CN101347636A - 3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸共聚物作为组织工程材料的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了3－羟基丁酸、3－羟基戊酸和3－羟基己酸共聚物在组织工程中的应用。已经证明，本发明的共聚物易加工成型，具有良好的抗张强度和柔韧性，并且对多种细胞具有良好的生物相容性和生物降解性，能显著地促进细胞生长。

Description

3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸共聚物作为组织工程材料的应用

技术领域

本发明涉及新型生物材料3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸共聚物P(3HB-co-3HV-co-3HHx，或PHBVHHx)作为组织工程生物材料的应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一系列广泛存在于许多微生物细胞中的天然高分子，种类繁多(Chen et al，2000)。PHA的结构通式可表示为式1-1。与化学合成的高分子材料相比，依单体的组成不同，PHA具有从坚硬的晶体到柔软的弹性体等一系列不同的聚合物性质。

组织工程(Tissue Engineering)是应用细胞生物学和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的生物活性替代物的一门科学。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可以被机体降解吸收的生物材料上面形成复合物，然后将细胞-生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的(Vacanti & Langer，1999)。PHA由于具有良好的生物相容性，生物可降解性和压电效应，因此决定了其在组织工程中的广泛应用(Chen & Wu，2005)。

R为取代基，可为饱和或不饱和、直链或支链的C₁-C₁₉的烷基。m为聚合度。n＝1、2、3或4。优选地，n＝1。例如，当n＝1，R＝甲基时，PHA单体为羟基丁酸(hydroxybutyrate或HB)；R＝乙基时为羟基戊酸(hydroxyvalerate或HV)；R＝丙基时为羟基己酸(hydroxyhexanoate或HHx)；R＝丁基时为羟基庚酸(hydroxyheptanoate或HHp)；R＝戊基时为羟基辛酸(hydroxyoctanoate或HO)等。

目前在组织工程材料中应用较多的可降解合成材料是聚乳酸(PLA)类材料。这种材料有许多优点，如能够较精确地控制分子量、降解时间、疏水性等，但也存在一些问题，例如其在体内降解产物使局部呈酸性从而可能引起不良反应，降解速率过快，另外作为合成类高分子材料缺乏细胞识别信号，其昂贵的价格也限制了其广泛应用。相比而言，天然生物可降解材料(如聚3-羟基丁酸酯(PHB)等)不仅具有良好的生物可降解性、生物相容性、有利于细胞吸附或保持分化等优点；同时在加工性能和机械性能方面更具优势(Chen & Wu，2005)。

PHA的聚合物具备有热塑性及一定的弹力强度，很适合于在心血管系统的组织工程中应用(Williams et al，1999)。作为替代心血管系统这类管状和膜状组织的材料骨架，必须具有良好的弹性，能够抵制来自周围组织和内部液体的机械压力，此外，还需具备良好的对液体的屏障作用。研究人员已经开始利用组织工程的方法构建组织化的心脏泵，利用PHA聚合物研制的活体组织心脏泵，在短期能够替代天然心脏泵的功能，如：泵必须具有足够的机械度，可以承受不断重复的双向搏动。而当新的组织再生以后，这些PHA生物材料最终将降解只留下新生的替代泵(Williams et al，1999)。

有研究表明可降弹性高分子聚羟基辛酸-羟基己酸酯P(3HO-co-3HHx)作为材料接种羊自体细胞，形成组织工程血管移植物(Shum etal，1999)。Poly(3HO-co-3HHx)-PGA移植体的组织学切片分析结果证实其引起免疫反应小、伴随着细胞密度的增加、胶原形成，其机械性能接近天然血管。早期的研究中，曾用接种了自体血管细胞的以多孔PGA与PLA为基础的支架，取代羊肺小叶管，但由于PGA-PLA生物材料相对高的硬度和强度导致失败。然而，当将poly(3HO-co-3HHx)多孔材料缝合在PGA网材制备的导管上，并以此取代肺小叶，即可克服上述缺陷(Stock et al，2000)。Hoerstrup等(2000)在羊体内成功地构建了PHAs的心瓣膜支架，它可在术后第8周完全取代三叶心瓣膜的功能。

3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)是作为PHB及PHBV的替代产品出现的，其体外细胞亲和性研究发现，该材料制成膜或三维支架后有利于成纤维细胞(Yang et al，2002)，软骨细胞(Deng et al，2002)，骨髓基质干细胞(Yang et al，2004)等黏附和增殖，并能够促经软骨细胞外基质的形成(Deng et al，2003)。经过脂肪酶处理(Zhao et al，2002)或与PHB共混(Deng et al，2002)能够显著提高其细胞亲和性。

原则上，PHA能够满足多种人种组织器官的需求，如：心血管系统、角膜胰腺、胃肠系统、肾脏、泌尿生殖系统、肌肉骨骼各系统、神经系统、牙齿与口腔、皮肤等。

目前，仍然需要具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时具有一定机械强度和延展性的新型生物材料。

发明内容

本发明提供了3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸共聚物在组织工程中的应用。

优选地，在所述共聚物中，3-羟基戊酸单体的摩尔比在0.5-30％范围内，3-羟基己酸单体的摩尔比在0.5-30％范围内。更优选地，在所述共聚物中，3-羟基戊酸单体的摩尔比在1-10％范围内，3-羟基己酸单体的摩尔比在5-20％范围内。根据一个特别优选的实施方式，3-羟基戊酸单体的摩尔比在2-7％范围内，3-羟基己酸单体的摩尔比在10-15％范围内。

本发明的共聚物特别适合用作组织工程支架材料。

本发明的聚羟基脂肪酸共聚物可用于制备各种组织工程用品，例如但不限于支架、修复材料、缝合线、骨钉、管形材料、骨修补物、组织再生基体、细胞培养附着材料、人造血管、创伤敷料、细胞或组织包被、多孔膜、微粒或毫微粒、心脏修复材料、心瓣膜、心脏叶瓣、心脏瓣环、牙齿移植材料或者心包膜等。

由于本发明的聚羟基脂肪酸共聚物具有良好的促进细胞粘附和生长的性能，因此可用作细胞或组织生长的基体和附着材料，尤其适合于间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞等。所述附着材料包括硬组织植入材料、软组织植入材料、骨组织工程支架材料等。

本发明所提供的3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸共聚物(PHBVHHx)是一种比PHB、PHBV、PHBHHx等更优秀的组织细胞相容性的材料。PHBVHHx具有良好的机械强度和延展性，可以加工成型，符合组织工程对材料的要求。

本发明中的新型生物材料PHBVHHx与已有的应用于组织工程中的生物材料如PHB和聚乳酸PLA相比，具有以下特点：(1)是完全由微生物合成的生物高分子材料，具有很好的生物可降解性；(2)具有很好的有机溶剂的溶解性；(3)具有很好的机械性能，易加工成型；(4)具有很好的细胞相容性；(5)具有更好的促进组织再生的能力。

附图的简要说明

图1显示了人间充质干细胞在PHBVHHx膜上的增殖情况。对照样品：PLA膜、PHBHHx膜、细胞培养板(不加膜)。n＝6，^＊p＜0.05。No films：不加膜。

图2显示了成骨细胞MC3T3在PHBVHHx膜上的增殖情况。对照样品：PLA膜、PHBV膜。n＝6，^＊p＜0.05。

图3显示了小鼠成纤维细胞L929在PHBVHHx膜上的增殖情况。对照样品：PLA膜、PHBV膜。n＝6，^＊p＜0.05。

具体实施方式

本发明的3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸共聚物可以是3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸任何单体比例的三聚物，也可以是该三聚物的共混物，三聚物的表面改性复合物，三聚物的表面处理修饰物等。

在本发明的聚合物中，对三种单体的比例没有特别的限制。但是，优选的3-羟基戊酸单体的摩尔比可以为0.5-30％，3-羟基己酸单体的摩尔比可以为0.5-30％。

本领域中已知多种对聚合物进行表面改性和表面处理的方法，可由本领域技术人员根据具体需要确定采用何种方法。

本发明的PHBVHHx新材料以及其它的对照样品成膜之后，用来培养人间充质干细胞72小时，经过MTT分析来检测对比细胞的生长情况。试验结果显示，四组中PLA膜上生长的细胞最少，而PHBVHHx膜上生长的细胞数量高于各对照组，且具有显著差异性(p＜0.05)。(图1)该试验结果说明，对比不加膜的培养板，PLA膜，PHBHHx膜而言，至少在培养人间充质干细胞上，新材料PHBVHHx具有更优的生物相容性。

成骨细胞MC3T3在PLA膜上的增殖量为3.32×10⁵个/ml，在PHBV膜上的增殖量为4.23×10⁵个/ml，在PHBVHHx膜上的增殖量4.92×10⁵个/ml(图2)。由此可见细胞在PHBVHHx生长速度较快，因此PHBVHHx比其他三种材料有更好的生物相容性。

成纤维细胞L929分别在PLA、PHBV和PHBVHHx膜上生长72小时，经过MTT检测，结果(图3)表明，细胞在PHBVHHx膜上生长比其他两种对照膜旺盛，相对于PLA而言，PHBVHHx具有更好的生物相容性。

下面将结合实施例对本发明进行更为具体的描述。这些实施例仅仅是出于更好地解释本发明的目的，不以任何形式构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：新材料PHBVHHx的获得

PHBVHHx的生产菌株可以通过对中国专利申请03146663.X(公开号CN 1570085A)中公开的嗜水气单胞菌CGMCC NO 091l(该菌株已于2003年3月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)进行基因工程改造而获得，其中将phbAB基因插入到质粒中然后转入到嗜水气单胞菌中构成重组菌。所涉及的操作均为常规技术，可参考《分子克隆实验指南》等工具书。

本实施例还提供了PHBVHHx的采用不同菌株的另一种备选的制备方法。

菌种：带有PHB合成基因phbAB的嗜水气生单胞菌Aeromonashydrophila 4AK4(phaAB)(清华大学生物系微生物实验室提供)。

上述两种菌株的培养方法是相似的，如下文所述。

LB培养基(Luria-Bertani Broth media)：5g/L酵母浸出物

10g/L胰蛋白胨；10g/L NaCl。

基本矿物盐培养基(Mineral media即MM)：9g/LNa₂HPO₄·12H₂O；

1.5g/L KH₂PO₄；1g/L(NH₄)₂SO₄；0.41g/L MgSO₄；0.05g/LFe(III)-NH₄-citrate；0.02g/L CaCl₂·2H₂O；和1ml的微量元素。

微量元素(每升1mol/L HCl含有)：100mg ZnSO₄·7H₂O；30mgMnCl₂·4H₂O；300mg H₃BO₃；200mg CoCl₂·6H₂O；10mgCuSO₄·5H₂O；20mg NiCl₂·6H₂O和30mg NaMnO₄·2H₂O。

本实施例操作如下：

A.hydrophila 4AK4在LB培养基(含有50μg/ml卡那霉素)中30℃、200rpm培养过夜作为种子液，按照2％的接种量将种子液接种到100ml发酵培养基(MM培养基，含有50μg/ml卡那霉素)中，并加入十二酸(8-10g/L)，30℃、200rpm培养48小时。培养期间，添加不等量的丙酸作为底物生成不同含量3HV组分的PHBVHHx材料。

摇瓶培养48小时后，离心(5000rpm，15分钟)收集菌体，收集的细胞用蒸馏水洗涤两次。冰冻干燥，用研钵将菌体磨碎，称重，加入10倍体积的氯仿，加盖密闭。100℃烘箱中4小时。冷却至室温后，抽滤，用10倍体积的无水乙醇沉淀，再次抽滤，去除氯仿和乙醇；真空干燥，得到新材料PHBVHHx。

具有不同3-羟基戊酸和3-羟基己酸单体摩尔比的PHBVHHx材料，可以通过对所用的底物浓度进行适当调整而制得。

实施例2：人间充质干细胞在PHBVHHx膜表面的增殖

本实施例的操作如下：

在60℃水浴回流保持0.5小时，使已纯化的PHBVHHx聚合物(P(3HB-3.9mol％3HV-13.4mol％3HHx))完全溶解于三氯甲烷，室温下展膜，经冰冻干燥去除残余在膜中的有机溶剂。将膜剪至24孔板孔的大小，将其完全浸入75％乙醇中过夜灭菌，用磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)反复荡洗，去除残余的乙醇。取生长旺盛的人间充质干细胞接种到膜表面，补加含有10％胎牛血清和5ng/ml的DMEM培养基(Dulbcco′sModifed Eagle Medium)，使初始的细胞浓度在2×10⁴个/ml，置于37℃CO₂培养箱中培养72小时。去除培养基，用PBS(pH 7.4)荡洗，加入0.1ml噻唑兰(MTT)和0.9ml DMEM基本培养基继续培养4小时，去除MTT溶液后加入1ml二甲基亚砜(DMSO)室温放置30分钟，取0.15ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶标仪双波长模式(540nm和690nm)下测定吸光度值。

试验结果显示，四组中PLA膜上生长的细胞最少，而PHBVHHx膜上生长的细胞数量高于各对照组，且具有显著差异性(p＜0.05)。(图1)

实施例3：成骨细胞MC3T3在PHBVHHx三聚物膜表面的增殖

本实施例的操作如下：

在60℃水浴回流保持1小时，使PHBVHHx(P(3HB-5.3mol％3HV-10.2mol％3HHx))完全溶解于三氯甲烷，逐滴加入到不断搅拌状态下的无水乙醇中，抽滤取沉淀，可以重复以上步骤进行进一步纯化。将纯化的PHBVHHx再按要求的比例溶解于三氯甲烷溶液中，室温下展膜。将膜完全在75％的乙醇中浸泡12小时，紫外照射过夜灭菌，用PBS反复洗三次，去除残液。取生长旺盛的MC3T3细胞接种到膜表面，补加含有10％胎牛血清的DMEM培养基，使初始的细胞浓度在4.0×10⁴个/ml，置于37℃CO₂培养箱中培养72小时。去除培养基用PBS(pH 7.4)荡洗，加入1ml MTT和9ml DMEM继续培养4小时，去除MTT溶液用PBS(pH 7.4)荡洗，加入10ml DMSO室温放置30分钟，取0.05ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶标仪540nm测定吸光度值。

试验结果显示成骨细胞MC3T3在PLA膜上的增殖量为3.32×10⁵个/ml，在PHBV膜上的增殖量为4.23×10⁵个/ml，在PHBVHHx膜上的增殖量4.92×10⁵个/ml。(图2)

实施例4：小鼠成纤维细胞L929在PHBVHHx三聚物膜表面的增殖

本实施例的操作如下：

在60℃水浴回流保持1小时，使PHBVHHx(P(3HB-5.3mol％3HV-10.2mol％3HHx))完全溶解于三氯甲烷，逐滴加入到不断搅拌状态下的无水乙醇中，抽滤取沉淀，可以重复以上步骤进行进一步纯化。将纯化的PHBVHHx溶解于三氯甲烷溶液中，室温下展膜。将膜完全在75％的乙醇中浸泡12小时，紫外照射过夜灭菌，用PBS反复洗三次，去除残液。取生长旺盛的成纤维细胞L929接种到膜表面，补加含有10％胎牛血清的DMEM培养基，使初始的细胞浓度在1.0×10⁴个/ml，置于37℃CO₂培养箱中培养72小时。去除培养基用PBS(pH 7.4)荡洗，加入1ml MTT和9ml DMEM继续培养4小时，去除MTT溶液用PBS(pH 7.4)荡洗，加入10ml DMSO室温放置30分钟，取0.05ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶标仪540nm测定吸光度值。经过MTT检测，结果(图3)表明，细胞在PHBVHHx膜上生长比其他两种对照膜旺盛。

本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。

应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

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Claims (9)

1.3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸共聚物在组织工程中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其中在所述共聚物中，3-羟基戊酸单体的摩尔比在0.5-30％范围内，3-羟基己酸单体的摩尔比在0.5-30％范围内。

3.根据权利要求2的应用，其中在所述共聚物中，3-羟基戊酸单体的摩尔比在1-10％范围内，3-羟基己酸单体的摩尔比在5-20％范围内。

4.根据权利要求3的应用，其中在所述共聚物中，3-羟基戊酸单体的摩尔比在2-7％范围内，3-羟基己酸单体的摩尔比在10-15％范围内。

5.根据权利要求1-4之任一项的应用，其中所述共聚物用作组织工程支架材料。

6.根据权利要求1-4之任一项的应用，其中所述共聚物用于制备支架、修复材料、缝合线、骨钉、管形材料、骨修补物、组织再生基体、细胞培养附着材料、人造血管、创伤敷料、细胞或组织包被、多孔膜、微粒或毫微粒、心脏修复材料、心瓣膜、心脏叶瓣、心脏瓣环、牙齿移植材料或者心包膜。

7.根据权利要求1-4之任一项的应用，其中所述共聚物用作细胞或组织生长的基体和附着材料。

8.根据权利要求7的应用，其中所述附着材料包括硬组织植入材料、软组织植入材料、骨组织工程支架材料。

9.根据权利要求7的应用，其中所述细胞选自间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞。

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