CN101496820A - 一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌的活性提取物及其制法和用途 - Google Patents

一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌的活性提取物及其制法和用途 Download PDF

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一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌的活性提取物及其制法和用途，从中国渤海分离获得的海洋菌株DN7，鉴定为施氏假单胞菌Pseudomonas stuszeri。DN7缺氧条件下扩大培养后的培养液，其正丁醇提取相经硅胶薄层层析和反相高效液相色谱分离，得到两个有效部分的白色粉末，对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性，具有作为抗菌药物的潜在用途。

Description

一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌的活性提取物及其制法和用途
技术领域
本发明涉及来源于细菌的医药配制品，特别是来源于一株兼性厌氧海洋反硝化细菌培养物的活性提取物及其制法。
背景技术
海洋微生物来源的新药开发是二十一世纪世界范围的研究热点问题，以其新菌种来源、产生新结构活性物质、克服传统抗生素耐药性以及实现资源可持续等特点而为人们所普遍关注。目前已经从各类海洋微生物中分离到许多结构新颖的抗细菌抗生素、抗真菌抗生素、抗病毒抗生素、抗肿瘤抗生素以及一些抗炎症和镇痛的活性物质、酶抑制剂等。但目前新型生命活性物质的研发对象主要集中于易于研究的海洋好氧微生物，有大量报道从海洋好氧微生物中分离到新的药理活性成分。由于海水的物理阻隔作用，中下层海水中存在大量的兼性厌氧细菌和严格厌氧细菌，至今稀见有从这些类型细菌中分离到活性成分的报道。海水中的反硝化细菌属于兼性厌氧的细菌类群，这类微生物在好氧培养条件下进行有氧呼吸，在缺氧培养条件下进行硝酸盐呼吸，在其硝酸盐呼吸代谢途径中产生了许多不同于有氧呼吸的次级代谢产物，但迄今尚未见有报道从海洋反硝化细菌类群在缺氧培养物中分离提取到具有药理活性的组分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反硝化细菌海洋菌株培养液的活性提取物。
本发明的另一个目的是提供了该活性提取物的分离方法。
本发明进一步的目的是提供了该活性提取物在制备抗细菌药物中的应用。
本发明涉及的一株兼性厌氧海洋细菌DN7是从中国渤海海域的海洋底泥中分离获得。该菌株合适的生长盐浓度范围为2.0％～5.0％；对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌有抗性。依据《Bergy’s manual of systematical bacteriology》(vol.1.The Williams and wilkins Co.Baltimore.1984)，经鉴定为施氏假单胞菌Pseudomonas stuszeri，已于2008年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏编号为：CGMCC No.2732。
海洋菌株DN7具有下述性质：革兰染色为阴性菌。短杆状，宽0.3μm～0.5μm，长1.0μm～1.5μm，无鞭毛。在有氧培养条件下进行氧呼吸，菌落为褐色，表面光滑，较粘稠，边缘规则；在缺氧培养条件下进行硝酸盐呼吸，产气，每一菌落将包围的营养琼脂胀裂，液体培养基中则产生连续而均匀的细小气泡。最佳生长温度范围35～37℃，最佳生长pH为7.2～7.4。对有机碳源的利用情况如下：在(1)乙酸盐，(2)酒石酸钾钠，(3)淀粉等条件下生长良好。海洋菌株DN7在缺氧培养条件下可产生抗菌活性物质，而在有氧培养条件下则检测不到抗菌活性物质的产生。
海洋菌株DN7的16S rDNA序列(1451bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为EU873348。其全序列如下：
ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGAGAGCTTGCTCTTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTGGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGG
这种海洋菌株DN7可以利用常规的液体培养方式，可使培养基中含有用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。对光照、时间等培养条件并无严格的限制，以适宜于海洋菌株DN7生长为准，并以选择使培养物的活性提取物的收率最高的条件为好。当然这些培养基的组分、氢离子的浓度、培养温度、搅拌条件等均应根据所使用的菌株种类及外部条件等进行适当的调节，并获得最好的效果。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取其中的活性组分，这些方法是常用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其它杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或反复使用。其中，以如下培养基、培养方法和提取方法来培养海洋菌株DN7产生抗生素最佳：
液体培养基为：
乙酸钠            20.0g；
KNO3              2.0g；
K2HPO4            0.5g；
MgSO4             0.2g；
NaCl              25.0g；
MgSO4·7H2O        3.0g；
CaCl2·2H2O        0.05g；
蒸馏水            1000ml；
用浓度为0.1～0.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2±0.2。
本发明的液体培养基还可以用如下配方为：
酒石酸钾钠              20.0g；
KNO3                    2.0g；
K2HPO4                  0.5g；
MgSO4                   0.2g；
人工海水(或陈海水)      1000ml；
用浓度为0.1～0.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2～7.5。
人工海水配方：
NaCl                  25.0g；
Na2SO4                4.0g；
KCl                   0.7g；
NaHCO3                0.20g；
KBr                   0.10g；
H3BO3                  0.03g；
NaF                   0.003g；
1.0mol/L MgCl2溶液     53mL；
1.0mol/l CaCl2溶液     10mL；
0.1mol/L SrO2溶液      0.90ml；
蒸馏水                1000ml
用浓度为0.1～0.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2～7.5。
A.种子培养：将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105Mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DN7，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶置于恒温培养箱中35～37℃下培养。培养时间为10～15天；
B.扩大培养：按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DN7菌液，于恒温培养箱中35～37℃下培养。培养时间为15～20天；
C.提取：将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液过滤，滤液依次分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇连续抽提3次(即乙酸乙酯提取时分出乙酸乙酯提取液，剩余物用正丁醇提取)，将正丁醇提取液用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得一份干固体；
D.提纯：将上述干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷：甲醇：三乙胺＝3：1：0.02的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法和纸片法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，用体积浓度为5～100％的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末。
本发明中从海洋菌株DN7中提取得到的活性提取物，通过抗菌模型筛选，采用琼脂稀释法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.2000.Approved standard：M2～A7，7th ed.NCCLS，Wayne，Pa.)测定对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的MIC值，证实其培养液的正丁醇提取相具有抗菌活性：制备出的活性组分抗铜绿假单胞菌的MIC值为0.64μg/mL，抗枯草芽孢杆菌的MIC值为1.28μg/mL。
利用本发明的活性提取物中的有效组分，可以用于制备抗菌的药物。
以下用实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1.液体培养基为：
乙酸钠                   20.0g；
KNO3                     2.0g；
K2HPO4                   0.5g；
MgSO4                    0.2g；
NaCl                     25.0g；
MgSO4·7H2O               3.0g；
CaCl2·2H2O               0.05g；
蒸馏水                   1000ml；
用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2±0.2。
A.种子培养：将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105Mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DN7，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶置于恒温培养箱中35～37℃下培养。培养时间为10～15天；
B.扩大培养：按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DN7菌液，于恒温培养箱中35～37℃下培养。培养时间为15～20天；
C.提取：将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液过滤，滤液依次分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇连续抽提3次，将正丁醇提取液用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得一份干固体；
D.提纯：将上述干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷：甲醇：三乙胺＝3：1：0.02的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法和纸片法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，用体积浓度为5～100％的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末。
实施例2.液体培养基为：
酒石酸钾钠                20.0g
KNO3                      2.0g
K2HPO4                    0.5g
MgSO4                     0.2g
人工海水(或陈海水)        1000ml
用浓度为0.3mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2～7.5。
人工海水配方：
NaCl                      25.0g
Na2SO4                    4.0g
KCl                       0.7g
NaHCO3                    0.20g
KBr                       0.10g
H3BO3                     0.03g
NaF                  0.003g
1.0mol/L MgCl2溶液   53mL
1.0mol/l CaCl2溶液   10mL
0.1mol/L SrO2溶液    0.90ml
蒸馏水               1000ml
用浓度为0.2mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2～7.5。
A.种子培养：将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105Mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DN7，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶置于恒温培养箱中35～37℃下培养。培养时间为10～15天；
B.扩大培养：按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DN7菌液，于恒温培养箱中35～37℃下培养。培养时间为15～20天；
C.提取：将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液过滤，滤液依次分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇连续抽提3次，将正丁醇提取液用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得一份干固体；
D.提纯：将上述干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷：甲醇：三乙胺＝3：1：0.02的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法和纸片法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，用体积浓度为5～100％的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末。
实施例3.活性组分活性测定结果
采用琼脂稀释法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.2000.Approved standard：M2～A7，7th ed.NCCLS，Wayne，Pa.)测定对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的MIC值，证实其培养液的乙酸乙酯提取相具有抗菌活性：制备出的活性组分抗铜绿假单胞菌的MIC值分别为0.64μg/mL，抗枯草芽孢杆菌的MIC值为1.28μg/mL。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>大连交通大学
<120>一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌的活性提取物及其制法和用途
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1451
<212>DNA
<213>海洋菌株DN7的16S rDNA序列
<400>1
Figure A200910010499D00111
Figure A200910010499D00121

Claims (6)

1.一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌DN7 CGMCC No.2732培养液的活性提取物。
2.根据权利要求1所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物，其特征在于为缺氧培养条件下培养物的正丁醇提取物，对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌有抗性。
3.根据权利要求1或2所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于包括下列步骤：
A.种子培养：将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121℃、0.105Mpa灭菌20min；冷却后接种海洋菌株DN7，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶置于恒温培养箱中35～37℃下培养，培养时间为10～15天；
B.扩大培养：按体积比5～10％的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DN7菌液，于恒温培养箱中35～37℃下培养。培养时间为15～20天；
所述种子培养和扩大培养中，液体培养基组成为：
乙酸钠                         20.0g
KNO3                           2.0g
K2HPO4                         0.5g
MgSO4                          0.2g
NaCl                           25.0g
MgSO4·7H2O                    3.0g
CaCl2·2H2O                    0.05g
蒸馏水                         1000ml
用浓度为0.1～0.5mol/L的氢氧化钠调节使其pH为7.2±0.2；
C.提取：将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液过滤，滤液依次分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇连续抽提3次，将正丁醇提取液用旋转蒸发仪于50℃减压蒸干，得一份干固体；
D.提纯：将上述干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺＝3∶1∶0.02的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法和纸片法追踪活性斑点；再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，用甲醇洗脱；洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C18反相柱，用体积浓度为5～100％的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100％甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末。
4.根据权利要求3所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于所述种子培养和扩大培养中，液体培养基组成为：
酒石酸钾钠                  20.0g
KNO3                        2.0g
K2HPO4                      0.5g
MgSO4                       0.2g
人工海水或陈海水            1000ml用浓度为0.1～0.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2～7.5；
所述人工海水组成为：
NaCl                        25.0g
Na2SO4                      4.0g
KCl                         0.7g
NaHCO3                      0.20g
KBr                         0.10g
H3BO3                       0.03g
NaF                         0.003g
1.0mol/L MgCl2溶液          53mL
1.0mol/l CaCl2溶液          10mL
0.1mol/L SrO2溶液           0.90ml
蒸馏水                      1000ml
用浓度为0.1～0.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2～7.5。
5.根据权利要求4所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于所述人工海水用陈海水代替。
6.权利要求1或2所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物在制备抗细菌药物中的应用。
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