此该发现确认了该疫苗诱导了显著水平的对保守的OspC7表位特异的OspC杀疏螺旋体属抗体。参见下表9。
表9.在来自用疫苗接种的狗(n＝5)的血清中移除OspC7抗体对杀疏螺旋体属活性的影响
Figure G2007800488742D00331
a交互稀释
b在研究的第28天收集的血清
cND＝未检测到
OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体对感染的蜱灭菌的能力
对以接种了的狗或对照狗为食源的蜱的中肠进行检查确认了疫苗诱导的OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体已对该蜱灭菌。在来自以15只安慰剂接种的狗中13只为食源的106只雌性蜱中有34只(32％)的蜱涂片检测到严格意义上的布氏疏螺旋体(下表10)。相反，在来自以用疫苗接种的狗为食源的雌性蜱的中肠中没有检测到螺旋体(99只中0)(p＜0.0001)。
表10.在从接种的或对照狗中移除的雌蜱中检测严格意义上的布氏疏螺旋体
  处理组   处理的雌性蜱(充血或不充血的)   布氏疏螺旋体涂片阳性   狗阳性总数
  接种疫苗   99/151(61％)   0/99(0％)   0/15
  对照   106/148(64％)   34/106(32％)   13/15*
*p＜0.0001
疫苗预防从皮肤上回收严格意义上的布氏疏螺旋体的能力
疫苗诱导的杀疏螺旋体属抗体还预防螺旋体寄居皮肤上。从在蜱攻击后以每月一次的间隔收集自安慰剂接种的狗的71个活组织检查样品中的56个(79％)回收了严格意义上的布氏疏螺旋体(下表11)，并且从来自该15只狗中14只(93％)的至少一个皮肤活组织检查样品中回收了螺旋体。相反，没有从任何收集自用疫苗接种的狗的皮肤活组织检查样品中回收了严格意义上的布氏疏螺旋体(p＜0.0001)。
表11.从接种或未接种对照狗的皮肤分离严格意义上的布氏疏螺旋体
  处理组   第78天   第106天   第134天   第162天   第197天   活组织检查样品阳性总数   狗阳性总数
  接种疫苗   0/15   0/15   0/15   0/15   0/13   0/73(0％)   0/15(0％)
  对照   12/15   13/15   11/15   11/14   9/12   56/71(79％)   14/15*(93％)
P＜0.0001
疫苗预防感染的血清学迹象的能力
该疫苗还预防莱姆病特异性抗体的发展。之前的研究(SPAHCReport B01-184-01R)证实严格意义上的布氏疏螺旋体感染切实地诱导结合约20kDa蛋白质的狗抗体，并且该反应不被疫苗诱导(图1)。在当前研究中，在来自15只安慰剂接种的对照狗中14只(93％)的免疫血清中很容易地检测到结合感染特异性20kDa蛋白质的抗体(图2A)。此外，自同样不能从皮肤产生螺旋体的对照狗收集到不含有任何20kDa蛋白质的血清。相反，没有任何用疫苗接种的狗产生20kDa蛋白质抗体(p＜0.0001)(图2B)。
此外，患有莱姆病的狗产生也能通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772分离株检测的非OspC杀疏螺旋体属抗体(Callister等，J.Clin.Microbiol.2000，38：3670-3674)。该反应的特异性靶是未知的，但是该抗体提供高特异的感染的血清学诊断确认。用疫苗接种的狗已经产生了OspC杀疏螺旋体属抗体，但是没有狗在蜱攻击后产生严格意义上的布氏疏螺旋体50772-特异性杀疏螺旋体属抗体水平的显著(≥4倍)升高。因此，接种了的狗极不可能被螺旋体感染。相反，在攻击前，安慰剂接种的狗不产生杀疏螺旋体属抗体，但是在允许蜱进食后，15只狗中有10只(67％；p＝0.0002)产生了显著水平(滴度≥1∶640)的通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772检测的杀疏螺旋体属抗体(下表12)。
表12.在蜱攻击后杀疏螺旋体属抗体b的平均滴度a
  处理组   第78天   第106天   第134天   第162天   第197天   具有增加滴度的狗的总数
  接种疫苗 50 48 46 42 42   0/15
  对照   ＞121   ＞463   ＞640   ＞390   ＞403   10/15*
*p＝0.0002
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772检测
疫苗预防明显的肢体/关节障碍的能力
之前的研究(Summers等，J.Comp.Path.2005，133：1-13，Wikle等，J.Appl.Res.Vet.Med.2006，4：23-28)证实用严格意义上的布氏疏螺旋体感染仅很少地导致明显的(frank)肢体/关节障碍(例如，肿胀、跛)，我们的发现证实了这点。只有一只(8％)安慰剂接种的对照狗产生了关节异常。其左前腿在蜱攻击9周后僵硬，并且从肘中回收了严格意义上的布氏疏螺旋体螺旋体。然而，这一发现不是显著的，因为两只用疫苗接种的狗的一个或更多个肢体也产生僵硬，但是，与接受安慰剂的狗不同，没有从任何组织回收到螺旋体。
为使该明显的症状的发展恶化，免疫抑制剩余的狗。随后，3只安慰剂接种的对照狗变跛，并且从这些狗的两只中回收了严格意义上的布氏疏螺旋体。相反，免疫抑制的接种疫苗的狗没有产生跛。因此，集合这些发现暗示疫苗预防莱姆关节炎的发展，尽管这些结果不显著(p＝0.0996)。然而，参见下面展现并讨论的另外数据。
疫苗预防与严格意义上的布氏疏螺旋体感染相关的糜烂性改变的能力
然而，当用显微镜检查上面讨论的狗的关节时，该发现清楚地证实了疫苗的效果。来自剩余的用疫苗接种的狗(n＝13)的关节囊是正常的。相反，来自11只剩余的安慰剂接种对照狗(上表7)中6只(p＝0.0034)的一个或更多个关节组织具有显著的以嗜中性粒细胞和单核细胞浸润为特征的炎症(图3)。此外，没有从来自用疫苗接种的狗的任何组织回收到严格意义上的布氏疏螺旋体，但是从6只具有糜烂性改变的安慰剂接种的对照狗中5只(83％)的关节组织中回收了螺旋体。因此集合这些结果证实了疫苗预防犬莱姆关节炎，并且还证实了之前关于该综合症最通常的特征是亚临床滑膜炎的报道(Summers等，J.Comp.Path.2005，133：1-13；Wikle等，J.Appl.Res.Vet.Med.2006，4：23-28)。
实施例7
天然存在的杀疏螺旋体属抗体针对OSPC7表位的特异性
通过分析来自具有或不具有莱姆病或莱姆病相关症状史的个体(人类)的血清获得了确认在哺乳动物中诱发的针对OspC7的杀疏螺旋体属抗体是特异性的数据，如下所述。
A.材料与方法
1.血清
来自没有莱姆病或莱姆病相关症状史(图表综述)的个体(n＝36)的正常血清，来自献血者(n＝100)或进行胆固醇筛查的个体(n＝100)的不特殊的血清，或来自具有通常与严格意义上的布氏疏螺旋体抗原交叉反应的血液因子或疾病(包括抗细胞核抗体(n＝20)、类风湿病因子(n＝20)、单核细胞增多症(n＝10)、巨细胞病毒(n＝10)、梅毒(n＝13)或落基山斑疹热(n＝4))的志愿者的血清来自于储存在-20℃的存档样品。莱姆病血清收集自2003或2004年期间在Gundersen Lutheran MedicalCenter鉴定的患者。将来自满足CDC监视标准(疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)，Morb.Mort.Wkly.Rep.1990，39：19-21.)的游走性红斑(EM)患者的血清(n＝86)归类为极可能的莱姆病，将来自具有蜱暴露及非典型皮肤损伤的患者的血清(n＝22)归类为很可能的莱姆病(n＝49)，并且将来自具有蜱暴露和全身症状(主要包括头疼、发热、肌痛和关节痛)的患者的血清归类为可能的莱姆病。在初访期间收集血清在-20℃储存并在测试之前不知情(blinded)。
OspC7肽。通过应用自动合成仪(Protein Technologies)和Fmoc方法(Fields等，Peptide Res.1991，4：95-101)在University of WisconsinBiotechnology Center(Madison，WI)合成7氨基酸的OspC7肽(AESPKKP；SEQ ID NO：1)。合成后，通过HBTU活化手工生物素化该肽的氨基端末端，并通过高压液相色谱纯化。应用基质辅助激光解吸电离-飞行时间(matrix-assisted laser desorption ionization-time offlight，MALDI-TOF)质谱确认组成(预期质量1095.4；观察质量：1095.8)。
OspC7ELISA。用100μL包含于碳酸盐缓冲液(90mM NaHCO3，60mM Na2CO3；pH 9.6)中的4μg/ml的链霉抗生物素蛋白(Pierce，Rockland，IL)悬浮液包被微量滴定板(Immunolon 2HB，ThermoLabsystems，Franklin，MA)的各个孔，并在4℃孵育过夜。孵育后，用含有0.05％Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS-T；13mM Tris HCl、3mMTris碱、140mM NaCl、2.7mM KCl；pH 7.4)洗涤板5次。洗涤后，往每孔加入200μL含有1μg/mL生物素化OspC7肽的封闭缓冲液(15mM NaCl、10mM Tris HCl、3％胎牛血清、0.05％Tween 20)，并在旋转下(150rpm)在室温孵育1小时。用TBS-T洗涤板3次，并与100μL量的在封闭缓冲液中1∶200稀释的血清在室温下反应1小时。二抗是在封闭缓冲液中1/15,000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗人IgM和IgG(Kirkegaard Perry Laboratories，Gaithersburg，Md.)。孵育1小时后，通过添加柠檬酸盐缓冲液(Sigma，St.Louis，Mo.)中的邻苯二胺和过氧化氢并确定490nm处的OD(SpectraMax 250；Molecular Devices，Sunnyvale，Calif.)定量结合的二抗。
B.结果
在之前的研究(Jobe等，Clin.Diagn.Lab.Immuno.2003，10：573-578，Lovrich等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005，12：746-751)中，将高保守性的免疫显性的OspC杀疏螺旋体属抗体表位定位于最靠近C-端的7个氨基酸(OspC7)内的区域。为确认该表位诱导对疏螺旋体属物种感染特异的抗体，比较了应用OspC7的ELISA的反应性，所述ELISA应用来自莱姆病患者的血清(图5)和来自正常受试者或患有其它很可能产生也能结合疏螺旋体属物种蛋白质的抗体的疾病的患者的血清(图4)。在图4和5中，在吸光度1.25处的线定义了比正常和潜在交叉反应的血清平均吸光度高3个标准差。因此任何落入该直线之上的结果具有99％的该反应是显著的可能性(真阳性)。仅很少在正常或潜在交叉反应血清中检测到显著反应性(图4)。还应当注意，大部分阳性结果是应用可能来自莱姆病患者的血清得到的，因为该血清(CS)获自在Gundersen Lutheran Medical Center看各种疾病的100例患者组。该区域是莱姆病的高地方病集中区，并且患者的身份和临床史未知。相反，在Wisconsin的非地方病区Milwaukee随机从献血者(BD)收集的血清样品(n＝100)中没有检测到阳性血清。
此外，在来自莱姆病患者的血清中普遍地检测到了阳性结果(比应该为没有反应的血清平均值超出高于3个标准差，图4)，并且吸光度值很高(图5)。因此集合这些结果确认了针对OspC7表位的抗体的高特异性和在人类莱姆病期间反应的免疫显性。
总结上面作为例证的数据，用含有5.0×108严格意义上的布氏疏螺旋体50772、2.5×107的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10和5％
Figure G2007800488742D00391
或仅含有5％的安慰剂接种并加强8周龄小狗组(15只狗)。疫苗在注射的部位引起轻微的肿胀，该肿胀很快消失。更显著地，该疫苗诱导高浓度的杀疏螺旋体属OspA和OspC抗体，其在加强剂量接种一周后达到峰值，并且在研究的持续时间内仍然能检测到。此外，显著比例的OspC杀疏螺旋体属抗体对OspC7内高度保守的表位是特异的。
然后使严格意义上的布氏疏螺旋体感染的雌性肩突硬蜱(I.scapularis)以接种的狗为食源，并且检查来自该蜱的中肠确认了血粉中的OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体完全消除了严格意义上的布氏疏螺旋体。具体而言，在34只(32％)收集自用安慰剂接种的对照狗的蜱中检测到了严格意义上的布氏疏螺旋体，但是在以用疫苗接种的狗为食源的蜱(n＝99)中没有检测到严格意义上的布氏疏螺旋体(p＜0.0001)。此外，通过若干种通常用于确认感染的间接或直接方法，疫苗接受者保持莱姆病阴性。相反，10只(67％)对照狗产生针对“感染特异性”20kDa严格意义上的布氏疏螺旋体蛋白的抗体，并且8只(53％)产生“感染特异性”杀疏螺旋体属抗体。此外，4只(27％)狗产生了持续的跛，并且从该4只跛动物中3只(75％)的关节中回收了严格意义上的布氏疏螺旋体。此外，所检查的11只安慰剂接种狗中的6只(55％)的关节囊中产生了炎性浸润。更令人注目的是，分别从14只(93％)和8只(53％)对照狗的皮肤和关节中回收了严格意义上的布氏疏螺旋体，而没有从用测试产物接种的狗中回收到螺旋体。因此，本发明的莱姆病疫苗引起最小的副反应并且提供针对严格意义上的布氏疏螺旋体感染的完全的保护。
实施例8
包含严格意义上的布氏疏螺旋体分离株S-1-10和50772的疫苗的免 疫持续时间
A.材料和方法
动物
上面实施例6描述了材料和方法。
接种和血清收集
用1mL剂量的疫苗在颈部皮下接种狗，并在21天后用另外的1mL剂量加强。在开始之前(研究的第-4天)及加强剂量接种之前(研究的第21天)和研究的第28、35、49、79、114、142、175、210、238、266、302、322、357及394天通过颈内静脉静脉穿刺收集全血。通过离心分离血清并在-20℃储存直到测试。
接种后观察
每天观察狗
蜱攻击
在第二次接种一年后，剃掉狗胸腔右侧的毛，并且将10只雌性和10只雄性布氏疏螺旋体感染的肩突硬蜱(I.scapularis)放置于用带子和绷带卷与剃毛区域固定的橡皮碗中。允许该蜱进食7天。
检测蜱中的严格意义上的布氏疏螺旋体
如在上面实施例6中所描述的方法进行检测。
血液样品
在研究的攻击后(PC)第43天、77PC、112PC、147PC、174PC和241PC在血清分离运输(SST)管中收集全血，分离该血清并储存于-20℃直到测试。
杀疏螺旋体属抗体的检测
如上在实施例1和2中描述的那样通过流式细胞术检测OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体。
皮肤活组织检验
在研究的攻击后(PC)第43天、77PC、112PC、147PC、174PC和241PC用一次性4mm穿刺装置从与蜱附着相邻的部位取得皮肤活组织检查样品。如在上面实施例6所描述的那样处理该活组织检查样品。
免疫抑制
通过在攻击后约20周开始每天一次施与地塞米松(0.4mg/lb体重)，施与5天，从而免疫抑制狗。
临床观察
如上面实施例6中那样进行临床观察。
尸体剖检
如上面实施例6中那样进行尸体剖检。
B.结果
接种后血清学
用安慰剂接种不能诱导对严格意义上的布氏疏螺旋体特异的抗体，相反，用疫苗接种诱导了显著水平的通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体分离株S-1-10和50772检测到的杀疏螺旋体属抗体。针对S-1-10的平均杀疏螺旋体属抗体滴度在加强剂量接种后一周(研究的第28天)达到峰值，并且直到研究的第394天仍然能够被检测到(表13)。类似地，在研究的第28天检测到了高浓度的对分离株50772特异的杀疏螺旋体属抗体，在研究的第49天滴度仍然是高水平，并且在79天后仍然能检测到低水平(表14)。
表13.用疫苗接种后杀疏螺旋体属活性b的平均滴度a(n＝15)
  组   第-4天   第21天   第28天   第35天   第49天   第79天  第114天  第142天
  接种疫苗   NDc   192 ＞7075 ＞5120   ＞4457   735   926   532
  对照   ND   ND ND ND   ND   ND   ND   ND
  组  第175天  第210天  第238天  第266天  第302天  第322天  第357天  第394天
  接种疫苗   702   611   926   557   508   351   211   175
  对照   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10的杀疏螺旋体属抗体测试检测
cND＝未检测到
表14.用疫苗接种后杀疏螺旋体属活性b的平均滴度a(n＝15)
  组   第-4天   第21天   第28天   第35天   第49天   第79天   第114天  第142天
  接种疫苗   NDc   40   1689   532   69   41   ND   ND
  对照   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND
  组  第175天  第210天  第238天  第266天  第302天  第322天  第357天   第394天
  接种疫苗   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND
  对照   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND   ND
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772的杀疏螺旋体属抗体测试检测
cND＝未检测到
OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体对感染的蜱灭菌的能力
对以接种了的狗或对照狗为食源的蜱的中肠进行检查确认了由疫苗诱导的OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体已对该蜱灭菌。在来自以15只安慰剂接种的狗中的12只为食源的95只雌性蜱中的15只(16％)的蜱涂片检测到严格意义上的布氏疏螺旋体(表15)。相反，仅在来自以15只疫苗接种狗中的2只为食源的75只雌性蜱中的2只(3％)的蜱涂片中检测到严格意义上的布氏疏螺旋体(p＝0.0003)。
表15.在从接种的或对照狗中移除的雌蜱中检测严格意义上的布氏疏螺旋体
  处理组  a处理的雌蜱   布氏疏螺旋体涂片阳性   狗阳性总数
  接种疫苗  75/148(51％)   2/75(3％)   2/15
  对照  95/146(65％)   15/95(16％)   12/15*
*p＝0.0003
a充血或不充血的
疫苗预防从皮肤上回收严格意义上的布氏疏螺旋体的能力
疫苗诱导的杀疏螺旋体属抗体还预防布氏疏螺旋体生物体在皮肤上的持续感染。从蜱攻击后以每月一次的间隔收集自安慰剂接种的狗的75个活组织检查样品中的33个(44％)回收了严格意义上的布氏疏螺旋体(表16)。相反，仅从收集自疫苗接种狗的75个活组织检查样品中的6个(8％)回收了严格意义上的布氏疏螺旋体(p＜0.0001)。与15只疫苗接种的狗中的6只(40％)相比较，从来自15只对照狗中10只(67％)的至少一个皮肤活组织检查样品回收了螺旋体。然而，来自接种狗的分离仅限于攻击后第一个月，而10只培养阳性对照狗中的8只(80％)在遍及该研究的随后月份一直具有布氏疏螺旋体阳性皮肤活组织检查样品培养物。
表16.从接种疫苗或未接种对照狗的皮肤分离严格意义上的布氏疏螺旋体
  处理组   第43天PC   第77天PC   第112天PC   第147天PC   第174天PC   活组织检查样品阳性(总数)b   狗阳性(总数)c   狗阳性(总数)d
  接种疫苗(A)   6/15   0/15   0/15   0/15   0/15   6/5(8％)   6/15(40％)   0/6(0％)
  对照(B)   9/15   8/15*   7/15a*   6/15*   3/15   33/75**(44％)   10/15(67％)   8/10(80％)
a一只新狗
b总的阳性活组织检查样品
c阳性狗总数
d在第一个月后阳性狗的总数
*p＜0.05
**p＜0.0001
疫苗预防感染的血清学迹象的能力
该疫苗还预防莱姆病特异性抗体的产生。患有莱姆病的狗产生也能通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772分离株检测到的非OspC杀疏螺旋体属抗体(如实施例6所述)。在15只安慰剂接种的对照狗中的5只(33％)中，攻击后观察到针对菌株50772的杀疏螺旋体属抗体的显著的升高的水平(≥4倍升高)，而在用测试疫苗接种的狗则没有一只如此。
表17.在蜱攻击后杀疏螺旋体属抗体b的平均滴度a
  处理组   第43天PC   第77天PC   第112天PC   第147天PC   第174天PC   具有升高滴度的狗总数
  接种疫苗   40   40   40   40   40   0/15
  对照   48   66   88   88   106   5/15c
a交互稀释
b通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772检测
c≥4倍升高滴度
疫苗预防明显的肢体/关节障碍及与严格意义上的布氏疏螺旋体感染相关的糜烂性改变的能力
之前的研究证实严格意义上的布氏疏螺旋体感染仅很少引起明显的肢体/关节障碍(实施例6)，并且已显示蜱攻击模型在老年狗中没那么有效。为使该明显的症状的发展恶化，攻击约3个月后用地塞米松免疫抑制狗。四只安慰剂接种的对照狗变跛或在关节组织中产生了糜烂性损伤。相反，在用本发明疫苗接种的狗中没有一只产生了任何肢体/关节障碍的临床体征或在关节组织中常见的糜烂性损伤。
本发明的范围不限于本文描述的特定实施方案。实际上，除了本文描述的那些之外，从之前的描述，本发明的各种变更对于本领域技术人员而言是显而易见的。此类变更也落入所附权利要求的范围之内。
还应当理解，对核酸或多肽给出的碱基大小或氨基酸大小以及所有的分子量或分子质量值均是近似的，并且提供用于描述。
本文应用的各种出版物的公开内容均在此通过引用全文并入本文。

Claims (22)

1.一种疫苗组合物，其包含来自疏螺旋体属基因种的第一菌株的免疫有效量的生物体和免疫有效量的疏螺旋体属基因种的第二菌株，
其中所述第二菌株的生物体在其细胞表面呈现OspA抗原、OspB抗原，或呈现OspA抗原和OspB抗原两者。
2.权利要求1的疫苗组合物，其中当用所述疫苗组合物免疫犬时，在所述犬中诱导OspC杀疏螺旋体属抗体和OspA杀疏螺旋体属抗体。
3.权利要求1的疫苗组合物，其中显著比例的OspC特异性杀疏螺旋体属抗体对OspC7是特异的。
4.权利要求1的疫苗组合物，其中所述第一菌株是严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)。
5.权利要求1的疫苗组合物，其中所述第二菌株是严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)菌株。
6.权利要求4的疫苗组合物，其中所述的免疫有效量的来自所述第一菌株和所述第二菌株的生物体已被灭活。
7.权利要求6的疫苗组合物，其包含每毫升约1×104至约1×1010个生物体的第一菌株及每毫升约1×104至约1×1010个生物体的第二菌株。
8.权利要求7的疫苗组合物，其包含每毫升约5.0×108至约5×109个生物体的第一菌株及每毫升约1.0×108至约5×108个生物体的第二菌株。
9.权利要求8的疫苗组合物，其还包含可药用佐剂。
10.权利要求9的疫苗组合物，其还包含可药用免疫刺激剂。
11.权利要求10的疫苗组合物，其还包含至少一种用于诱发针对非疏螺旋体属病原体的保护性免疫的非疏螺旋体属免疫原。
12.权利要求11的疫苗组合物，其中所述非疏螺旋体属免疫原选自：犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬流感病毒、钩端螺旋体属血清型、利什曼原虫属生物、支气管败血性包特氏菌、支原体属物种、狂犬病病毒、犬埃里希氏体、无形体属生物，及其组合。
13.权利要求12的疫苗组合物，其中所述的钩端螺旋体属血清型选自：Leptospira kirschneri感冒伤寒型血清型、肾脏钩端螺旋体犬血清型、肾脏钩端螺旋体出血性黄疸型血清型、肾脏钩端螺旋体pomona血清型，及其组合。
14.权利要求12的疫苗组合物，其中所述的支原体属物种包含犬支原体。
15.一种疫苗组合物，其包含免疫有效量的严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)和严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)。
16.权利要求15的疫苗组合物，其中所述免疫有效量的严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)和严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)已被灭活。
17.权利要求16的疫苗组合物，其包含每毫升约1×104至约1×1010个生物体的严格意义上的布氏疏螺旋体50772及每毫升约1×104至约1×1010个生物体的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10。
18.权利要求17的疫苗组合物，其包含每毫升约5.0×108至约5×109个生物体的严格意义上的布氏疏螺旋体50772及每毫升约1.0×108至约5×108个生物体的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10。
19.权利要求16的疫苗组合物，其还包含可药用佐剂。
20.权利要求16的疫苗组合物，其还包含可药用免疫刺激剂。
21.权利要求16的疫苗组合物在制备用于针对病原性疏螺旋体属基因种免疫犬的疫苗中的用途。
22.血清，其包含获自用权利要求16的疫苗组合物免疫的犬的、与布氏疏螺旋体OspC结合的杀疏螺旋体属抗体。
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