CN101343311B - 一种多亚基蛋白的复性方法 - Google Patents
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Abstract
一种多亚基蛋白的复性方法，其特征在于对两个或两个以上亚基组成的蛋白，其中一个或多个蛋白亚基先行预复性，其它的一个或多个蛋白亚基结合在色谱柱上，梯度增加含预复性蛋白亚基的复性液使结合在色谱柱上的蛋白亚基复性并与预复性的蛋白亚基结合而形成完整的蛋白质分子，经过洗涤后将复性后的蛋白从色谱柱上洗脱下来。应用此复性方法制备的多个亚基组成的蛋白，蛋白得率高，不需纯化，操作简便，节省原料，省时省力。
Description
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，特别涉及一种多亚基蛋白的复性方法。
背景技术
变性蛋白的复性技术是现代生命科学领域经常使用的一种实验技术，是指变性蛋白质在变性剂如盐酸或尿素去除或浓度降低后，就会自发地从变性的热不稳定状态向热力学稳定状态转变，从而形成具有生物学功能的天然结构。目前常用的复性方法可以分为两类：稀释/透析复性法和色谱复性法。稀释/透析复性法是目前最简单也是最常采用的复性方法，包括稀释复性法和透析复性法。稀释复性法是将变性蛋白质溶液直接加入到复性缓冲液中进行复性的一种方法，操作简单，缺点是蛋白复性时必须保持在较低的浓度(一般为10-100μg/mL)，复性反应的体积较大，需要昂贵的复性添加剂并且必须保证质量要高，废水处理也相当昂贵。透析复性法是将蛋白质加入到透析装置中，通过透析的过程将变性剂浓度降低，从而使变性的蛋白质恢复到天然的状态，其操作相对简单，蛋白浓度也较高，但其缺点是复性所需时间较长，需要大量的透析液，且蛋白质浓度较高而易导致蛋白质的聚集沉淀。总体来说，稀释/透析复性法中蛋白质的复性率较低，且费时，复性结束后需对复性蛋白质进行进一步的纯化。色谱复性法是一种色谱柱辅助的在柱复性方法，其复性过程与蛋白质的纯化过程相似，将变性蛋白质吸附在色谱柱上，然后梯度降低变性剂的浓度而使蛋白复性，或是利用蛋白质分子与变性剂在凝胶柱介质中具有不同的迁移速率而使两者分离，从而使蛋白质复性。色谱复性中常用的色谱有尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱和亲和色谱。与传统的稀释或透析法相比，色谱复性法的优点是：1)在进样后可很快脱除变性剂，操作效率高；2)减少了变性蛋白在脱除变性剂后形成聚集体，提高了蛋白质复性的质量回收率和活性回收率，同时提高了蛋白质复性的初始浓度；3)在复性的同时可以使目的蛋白与杂蛋白分离；4)便于回收变性剂，降低了废水处理的成本。但是现有的色谱复性技术仅限于一条完整肽链的单亚基蛋白的复性，对于两个或两个以上亚基组成的蛋白如主要组织相容性复合体没有合适的色谱复性方法。
发明内容
技术问题：本发明针对上述问题提供一种省时高效的适用于两个或两个以上亚基组成蛋白复性的多亚基蛋白的复性方法。
技术方案：本发明的多亚基蛋白的复性方法为：对由两个或两个以上亚基组成的蛋白按如下步骤进行复性：先通过基因工程技术将各亚基分别在表达性宿主菌中以包涵体形式表达，收获包涵体蛋白；再通过稀释/透析复性法对其中一个或多个蛋白亚基进行预复性；然后进行多亚基蛋白的色谱复性，方法是首先将未进行预复性的另一个或其余多个蛋白亚基结合在色谱柱上，然后将含有预复性蛋白亚基的复性液上柱，并梯度性地增加已预复性蛋白亚基的浓度，使结合在色谱柱上的蛋白亚基在复性的同时并与已预复性的蛋白亚基结合而折叠成完整的蛋白质分子，最后经过洗涤后将复性后的蛋白从色谱柱上洗脱下来。
多亚基蛋白的色谱复性之前对其一个或多个蛋白亚基预复性的方法为稀释/透析复性法或色谱复性法。
多亚基蛋白的色谱复性时所采用的色谱柱为离子交换色谱柱、疏水相互作用色谱柱或亲和色谱柱。
多亚基蛋白的一个或多个蛋白亚基预复性方法中的色谱复性法所采用的稀释/透析复性法为稀释复性法或透析复性法。
多亚基蛋白的一个或多个蛋白亚基预复性方法中的色谱复性法所采用的色谱柱为离子交换色谱柱、疏水相互作用色谱柱、亲和色谱柱或尺寸排阻色谱柱。
有益效果：本发明的有益效果如下：
(1)应用此复性方法可以对多个亚基组成的蛋白进行色谱法复性；
(2)蛋白复性率和产量均较高；
(3)由于复性和分离同时进行，所以所得复性后的蛋白不需纯化，简化了操作过程；
(4)与稀释或透析复性法相比，此复性方法节省原料，省时省力。
附图说明
图1蛋白复性方法复性MHC/HBc18-27复合体原理示意图。
图中1.变性的HBc18-27-β2微球蛋白，2.稀释法预复性，3.预复性的HBc18-27-β2微球蛋白，4.变性的MHC I重链蛋白，5.阴离子交换色谱柱介质，6.复性后的MHC/HBc18-27复合体。
具体实施方式
本发明对于多个亚基组成的蛋白，其中一个或多个蛋白亚基先行预复性，形成预复性的蛋白亚基，其它的一个或多个蛋白亚基结合在色谱柱介质上，梯度增加含预复性蛋白亚基的复性液使结合在色谱柱上的蛋白亚基复性并与预复性的蛋白亚基结合而形成完整的蛋白质分子，经过洗涤后将复性后的蛋白从色谱柱上洗脱下来。预复性时采用的复性方法可以是稀释/透析复性法，也可以是现有的色谱复性法。多亚基蛋白的色谱复性时所采用的色谱可以是离子交换色谱、疏水相互作用色谱或亲和色谱。
本发明以主要组织相容性复合体I类分子(MHC I)为目标复性蛋白，HBV核心抗原的抗原肽HBc18-27序列为加载到复合体中的抗原肽段，以稀释复性法进行亚基的预复性，以离子交换色谱进行MHC/HBc18-27复合体分子复性的新型复性方法为例进一步说明本发明的技术方案：
MHC I重链基因和HBc18-27-β2微球蛋白基因分别以相应的模板经过PCR扩增而获得，其中HBc18-27-β2微球蛋白基因是利用已有的“肽-Linker-β2微球蛋白”融合表达策略而构建。将获得的MHC I重链基因和HBc18-27-β2微球蛋白基因经过分子克隆手段分别插入到质粒pET28a中，并在表达宿主菌BL21中经IPTG诱导而表达出相应的蛋白MHC I重链蛋白和HBc18-27-β2微球蛋白。
MHC/HBc18-27复合体应用多亚基蛋白的复性方法进行复性时有以下过程：
(1)HBc18-27-β2微球蛋白的预复性
将5mg HBc18-27-β2微球蛋白加入到预冷的50ml Buffer D(20mM Tris，150mM L-arginine，0.2mM EDTA，5mM GSH，0.5mM GSSG，0.2mM PMSF，pH8.0)中，4℃搅拌复性8h。复性后将预复性反应液离心(3000rpm，10min)，弃沉淀并用0.22μm的滤器过滤。
(2)MHC I重链蛋白结合于阴离子交换层析柱上
Q sepharose HP(5ml)阴离子交换层析柱用Buffer C(20mM Tris，8M urea，pH8.0)平衡5个柱床体积(CV)后将6mg HC蛋白加样到层析柱，流速0.1ml/min。收集穿过峰并进行蛋白定量。上样结束后继续用Buffer C洗涤2CV。
(3)多亚基蛋白的色谱复性
将含预复性HBc18-27-β2微球蛋白的复性缓冲液梯度增加(0-100％)以进行复性反应。梯度时间8h，流速0.05ml/min。然后100％轻链复性缓冲液继续复性8h，流速0.05ml/min。预复性的HBc18-27-β2微球蛋白在150mM L-arginine存在的情况下不能结合在色谱柱上，而是穿过色谱柱，这样就保证了HBc18-27-β2微球蛋白可以在位置上较为自由，方便了与复性中的重链蛋白结合而形成复合体蛋白。
(4)洗涤及复性蛋白的洗脱
用Buffer A(20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)洗涤层析柱，6CV，2h。最后用Buffer E(20mM Tris，1M NaCl，pH8.0)梯度(0-100％)洗脱蛋白，6CV，0.5ml/min。用自动组份收集器收集洗脱峰，1ml/管。取峰值收集管液体进行SDS-PAGE电泳，鉴定洗脱峰成份。将复合体峰蛋白用0.22μm的注射过滤器过滤备用。
将复性得到的MHC/HBc18-27复合体运用尺寸排阻色谱进行结构及纯度鉴定；将MHC/HBc18-27复合体经过与相应的抗体反应制备出MHC/HBc18-27多聚体，然后进行乙型肝炎患者和健康献血者外周血PBMC中的HBc18-27特异性T细胞检测以评价复性得到的MHC/HBc18-27复合体的功能。
本发明以主要组织相容性复合体I类分子(MHC I)为目标复性蛋白，HBV核心抗原的抗原肽HBc18-27序列为加载到复合体中的抗原肽段，以稀释复性法进行亚基的预复性，以离子交换色谱进行复合体分子的复性的新型复性方法为例说明具体实施方式。
实施例1：MHC I重链基因的扩增和重组质粒的构建。
根据GenBank中人MHC I重链的cDNA序列(AF036921.1GI：4104536)设计引物。在重链基因C端，有一段用来生物素化的BSP(biotin protein ligaseBirA substrate peptide)序列(17aa：GSLHHILDAQKMVWNHR)和能与Ni2+-NTA结合的His-tag(6aa：HHHHHH)。上游引物含起始密码子、Nco I识别位点及保护碱基，下游引物含Xho I酶切位点。它们的序列分别为：
上游p1：5`-GCCCATGGGCTCTCACTCCATGAGGTAT-3`；
下游p2：5`-GCCTCGAGACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATATGATGCAGGGATCCGGTGAGGGGCTTGGGCAA-3`。
扩增重链基因采用的聚合酶链式反应“PCR”的体系为：在50μl PCR总反应体系中加入5μl10×Taq DNA聚合酶Buffer，5μl25mM MgCl2，1μl10mMdNTP，1μl质粒pBluescriptIIsk-HLA-A*0201模板(由上海第二医科大学周光炎教授惠赠；也可从基因型为HLA-A*0201供血者外周血中提取细胞总RNA并进行逆转录反应获得cDNA以作为模板，步骤参考实施例2)，0.25μlTaq DNA聚合酶，1μl10pM上游特异引物p6，1μl10pM下游特异引物p7，35.75μl水，PCR程序为：95℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min；72℃10min；4℃保温。PCR产物用1～1.5％琼脂糖胶电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，用紫外检测仪观察结果。
利用Nco I、Xho I酶切位点将PCR产物插入质粒pET28a以构建含重链基因的重组质粒。采用的酶切体系为：50μl总反应体系中加入32μl水，5μl10×R+Buffer(MBI)，15M(1.5μl)Nco I(MBI)，15M(1.5μl)Xho I(MBI)，50μg(10μl)质粒DNA或PCR产物，混匀，37℃水浴3h或过夜，利用上海华舜生物公司胶回收试剂盒按说明书操作回收纯化酶切产物，进行连接。采用的连接体系为：40μl总反应体系中加入23.3μl水，4μl10×T4DNA连接酶Buffer，4μl质粒载体酶切纯化产物，4.7μl PCR酶切纯化产物，4μl T4DNA连接酶，16℃过夜。连接产物转化转化感受态DH5α菌，37℃16h后挑克隆与LB液体培养基(卡那霉素35μg/ml)，过夜培养后提质粒，经酶切、PCR、测序等手段证明以上重组质粒插入子正确。
实施例2：人外周血细胞总RNA的提取及HBc18-27-β2微球蛋白的重组质粒的构建。
(1)β2微球蛋白(β2m)cDNA的扩增
人外周血细胞总RNA的提取步骤按TRIZOL试剂盒(Promega公司)推荐的方法进行。
根据GenBank中人β2m的cDNA序列(S71244.1GI：547297)设计引物。
上游引物含起始密码子、Nco I识别位点及保护碱基，下游引物含Xho I酶切位点。它们的序列分别为：
上游p3：5`-GGCCCATGGATATCCAGCGTACTCCAAAG-3`；
下游p4：5`-CAACTCGAGattaCATGTCTCGATCCCACTTAAC-3`。
扩增β2微球蛋白基因采用的逆转录聚合酶链式反应“RT-PCR”的逆转录“RT”体系及过程为：在20μl总反应体系中加入6μlDEPC水，加入细胞总RNA约5μl，RNasin0.5μl和OligdT2μl。混匀，在65℃变性5min后置冰浴。再加入5×反应缓冲液4μl，10mM dNTP1μl，RNasin0.5μl及0.1mol/l DTT0.5μl，最后加入M-MLV逆转录酶1μl(200u)，混匀后，置37℃水浴1.5h。再在95℃中变性5min终止反应后得到逆转录产；采用的PCR体系为：在50μl PCR总反应体系中加入5μl10×Taq DNA聚合酶Buffer(含Mg2+)、1μl10mM dNTP，4μl逆转录产物，2μl Taq DNA聚合酶，1μl10pM上游特异引物p3，1μl10pM下游特异引物p4，32μl水；PCR程序为：94℃4min；94℃1min，60℃1min，72℃2min；72℃10min；4℃保温。PCR产物用1.5～2％琼脂糖胶电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，用紫外检测仪观察结果。
(2)β2微球蛋白重组质粒的构建
利用Nco I、Xho I酶切位点将PCR产物插入质粒pET28a以构建含β2微球蛋白基因的重组质粒。采用的酶切体系为：20μl总反应体系中加入12.6μl水，4μl10×Y+Buffer(MBI)，7U(0.7μl)Nco I(MBI)，7U(0.7μl)Xho I(MBI)，20μg(2μl)cDNA产物，混匀，37℃水浴4h，也可过夜，利用上海华舜生物公司胶回收试剂盒按说明书操作回收纯化酶切产物，进行连接。采用的连接体系为：30μl总反应体系中加入18μl水，3μl10×T4DNA连接酶Buffer，5μl质粒载体酶切纯化产物，1μl PCR酶切纯化产物，3μl T4DNA连接酶，16℃过夜。连接产物转化转化感受态DH5α菌，37℃16h后挑克隆与LB液体培养基(卡那霉素35μg/ml)，过夜培养后提质粒，经酶切、PCR、测序等手段证明以上重组质粒插入片段正确。
(3)HBc18-27-β2微球蛋白重组质粒的构建
以步骤(3)得到的β2微球蛋白重组质粒为模板进行如下扩增：在轻链基因N端，有一段来源于HBV核心抗原的抗原肽HBc18-27序列(10aa：FLPSDFFPSV)和一段Linker序列(15aa：GGGGGGSGGSGGSGG)。因序列较长，故分两步分别引入此两段序列。上游引物含起始密码子，Psc I识别位点及保护碱基，下游引物含Xho I酶切位点。它们的序列分别为：
上游p5：5’-GGAGGTGGTGGTGGCGGATCAGGAGGCTCAGGAGGTTCAGGAGGCATCCAGCGTACTCCAAAG ATT-3’；
上游p6：5’-GGCACATGTTTTTACCTTCTGATTTCTTTCCTTCGGTCGGAGGTGGTGGTGGCGGA-3’；
下游p7：5’-CAACTCGAGATTACATGTCTCGATCCCACTTAAC-3’。
第一轮扩增采用的聚合酶链式反应“PCR”的体系为：在25μl PCR总反应体系中加入2.5μl10×Taq DNA聚合酶Buffer，2.5μl25mM MgCl2，0.5μl10mMdNTP，2μl质粒模板，0.5μl Taq DNA聚合酶，1μl10pM上游引物P5，1μl10pM下游引物p7，15μl水，PCR程序为：95℃5min；94℃1min，48℃1min，72℃1min；72℃10min；4℃保温。
以第一轮PCR扩增产物为模板(1：1000稀释)，以上游引物p6和下游引物p7为引物，进行第二轮扩增。PCR体系及程序同第一轮，退火温度为58℃。
将第二轮PCR产物用Psc I和Xho I双酶切，质粒pET28a用Nco I和Xho I双酶切，然后进行连接反应以将HBc18-27-β2微球蛋白基因插入质粒pET28a构建HBc18-27-β2微球蛋白重组质粒。酶切及连接体系同步骤(3)。连接产物转化转化感受态DH5α菌，37℃16h后挑克隆与LB液体培养基(卡那霉素35μg/ml)，过夜培养后提质粒，经酶切、PCR、测序等手段证明以上重组质粒插入子正确。
实施例3：MHC I重链蛋白和HBc18-27-β2微球蛋白的表达与初步纯化
将MHC I重链和HBc18-27-β2微球蛋白重组质粒分别转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)，挑克隆后接种于含卡那霉素(35μg/ml)的LB培养基，培养至OD600为0.6-0.8，加IPTG至终浓度为0.1mM，37℃诱导3h。5000g离心10min收集细菌沉淀，并重悬于冰冷的Buffer A(20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)中，充分混匀后行高压均质破菌，4℃10000g离心10min后弃上清，沉淀重悬于Buffer B(20mM Tris，150mM NaCl，0.5％Triton X-100，pH8.0)中，混匀后于4℃10000g离心10min，弃尽上清液，收集包涵体沉淀。然后重复洗涤一次，沉淀重悬于Buffer B中混匀后离心。再将沉淀重悬于Buffer A中，混匀后于4℃10000g离心10min，弃尽上清液，收集包涵体沉淀。最后沉淀重悬于5ml Buffer C(20mM Tris，8M urea，pH8.0)中，室温轻缓搅拌，直至沉淀溶解、变清晰透明。于4℃20000xg离心20min，收集上清，用SDS-PAGE鉴定表达蛋白的纯度，用Bradford法进行蛋白定量(Bio-Rad蛋白定量试剂)，分装后置-70℃冰箱保存备用。
实施例4：应用多亚基蛋白的复性方法制备MHC/HBc18-27复合体
(1)HBc18-27-β2微球蛋白的预复性
将5mg HBc18-27-β2微球蛋白加入到预冷的50ml Buffer D(20mM Tris，150mM L-arginine，0.2mM EDTA，5mM GSH，0.5mM GSSG，0.2mM PMSF，pH8.0)中，4℃搅拌复性8h。复性后将预复性反应液离心(3000rpm，10min)，弃沉淀并用0.22μm的滤器过滤。
(2)MHC I重链蛋白结合与阴离子交换层析柱上
Q sepharose HP(5ml)阴离子交换层析柱用Buffer C平衡5个柱床体积(CV)后将6mg HC蛋白加样到层析柱，流速0.1ml/min。收集穿过峰并进行蛋白定量。上样结束后继续用Buffer C洗涤2CV。
(3)多亚基蛋白的色谱复性
将含预复性HBc18-27-β2微球蛋白的复性缓冲液梯度增加(0-100％)以进行复性反应。梯度时间8h，流速0.05ml/min。然后100％轻链复性缓冲液继续复性8h，流速0.05ml/min。预复性的HBc18-27-β2微球蛋白在150mM L-arginine存在的情况下不能结合在色谱柱上，而是穿过色谱柱，这样就保证了HBc18-27-β2微球蛋白可以在位置上较为自由，方便了与复性中的重链蛋白结合而形成复合体蛋白。
(4)洗涤及复性蛋白的洗脱
用Buffer A洗涤层析柱，6CV，2h。最后用Buffer E(20mM Tris，1M NaCl，pH8.0)梯度(0-100％)洗脱蛋白，6CV，0.5ml/min。用自动组份收集器收集洗脱峰，1ml/管。取峰值收集管液体进行SDS-PAGE电泳，鉴定洗脱峰成份。将复合体峰蛋白用0.22μm的注射过滤器过滤备用。
层析柱用1M NaOH和2M NaCl清洗，各5CV，以除去层析柱中残留的未复性的蛋白备下次使用。
实施例5：运用尺寸排阻色谱进行MHC/HBc18-27复合体的结构及纯度鉴定
将凝胶层析柱Superdex75prep grade(内径1.0cm，长70cm)与FPLC系统相连，置4℃冷室。用3个柱床体积的Buffer A洗泵和平衡层析柱，流速设为0.5ml/min，柱压<0.3Mpa。然后取1ml复性得到的HLA/HBc18-27复合体上柱，用FPLC缓冲液洗柱，流速设为0.5ml/min。洗脱液用UV检测仪(280nm)监测蛋白含量，并用记录仪画图记录蛋白峰。
实施例6：MHC/HBc18-27复合体的功能检测
(1)外周血PBMC的分离和培养
将慢性乙肝患者和健康人(HBV表面抗原阴性)的外周血标本5ml在15ml离心管中用无菌D-HANKS稀释至8ml。取无菌15ml离心管，每管加入5ml淋巴细胞分离液Ficoll，将稀释的外周血小心加到分离液上层，然后离心，2000rpm，20min。用吸管轻轻吸取淋巴细胞层，置于另一细胞离心管中。之后用无菌的不含人AB血清的1640培养液洗涤细胞沉淀2次，每次加8ml，于1200rpm，12min离心。所得细胞沉淀用4mL含15％人AB血清及2000U/mL IL-2的1640培养液重悬，并用滴管转移到50mL细胞培养瓶中，置细胞培养箱中培养。培养细胞在2周内行FACS检测。
(2)PE标记的MHC/HBc18-27多聚体的制备
首先计算应加试剂量：(按每管样品加入量计)
MHC/HBc18-27复合体(48kDa) 8pmol， 0.4μg
Anti-His-tag mAb(150kDa) 2pmol， 0.3μg
PE-rat-anti-mouse IgG(390kDa) 0.5pmol， 0.2μg
将MHC/HBC18-27复合体和Anti-His-tag单克隆抗体加入Ep管中，4℃孵育30min。然后加入PE标记的rat-anti-mouse IgG，继续于4℃避光孵育30min。
(3)HBc18-27特异性T细胞的FACS检测
培养的PBMC用细胞计数板进行细胞计数后取5×105细胞于小试管中，用PBS2mL洗涤1次，于1200rpm，12min离心。用含1％BSA的PBS2mL洗涤细胞2次，于1200rpm，12min离心。之后将上清倒掉，细胞沉淀中加入20μL的PE标记的MHC/HBc18-27多聚体，4℃染色1h。小试管中加入含1％BSA的PBS2mL洗涤细胞2次，于1200rpm，12min离心。将上清倒掉，细胞沉淀中加入10μLFITC标记的小鼠抗人CD8抗体，4℃染色15min。(同时做PE/FITC标记的鼠IgG1 isotype control，PE标记的鼠抗人CD3单克隆抗体和FITC标记的鼠抗人CD4单克隆抗体对照各一管，共4管，以便进行质量控制。)小试管中加入含1％BSA的PBS2mL洗涤细胞1次，于1200rpm，12min离心。小试管中加入PBS2mL洗涤细胞1次，于1200rpm，12min离心。细胞沉淀用含0.5％的PBS600μL重悬，备流式细胞分析时所用。做流式细胞分析时，每管采集细胞30,000个。结果用CellQuest和WinMDI2.8软件分析。
实验结果表明：运用蛋白复性方法制备MHC/HBc18-27复合体时，经NaCl梯度洗脱得到两个洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定后确定第一个洗脱峰的成分为MHC/HBc18-27复合体，MHC/HBc18-27复合体的复性率(以MHC I重链蛋白计)为20％，高于稀释复性法的复性率(7％)，复性所用时间为30h，低于稀释复性法的复性时间(72h以上)；运用尺寸排阻色谱进行MHC/HBc18-27复合体的结构及纯度鉴定时得到一主洗脱峰，其保留时间与稀释复性法得到的MHC/HBc18-27复合体的保留时间相一致，纯度均在85％以上；将MHC/HBc18-27复合体经过与相应的抗体反应制备出MHC/HBc18-27多聚体，然后进行乙型肝炎患者和健康献血者外周血PBMC中的HBc18-27特异性T细胞检测，在HLA-A2+的乙型肝炎患者外周血PBMC中可以检测到HBc18-27特异性T细胞，而在HLA-A2-的乙型肝炎患者和HLA-A2+的健康献血者外周血PBMC中没有检测到HBc18-27特异性T细胞，这个结果与稀释复性法得到的MHC/HBc18-27复合体经相同的操作后的结果相一致，说明复性得到的MHC/HBc18-27复合体具有相应的生物学功能。
Claims (3)
1.一种二亚基蛋白的复性方法，其特征在于对由两个亚基组成的蛋白按如下步骤进行复性：先通过基因工程技术将各亚基分别在表达性宿主菌中以包涵体形式表达，收获包涵体蛋白；再通过稀释/透析复性法对其中一个蛋白亚基进行预复性；然后进行二亚基蛋白的色谱复性，方法是首先将未进行预复性的另一个蛋白亚基结合在色谱柱上，然后将含有预复性蛋白亚基的复性液上柱，并梯度性地增加已预复性蛋白亚基的浓度，使结合在色谱柱上的蛋白亚基在复性的同时并与已预复性的蛋白亚基结合而折叠成完整的蛋白质分子，最后经过洗涤后将复性后的蛋白从色谱柱上洗脱下来。
2.根据权利要求1所述的二亚基蛋白的复性方法，其特征在于二亚基蛋白的色谱复性时所采用的色谱柱为离子交换色谱柱、疏水相互作用色谱柱或亲和色谱柱。
3.根据权利要求1所述的二亚基蛋白的复性方法，其特征在于二亚基蛋白的一个蛋白亚基预复性方法中的色谱复性法所采用的色谱柱为离子交换色谱柱、疏水相互作用色谱柱、亲和色谱柱或尺寸排阻色谱柱。
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