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CN101198872B - 用于同时检测并鉴定不同类型的抗生素的体外方法以及相应的检定试剂盒 - Google Patents

用于同时检测并鉴定不同类型的抗生素的体外方法以及相应的检定试剂盒 Download PDF

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CN101198872B
CN101198872B CN 200680021524 CN200680021524A CN101198872B CN 101198872 B CN101198872 B CN 101198872B CN 200680021524 CN200680021524 CN 200680021524 CN 200680021524 A CN200680021524 A CN 200680021524A CN 101198872 B CN101198872 B CN 101198872B
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B·格拉涅尔
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优尼森索股份有限公司
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Abstract

本发明涉及同时测量不同类型的抗生素的检定试剂盒,其特征在于,所述检定试剂盒包括:-一方面,单一的反应混合物,所述反应混合物至少包含特异性识别β-内酰胺类的经标记的第一种受体、以特异性和竞争性的方式识别四环素和生物素化的核酸片段的经标记的第二种受体、抗磺酰胺抗体和经标记的磺酰胺类似物;-和另一方面,固体支持物形式的回收系统,所述回收系统包括硝化纤维素膜,在该硝化纤维素膜上,在三个不同的测试区带处分别固着有具有β-内酰胺核的抗生素、抗生物素蛋白和能够特异性地识别抗磺酰胺抗体的抗体,从而使得在所述三个测试区带处在该回收系统上检测到的标记强度独立地由于每种抗生素被其经标记的受体竞争性地识别而产生。

Description

用于同时检测并鉴定不同类型的抗生素的体外方法以及相应的检定试剂盒

发明领域

[0001] 本发明涉及一种方法,该方法在于在单一的反应混合物中同时使各种不同的生物学识别分子的集合反应,这些生物学识别分子能够以提高的灵敏度特异性地检测数种不同的分析物,并确定每种受检测的化合物所属的分析物类型,只要给定类型的分析物的特异性识别的原理不会干扰另一类型的分析物的特异性识别的原理。

[0002] 本发明还涉及特别地设计用于实施本方法的检定试剂盒。

技术背景

[0003] 支配很好地实施监控和检查食物链的基本原则需要尽可能在生产的上游进行检查分析,以便使得能够尽可能快地鉴定和分离怀疑受到污染的食品。

[0004] 一般地,当进行检出测试(通常称为“筛选测试”)时,在第一次检查分析过程中被检测为阳性的样品仅假定是真正阳性的,并且其必须接受称为“确认”的第二次测试。相反地,如果初始检出测试得到阴性应答,这就足够了并且不需要进一步的分析来再次确认结

里⑴

TN o

[0005] 这项规则的第一个后果是,第一次检出方法必须能够包括最大量的化合物的检测。因而,筛选或检出测试应该优选地且在逻辑上是“多分析物测试”。

[0006] 这项规则的第二个结果是,在筛选测试过程中知道在阳性样品中发现的化合物所属的类型是很重要的,以便能够直接转向至通常十分特定的确认方法,因为必须做到分离和鉴定所涉及的化合物。

[0007] 这项规则的第三个结果是,筛选测试不能得到“假阴性”类型的结果,因为从此以后它们将逃避在该初始阶段的分析并且将不会在以后得到确认。

[0008]目前,已知各种用于检测抗生物素的方法:

[0009]-测量样品对细菌菌株生长的抑制能力的微生物学测试。这种类型的测试需要相对长的培养时间(3至16小时)才能获得结果。通常,这些测试(Delvotest ® SP、BRT

Test, Copan™, Eclipse™, Valio™)能够同时识别数种类型的抗生物素,因为所使用的细菌菌株通常对不同类型的数种化合物敏感。然而,这种类型的测试不允许鉴定受试抗生素化合物所属的确切类型。

[0010]-在检测小分子的情况下,体外测试根据存在于样品中的待研究的化合物与经标记的竞争剂之间存在竞争这一原理来工作,所述经标记的竞争剂是对于单个相同识别位点而有意引入样品中的,其可以由受体或抗体构成。在ELISA(酶联免疫吸附测定)或RIA(放射免疫测定)/RRA (放射受体测定)类型的形式中,分析所需的时间是2-6小时的级别。这些方法中的一些,特别是实验室的RRA方法,使得能够同时检测不同类型的数种化合物。然而,在该情形中,该方法不允许鉴定已提供了阳性应答的化合物所属的类型。

[0011]-最近以来,允许分离和鉴定所研究的化合物的更复杂的物理-化学方法就其来说主要是其中将色谱法分离系统与质谱法检测系统相偶联的方法(GC/MS或LC/MS)。这些方法需要对于待鉴定的每种不同化合物来调整特定的方案。有时候单种化合物或相同类型的一部分化合物可以同时进行分析,有时候相同类型的所有化合物可以得到检测,但这对不同类型的化合物从来是不可能的。事实上,色谱法分离的原理是给定化合物的物理-化学特性的表征,这些物理-化学特性通常在一种类型与另一种类型之间是不同的。在操作者不知道待鉴定的化合物的类型的情形中,必须考虑与存在的化合物类型一样多的方法。

[0012] 近些年来,还开发了快得多的方法。这些称为“RAPID TESTS”的方法用于对大量的样品进行快速检出。通常,这些方法利用所研究的化合物根据竞争原理相对于生物分子的识别。为了使分析快捷而简便,这些类型的测试借助于具有侧流的膜装置(Tetrasensor™、SNAP ®、Beta-STA™、ROSA)进行工作。这些测试根据各种不同类型的抗生物素而变化,但

至今已知的这些产品没有一种允许在单次操作中检测属于不同类型的化合物。

[0013] 如果设想且规定在农业食品领域进行初级检出分析是合理的,那么所涉及的领域将需要能够优选鉴定最大数目的可疑化合物的尽可能完全的分析。这是因为,对单个样品进行单次多重检测与必须对每种特定化合物进行一次特定的检测相比更实用且经济。这种实践在时间、样品管理和花费方面是繁重的。这制约了对食品的良好管理和有效检查。

[0014] 因此,在这个阶段,这种校查在效率方面受到巨大的限制,特征在于缺乏多分析物测试,所述多分析物测试允许在单次操作中并且例如在少于10分钟内检测数种分析物类型的所有化合物。

[0015] 特别地,农业食品领域将会对允许在单次操作中分析属于至少两种不同抗生素类型的化合物的新方法感兴趣。

[0016] 根据应用是治疗性的或是预防性的,根据动物种类、要对抗的微生物、兽医学实践、现行法规、可利用的手段或者甚至地理区域,可以施用给动物的抗生素类型可能不同。在一些特定的治疗情形中,使用了药物的混合物。一般地,从业者使用选自经他评估最有效的所有可商业获得的化合物的抗生物素产品。

[0017] 所使用的主要类型的抗菌剂和抗生素是:青霉素类和头孢菌素类、四环素类、磺酰胺类、氨基糖苷类和氨基环多醇类、大环内酯类、氯霉素类或其他肽类、离子载体类、硝基呋喃类、喹诺酮类、卡巴多司等。所有这些类型覆盖了很宽范围的化学上不同的化合物。

[0018] 据认为,在兽医药学中和农业生产中不时地密集使用抗生素可能是出现变得对抗生素具有抗性的细菌菌株的起因。为了保护人类健康并且在该领域立法,许多国家(欧盟、美国、加拿大等)已经设置了食品中抗生素残留的最大批准限度(MRLs—一最大残留水平)

(2)。在一定程度上可以说,这些MRLs设定了阳性样品和阴性样品之间,即被拒绝的样品和被接受的样品之间的界限。

[0019] 此外,2002年8月12日的欧盟委员会决议确定了可应用于用来检验样品的分析方法的所要求的最低执性限量(MRPLs),并定义了用于解释结果的通用标准(3)。

[0020] 应当理解,只有这样的分析技术才可用于遵照DirectiVe96/23/EC的筛选目的,利用所述分析技术可基于能鉴别的证据来证明它们得到了验证并且具有对于所考虑的水平而言符合小于5%的标准的误差率。

[0021] 在1995年,平均I %的全部经分析的样品关于它们的抗生素含量具有高于MRL的水平并得到阳性应答。当这些阳性结果得到确认时,最经常涉及的产品是青霉素类和四环素类⑷。

现有技术

[0022] 四环素分子的识别系统描述于题目为“Proc6d6pour effectuerun diagnostic invitro au moyen de mecanismes de regulationgenetique et trousse de diagnosticcorrespondante”的本申请人的专利申请W0-A-03/048770中。该方法不能检测除四环素类以外的其他物质。在一个优选的制剂中,反应物包括tetR受体(分离自用于抵抗四环素类的大肠杆菌遗传调节机制)、能识别该受体的抗体和与胶体金颗粒缀合的蛋白A制剂。另一方面,回收系统是特异性的且生物素化的DNA片段,该DNA片段可以固定在固着于硝化纤维素膜上的抗生物素蛋白分 子上。在样品存在下的孵育过程中,所述受体和DNA片段仅在四环素不存在时相互作用。在这种情况下,该DNA片段与受体形成复合物,并且出现由固着至受体上的金颗粒产生的信号。在相反的情况下,事先已经识别了四环素分子的受体不再能够结合该DNA片段,并因而不出现信号。

[0023] @ -内酰胺类的识别系统描述于标题为“Proc6d6pour Iadeterminationd ' antibiotiques anoyaux ^ -1actame dans unliquide biologique,, 的专利W0-A-99/67416中。根据这种方法,不可能检测除了 P _内酰胺类以外的其他物质。在一个优选的制剂中,发明人描述了,一方面,分离自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的受体,该受体经纯化并化学偶联至生物素分子,在生物素分子上联合了与胶体金颗粒缀合的抗-生物素抗体制剂;和另一方面,缀合物,该缀合物由偶联至人免疫球蛋白的头孢菌素形成并固定在硝化纤维素膜上。在样品不含有¢-内酰胺的情况下,受体结合至固定的抗生素,并且出现由借助于偶联至金的抗-生物素抗体而固着至受体-生物素的金颗粒产生的信号。在相反的情况下,如果在与待测试的样品的预先孵育过程中受体受到抑制,则其不再能够与固定的抗生素结合,并因而没有信号出现。

[0024] 还知道由R. Verheijen等人描述的快速的磺酰胺识别系统,题目为“Developmentof a one step strip test for the detection ofsulfadimidine residues,,。该系统利用与上述的¢-内酰胺类检测类似的原理。一方面,将磺胺二甲嘧啶类的特异性抗体与胶体金颗粒缀合,并且将磺胺二甲嘧啶缀合至卵清蛋白并固定在硝化纤维素膜上。如果样品包含被该抗体识别的磺胺二甲嘧啶类,则其形成复合物,该复合物不能在以后碰到固定的化合物并因而将不能与其结合。在相反的情况下,当样品中不存在磺胺二甲嘧啶时,缀合的抗体将能够识别固定的磺胺二甲嘧啶并将出现着色信号。这篇文章没有指出这种测试的特异性。

[0025] 迄今已知的使用侧流的所有快速方法和过程仅应用于检测单一和相同类型的化合物,并且至今没有使得能够在单次操作中检测属于至少两种不同抗生素类型的所有化合物的方法。这种情况的主要原因是,在单个和同一过程中将检测每种类型所需的所有反应物独立地且不干扰地合并在一起具有技术上的不兼容性。其次,第二个困难在于获得对于受检测化合物所属类型的鉴定的方式。

[0026] 概括来说,已知用于检测小分子(MW < 2000)的快速系统根据竞争原理来工作,所述竞争原理需要利用两种特定的元素,这两种元素中的一种是可特异性识别待检测的化合物的分子,该分子通常为细菌受体或免疫球蛋白(抗体),和另一种是对于该识别位点的竞争剂。取决于所选择的方法,将其中一种元素固定于支持物上,而将另一元素进行标记。在某些情形中(形式1,见下面),将识别分子进行标记,而将分析物的类似物固定;在另一些情形中(形式2,见下面),将分析物的类似物进行标记,而将识别分子附着至不溶性级分。

[0027] 四环素检测系统的独创性的特征在于,受体包含两个相互依赖的识别位点,并因而竞争剂不是所研究的分析物的类似物而是能结合至相同受体的第二个识别位点的DNA片段。

[0028] 在所有称为“RAPID TESTS”的方法中,评价通过下列方式来进行:将在“测试”区带中(即在固定了活性受体的回收元素(6l6mentr6cup6rateur)的地方)获得的信号强度与在“对照”区带中(即在回收其他反应物(或过量反应物)的地方)获得的其他信号强度相比较。一般地,当“检测”区带中的强度比“对照”区带中的强度更明显时,对于所研究的元素来说结果是阴性的。

[0029] 在涉及测量¢-内酰胺分子的所有情形中,识别分子从芽胞杆菌属(Bacillus) 制备物中获得,并且在每种情形中,该分子在纯化后进行标记。为了完成这一标记过程,表面需要进行化学修饰。例如,其可以与酶化学偶联,如使用偶联有过氧化物酶(Giestfcocades的EP-A-O 593112和US-A-5,434,053)或生物素的嗜热脂肪芽胞杆菌(BacillusStearothermophillus)的受体的情况,如使用偶联有生物素的地衣芽胞杆菌的受体(U. C. B. S. A.的TO-A-99/67416和US-A-6,524,804)或者使用直接缀合有胶体金的嗜热脂肪芽胞杆菌的受体(Charm Inc.的US-A-6, 475,805)的情况。除了 Tetrasensor™方法,在迄今已知的其他情形中,需要对识别分子进行化学修饰以从中获得有色的复合物。因而,有必要将其纯化并修饰它的表面上的某些取代基,这具有改变其重要的官能性或稳定性性质的风险。

[0030] 在迄今已知的其他情形中,因而通常不可能用未经纯化的粗提取物或者用将不进行化学修饰的受体来工作。

[0031] 此外,在测量“四环素”中使用的标记的类型与内酰胺类的测量不兼容,因为在后者情况下,在所有已报道的情况下,是将免疫球蛋白固定在“对照”区带处。在文献W0-99/67416的情形中,同样地,免疫球蛋白用作锚定蛋白以将竞争剂固定在”测试”区带处。如在测量四环素类中一样,使用蛋白A将不可避免地在对于检测¢-内酰胺类所需的一条或两条捕获线上引起非特异性的标记。

[0032] 在另一类想法中,当必须借助于抗生物素蛋白-生物素组合的使用以便有助于固着在支持物上或有助于进行标记时,抗生物素蛋白-生物素组合仅可在给定的方法中用于单一特异性识别。这是因为,如果抗生物素蛋白形成了锚定点,那么所有生物素化的分子将有可能固着在那里。在这种情况下,特别不可能实现的是,设想一种用于¢-内酰胺类和四环素类的共同检测的测试,该测试将基于例如在文献W0-A-99/67416和文献W0-A-03/048770中描述的两种测量原理的组合。这是因为,在第一种情况下,将受体进行生物素化,以便随后用抗生物素-金进行标记,而在第二种情况下,将抗生物素蛋白固定以便回收生物素化的DNA片段。这两种原理的结合则会导致使用抗生物素蛋白-生物素对的两个独立系统之间的进一步冲突。在这两种现存系统的组合中,¢-内酰胺系统的生物素化受体结合在对于回收四环素系统的DNA所必需的抗生物素蛋白中,并因而引起与样品中四环素的水平无关的非特异性标记。此外,流动相中抗生物素-金的存在干扰了生物素化的DNA,阻止其遇见对于其捕获来说所需的抗生物素蛋白,这又会导致另一个冲突。

[0033] 在第三类想法中,两种独立的识别系统的组合需要相当复杂的用于读取和解释结果的系统,其中每种标记物必须通过相对于内部参照的强度来评估。因而将有两条“测试”带(“beta”和“tetra”)和两条“对照”带。这种念头使得该分析既不简单也不实用。在这两种测试组合的情形中,最好还是通过相互比较来评估每种测试的强度。在这样一种方法中,I号分析物的“测试”区带变为2号分析物的“对照”区带,反之亦然。在所涉及的两种类型的分析物同时出现于同一样品中的情况下,该方法将不产生或几乎不产生信号。这是罕见的情形,但是如果出现,那么为了避免在¢-内酰胺类和四环素类双污染的情形中的判读困难,合适的是建议以单条对照线的形式加入单个参照,以使得能够更容易地评估这两种测试信号的相对强度。显然,在同一过程中合并多于两种测试的情况下,这种单条对照线将变得有必要。

[0034] 在第四类想法中,特意并且优先地选择用于形成检定试剂盒的浸溃片(tigette)装置的材料必须对于同时分析两种类型的分析物是兼容的。这是因为,在WO 99/67416中描述的一个优选的实施方案中,推荐使用“Leukosorb®”类型的膜,但是其与我们推荐用

于四环素测试的方法不兼容,并且不适合用于多分析物测量。这是因为,十分奇怪地,在其中两种受体用它们各自的抗体进行标记的制剂中,当所述反应物在到达捕获位点前遇到Leukosorb®膜时,不可能通过加入P -内酰胺类而获得清楚的截断点。其效率在对于奶

的纯化和于侧流中的使用来说已经得到证明的这种膜是当用抗体和缀合了胶体金的蛋白A来进行标记时产生非特异性识别信号的原因。

[0035] 在第五类想法中,选择参与识别每种类型的全部化合物的受体是重要的。这种选择不仅是由化合物的识别性能决定,而且还由稳定性、结构、抗原反应性、氨基酸组成等标准决定。

[0036] 总之,基于已知的方法,可推理出,不可能将至少两种独立的方法(例如用于通过受体识别¢-内酰胺类和四环素类的方法)集合于单个的同一种方法中而不考虑本质的修饰来使得能组合所有所需的元素,同时确保一种化合物的识别系统不干扰另一种化合物的识别系统。

[0037] 未发明的目标

[0038] 本发明旨在提供一种新的检定方法,该方法使得能同时检测可能属于至少两种不同分析物类型的化合物的组合(理论上是无限的)并表征所检测的化合物实际上属于哪种类型。

[0039] 特别地,本发明旨在证明将至少两种检测机制合并入单个的同一种方法中而它们其中之一的运作不会干扰另一机制的运作的技术和实践相容性。

[0040] 本发明的另一个目标是证明多分析物测量的技术可行性,这种测量可快速地例如在少于30分钟内并且在单个同一分析步骤中用单个同一样品完成。

[0041] 本发明的另一个目标是提供体外检定的方法和试剂盒,用于同时检测并测量至少两种类型的分析物。

[0042] 本发明的主要的特征性要素

[0043] 如分别在权利要求1、3、4和10中所述的,本发明的第一个目标涉及用于同时并特异性地检测和定量至少两种分析物的检定试剂盒,所述分析物属于不同的抗生素类型,即内酰胺类、四环素类和磺酰胺类中的至少两种类型,所述检定试剂盒的特征在于,其通常包含,例如:

[0044]-—方面,单一的反应混合物,优选以溶液或冻干物的形式,所述反应混合物包含至少两种不同的生物分子,每种生物分子能够分别、同时和特异性地识别存在于样品中的受测定的分析物,所述样品可以包含属于所述不同分析物类型的分析物。

[0045]-和另一方面,以单一的固体支持物形式的回收系统,在该支持物上在不同且已知的空间位置处固着有各自的配体,所述配体能够特异性、选择性和专一性地回收包含于所述反应混合物中的每一种所述生物分子,以便通过在所述支持物上的回收位置来鉴定存在于样品中的每种分析物所属的类型。

[0046] 根据具体情形,或者固定的回收元素是所研究的物质的竞争性类似物而对溶液中的受体进行标记,或者对溶液中的竞争性类似物进行标记而固定的回收元件是受体。根据本发明,混合的系统也可以共存。

[0047] 本发明的优选实施方案在从属权利要求2、5_9以及11-12中描述。

[0048] 如权利要求13中所示的,本发明的第二个目标涉及应用根据权利要求1-12中任一项的检定试剂盒的方法,其特征在于以下步骤:

[0049]-将上述反应混合物与待表征的样品接触以获得溶液,让该溶液在30°C -50°C的温度下孵育3-15分钟。

[0050]-将带有上述回收系统的浸溃片浸入所获得的溶液中,并允许孵育3-15分钟。

[0051]-用眼睛以目测方式或者借助于浸溃片的光学读取仪来判读浸溃片上的结果。

[0052] 在本发明的优选实施方案中,推荐一方面避免纯化,和另一方面避免受体的化学修饰,例如通过使用直接用胶体金或优选借助于与胶体金偶联的蛋白A进行标记的抗-受体抗体。另一方面,在多重检测的想法中,用胶体金标记的蛋白A用作所有引入溶液中的抗体的一般标记物。

[0053] 为了保存在本发明中使用的受体和抗体的最大官能性,所采用的一个原则是不通过化学修饰来进行标记。因此,本发明使用处于其尽可能天然状态的细菌受体。这些受体借助于抗体来标记,所述抗体自身将被与胶体金缀合的蛋白A识别。因此,如果有这种情况,仅标记蛋白将偶联至胶体金,而不是对于识别所涉及的分析物的敏感的分子。

[0054] 在该方法中,因而保留了对于识别来说敏感的分子的所有官能团。当涉及利用其识别机制依赖于某些侧链(例如赖氨酸残基)的受体的活性时,这种优势被利用到了极致。更加重要的是,当发生化学修饰时,在大多数报道的情况下,修饰涉及赖氨酸侧链的NH3+残基。因此,化学偶联至赖氨酸上可以改变活性位点的赖氨酸,并因而使得制剂部分失活,

[0055] 借助于抗体的标记具有非固定不动性标记的柔性。这是因为,化学标记意味着不可逆的共价连接,而抗体的附着是可逆的并且服从一种平衡,该平衡可以根据作用力而移动。另一种优势是能够在第二个时期中调整标记阶段。这是因为,在本发明的第二种制剂中,是在受体识别分析物阶段后,不管是样品的游离的分析物还是用于回收的固定的分析物,抗体均识别受体。

[0056] 由于经济或稳定性的多种原因,而且还为了在多分析物测试中的完美整合,本发明优选地推荐使用从金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中分离的P _内酰胺类受体⑹。

[0057] 这是因为,由于其源自关于对抗抗生素(特别是内酰胺类)而言最有效的细菌菌株,所以在体外使用的这种受体显示出超常的识别所有¢-内酰胺类化合物(对于青霉素类以及对于头孢菌素类)的能力(见参考文献(6),以及显示于实施例中的结果)。

[0058] 这种受体的另一个优势是具有碱性等电点(pi)。这提供了能够十分容易地将其从细胞粗提取物中纯化出来以便由其获得抗体的可能性。

[0059] 此外,我们的选择还由观察到在兔中十分好的免疫应答决定,该免疫应答是十分特异性的,并且不会引起与在多分析物测量所涉及的剩下的所有反应物的任何非特异性应答。 [0060] 根据本发明,成功地制定了一种方法,其中有可能在单个同一操作中合并所有元素,所述元素对于通过使用完全不同的识别机制共同检测不同类型的数种化合物来说是必需的。

[0061] 本发明提供了额外的优势,即提出了可靠且经济的多分析物测试的方案。这是因为,不必纯化受体,也不必纯化抗体制剂,而且受体不进行化学修饰,这将会保留它们的全部反应性和稳定性。

[0062] 附图简述

[0063] 图1示意性地呈现了,在同时测量仅两种抗生素的情形中,根据本发明的回收元素在固体硝化纤维素支持物上的定位的实例,还显示了固着的对照区带。

[0064] 图2示意性地呈现了,在同时测量四环素类、P -内酰胺类和磺酰胺类的情形中,根据本发明的回收元素在固体硝化纤维素支持物上的定位的实例,还显示了固着的对照区带。

[0065] 本发明的优选实施方案的描述

[0066] 初步的评论

[0067] 如在“现有技术”中提到的,根据本发明而设想的竞争测试特别地可以以两种不同的形式存在。在第一种情形(形式I)中,受体与胶体金颗粒缀合,而竞争性化合物即所研究的物质的类似物通过固定于特定的捕获位点处而用作回收元素。在第二种情形(形式2)中,竞争性化合物即所研究的物质的类似物与胶体金颗粒缀合,而受体通过固定于特定的捕获位点处而用作回收元素。在多分析物检测的某些情形中,还可以具有混合系统(存在形式I和形式2)。

[0068] 实施例1 :借助于特异性受体来同时测量四环素类和P -内酰胺类(形式I用于这两种检测)

[0069] 本方法使用含有¢-内酰胺类和四环素类这两者各自的受体以及它们的反应物和回收元素的反应混合物,在所述回收元素上,在精确且不同的地方固定有这些受体的特异性配体。

[0070] 反应混合物的制备

[0071] 对于检测0 -内酰胺类,反应混合物包含用于识别P -内酰胺类的特异性受体、其特异性抗体和与胶体金缀合的蛋白A制剂。对于检测四环素类,反应混合物包含四环素类的受体、其特异性抗体、与生物素缀合的特异性DNA片段和与胶体金缀合的蛋白A制剂。

[0072] 根据Golem1-Kotra等人(6)描述的方法获得P -内酰胺受体。将未纯化的受体在Millex HV膜(Millipore, Inc.,USA)上过滤,随后在50% v/v的甘油存在下于4°C保存。根据专利申请W0-A-03/048770中描述的方法获得四环素受体。

[0073] 根据Kachab等人⑺描述的方法获得这两种抗体制剂。对于P _内酰胺类的受体根据Golem1-Kotra等人(6),以及对于四环素类的受体根据申请W0-A-03/048770,通过注射纯化的受体的制剂直到蛋白质同质来获得这些抗体制剂。这两种抗体制剂优选未经纯化而使用,这表示是将未经纯化的血清直接加入至反应混合物中。根据第二个优选的实施方案,单克隆或多克隆类型的特异性抗体根据本领域技术人员已知的方法来纯化,以便然后根据Frens的方法(8)直接或间接地与胶体金颗粒偶联。

[0074] 根据专利申请W0-A-03/048770中描述的序列和制剂从Eurogentec SA, Belgium获得DNA片段。在这个确切的情形中,DNA片段不固定至硝化纤维素膜上的捕获位点,而是将其直接混合进反应混合物中。该片段将通过在固定于捕获位点处的抗生物素蛋白上的其生物素化末端而在测试中(in testo)回收(参见下文)。

·[0075] 引入所有所需反应物而没有任何化学修饰或取代,使得保留了全部的反应性和稳定性特性。这些分子可以是经纯化或未经纯化的,这显示出明显的经济上的优势。

[0076] 在该确切的实例中,反应混合物包括:

[0077] -5份的@ -内酰胺受体(RSA),其浓度为360nM ;

[0078] -5份的四环素受体(TetR),其浓度为4. 2 ii M ;

[0079] -1份的抗-RSA血清,其4倍稀释于缓冲液NaPi 50mM、NaC1150mM(pH7. 8)中;

[0080] -1份的抗-TetR血清,其4倍稀释于缓冲液NaPi 50mM、NaC1150mM(pH 7. 8)中;

[0081] -1份的核酸,其在NaCl 690mM中的浓度为25iiM ;

[0082] -15份的蛋白A_40nm的金,其在520nm下的OD = 10 ;

[0083] -22 份的缓冲液 Ifepes 120mM(pH 8)、BSA 2%、葡聚糖 I %、蔗糖 5%。

[0084] 这种混合物或者即时地制备或者冻干20小时。

[0085] 回收系统

[0086] 该回收系统由硝化纤维素膜构成,在其上在不同的地方固着有能够与反应混合物的识别分子形成复合物的元素。这些元素如下:

[0087]-对于称为“beta”的信号(对于P _内酰胺),是抗生素,优选青霉素或头孢菌素类型的抗生素,其固定在与蛋白A或生物素或抗生物素蛋白没有特殊反应性的分子上。在本发明的一个优选的实施方案中,使用固定在¢-乳球蛋白上的氨苄青霉素;

[0088]-对于称为“tetra”的信号(对于四环素),是抗生物素蛋白,其能够识别在一末端具有生物素分子的DNA片段。优选地使用卵抗生物素蛋白。

[0089] “beta”和“tetra”捕获带可以接连地相继定位或者相反,没有任何特别的优先选择,只要将它们布置于在空间上不同但已知的位置处。这是因为,正是这种不同的位置将使得能够测定存在于分析溶液中的抗生素的类型。如果两个捕获系统汇集在单个地点,那么它们的测量将不会改变,但将不可能确定哪种类型的化合物真正存在。

[0090] 与氨苄青霉素缀合的乳球蛋白的制备

[0091] 选择¢-乳球蛋白,因为其为一种包含许多赖氨酸残基(10% )的乳蛋白,并且三维结构表明大多数赖氨酸具有朝向蛋白质外部的其NH2末端(Pubmed, structure, IGXA)。

[0092] 将IOOmg 乳球蛋白和15mg 2_亚氨基硫杂环戍烧(2-1minothiolane)以4ml的反应体积在缓冲液NaPi IOOmM(pH 8.5)中于25°C孵育60分钟。然后将该混合物上样至预先在 PBS (pH 7)、EDTA 5mM 中平衡的 PDlO 柱(Amersham Biosciences, UK)上,并在相同缓冲液中洗脱。根据熟知的方法收集蛋白质级分。

[0093] 另外,将2ml含有IOOmg SICC的DMSO与2ml在缓冲液NaPi 25mM(pH 8)中的50mg/ml氨苄青霉素钠的溶液在25°C下孵育60分钟,随后在50mg蛋白质溶液存在下于4°C孵育4小时。最后,将该溶液逆100体积的缓冲液NaPi 25mM(pH7. 5)透析两次6小时。

[0094] 中和的抗生物素蛋白溶液的制备 [0095] 在缓冲液NaPi 50mM(pH 7.5)中制备5mg/ml的卵抗生物素蛋白溶液,卵抗生物素蛋白从Pierce Inc., USA获得。

[0096] BSA-金对照溶液的制备

[0097] 本发明推荐使用具有恒定强度且在测试显色之前和之后可见的对照线。该线优选是与“检测”线中所显现的颜色相似的颜色,并且如下合成。

[0098] 将3ml在IOmM硼酸盐(pH 6. 5)缓冲液中的10% BSA(Sigma)溶液加至27ml 40nm的胶体金制备物中,所述胶体金制备物通过Frens®的方法获得并且其光密度ODa最大为3。将该混合物在20°C下孵育60分钟,然后将其在SS34转子(Sorvall)中以10,OOOrpm离心45分钟。然后将沉淀回收在缓冲液NaPi 50mM、NaCl 150mM中以便获得45的ODa最大。在相同缓冲液中对将要上样至硝化纤维素膜的该溶液进一步进行15倍稀释以获得3的最终OD值。

[0099] 免疫色谱技术

[0100] 免疫色谱技术是已知的并描述于文献(Developinglmmunochromatographic TestStrips :A Short Guide, Millipore, Lit. no. TB500 Printed in USA 11/96,96-204)中。在本发明中,将上面获得的制备物沉积在硝化纤维素膜上的精确且不同的位置处,并且优选参照液体的迁移方向接连地相继布置。然后将该硝化纤维素膜在一端与膜(例如可从Ahlstrom, Inc.,USA获得的142型膜或可从Whatman,UK获得的GFDVA型膜,但不是可从Pall,UK获得的Leukosorb®型膜)接触,并且在另一端与任何吸水纸(例如可从Whatman,

UK获得的17CHR型吸水纸)接触。

[0101] 硝化纤维素支持物上的回收元素的沉积

[0102]回收元素的定位将使得能够鉴定在样品中发现的污染物的类型。所述溶液借助于Quant1-3000 型的 Biodot(UK) “分配器(dispenser) ”以 I y L/cm 的流量进行沉积。

[0103] 在检测两个参数的情况下,P -乳球蛋白和抗生物素蛋白的制剂将会被沉积于对照线的两边。例如,事先制备好的¢-乳球蛋白缀合物将沉积于对照线下面,而中和的抗生物素蛋白溶液将沉积于对照线上面(图1)。因此,^ -内酰胺类化合物的存在将表现为缺少^ -乳球蛋白上的标记,即位于对照线下面的测试线处的标记,而四环素类化合物的存在将表现为缺少位于对照线上面的测试线处的标记。在两种化合物都以足够量存在的情况下,两种信号都将不会出现在对照线的任一端(见图1)。

[0104]同时测暈乳样品中的内酰胺类和四环素类

[0105] 将200 ii L冷的奶在50iU如上制备和/或冻干的反应物存在下于50°C孵育。于50°C孵育3分钟后,将上面描述的回收元素浸入该溶液中。在孵育3分钟后,用从Matest (德国)购得的浸溃片光学读取仪来做最后的判读。[0106] 结果在表I中列出。本方法使得能够将含有4ppb氨苄青霉素和/或75ppb四环素的乳样品判断为阳性。

[0107] 表2概括了关于所提及的各种0 -内酰胺类和四环素类化合物的通过本方法获得的检测极限。一般地,当所涉及的测试信号强度相对于对照信号强度的比率等于或小于I时,该样品被认为关于所涉及的参数(化合物)来说为阳性。

[0108] 表1:在捕获位点处测量到的强度的单位和比率

[0109]

Figure CN101198872BD00141

[0110] (*)B :beta ;T :tetra ;C :对照

[0111] 表2:检测极限

[0112]

Figure CN101198872BD00142

[0113] 实施例2 :四环素类、P -内酰胺类和磺酰胺类的同时测量(形式I用于这三种检测)

[0114] 在该优选的实施方案中,除了四环素类和¢-内酰胺类的两类受体外,本方法还引入了用于识别磺胺间二甲氧嘧啶类的特异性抗体。

[0115] 反应混合物的制备

[0116] 根据以下制备方法,还将抗-磺胺间二甲氧嘧啶抗体掺入上述混合物中:

[0117] -5份的β -内酰胺受体(RSA),其浓度为360ηΜ ;

[0118] -5份的四环素受体(TetR),其浓度为4· 2μ M ;

[0119] -1份的抗-RSA血清,其4倍稀释于缓冲液NaPi 50mM、NaC1150mM(pH 7. 8)中;

[0120] -1份的抗-TetR血清,其4倍稀释于这一相同缓冲液中;

[0121] -1份的抗-磺胺间二甲氧嘧啶血清,其2倍稀释于这一相同缓冲液中;

[0122] -1份的核酸,其浓度为50μΜ;

[0123] -20份的蛋白A-40nm的金,其在520nm下的OD = 10 ;

[0124] -16 份的缓冲液 Hepes 120mM(pH8)、BSA 2%、葡聚糖 I %、鹿糖 5%。

[0125] 这种混合物或者即时地制备或者冻干20小时。

[0126] 回收系统

[0127] 该回收系统类似于实施例1的回收系统,其中整合入了用于回收抗-磺胺间二甲氧嘧啶抗体分子的特异的第四条线(第三条测试线)。其他的捕获区带相同但位置不同,如图2中的。

[0128] 与磺胺间二甲氧嘧啶缀合的BSA的制备

[0129] 该制备通过依照Dixon-Holland和Katz⑼描述的方案来完成。将溶解于含有2份50mM磷酸盐(pH 7. 2)缓冲液和I份二I恶烷的25ml混合物中的IOOmg磺胺间二甲氧嘧啶和200mg BSA,在120 μ L25%戊二醛存在下于25°C搅拌孵育3小时。然后将该溶液在4°C下逆100体积的缓冲液NaPi 50mM(pH 7. 2)透析6天,每12小时更换一次缓冲液。

[0130] 硝化纤维素支持物上的回收元素的沉积

[0131] 在检测三个参数的情况下,将捕获线置于硝化纤维素膜上的精确且不同的位置处,并且优选参照液体的迁移方向接连地相继布置。根据一个优选的实施方案,β_内酰胺、四环素和磺胺间二甲氧嘧啶的捕获区带以及对照区带参照液体的迁移方向分别置于第一个、第二个、第三个和最后第四个水平处(图2)。单条对照区带用作这三个标记物的参照。类似于前面的实例,一种不同的形式为加入两个对照区带,即每条测试区带之间有一条对照区带。

[0132] 一般地,应该注意到,根据本发明,测试线和对照线不一定必须以相同的相对于液体迁移方向的次序布置。因而,不管次序分别为“beta”- “tetra”还是“tetra”- “beta”,“beta”- “sulfa”还是“sulfa”- “beta”(见下面的实施例),“beta”- “tetra”- “sulfa”还是“sulfa,,- “tetra”- “beta”等,该试剂盒同样都能很好地工作。

[0133]同时测量乳样品中的内酰胺类、四环素类和磺胺间二甲氧嘧啶类

[0134] 将200 μ L冷的奶在50 μ I如上制备和/或冻干的反应物存在下于50°C孵育。于50°C孵育3分钟后,将上面描述的回收元素浸入该溶液中。在孵育3分钟后,用从Matest (德国)购得的浸溃片光学读取仪来做最后的判读。

[0135] 结果在表3中列出。本方法使得能够将含有4 ppb氨苄青霉素和/或75ppb四环素和IOOppb磺胺间二甲氧嘧啶的乳样品判断为阳性。

[0136] 表4概括了关于所提及的内酰胺类、四环素类和磺胺间二甲氧嘧啶类的不同化合物的、通过本发明方法获得的检测极限。一般地,当所涉及的测试信号强度相对于对照信号强度的比率等于或小于I时,该样品被认为关于所涉及的参数(化合物)来说为阳性。

[0137] 表3:测量的强度的比率

[0138]

Figure CN101198872BD00161

[0139] (*)A :氨苄青霉素;T :四环素;S :磺酰胺;C :对照

[0140] 表4:检测极限

Figure CN101198872BD00162

[0142] 实施例3 : β -内酰胺类和磺酰胺类的同时测量(形式I用于β -内酰胺类,形式2用于磺酰胺类)

[0143] 反应混合物的制备

[0144] 反应混合物包含:

[0145] -5份的β -内酰胺受体(RSA),其浓度为360ηΜ ;[0146] -10份的偶联至胶体金的单克隆抗-RSA抗体(520nm下OD = 10);

[0147] -1份的在NaPi 50mM、NaCl 150mM(pH 7.8)中稀释的且生物素化的抗-磺胺间二

甲氧喃唳;

[0148] -10份的BSA-磺胺间二甲氧嘧啶_40nm的金的稀释物;

[0149] -24 份的缓冲液 Hepes 120mM (pH 8)、BSA 2%、葡聚糖 I %、鹿糖 5%。

[0150] 这种混合物或者即时地制备或者冻干20小时。

[0151] 抗-磺胺间二甲氧嘧啶抗体的生物素化

[0152] 将825 μ L含有5mg/ml抗-磺胺间二甲氧卩密唳抗体的溶液在165 μ L1. 5mg/ml的生物素-LC-NHS溶液(从Perbio,Inc.购得)存在下于25°C避光孵育2小时,其中所述抗-磺胺间二甲氧嘧啶抗体在IOOmM碳酸盐(pH 9. 2)缓冲液中透析。通过加入10 μ L缓冲溶液Tris IM(pH 8)来阻断反应30分钟,随后逆缓冲液NaPi 50mM、NaCl 150mM(pH 7.8)透析2次10小时。

[0153] 与金颗粒缀合的BSA-磺胺间二甲氧嘧啶的制备

[0154] 在类似于在实施例1中对于制备BSA-金对照溶液所描述的方案中,将实施例2中描述的BSA-磺胺间二甲氧嘧啶的制剂用于偶联至胶体金颗粒。

[0155] 回收系统

[0156] 该回收系统与实施例1的相同。然而,在本情况下,生物素化的抗-磺酰胺抗体将被回收在固定于对照区带上面第二个捕获位点处的抗生物素蛋白中。

[0157]同时测量乳样品中的内酰胺类和磺胺间二甲氧嘧啶类

[0158] 将200 μ L冷的奶在50 μ L如上制备的反应物存在下于30°C孵育15分钟。在该第一次孵育后,将上面描述的回收元素浸入该溶液中。在第二次孵育15分钟后,进行最后的判读。结果在表5中列出。

[0159] 表5:测量的强度的比率

Figure CN101198872BD00171

[0162] _ : β -内酰胺;S :磺酰胺;C :对照

[0163] 实施例4 :四环素类和磺酰胺类的同时测量(形式2用于这两种检测)[0164] 反应混合物的制备

[0165] 反应混合物包含:

[0166] -5份的四环素受体(TetR),其浓度为4. 2μ M ;

[0167] -1份的小鼠单克隆抗-TetR抗体,其稀释于缓冲液NaPi 5 OmM、NaCl 150mM(pH7. 8)中;

[0168] -1份的兔抗-磺酰胺抗体,其稀释于这一相同缓冲液中;

[0169] -10份的BSA-磺胺间 二甲氧嘧啶_40nm的金的稀释物;

[0170] -1份的生物素化的核 酸,其浓度为50 μ M ;

[0171] -10份的抗生物素抗体_40nm的金,520nm下的OD = 10 ;

[0172] -22 份的缓冲液!fepes 120mM(pH8)、BSA2%、葡聚糖 I %、蔗糖 5%。

[0173] 这种混合物或者即时地制备或者冻干20小时。

[0174] 回收系统

[0175] 该回收系统类似于实施例1的回收系统。然而,在本情况下,抗小鼠抗体形成了第一个捕获位点,在那里将回收所述单克隆抗-TetR抗体,并且鸡抗兔抗体形成了第二个捕获位点,在那里将回收所述抗-磺酰胺抗体。

[0176]同时测暈肉样品中的四环素类和磺酰胺类

[0177] 将30ml缓冲液NaPi 50mM (pH8)加至IOg猪肉中,并将混合物用MiniMix型搅拌器(Interscience, F)搅拌2分钟。然后,将收集在Eppendorf管中的溶液以6,OOOrpm离心I分钟,从它回收上清液。将200 μ L上清液在50 μ L如上制备的反应物存在下于25°C孵育15分钟。在该第一次孵育后,将上面描述的回收元素浸入该溶液中。在第二次孵育15分钟后,进行最后的判读。结果在下面的表6中列出。

[0178] 表6:测量的强度的比率

Figure CN101198872BD00181

[0180] ⑷T :四环素;S :磺酰胺;C :对照

[0181] 实施例5 : β -内酰胺类、四环素类和磺酰胺类的同时测量(形式I用于β -内酰胺类/四环素类,和形式2用于磺酰胺类)

[0182] 反应混合物的制备[0183] 反应混合物包含:

[0184] -5份的β -内酰胺受体(RSA),其浓度为360ηΜ ;

[0185] -1份的小鼠单克隆抗-RSA抗体,其稀释于缓冲液NaPi 5 OmM、NaCl 150mM(pH7. 8)中;

[0186] -5份的四环素受体(TetR),其浓度为4. 2μ M ;·

[0187] -1份的小鼠单克隆抗-TetR抗体,其稀释于缓冲液NaPi 5 OmM、NaCl 150mM(pH7. 8)中;

[0188] -1份的生物素化的核酸,其浓度为50 μ M ;

[0189] -1份的兔多克隆抗-磺酰胺抗体,其稀释于缓冲液NaPi50mM、NaCl 150mM(pH7. 8)中;

[0190] -7份的BSA-磺胺间二甲氧嘧啶_40nm的金的稀释物;

[0191] -13份的偶联至40nm的胶体金的抗小鼠抗体,520nm下的OD = 10 ;

[0192] -16 份的缓冲液 Hepes 120mM(pH 8)、BSA2%、葡聚糖 I %、鹿糖 5%。

[0193] 这种混合物或者即时地制备或者冻干20小时。

[0194] 在第二个优选的方法中,单克隆抗-RSA和抗-TetR这两种抗体直接与胶体金颗粒

三双口 ο

[0195] 回收系统

[0196] 该回收系统类似于实施例1的回收系统。然而,在本情况下,乳球蛋白-氨苄青霉素形成了第一个捕获位点,在那里将回收受体RSA,抗生物素蛋白在第二个捕获位点处,在那里将回收受体TetR,并且鸡抗兔抗体形成了第三个捕获位点,在那里将回收兔抗-磺酰胺抗体。

[0197]同时测量乳样品中的内酰按类、四环素类和磺酰胺类

[0198] 将200 μ L冷的奶在50 μ L如上制备的反应物存在下于30°C孵育15分钟。在该第一次孵育后,将上面描述的回收元素浸入该溶液中。在第二次孵育15分钟后,进行最后的判读。结果在表7中列出。

[0199] 表7:测量的强度的比率

[0200]

Figure CN101198872BD00191

[0201]

Figure CN101198872BD00201

Claims (22)

1.同时测量样品中不同类型的抗生素的检定试剂盒,所述不同类型的抗生素至少为 β-内酰胺类和四环素类,其特征在于,所述检定试剂盒包括:-一方面,单一的反应混合物,所述反应混合物待添加至所述样品以获得溶液,并且至少包含特异性识别内酰胺类的第一种经标记的受体、第二种经标记的受体和生物素化的核酸片段,从而该第二种经标记的受体以特异性和竞争性的方式在所述溶液中识别四环素和该生物素化的核酸片段;-和另一方面,固体支持物形式的回收系统,所述回收系统待浸入所述溶液中,并且包括硝化纤维素膜,在该硝化纤维素膜上,在两个已知且不同的、称为测试区带的地方分别固着有具有β_内酰胺核的抗生素和抗生物素蛋白,或者相反;从而使得在所述两个测试区带处在该回收系统上检测到的标记强度独立地由于每种抗生素被其经标记的受体竞争性地识别而产生。
2.根据权利要求1的检定试剂盒,其特征在于,所述第一种经标记的受体和第二种经标记的受体用胶体金颗粒直接地或者借助于抗体或与蛋白A相联合的抗体间接地进行标记。
3.根据权利要求1或2的检定试剂盒,其特征在于,固着在硝化纤维素膜上的具有 β_内酰胺核的抗生素是青霉素或头孢菌素,和固着在硝化纤维素膜上的抗生物素蛋白是卵抗生物素蛋白。
4.根据权利要求3的检定试剂盒,其特征在于,所述具有β-内酰胺核的抗生素是固定在β_乳球蛋白上的氨苄青霉素。
5.同时测量样品中不同类型的抗生素的检定试剂盒,所述不同类型的抗生素至少为 β-内酰胺类和磺酰胺类,其特征在于,所述检定试剂盒包括:-一方面,单一的反应混合物,所述反应混合物待添加至所述样品以获得溶液,并且至少包含特异性识别β -内酰胺类的第一种经标记的受体、生物素化的抗磺酰胺抗体和直接或间接用胶体金标记的磺酰胺类似物;-和另一方面,固体支持物形式的回收系统,所述回收系统待浸入所述溶液中,并且包括硝化纤维素膜,在该硝化纤维素膜上,在两个已知且不同的、称为测试区带的地方分别固着有具有β -内酰胺核的抗生素和抗生物素蛋白,或者相反;从而使得在所述两个测试区带处在该回收系统上检测到的标记强度独立地由于每种抗生素的竞争性识别而产生。
6.根据权利要求5的检定试剂盒,其特征在于,所述第一种经标记的受体是直接或间接用胶体金颗粒进行标记的。
7.用于同时测量样品中相应于不同类型的抗生素的分析物的检定试剂盒,所述不同类型的抗生素至少为四环素类和磺酰胺类,其特征在于,所述检定试剂盒包括:-一方面,单一的反应混合物,所述反应混合物待添加至所述样品以获得溶液,并且包含至少一种经标记的受体和生物素化的核酸片段,从而该经标记的受体以特异性和竞争性的方式在所述溶液中识别四环素和该生物素化的核酸片段,以及抗磺酰胺抗体和经标记的磺酰胺类似物;-和另一方面,固体支持物形式的回收系统,所述回收系统待浸入所述溶液中,并且包括硝化纤维素膜,在该硝化纤维素膜上,在两个已知且不同的、称为测试区带的地方分别固着有特异性地针对经标记的四环素受体或针对经标记的四环素受体的特异性抗体的抗体和特异性地针对抗磺酰胺抗体的抗体,或者相反。
8.根据权利要求7的检定试剂盒,其特征在于,所述经标记的受体是用胶体金颗粒直接地或借助于抗体间接地进行标记的。
9.根据权利要求7的检定试剂盒,其特征在于,所述经标记的磺酰胺类似物是直接或间接用胶体金进行标记的。
10.根据权利要求1、2和5-9中任一项的检定试剂盒,其特征在于,加至反应混合物中的特异性抗-受体抗体是单克隆或多克隆的抗体,其经化学或重组修饰或者未经化学或重组修饰,经纯化或未经纯化,直接或间接地与标记颗粒相偶联或未相偶联。
11.根据权利要求10的检定试剂盒,其特征在于,所述标记颗粒为胶体金颗粒。
12.根据权利要求1、2和5-9中任一项的检定试剂盒,其特征在于,将该硝化纤维素膜置于浸溃片支持物上,并且使其在第一端与膜接触,而在第二端与吸水纸接触,并且该硝化纤维素膜在液体的迁移方向上接连地具有所述两个不同的测试区带,和具有一个能够将所述两个测试区带分开的对照区带。
13.根据权利要求12的检定试剂盒,其特征在于,所述对照区带从用胶体金颗粒标记的BSA获得。
14.根据权利要求1或2的检定试剂盒,其特征在于,所述检定试剂盒用于同时测量 β -内酰胺类、四环素类和磺酰胺类,所述反应混合物还包含特异性识别磺酰胺类并经标记的抗体,以及所述回收系统还包括固定在硝化纤维素膜上的与磺酰胺类相缀合的蛋白质制剂。
15.根据权利要求14的检定试剂盒,其特征在于,所述特异性识别磺酰胺类并经标记的抗体是直接或间接用胶体金颗粒进行标记的。
16.根据权利要求14的检定试剂盒,其特征在于,将该硝化纤维素膜置于浸溃片支持物上,并且使其在第一端与膜接触,而在第二端与吸水纸接触,并且该硝化纤维素膜在液体的迁移方向上具有接连地相继布置的三个不同测试区带和一个对照区带,或者两个对照区带,每个置于两条测试区带之间。
17.用于同时测量样品中相应于不同类型的抗生素的分析物的检定试剂盒,所述不同类型的抗生素至少为内酰胺类、四环素类和磺酰胺类,其特征在于,所述检定试剂盒包括:-一方面,单一的反应混合物,所述反应混合物待添加至所述样品以获得溶液,并且至少包含特异性识别内酰胺类的第一种经标记的受体、第二种经标记的受体和生物素化的核酸片段,从而该第二种经标记的受体以特异性和竞争性的方式在所述溶液中识别四环素和该生物素化的核酸片段,以及抗磺酰胺抗体以及直接或间接用胶体金标记的游离的磺酰胺类似物;-和另一方面,固体支持物形式的回收系统,所述回收系统待浸入所述溶液中,并且包括硝化纤维素膜,在该硝化纤维素膜上,在三个已知且不同的地方分别固着有具有β_内酰胺核的抗生素、抗生物素蛋白和针对抗磺酰胺抗体的抗体,从而使得在所述三个测试区带处在该回收系统上检测到的标记强度独立地由于每种抗生素的竞争性识别而产生。
18.根据权利要求17的检定试剂盒,其特征在于,所述第一种经标记的受体和第二种经标记的受体用胶体金颗粒直接地或者借助于抗体或与蛋白A相联合的抗体间接地进行T 己 O
19.根据权利要求1、2、5-9和17-18中任一项的检定试剂盒,其特征在于,样品是液体的,并且从奶、蜂蜜、肉、蛋或生物液体获得。
20.根据权利要求1、2、5-9和17-18中任一项的检定试剂盒,其特征在于,用于测量 β-内酰胺类或四环素类的经标记的受体分别获得自从已知类型的微生物中分离的受体 BlaR 和 TetR0
21.根据权利要求20的检定试剂盒,其特征在于,所述受体BlaR从金黄色葡萄球菌中分离,和所述受体TetR从大肠杆菌600的质粒pSClOl中分离。
22.应用根据前述权利要求中任一项的检定试剂盒的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:-将上述反应混合物与待表征的样品接触以获得溶液,让该溶液在30°C -50°C的温度下孵育3-15分钟;-将带有上述回收系统的浸溃片浸入所获得的溶液中,并允许孵育3-15分钟;-用眼睛以目测方式或者借助于浸溃片的光学读取仪来判读浸溃片上的结果。
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