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检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量pcr方法
CN101260442A
China
- Other languages
English - Inventor
李曦 童光志 符芳 - Current Assignee
- Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Worldwide applications
2007
CN
Application CNA2007100797663A events
2007-03-09
2008-09-10
2010-09-29
Application granted
2010-09-29
Status
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2027-03-09
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Description
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技术领域
本发明涉及一种病毒的检测方法，尤其涉及一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，属于生物技术领域。
背景技术
猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、II型猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV2)、猪瘟病毒(Hog choleravirus，HCV)等都属于猪呼吸道病和繁殖障碍综合症病原，并且4种病毒常出现混合感染。PCV-2还与猪呼吸道病综合症(Porcine respiratory disease complex，PRDC)、断乳仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)等均具有密切的相关性，是引起多种综合症的重要原发病原(Segales J，Allan GM，DomingoM.Porcine circovirus diseases.Anim Health Res Rev.2005 Dec；6(2)：119-42；Lipej Z，Segales J，Toplak I，et al.Postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)in pigsin Croatia：detection and characterisation of porcine circovirus type 2(PCV2).Acta VetHung.2005；53(3)：385-96；Sipos W，Duvigneau JC，Pietschmann P，et al.Porcinedermatitis and nephropathy syndrome(PDNS)is associated with a systemic cvtokineexpression profile indicative of proinflammation and a Th1 bias.Vet ImmunolImmunopathol.2005 Sep 15；107(3-4)：303-13；Kim J，Chung HK，Chae C.Association ofporcine circovirus 2 with porcine respiratory disease complex.Vet J.2003Nov；166(3)：251-6.)，PRV引起乳猪患病死亡率高达100％。反刍动物发病无药治疗，均已死亡告终；猪瘟遍布于全世界，具有高度接触传染性，是国际兽医局明列的A类15种法定传染病之一；PPV于1966年进行猪瘟病毒组织培养时发现的，是猪繁殖障碍的重要病原。
目前，检测各种病毒的方法很多，如检测PRV潜伏感染的方法有血清学试验、体内潜伏病毒的激活与检测、组织块培养和共培养技术、核酸杂交和常规PCR检测技术，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染和EB等对操作者的危害。而实时荧光定量PCR检测技术就填补了以上的缺陷，无论是在研究中还是在临床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效方法(Kim J，ChungHK，Chae C.Association of porcine circovirus 2 with porcine respiratory diseasecomplex.Vet J.2003Nov；166(3)：251-6.)，实时荧光定量PCR比较以往的荧光抗体试验FA、IPMA法、以及病毒分离法，具有更加快速、敏感、安全的特点。其检测的灵敏度优于传统检测方法(Kim J，Chung HK，Chae C.Association of porcinecircovirus 2 with porcine respiratory disease complex.Vet J.2003Nov；166(3)：251-6.)，比较PCR法敏感性达10-100倍(Gunson RN，Collins TC，Carman WF.Practicalexperience of high throughput real time PCR in the routine diagnostic virology setting.JClin Virol.2006 Apr；35(4)：355-67.Epub 2006 Feb 7)。
建立4种病毒同时快速、敏感及准确定量的方法，对各种病原诊断及各种病原病因学研究具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，该方法能快速、敏感、特异地检测对经济危害严重的四种病毒，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可应用四种病毒感染的前期诊断。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，包括制备4种病毒的标准质粒并建立标准曲线，确定判定样品阳性或阴性的标准，设计检测引物进行样品的荧光定量PCR扩增并获得样品的Tm值，将所获得的Tm值用所确定的判定标准评判样品的阳性或阴性等步骤，其中，所述的标准曲线的建立方法如下：
(1)按照常规方法分别提取猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒的核酸；
(2)以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，以所提取的II型猪圆环病毒(PCV2)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得II型猪圆环病毒标准质粒；
以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，以所提取的猪细小病毒(PPV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪细小病毒标准质粒；
以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为引物，以所提取的猪伪狂犬病毒(PRV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪伪狂犬病毒标准质粒；
以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为引物，以所提取的猪瘟病毒(HCV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪瘟病毒标准质粒；
(3)将步骤(2)所制备的4种标准质粒分别作10倍系列稀释，以稀释液为模板，进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号，经计算机软件Rotor-gene6.0生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线。
所述的确定判定阳性或阴性的标准是：在CT值在35循环内；Tm值分别为：PCV-2：86.69±0.21；PPV：79.97±0.15；PRV：88.56±0.15；HCV：84.61±0.16。
所述的检测引物为：检测II型猪圆环病毒(PCV2)的引物为SEQ ID NO：9和SEQID NO：10；检测猪细小病毒(PPV)的引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；检测猪伪狂犬病毒(PRV)的引物为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；检测猪瘟病毒(HCV)的引物为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
优选的，所述检测II型猪圆环病毒的标准曲线是图3所示；检测猪细小病毒病毒的标准曲线是图4所示；检测猪伪狂犬病毒的标准曲线是图5所示；检测猪瘟病毒的标准曲线是图6所示。
本发明方法(SyMuReTi-PCR)能高敏感、特异、迅速简便地同时检测PRV、PPV、PCV-2、HC。在构建引物和检测引物设计上，在GENEBANK下载核酸序列，分别选取PRV、PPV、PCV-2、HC具有代表性gE、VP2、ORF2、E2基因的保守区域设计构建引物和检测引物引物，NCBI中BLAST中比对，发现PCV-2与195株PCV-2分离毒核酸具有100％的同源性，扩增产物135nt与PCV-2的100株分离毒核酸100％同源性，未见点突变，且与PCV-1无任何同源；HC检测引物与100株毒株100％同源性；PPV检测引物和67株毒株有100％同源；PRV跟其他病毒无任何同原。检测引物设计的保守性决定了样品检测定性的特异性及稳定性，同时支持SyMuReTi-PCR方法具有良好的线性关系；继而决定了定量的精确性。
本发明方法(SyMuReTi-PCR)检测PCV-2的方法中应用SYBR GREEN荧光染料作为标记物，因其成本较低，更适用于兽医病原的检测；在PCR反应体系中，加入适量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子发射的荧光信号检测不到，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。因此其应用稳定性较好，并不会随着病毒核酸序列发生点变异而出现检测受限。
本发明同时检测4种病毒方法(SyMuReTi-PCR)具有良好的特异性、敏感性及稳定性。同时检测4种病毒无交叉反应，判定SyMuReTi-PCR同时检测4种病毒方法特异性Tm值应用统计学软件来判定是否显著不显著；批间及批内重复性试验表明CV都小于2％均在稳定范围内；4种细胞培养病毒敏感度都高于普通PCR100倍，4种不同细胞毒检测的最低极限不同，PCV-2检测到0.00001TCID50、PPV检测到0.001TCID50、PRV检测到0.01TCID50、HC检测到0.1TCID50，这与细胞毒核酸的特性、细胞毒致病性及培养特性密切相关，如PCV-2有的不使细胞致病，检测的最低极限高，并且3种DNA病毒是应用煮沸法不提核酸的过程，不考虑损失率问题，所以3种DNA病毒检测的最低极限高于HC。所以SyMuReTi-PCR具有操作更为简便、灵敏度更高、且可以有效避免普通PCR污染的缺陷等优点。
本发明方法可在1.5hr内完成。可见，本方法应用于现地临床样品的检测具有良好的前景。
应用本发明方法(SyMuReTi-PCR)对实验攻毒动物的脏器定量检测发现，不同的脏器病毒分布的量差别较大。在腹股沟淋巴结病毒分布量较大，为105copies/ul，在十二指肠中分布较少，为7个拷贝/ul。可见通过本发明SyReTi-PCR方法可以应用于实验研究，评估病毒感染程度、监测病毒感染水平，进一步探讨病毒的致病性，进行病因学的研究。
总之，本发明所建立的SyMuReTi-PCR检测各种病原的方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可以应用于临床的病原诊断及试验研究中的病因学研究。
附图说明
图1琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
1，Marker DL2000；2，PCV的PCR扩增产物792bp；3，PCV的阴性对照；4，MarkerDL2000；5，PRV的阴性对照；6，PRV的PCR扩增产物265bp；7，Marker DL2000；8，PPV的PCR扩增产物764bp；9，PPV的阴性对照；10，HCV的阴性对照；11，HCV的PCR扩增产物303bp；12，Marker DL2000。
图2琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒标准品。
1，Marker DL2000；2，质粒PCV的PCR扩增产物792bp；3，质粒PCV的阴性对照；4，Marker DL2000；5，质粒PRV的阴性对照；6，质粒PRV的PCR扩增产物265bp；7，Marker DL2000；8，质粒PPV的PCR扩增产物764bp；9，质粒PPV的阴性对照；10，质粒HC的阴性对照；11，质粒HCV的PCR扩增产物303bp；12，Marker DL2000.
图3PCV-2的标准曲线。
图4PPV的标准曲线。
图5PRV的标准曲线。
图6HCV的标准曲线。
图7SyMuReTi-PCR检测4种病毒的特异性试验结果。
为溶解曲线的负一次微分曲线，X轴代表溶解温度，Y轴代表荧光信号值与温度的求导；BinA为PPV的Tm值；BinB为HC的Tm值；BinC为PCV-2的Tm值；BinD为PRV的Tm值。
以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
具体实施方式
试验材料
1.1毒株 II型猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV2)、猪伪狂犬病毒(Porcinepseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、猪瘟病毒(Hogcholera virus，HCV)各1株；
1.2待检样品13份脏器采集自试验猪(由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘长明教授提供)；47份病料分别自黑龙江、吉林、河南、湖南等地的猪场采集；
1.3试剂pMD18-T载体、
Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)、EASYDilution(TOKARA)；质粒小提试剂盒(天为时代)；Plasmid Miniprep Kit(AXYGEN)；in Vitro Transcription T7 Kit、DNase I(TOKARA)；TRlzolRLS Reagent、反转录酶(Invitrogen)。
1.4仪器Rotor-gene3000定量PCR仪；Eppendorf Biophoto meter。
实施例1 标准质粒制备
1目的片段的制备 按照常规方法提取PRV、PPV、PCV-2、HCV的核酸，将核酸储存于-20℃备用。设计引物，应用OLIGO6.24，根据GENEBANK中的核酸序列进行比对，设计引物(表1)。以提取的PRV、PPV、PCV-2、HCV病毒核酸作为模板，以表1的引物进行PCR扩增，预计扩增产物长度为265bp、764bp、792bp 303bp。将获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。
表1 扩增目标基因的引物对序列
2标准质粒的制备 按照Plasmid Miniprep Kit操作方法回收目的片段，将回收产物连接到pMD18-T载体上，通过大肠杆菌DH5α感受态转化，挑取白色菌落，鉴定，阳性菌增殖，提取质粒DNA，作为实时荧光定量PCR检测四种病毒的标准质粒。
将265bp、764bp、792bp 303bp的扩增产物克隆于T-Vector，制备标准品。经过转化、阳性菌筛选、鉴定，表明获得了含有目的片段的质粒T-PRV、T-PPV、T-PCV-2、T-HCV，结果见图2。
实施例2 SyMuReTi-PCR检测4种病毒方法的建立
1.1四种病毒标准质粒的稀释 应用Eppendorf Biophoto meter定量标准质粒为4.97×1012Copies/μl、3.44×1012Copies/μl、8.18×1012Copies/μl、7.98×1012Copies/μl，以EASY Dilution稀释液将标准品质粒按照1.0×108～1.0×101Copies/μl 10倍稀释，-20℃保存。
1.2检测引物设计 将实施例1中克隆的目的基因测序，根据测定的序列，应用OLIGO6.24设计四对特异引物(表2)。
表2 扩增目标基因的引物对序列
1.3SyMuReTi-PCR在Axygen Scientific Quality离心管(200μl)中依次加入：灭菌无离子水9.5μl、二甲基亚砜1μl、表2的4对引物各0.5μl、不同离心管中分别加入不同稀释度的不同病毒的标准品1μl、
Premix Ex TaqTM12.5μl，反应体系25ul。每种病毒的标准品按高稀释度到底稀释度的顺序放在一排，便于分析。反应参数为：95℃，10sec；95℃，5sec、60℃，20sec，45个循环。
1.4建立SyMuReTi-PCR检测4种病毒的标准曲线用含有PRV、PPV、HC、PCV-2目的片段的克隆质粒作为标准品，将PRV、PPV、HC、PCV-2质粒分别作10倍系列稀释，1.0×108～1.0×10Copies/μl、1.0×108～1.0×102Copies/μl、1.0×108～1.0×10Copies/μl、1.0×109～1.0×10Copies/μl作为模板，进行实时荧光定量PCR。Rotor-gene3000定量PCR仪采集荧光信号，经计算机软件Rotor-gene6.0将自动生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线(图3-6)。在分析其中一种标准曲线时，用Rotor-gene6.0软件将其他三种病毒的标准品和样品都隐藏，这样就可以在不同的界面分析四种病毒的标准曲线。经分析PCV标准品的9个稀释点均在一条直线上，表明当基因拷贝数在109～10范围内，检测域值与拷贝数之间均呈良好线性关系，回归分析显示，二者相关系数为R2＞0.999，扩增效率达到97％；PRV标准品的8个稀释点均在一条直线上，并且当基因拷贝数在108～102范围内，检测临界循环数(CT)与拷贝数之间均呈良好线性关系，回归分析显示，二者相关系数为R2＞0.996，扩增效率达到93％；HCV标准品8个稀释点均在一条直线上，二者相关系数为R2＞0.996；PPV标准品按照6个稀释度均在一条直线上，二者相关系数为R2＞0.994，扩增效率达到99％。
试验例3 本发明SyMuReTi-PCR方法检测4种病毒敏感性试验
PK-15细胞培养的PCV-2自101TCID50～10-6TCID50系列10倍稀释，PRV自101TCID50～10-6TCID50系列10倍稀释，系列10倍稀释，PPV自21血凝价～2-6血凝价系列10倍稀释和HC自101TCID50～10-6TCID50系列10倍稀释，三种DNA病毒直接煮沸5分钟，RNA病毒提取核酸，反转录.分别进行定量PCR、普通PCR检测敏感度，比较敏感性，结果见表3。
试验结果表明，本发明定量检测方法的敏感性高于普通PCR约10-100倍。
表3 SyMuReTi-PCR检测4种病毒的敏感性
注：PPV*是以同等稀释度的血凝价；+：阳性；-：阴性。TCID50为半数细胞培养物感染量。
Note：+：Positive；-：Negative.TCID50Tissue culture infectious dose
试验例4 本发明SyMuReTi-PCR检测4种病毒的特异性试验
将PRV的引物与、PPV、HCV、PCV-2、SIV、PRRSV和已知阳性、阴性的样品DNA/cDNA反应；PPV的引物与PRV、HCV、PCV-2、SIV、PRRSV和已知阳性、阴性的样品DNA/cDNA反应；HC的引物与PRV、PPV、PCV-2、SIV、PRRSV和已知阳性、阴性的样品DNA/cDNA反应；PCV-2的引物与PRV、PPV、、SIV、PRRSV和已知阳性、阴性的样品DNA/cDNA反应；共同进行实时荧光定量PCR特异性检测试验。特异性试验结果显示：4种病毒的阳性样品各2份DNA/cDNA标准质粒均有特异性扩增，并且溶解曲线的峰值单一；而用4种引物分别扩增的除自身之外的3种细胞培养病毒、PRRSV、SIV无扩增的荧光信号，无CT值，无溶解曲线的峰值(图3)。特异性试验结果表明SRT-PCR特异性良好。4种病毒检测的特异性可以通过同一界面对4种病毒的目的基因Tm来值判断是否是特异性扩增(表5)，从图3可见BinA、BinB、BinC、BinD分别为PPV、HC、PCV-2、PRV的Tm。PPV、HC、PCV-2、PRV的Tm范围是通过100份阳性样品的Tm值，再用统计学方法计算出平均数和标准偏差，所得范围PPV为79.82-80.12、HC为84.45-84.77、PCV-2为86.48-86.90、PRV为88.41-88.71(表4)。
表4 溶解曲线的Tm值
注；M为平均数；SD为标准偏差；Tm为溶解温度。
表5 SyMuReTi-PCR检测4种病毒的特异性
注：标*是细胞培养病毒；+：阳性；-：阴性；YL544124、L1001、Y1104、D45、D46、D45xiao为待检阳性样品。
Note：*is virus of cell；+：Positive；-：Negative；YL544124，L1001，Y1104，D45，D46，D45xiao is sample.
试验例5 本发明SyMuReTi-PCR检测4种病毒稳定性试验
将PRV、PPV、PCV-2、HC，分别取5份阳性样品和1份阴性样品分别进行批内、批间重复试验。批内重复试验是将5份样品在同一次实时荧光中重复3次，结果见表6；批间重复试验是在3次不同时间的试验中(间隔4天)进行实时荧光定量PCR试验，结果见表6。4种病毒的批间、批内重复试验的平均变异系数CV值均小于2％；
表6 SyMuReTi-PCR检测4种病毒的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数
注：CV为变异系数；Note：CV is coefficient of variability
试验例6 本发明SyMuReTi-PCR检测4种病毒样品试验
检测样品共计60份，其中现地采集全血27份，试验攻毒猪脏器13份，20病料分别从河南、湖南等地的猪场采集，根据常规方法提取核酸，应用建立的SyMuReTi-PCR方法和普通PCR检测样品。待检样品为全血，自表现有PRV、PPV、PCV-2、HC相关疫病临床症状的疑似猪只中采集，临床主要表现为背毛蓬乱、食欲不振，有些出现振颤及呼吸道症状，或出现生殖障碍等。皮肤坏死性出血，有黄豆粒大小的紫斑，淋巴结肿，肺充血、淤血、肉变，肠淋肿(河南、湖南等地猪群的临床症状)。
普通PCR法检测与SyMuReTi-PCR检测的结果见表7和表8。由表7可以看出：PCV-2普通PCR检测出39份阳性，本发明SyMuReTi-PCR检出45份阳性；PRV普通PCR检出14份阳性，SyMuReTi-PCR检出19份阳性；HC普通PCR检出3份阳性，SyMuReTi-PCR检出4份阳性；PPV普通PCR和SyMuReTi-PCR检出3份；HC和PCV-2混合感染病毒的有3份；HC和PRV混合感染病毒的有1份；PCV-2和PRV混合感染的有4份。
表7 SyMuReTi-PCR检测样品结果
注：判定标准确定为：在CT值在35循环内，
Tm值分别为：
PCV-2：86.69±0.21
PPV：79.97±0.15
PRV：88.56±0.15
HCV：84.61±0.16。
表8 SyMuReTi-PCR检测4种病毒的样品结果
注：+：阳性；-：阴性Note：+：Positive；-：Negative.
序列表
<110>中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所
<120>检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法
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<160>16
<170>PatentIn version 3.1
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1. 一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，包括制备4种病毒的标准质粒并建立标准曲线，确定判定样品阳性或阴性的标准，设计检测引物进行样品的荧光定量PCR扩增并获得样品的Tm值，将所获得的Tm值用所确定的判定标准评判样品的阳性或阴性等步骤，其特征在于，所述的标准曲线的建立方法如下：
(1)按照常规方法分别提取猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒的核酸；
(2)以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，以所提取的II型猪圆环病毒(PCV2)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得II型猪圆环病毒标准质粒；
以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，以所提取的猪细小病毒(PPV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪细小病毒标准质粒；
以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为引物，以所提取的猪伪狂犬病毒(PRV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪伪狂犬病毒标准质粒；
以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为引物，以所提取的猪瘟病毒(HCV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪瘟病毒标准质粒；
(3)将步骤(2)所制备的4种标准质粒分别作10倍系列稀释，以稀释液为模板，进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号，经计算机软件Rotor-gene6.0生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线；
所述的确定判定阳性或阴性的标准是：在CT值在35循环内；Tm值分别为：PCV-2：86.69±0.21；PPV：79.97±0.15；PRV：88.56±0.15；HCV：84.61±0.16；
所述的检测引物为：检测II型猪圆环病毒(PCV2)的引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；检测猪细小病毒(PPV)的引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；检测猪伪狂犬病毒(PRV)的引物为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；检测猪瘟病毒(HCV)的引物为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
2. 按照权利要求1的多重实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述检测II型猪圆环病毒的标准曲线是图3所示；检测猪细小病毒病毒的标准曲线是图4所示；检测猪伪狂犬病毒的标准曲线是图5所示；检测猪瘟病毒的标准曲线是图6所示。