CN101381714B - 一种葡聚糖酶的分离纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
一种葡聚糖酶的分离纯化的方法，它涉及了一种纤维素酶的分离纯化的方法。本发明解决了现有应用于棉织品水洗整理工艺中的纤维素酶存在应用时需要特定的酸性环境而影响产品的外观与质量的缺陷。本发明的葡聚糖酶用于降解羧甲基纤维素钠，它既具有内切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反应最适pH值为8.0，酶促反应最适温度为55℃。本发明葡聚糖酶的分离纯化按照以下步骤进行：一、发酵粗酶液的预处理；二、柱层析；洗脱即得到葡聚糖酶。本发明的葡聚糖酶在中性或碱性的条件下保持着较高的酶活和良好的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种纤维素酶的分离纯化的方法。
背景技术
目前，在棉织品(牛仔服等)水洗整理工艺中广泛采用李氏木霉(T.reesei)产生的纤维素酶，由于这类真菌纤维素酶制剂的适宜反应pH条件通常是酸性的，所以在水洗前要加酸将水洗液调至特定的酸性环境，操作麻烦。同时，在酸性条件下水洗液中的染料容易玷污织物，造成“反沾色”现象，严重影响产品的外观与质量。
发明内容
本发明是为了解决现有应用于棉织品水洗整理工艺中的纤维素酶存在应用时需要特定的酸性环境而影响产品的外观与质量的缺陷，而提供一种葡聚糖酶的分离纯化的方法。
本发明的葡聚糖酶用于降解羧甲基纤维素钠，它既具有内切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反应最适pH值为8.0，酶促反应最适温度为55℃，分子量为51.3kDa，Km值为2.1218mg/mL，Vmax值为5.3706μg/mL·min；其中Km值和Vmax值为葡聚糖酶降解羧甲基纤维素钠反应中的特征值。
本发明葡聚糖酶的分离纯化按照以下步骤进行；一、发酵粗酶液的预处理：将蜡样芽胞杆菌发酵60h后收集发酵液，以3000r/min的速度离心15min，取上清液加入(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的浓度为饱和度的30％，在4℃条件下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h，再以5000r/min的速度离心15min，取上清液中补加(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的浓度为饱和度的90％，然后再在4℃条件下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h后，以5000r/min的速度离心15min，收集蛋白沉淀，并用透析袋将收集的蛋白沉淀物进行脱盐，而后再进行超滤浓缩，即得到柱层析前的酶液；二、柱层析：用葡聚糖凝胶SephadexG-75进行柱层析，洗脱液为浓度为0.02mol/L、pH值为4，8的乙酸-乙酸钠缓冲液，洗脱液流速为12mL/h；洗脱即得到葡聚糖酶。
本发明的葡聚糖酶具有以下优点：
1、本发明的葡聚糖酶在中性或碱性的条件下、降解羧甲基纤维素钠的反应中保持着较高的酶活和良好的稳定性：这一酶学特性显示，本发明的葡聚糖酶在棉织品的生物整理工业中将会克服当前使用真菌来源的葡聚糖酶带来的不利，具有良好的应用前景。
2、本发明的葡聚糖酶在中性或碱性的条件下、降解羧甲基纤维素钠的反应中不但保持着高酶活和良好的稳定性，而且在表面活性剂(SDS)和螯合剂(EDTA)存在时表现出来的显著的稳定性，说明本发明的葡聚糖酶能够作为洗涤剂产品的添加剂。
附图说明
图1为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶的电泳图谱，其中1号条带为标准条带，2号和3号条带分别为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶两个平行样的条带；图2为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶酶活随温度变化图；图3为温度对具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶活性稳定性的影响曲线；图4为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶酶活随pH值变化图；图5为pH值对具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶活性稳定性的影响曲线；图6为具体实施方式二分离纯化出的葡聚糖酶的Lineweaver-Burk作图曲线。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的葡聚糖酶用于降解羧甲基纤维素钠，它既具有内切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反应最适pH值为8.0，酶促反应最适温度为55℃，分子量为51.3kDa，Km值为2.12mg/mL，Vmax值为5.37μg/mL·min；其中Km值和Vmax值为葡聚糖酶降解羧甲基纤维素钠反应中的特征值。
具体实施方式二：本实施方式葡聚糖酶的分离纯化按照以下步骤进行：一、发酵粗酶液的预处理：将蜡样芽胞杆菌发酵60h后收集发酵液，以3000r/min的速度离心15min，取上清液加入(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的浓度为饱和度的30％，在4℃条件下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h，再以5000r/min的速度离心15min，取上清液中补加(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的浓度为饱和度的90％，然后再在4℃条件下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h后，以5000r/min的速度离心15min，收集蛋白沉淀，并用透析袋将收集的蛋白沉淀物进行脱盐，而后再进行超滤浓缩，即得到柱层析前的酶液；二、柱层析：用葡聚糖凝胶Sephadex G-75进行柱层析，洗脱液为浓度为0.02mol/L、pH值为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，洗脱液流速为12mL/h；洗脱即得到葡聚糖酶。
本实施方式中的饱和度为质量饱和度，步骤二中的葡聚糖凝胶SephadexG-75的分子量为3～80kDa。
将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶经过如下实验，以确定它的性质：
1、将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶通过SDS-PAGE，如果出现的是单一条带，则说明酶蛋白已经达到电泳纯，经过SDS-PAGE测定葡聚糖酶的分子量，电泳图谱如图1所示，计算得出葡聚糖酶的分子量为51.3kDa。
2、分别以35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃为反应温度，于pH4.8测定本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶活，以酶活最高者为100％计，结果如图2所示。从图2可以看出，本实施方式分离纯化出的酶组分的活性随着温度的升高而逐渐提高，在温度达到55℃时酶活最高，而高于此温度后，随着温度的升高，酶活急剧下降，在达到75℃时酶活趋近于零。因此，该酶组分的酶促反应的最适温度分别为55℃。
3、在pH值为4.8的条件下，将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶液分别于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃下保温30min后，恢复至室温，在标准条件下，测定残存酶活力，以标准状态下未经保温的酶活力为100％，测得结果如图3所示。从图3可以看出，在35℃～55℃的温度范围内，本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶保持着相对稳定的酶活性；当温度高于55℃，酶的稳定性迅速下降，当保温温度达到80℃时，酶的活性仅为原酶活性的11.03％。因此，在55℃以下，CMCase具有良好的热稳定性。
4、在温度50℃条件下，将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶液分别与pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0或12.0的缓冲液配制的底物混合后，反应30min，然后分别测定在这些pH条件下本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶活，以酶活最高者为100％计，结果如图4所示。从图4中可以看出，pH为3.0～8.0时酶的活性随pH值的增加而逐渐升高，且在pH值在6.0～8.0的范围内提升的幅度较大；当pH值大于8.0时，酶的活性随pH值的增加而逐渐下降；在pH值为12.0时，酶的活性降至最低点；在pH7.0～9.0，CMCase保持着最高活性；因此，此CMCase酶促反应的最适pH为8.0。
5、将本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶液分别在pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0或12.0的缓冲液中，在温度为30℃的条件下保温30min，测定残存CMCase活力，以标准状态下CMCase酶液的活力为100％，得出相对酶活，测得结果如图5所示。从图5中可以看出，pH值为3.0～8.0时，酶活性逐渐升高，尤其在pH值为3.0～5.0酶活性提升较迅速，pH5.0～8.0范围内酶活较平稳，且保持较高的酶活性；pH值为8.0～12.0时，酶活性逐渐下降，但在pH值为9.0时仍保持较高的酶活性，约为标准条件下的83％pH值为9.0～12.0范围内酶活急剧下降。由此可见，本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶具有较宽的pH值稳定范围，在pH值5.0～9.0范围内酶液仍残存有较高的酶活性，特别是在pH值7.0～9.0的中、碱性范围内保持着较好的稳定性。
6、向本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶液分别添加一些离子和化合物后测得酶活力，以标准状态下酶液的酶活力为100％，得出相对酶活，测试结果如表1所示。
结果表明，Mn2+、Fe2+和EDTA对本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶在酶促反应中有一定的激活作用，尤其是Mn2+的激活作用最为显著，使得本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的相对酶活高达113.40％；Ba2+、Cu2+、Mg2+和C2O4 2-对本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶在酶促反应中均有不同程度的抑制作用，其中以Ba2+和C2O4 2-的抑制作用最为显著，导致CMCase相对酶活分别仅为标准状态下的60.97％和62.98％；各种离子和化合物对CMCase的激活作用Mn2+＞Fe2+＞EDTA＞Zn2+；对CMCase的抑制作用Ba2+＞C2O4 2-＞Cu2+＞Mg2+＞SDS；脲、Ca2+、Co2+、K+和Na+对CMCase的作用效果不明显。
表1
7、底物专一性的测定
测定本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶对不同底物的酶活，结果如表2所示。表2的数据说明，本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶对底物羧甲基纤维素钠的酶活性较强，同时对Whatman滤纸和木聚糖也显示出微弱的酶活性，这表明本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶在对CMC表现出较强的酶活力的同时，还含有微弱的降解结晶纤维素和半纤维素的活性
表2
注：表中数据为三次平行的平均值
8、动力学常数Km和Vmax的测定
在与不同浓度CMC-Na作用下，测得本实施方式分离纯化出的葡聚糖酶的酶活力，结果如表3所示。根据米氏方程
用双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)，取米氏方程的倒数式：
以1/v对1/[S]作图，如图6所示，图6中的线性方程为y＝0.395x+0.1862。直线在y轴上的截距即为
将直线反向延长，交于x轴负轴，其横轴截距为
由此求出Km＝2.12mg/mL，Vmax＝5.37μg/mI·min。该菌的Km值明显高于以前所报道的其它芽胞杆菌的内切葡聚糖酶(0.59～1.6mg/mL)。
表3
注：表中数据为三次平行的平均值
Claims (1)
1.一种葡聚糖酶的分离纯化方法，其特征在于葡聚糖酶的分离纯化按照以下步骤进行：一、发酵粗酶液的预处理：将蜡样芽胞杆菌发酵60h后收集发酵液，以3000r/min的速度离心15min，取上清液加入(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的浓度为饱和度的30％，在4℃条件下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h，再以5000r/min的速度离心15min，取上清液中补加(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的浓度为饱和度的90％，然后再在4℃条件下以10r/min的速度搅拌2h，静置2h后，以5000r/min的速度离心15min，收集蛋白沉淀，并用透析袋将收集的蛋白沉淀物进行脱盐，而后再进行超滤浓缩，即得到柱层析前的酶液；二、柱层析：用葡聚糖凝胶Sephadex G-75进行柱层析，洗脱液为浓度为0.02mol/L、pH值为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，洗脱液流速为12mL/h；洗脱即得到葡聚糖酶。
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| 吕文平等.地衣芽孢杆菌β -1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达.《农业生物技术学报》.2004,第12卷(第4期),446-449. |
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