CN101387586A - 荭草苷标准品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荭草苷标准品的制备方法，该方法包括如下步骤：步骤I：金莲花药材，加50－80％乙醇回流提取，减压回收乙醇并浓缩至膏状；步骤II：浸膏经过硅胶柱层析，洗脱，收集含有荭草苷的洗脱液；洗脱液采用薄层色谱检测，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70－80％荭草苷粗品。步骤III：荭草苷粗品加70－100％甲醇溶解，Sephadex LH－20柱层析，70－100％甲醇洗脱；步骤IV：Sephadex LH－20洗脱液用HPLC检测纯度，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷；本方法收率高、稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取物标准品的制备方法，特别是涉及荭草苷标准品的制备方法。
背景技术
本品荭草苷来源于毛茛科植物金莲花，在竹叶、荭草等植物中均有分布。目前主要用于金莲花、竹叶和荭草等药材的质量控制以及含有金莲花、竹叶和荭草等药材的中药制剂的质量控制。目前荭草苷标准品的制备方法存在收率低，成本高并且纯度不够等缺点。
发明内容
本发明目的在于公开荭草苷标准品的制备方法。
本发明所述的荭草苷标准品是通过如下步骤制备的：
步骤I：金莲花药材，加相当于生药重量6-10倍量的50-80％乙醇回流提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至浸膏；
步骤II：浸膏用常规溶剂溶解，经过硅胶柱层析，60-80:20-40:5-15的氯仿：甲醇：水的下层溶液洗脱，洗脱溶液采用薄层色谱检测，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80％荭草苷粗品；
步骤III：荭草苷粗品加70-100％甲醇溶解，经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析，70-100％甲醇洗脱；
步骤IV：洗脱液用HPLC检测纯度，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷。
上述的荭草苷标准品制备中TLC系统检测，展开溶剂为60-70：25-45：5-15的氯仿：甲醇：水的下层溶液展开。
本发明所述的荭草苷标准品制备优选如下方法：
步骤I：金莲花药材，加生药按重量比计8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至浸膏；
步骤II：浸膏用常规溶溶解剂，经过硅胶柱层析，70:30:10的氯仿：甲醇：水的下层溶液洗脱，收集含有荭草苷的洗脱液，洗脱液采用薄层色谱检测(TLC)检测，展开溶剂为65：35：10的氯仿：甲醇：水的下层溶液展开，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80％荭草苷粗品；
步骤III：荭草苷粗品加80％甲醇溶解，Sephadex LH-20柱层析，80％甲醇洗脱；
步骤IV：洗脱液用HPLC检测纯度，流动相为乙腈-0.1％磷酸水为12：88，检测波长350nm，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷标准品。
所述浸膏可以用现有技术中公开的溶剂溶解，如甲醇，然后干法上样。
本发明公开荭草苷标准品的制备方法具有如下特点：
(1)工艺简单，成本低廉：该标准品的制备首先采用50％～80％浓度间的乙醇回流提取，溶剂经减压回收以后，得浸膏，上硅胶柱色谱层析，以不同比例的氯仿-甲醇-水下层溶剂系统为洗脱剂，并采用TLC检测，合并含有荭草苷的洗脱液，得荭草苷粗品；
经反复试验，选用硅胶柱色谱层析能够很好的去除色素和其它杂质，得到荭草苷粗品；在实验过程中，如对比采用丙酮-乙酸乙酯系统为洗脱剂，洗脱效果不好，洗脱流程长，且乙酸乙酯极性较小，不利于荭草苷的洗脱，且容易引进其它极性较小的杂质；曾选用乙酸乙酯-甲醇(9:1)等为洗脱剂，洗脱流程长，得到的荭草苷粗品纯度低(约60～70％)且去除色素效果不好；选用氯仿-甲醇-水(60-80:20-40:5-15)下层溶剂为洗脱剂，洗脱流程短，去除色素和其它杂质的效果好，荭草苷粗品的纯度能达到70～80％；
荭草苷粗品的进一步纯化；对硅胶柱色谱等进行考察，发现不但流程长，浪费试剂，且由于硅胶柱色谱的特性，吸附性较大，得到的收率低，同时去除色素效果不好，含有其它杂质，荭草苷标准品的纯度达不到98.0％；采用Sephadex LH-20柱色谱进行纯化，由于以80％甲醇为洗脱剂，可回收利用且流程短，几乎不产生吸附，收率较高，同时去除色素和其它杂质的效果好，一般经一次Sephadex LH-20柱色谱纯化，能得到75～85％的荭草苷标准品。
(2)收率高：本法制得的荭草苷标准品收率在0.05～0.1％之间，即平均1000g金莲花药材即可制得500mg荭草苷标准品，获得很高的收率；
(3)稳定性好：本法制得的荭草苷标准品的稳定性很好，经试验，在粉末状态，在两年内稳定性良好；在溶液状态，在48h内稳定性良好；
(4)标准品纯度：纯度在98.0％以上；
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明；
实验例1 Sephadex LH-20柱应用的实验
纯化方法一般有硅胶柱层析纯化法、Sephadex LH-20柱纯化法和制备液相纯化法等。曾采用过硅胶柱层析纯化法，选用氯仿-甲醇-水(65:35:10)下层溶液为洗脱剂，由于硅胶柱吸附作用较强，荭草苷收率较低；且采用大量有机溶剂进行洗脱，不能回收使用，成本较高；另外纯化得到的荭草苷纯度有时不够98.0％，需进行进一步纯化。
制备液相纯化法费时且成本高，一般不适用于大量标准品的制备。
Sephadex LH-20柱纯化法，以80％甲醇为洗脱溶剂，洗脱溶剂可回收使用，洗脱流程很短，且没有死吸附，收率较高，得到的荭草苷标准品的纯度也较高，一般都能够达到98.0％。结果见表1。
表1
采用Sephadex LH-20柱进行纯化，曾采用氯仿-甲醇(1：1)系统进行洗脱，分离效果不好，荭草苷标准品纯度不是很高，大于98.0％纯度的洗脱液较少，并且成本较高，说明氯仿-甲醇系统不适用。还曾选择40-60％甲醇为洗脱溶剂进行洗脱，杂质与荭草苷的分离效果不好，有时交叉较严重，标准品的纯度不高，还需进行纯化。后以80％甲醇为洗脱溶剂进行洗脱，杂质与荭草苷的分离效果很好，荭草苷纯度较高，纯度一般均大于98.0％，收率较高，成本很低。经过筛选实验，说明80％甲醇为洗脱溶剂效果很好，成本很低且流程短，目前还没有应用Sephadex LH-20柱进行纯化的文献报道。
实验例2 硅胶柱、Sephadex LH-20柱结合与硅胶柱、硅胶柱结合效果的对比实验
在荭草苷标准品的制备过程中，我们曾选用硅胶柱与硅胶柱结合的方法，结果实验流程很长，成本很高，并且收率很低，标准品纯度低，往往需再次纯化；硅胶柱与Sephadex LH-20柱结合，结果实验流程短，溶剂可回收利用，成本低，并且收率高，标准品纯度高。结果见表2。
表2
下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果
具体实施方式
实施例1：荭草苷制备方法
金莲花药材，加生药10倍量50％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至浸膏；该浸膏用甲醇溶解，干法上样，经过硅胶柱层析，70:30:10氯仿：甲醇：水的下层溶液为洗脱剂，洗脱，TLC检测，65:30:10氯仿：甲醇：水的下层溶液为展开剂，展开，收集含有荭草苷的洗脱液，加80％甲醇溶解，Sephadex LH-20柱层析，80％甲醇洗脱；洗脱液用HPLC检测纯度，流动相为12：88的乙腈-0.1％磷酸水，检测波长350nm合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷；
实施例2：荭草苷制备方法
金莲花药材，加生药7倍量60％乙醇回流提取2次，每次3小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至稀膏状；浸膏经过硅胶柱层析，80:22:5的氯仿：甲醇：水的下层溶液为洗脱剂，洗脱，TLC检测，70:30:10的氯仿：甲醇：水的下层溶液为展开剂展开，收集含有荭草苷的洗脱液，加70％甲醇溶解，Sephadex LH-20柱层析，75％甲醇洗脱；洗脱洗脱液用HPLC检测纯度，流动相：乙腈-0.1％磷酸水为14：82，检测波长350nm，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷。
实施例3：荭草苷制备方法
金莲花药材，加生药6倍量60％乙醇回流提取4次，每次1小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至稀膏状；浸膏经过硅胶柱层析，65：35：10的氯仿：甲醇：水的下层溶液为洗脱剂，洗脱，TLC检测，60:40:10的氯仿：甲醇：水的下层溶液为展开剂展开，收集含有荭草苷的洗脱液，加甲醇溶解，Sephadex LH-20柱层析，甲醇洗脱；洗脱洗脱液用HPLC检测纯度，流动相：乙腈-0.1％磷酸水为16：82，检测波长350nm，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷。
Claims (4)
1、一种荭草苷标准品的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤I：金莲花药材，加相当于生药重量6-10倍量的50-80％乙醇回流提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至浸膏；
步骤II：浸膏用常规溶剂溶解，经过硅胶柱层析，60-80:20-40:5-15的氯仿：甲醇：水的下层溶液洗脱，洗脱溶液采用薄层色谱检测，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80％荭草苷粗品；
步骤III：荭草苷粗品加70-100％甲醇溶解，Sephadex LH-20柱层析，70-100％甲醇洗脱；
步骤IV：洗脱液用HPLC检测纯度，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷。
2、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该方法步骤II中的薄层色谱检测展开溶剂为氯仿：甲醇：水60-70：25-45：5-15的下层溶液。
3、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤IV中的HPLC检测纯度时流动相10-20：80-90的乙腈-0.1％磷酸水，检测波长350nm。
4、如权利要求1-3所述的任意一种制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤I：金莲花药材，加生药按重量比计8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至浸膏；
步骤II：浸膏用常规溶剂溶解，经过硅胶柱层析，70:30:10的氯仿：甲醇：水的下层溶液洗脱，收集含有荭草苷的洗脱液，洗脱液采用TLC系统检测，展开溶剂为65:35:10的氯仿：甲醇：水的下层溶液，合并含有荭草苷的洗脱液，得纯度70-80％荭草苷粗品；
步骤III：荭草苷粗品加80％甲醇溶解，Sephadex LH-20柱层析，80％甲醇洗脱；
步骤IV：洗脱液用HPLC检测纯度，流动相为乙腈-0.1％磷酸水为12：88，检测波长350nm，合并纯度大于98％的洗脱液，即得荭草苷标准品。
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