CN101157921B - 培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法。该培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法，是提高目的植物中CPK4的表达量，得到抗旱和/或在逆境中延迟生长植物。本发明的培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法对作物遗传改良和农业发展有着重要的应用价值，尤其是在提高粮食、经济作物的抗旱性方面具有重要的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法。
背景技术
植物激素脱落酸(ABA)参与调控植物生长发育的很多方面，包括种子成熟和萌发，幼苗生长，开花，气孔运动；而且是植物响应干旱，高盐，低温等多种非生物胁迫中的关键植物激素。但是，ABA信号转导途径还很不清楚，需要进一步对其中的信号组分进行鉴定和研究。
钙离子在ABA信号转导中，作为第二信使起重要作用。钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)，是一类植物中研究较多的钙感受器。CDPKs是多基因家族，CPK4、CPK11、CPK3、CPK6、CPK32、CPK10和CPK30均是CDPK家族中的成员，这些成员之间存在着功能冗余和功能差异。越来越多的研究表明CDPKs不仅参与调控植物生长发育，还介导了植物对各种生物和非生物胁迫的响应。已有相关的研究表明CDPKs参与了很多激素信号转导。在玉米叶片原生质体中异源过表达CPK10和CPK30可以激活逆境和ABA响应的启动子。通过酵母双杂交发现ABF4的上游调控蛋白之一为CPK32，而且CPK32的过量表达可以加剧ABA对种子萌发的抑制作用。但是，利用遗传学手段，比如基因敲除技术，研究参与到受ABA调控的种子成熟和萌发，幼苗生长，气孔运动，植物胁迫耐受性中的特定的CDPKs，还鲜有报道。直到最近，通过CPK3和CPK6的T-DNA敲除突变体，研究了CPK3和CPK6在气孔运动中的作用，其它生理方面的功能不明显或没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法。
本发明所提供的培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法，是提高目的植物中钙依赖型蛋白激酶4(calcium-dependent protein kinase4，CPK4)的表达量，得到抗旱和/或在逆境中延迟生长植物。
所述延迟生长具体为延迟种子萌发，延迟植株的主根和/或侧根生长。
所述CPK4的氨基酸序列如GenBank Accession Number NP_192695所示，自氨基末端第1位至501位氨基酸残基。
现有的能提高植物中CPK4表达量的方法均可采用，如将CPK4的编码基因通过植物表达载体导入目的植物中。
所述CPK4的编码基因具体可通过重组植物表达载体pCAMBIA-35S-CPK4导入目的植物中；所述pCAMBIA-35S-CPK4是将所述CPK4的编码基因插入pCAMBIA-1304的多克隆位点得到的。
所述pCAMBIA-35S-CPK4可按照以下方法构建：以拟南芥Col(Columbia)的总RNA反转录得到的双链cDNA为模板，PCR扩增出CPK4的开放阅读框架，该开放阅读框架的核苷酸序列是GenBank Accession Number ATU31752的自5′端第1位到第1506位脱氧核苷酸，上游引物为(序列为5’-GCTCTAGAATGGAGAAACCAAACCCTAG-3’)，下游引物为(序列为5’-CGGGATCCTTACTTTGGTGAATCATCAGA-3’)。通过Xhol和BamH1双酶切后，连接到过表达载体pCAMBIA-1304上，得到pCAMBIA-35S-CPK4。
ABA是调节植物种子发育、幼苗生长、叶片气孔行为的关键激素，并在植物对干旱等逆境胁迫的反应和适应中起着关键的作用。因此，对于ABA信号转导途径中的信号组分进行鉴定和研究非常重要。操纵CPK4和CPK11的表达水平可以调控植物体一系列生理、生化过程和一批应答的基因表达，从而调节植物的生长发育，提高植物体对干旱等逆境胁迫的抗性。实验证明，CPK4过表达植株与出发植株(用于导入外源CPK4编码基因的植株)相比，其抗旱性明显增强，种子萌发明显延迟，幼苗的主根和侧根生长明显受到抑制。其中，延迟植物生长，可使植株顺利渡过逆境，如倒春寒，春季天气回暖过程中，常因冷空气的侵入，使气温明显降低，对作物造成危害，这种“前春暖，后春寒”的天气称为倒春寒。倒春寒对早稻、棉花、花生等农作物生产非常不利，通过延迟作物生长，可以明显提高植株抗寒性。另外，在干旱的逆境条件下，延迟作物生长，可以降低蒸腾作用，有利于植物体内水分的保持，从而也可以提高作物的耐旱性。本发明的培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法对作物遗传改良和农业发展有着重要的应用价值，尤其是在提高粮食、经济作物的抗旱性方面具有重要的实用价值。
附图说明
图1为Western blot鉴定野生型哥伦比亚生态型拟南芥和草丁磷筛选阳性转pCAMBIA-35S-CPK4 T3代植株中的CPK4和CPK11的总表达量。
图2为干旱处理的野生型哥伦比亚生态型拟南芥和CPK4过表达植株的照片
图3为干旱处理的野生型哥伦比亚生态型拟南芥和CPK4过表达植株的失水率曲线
图4为CPK4和CPK11的T-DNA插入突变体的T-DNA插入位置示意图和mRNA表达水平检测
A为cpk4-1(生态型为Columbia，SALK_081860)中T-DNA序列插入位置。
B为cpk11-1(SALK_023086)和cpk11-2(SALK_054495)中T-DNA序列插入位置。
C为利用RT-PCR分析在野生型Col，突变体cpk4-1，cpk11-1和cpk11-2，双突变纯合体cpk4-1cpk11-1和cpk4-1cpk11-2中，CPK4和CPK11这两个基因的表达情况。以Atcin2/8的表达水平作为对照。
图5为ABA激活CPK4和CPK11
A为ABA处理提高了CPK4和CPK11的蛋白含量。
B为ABA处理提高了CPK4和CPK11的激酶活性。
图6为CPK4或CPK11都可以体外磷酸化ABF1和ABF4
A总蛋白中可以磷酸化ABF1的蛋白激酶。
B总蛋白中可以磷酸化ABF4的蛋白激酶。
CCPK4和CPK11为体外磷酸化ABF1的蛋白激酶。
DCPK4和CPK11为体外磷酸化ABF4的蛋白激酶。
图7为野生型哥伦比亚生态型拟南芥和CPK4过表达植株中ABA响应基因的表达情况
图8为在用0.5μmol/L的2-顺式(+)-ABA模仿的逆境中，CPK4过表达植株与野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比，延迟萌发
图9为在用0.5-5μmol/L的2-顺式(+)-ABA模仿的逆境中，CPK4过表达植株与野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比，幼苗的生长明显受到抑制
图10为图9实验中，在含有0、1、5、10、20、40μmol/L 2-顺式(+)-ABA)的MS培养基上生长10天后的幼苗的主根长度
图11为CPK4过表达植株与野生型哥伦比亚生态型拟南芥在含有1μmol/L 2-顺式(+)-ABA)的培养基中生长10天后的幼苗的侧根生长情况
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的ABA均为2-顺式(+)-ABA(Sigma)。
下述实施例中所用的植物生长条件如下：
培养箱的生长条件为：温度为20-21℃，光照强度为80uM光子m-2s-1，光照周期为16hr/天；温室的生长条件为：温度为22℃，光照强度为120uM光子m-2s-1，光照周期为16hr/天。
实施例1、培育抗旱和在逆境中延迟生长的植物
一、提高目的植物中CPK4的表达量
1、构建CPK4过表达载体pCAMBIA-35S-CPK4
以哥伦比亚生态型拟南芥(Columbia，Col)的总RNA反转录得到的双链cDNA为模板，PCR扩增出CPK4开放阅读框架。用于PCR扩增的上游引物p1为(序列为5’-CATGCCATGGCGATGGAGAAACCAAACCCTAG-3’)(序列表中的序列1)，下游引物p2为(序列为5’-GAAGATCTTTACTTTGGTGAATCATCAGA-3’)(序列表中的序列2)。按照常规方法对该PCR产物进行测序，测序结果表明该PCR产物的核苷酸序列是GenBank Accession Number为ATU31752的自5′端第1位到第1506位脱氧核糖核苷酸。将该PCR产物和
pCAMBIA-1304(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.h tml)分别用Nco1和Bgl11双酶切后，用T4DNA连接酶将该PCR产物插入pCAMBIA-1304的Ncol和Bgl11位点间，得到重组表达载体pCAMBIA-35S-CPK4。经Nco1和Bgl11酶切鉴定和PCR鉴定及测序验证，pCAMBIA-35S-CPK4中的CPK4基因开放阅读框架的核苷酸序列正确。
2、CPK4过表达植株的获得
将pCAMBIA-35S-CPK4通过花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998，16∶6，735-743)利用根癌农杆菌菌株GV3101转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥，对得到的T0代转pCAMBIA-35S-CPK4植株用除草剂草丁磷(basta，购自INVITROGEN公司)筛选转化苗。共得到了34株草丁磷筛选阳性转pCAMBIA-35S-CPK4 T0代植株。
收获上述T0代草丁磷筛选阳性植株的所结种子(T1代种子)，种植收获T1代植株所结的种子(T2代种子)，种植收获T2代植株所结的种子(T3代种子)。
T3代纯合体(将T2代种子分离比为3∶1的草丁磷筛选阳性株系收到的T3代种子在抗生素上进行筛选，没有分离表明为纯合体)种子进行下述实验。
CPK4和CPK11的氨基酸序列有94％的同源性，而且都是可溶性蛋白，分布在细胞质和细胞核中。很难制备出分别针对CPK4或CPK11的特异抗体。以CPK4和CPK11的C-端为抗原，制备了抗体anti-CPK4C，可以识别CPK4和CPK11。
其中，抗体anti-CPK4C按照如下方法制备：以哥伦比亚生态型拟南芥(Columbia，Col)的总RNA反转录得到的双链cDNA为模板，利用上游引物：(序列为5’-CCGGAATTCATGGCTTGCACAGAGTTTGGTCT-3’)；和下游引物：(5’-ACGCGTCGACTTACTTTGGTGAATCATCAGA-3’)PCR扩增CPK11的C-端116个氨基酸(从386到501氨基酸)的cDNA片段，该cDNA片段的序列是GenBank AccessionNumber AY050981的自5′端第1156位到第1506位脱氧核糖核苷酸。将该cDNA片段插入原核表达载体pGEX4T-1的EcoR1和Sal1位点间，在大肠杆菌中诱导表达出融合蛋白GST-CPK4C。将GST-CPK4C免疫兔子，获得兔血清，通过进一步的亲和纯化得到抗体anti-CPK4C。
用Western blot鉴定野生型哥伦比亚生态型拟南芥、草丁磷筛选阳性转pCAMBIA-35S-CPK4 T3代纯合体植株中的CPK4和CPK11的总表达量。该Western blot鉴定方法为：提取10株野生型哥伦比亚生态型拟南芥、20株草丁磷筛选阳性转pCAMBIA-35S-CPK4 T3代纯合体植株粗蛋白，然后进行SDS-PAGE，以抗体anti-CPK4C为一抗进行免疫印迹(免疫印迹按照文献Zhang，D.P.，Wu，Z.Y.，Li，X.Y.&Zhao，Z.X.Purification and identification of a 42-kilodalton abscisicacid-specifie-binding protein from epidermis of broad bean leaves.Plantphysiol.128，714-725(2002)描述的方法进行)，印迹条带强度由电子成像系统扫描确定。同时以Tubulin的表达水平作为对照。结果表明20株草丁磷筛选阳性转pCAMBIA-35S-CPK4 T3代纯合体植株的CPK4和CPK11的总表达量均高于10株野生型哥伦比亚生态型拟南芥，其中的一个株系的结果见图1，该阳性转pCAMBIA-35S-CPK4 T3代纯合体植株为CPK4过表达植株；所有植株的Tubulin表达水平一致。图1中的Col表示野生型哥伦比亚生态型拟南芥，其下面的数值100为野生型哥伦比亚生态型拟南芥CPK4和CPK11的总表达量；40E12表示草丁磷筛选阳性转pCAMBIA-35S-CPK4 T3代纯合体植株，其下面的数值220为阳性转pCAMBIA-35S-CPK4 T3代纯合体植株第12号株系中CPK4和CPK11的总表达量。
二、CPK4过表达植株抗旱效果
该实验中CPK4过表达株系均做了10个株系，都得到了一致的结果。下面仅以第12号株系中为例显示该结果。
将野生型哥伦比亚生态型拟南芥种子、步骤一中的CPK4过表达植株所结的种子，播于MS培养基上(Sigma，货号#，M5524)，先置于4℃春化3天，然后放于20℃的光照条件下生长7-10天，然后移到装有8厘米混合肥的盆中，再生长15天，当幼苗具有5-6片完全伸展的叶片时，停止浇水18天，复水后两天，统计株系的存活率，留一半苗子正常浇水作为对照。每个处理100株，三个重复。结果表明干旱处理的野生型哥伦比亚生态型拟南芥的存活率为60％±7％(平均值±标准差)，作为对照的野生型哥伦比亚生态型拟南芥的存活率为100％；干旱处理的CPK4过表达植株的存活率为100％±5％(平均值±标准差)，作为对照的CPK4过表达植株的存活率为100％。T-检测的结果表明：干旱处理的CPK4过表达植株的存活率和干旱处理的野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比有显著的差异(P＜0.05)。从外观上观察，干旱处理后CPK4过表达植株能够正常生长，但是野生型哥伦比亚生态型拟南芥叶片萎蔫甚至死亡(图2)。图2中的Col表示野生型哥伦比亚生态型拟南芥；40E12表示CPK4过表达植株。
将野生型哥伦比亚生态型拟南芥种子、步骤一中的CPK4过表达植株所结的种子种子播于MS培养基上(Sigma，货号#，M5524)，先置于4℃春化3天，然后放于20℃、每天16小时光照、8小时黑暗的光照条件下生长7-10天，然后移到装有8厘米混合肥的盆中，再生长2-3周，将莲座叶从根部被取下，置于滤纸上，放在通风橱中，每隔半小时测定一次鲜重，共测定6小时，统计鲜重损失。每个处理100株，三个重复。用失水率(失水率＝失水处理前的鲜重-失水处理后的鲜重/失水处理前的鲜重)衡量鲜重损失。结果如图3所示，表明CPK4过表达植株的失水率一直低于野生型哥伦比亚生态型拟南芥。T-检测的结果表明失水处理6小时，CPK4过表达植株的失水率和野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比有显著的差异(P＜0.05)。失水处理6小时，CPK4过表达植株、野生型哥伦比亚生态型拟南芥的失水率分别为25％±5％(平均值±标准差)，45％±7％(平均值±标准差)。图3中的Col表示野生型哥伦比亚生态型拟南芥。
三、CPK4过表达植株的抗旱机理
1、ABA激活CPK4
1)CPK4和CPK11的T-DNA敲除突变体的获得
从Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)的T-DNA插入突变体库中购买了CPK4的T-DNA插入突变体，cpk4-1(SALK_081860)，两个CPK11的T-DNA插入突变体，cpk11-1(SALK_023086)，cpk11-2 SALK_054495)。在cpk4-1中，两个拷贝的T-DNA序列以反向串联的方式插入到CPK4基因的5’-非翻译区，具体的插入位置在启始密码子ATG上游67和57之间，插入导致11bp的缺失(图4中A)。在cpk11-1中，两个拷贝的T-DNA序列以反向串联的方式插入到CPK11基因的5’-非翻译区，具体的插入位置在启始密码子ATG上游120和87之间，插入导致34bp的缺失。在cpk11-2中，单拷贝的T-DNA序列插入到CPK11基因的第一个外显子区，具体的插入位置在启始密码子ATG下游320和358之间，插入导致39bp的缺失(图4中B)。三个突变体的生态型都是Columbia(Col)。所有突变体都通过PCR鉴定，PCR产物测序，分析插入的具体位置，并且以T-DNA上特异的序列为探针进行Southern杂交分析T-DNA序列插入的拷贝数。
对于串联插入的cpk4-1，cpk11-1，还以杂合体在抗生素Kan上的分离比进行了确认。cpk4-1，cpk11-1的杂合体在卡那霉素(50ug/mL)上的分离比为3∶1。而且从cpk4-1和cpk11-1杂交的512株F2代植株中鉴定出30株(1/16)cpk4-1cpk11-1纯合体。这些实验结果表明cpk4-1和cpk11-1的基因组中T-DNA序列是单一位置插入的。
通过RT-PCR分析，发现cpk4-1中的CPK4基因和cpk11-1和cpk11-2中的CPK11基因是完全敲除的，而且不影响另外一个基因(cpk4-1中的CPK11，cpk11-1和cpk11-2中的CPK4)的表达(图4中C)。该RT-PCR分析中用于扩增CPK4的引物为下述LP2和RP2；用于扩增野生型哥伦比亚生态型拟南芥(Col)、cpk4-1、cpk11-1、cpk11-2、cpk4-1cpk11-1和cpk4-1cpk11-2中CPK11的引物为下述LP1和RP1。该RT-PCR分析以Atcin2/8的表达水平作为对照。
其中，上述T-DNA插入突变体cpk4-1按照以下方法获得：从ArabidopsisBiological Resource Center(ABRC)处购买到SALK Institute(http://signal.salk.edu/)提供的生态型为Columbia的CPK4 gene(At4g09570，CPK4)的T-DNA突变体种子。通过一系列方法鉴定出纯合体。首先以基因组DNA为模板，进行PCR鉴定，所用的PCR引物组合分别为：T-DNA序列的左端引物或右端引物与CPK4基因的左端引物，T-DNA左端引物与CPK4基因的右端引物，CPK4基因的左端引物与右端引物。这些引物的核酸序列如下：T-DNA左端引物(LBa1)：
5’-GGTTCACGTAGTGGGCCATC-3’；T-DNA的右端引物(RBa1)：
5’-GTTTCTGACGTATGTGCTTAGC-3’。对于CPK4，左端引物(LP2)：
5’-AATCCGACTTACTTTGGTTAGAA-3’；右端引物(RP2)：
5’-GCTTAGCATCATCACTGGGAC-3’。
对于CPK11，左端引物(LP1)：5’-GAGAGAGTCAAAAAAATTGGAGAA-3’，(LP3)：
5’-TGGGATGAAAACACACAAGCGG-3’；右端引物(RP1)：
5’-AAACCAATTAGGCGATGAACC-3’。
另外，通过PCR产物测序，Southern杂交，对T-DNA插入突变体进一步鉴定。最后，筛选出CPK4基因的一个T-DNA插入纯合体，SALK_081860，命名为cpk4-1。两个CPK11基因的一个T-DNA插入纯合体，SALK_023086和SALK_054495，分别命名为cpk11-1和cpk11-2。通过杂交和上述的PCR鉴定方法，获得了双突变纯合体：cpk4-1cpk11-2和cpk4-1cpk11-1。
2)ABA激活CPK4和CPK11
在不同浓度ABA处理实验中，普通MS培养基上生长的幼苗，在48h后移到含有不同浓度ABA(0，0.5，1，2，5uM)平板上。10天后，取样提总蛋白。用anti-CPK4C的抗体检测Col中的CPK4和cpk11-2中的CPK4(图5中A左侧，用‘CPK4 in cpk11-2’表示)。上样量为20ug总蛋白。
用Western blot鉴定各个处理的野生型哥伦比亚生态型拟南芥、cpk4-1和cpk11-2中的CPK4和CPK11的表达量。每个处理10株。该Western blot鉴定方法为：提取各个处理植株的粗蛋白，然后进行SDS-PAGE，以抗体anti-CPK4C为一抗进行免疫印迹(免疫印迹按照文献Zhang，D.P.，Wu，Z.Y.，Li，X.Y.&Zhao，Z.X.Purification and identification of a 42-kilodalton abscisicacid-specific-binding protein from epidermis of broad bean leaves.Plantphysiol.128，714-725(2002)描述的方法进行)，印迹条带强度由电子成像系统扫描确定。同时以Tubulin的表达水平作为对照。
胶内磷酸化分析时，用anti-CPK4C的抗体从cpk11-2中沉淀下相应的CPK4((A)左侧)。样品量为50ug总蛋白。在ABA处理的时间效应中，用50uM ABA处理生长三周的cpk11-2和cpk4-1，相应的时间(0，30，60，120，300min)取样，提取总蛋白。按照前面所述的方法，从cpk11-2中检测CPK4。从cpk11-2中沉淀下相应的CPK4，然后做胶内磷酸化分析。以Tubulin为上样对照。其中，在免疫沉淀之前，先用总蛋白做anti-Tubulin免疫印迹。以0uMABA或0min处理时的条带强度为对照(100)，表示出条带的相对强弱。三次重复实验结果一致。
利用外源ABA处理并不是很明显地影响CPK4和CPK11的mRNA的表达。但是，ABA处理可以明显地提高CPK4的蛋白含量，以及激酶活性。这种激活作用具有ABA浓度效应(图5中A和B)。在ABA浓度为1uM的平板上处理时，激活效果最为明显；更高的ABA浓度处理反而会降低这种激活效应。这一点可以从生理上这样解释，即逆境胁迫下，可以引起体内ABA水平的变化程度与1uM ABA处理时引起内源ABA水平变化程度相当；而更高浓度的处理会对ABA的响应产生不利影响。同时，ABA激活作用具有时间效应，ABA喷施处理后，在60到120分钟具有最明显的激活。图5中的Col表示野生型哥伦比亚生态型拟南芥中CPK4和CPK11的总表达量的平均值，以ABA处理0小时的表达量作为基准，计为100；CPK4(in cpk11-2)表示cpk11-2中的CPK4表达量的平均值，以ABA处理0小时的表达量作为基准，计为100；CPK11(in cpk4-1)表示cpk4-1中的CPK4表达量，以ABA处理0小时的表达量作为基准，计为100。
2、CPK4可以体外磷酸化参与ABA响应的转录因子ABF1和ABF4
之前的研究表明，ABA响应的转录因子，ABF1，ABF2，ABF3，ABF4通过被上游的蛋白激酶磷酸化激活参与ABA信号转导。为了研究ABFs是否也参与了CPK4介导的ABA信号转导通路中。首先通过ABF1-和ABF4-in-gel phosphorylation，分析野生型Col和突变体cpk4-1cpk11-2中可以磷酸化ABF1和ABF4的蛋白激酶的变化。
1)ABF1和ABF4的融合蛋白的表达
以哥伦比亚生态型拟南芥(Columbia，Col)的总RNA反转录得到的双链cDNA为模板，利用PCR扩增ABF1和ABF4的cDNA全长，PCR引物为：对于ABF1，正向引物：
5’-CGGGATCCGATGGGTACTCACATTGATATC-3’，反向引物：
5’-CCCAAGCTTTTACCACGGACCGGTAAGGGTTC-3’。对于ABF4，正向引物：
5’-GGAATTCTATGGGAACTCACATCAATTTCAAC-3’，反向引物：
5’-CCGCTCGAGTCACCATGGTCCGGTTAATGTCCT-3’。将ABF1和ABF4的PCR产物分别插入原核表达载体pET48b(+)(Novagen)的限制性内切酶EcoR1和Sal1位点间，得到含有ABF1的重组表达载体pET-ABF1，含有ABF4的重组表达载体pET-ABF4。将pET-ABF1和pET-ABF4分别转化E coli.BL21(DE3)，并进行诱导表达。通过镍柱(Novagen)纯化，得到ABF1的融合蛋白His-ABF1和ABF4的融合蛋白His-ABF4。更换缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5)后，分装成小份，保存于-80℃备用。
2)体外磷酸化实验
用50uM ABA处理生长三周的Col、cpk4-1、cpk11-2和cpk4-1cpk11-2的幼苗120min。取样，提取总蛋白。每个处理10株。提取经ABA和未经ABA处理的植株的总蛋白，在包埋有0.5mg/ml His-ABF1或His-ABF4的分离胶内进行12％SDS-PAGE电泳。电泳后，将凝胶放入洗涤缓冲液(50mmol/L Tris-Cl pH8.0，1mmol/L DTT，20％丙醇)室温下洗两次，每次1h，洗去SDS-PAGE胶内的SDS；接着再用变性缓冲液(50mmol/L Tris-Cl pH8.0，0.1mmol/L EDTA，5mmol/L巯基乙醇，6mol/L盐酸胍)洗涤1h；随后4℃轻摇过夜复性，复性缓冲液为：50mmol/L Tris-Cl pH8.0，0.1mmol/L EDTA，5mmol/L巯基乙醇，0.04％(v/v)Tween20。期间至少换洗6次，每次3h。然后在室温下进行预反应30min，预反应液为：40mmol/L Hepes-NaOH pH7.5，0.45mmol/L EGTA，0.55mmol/L CaCl2，10mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT；再在反应液中室温下进行磷酸化反应1小时，反应液为：40mmol/L Hepes-NaOH pH7.5，0.45mmol/L EGTA，0.55mmol/L CaCl2，10mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT 20μmol/L ATP和8μCi/ml[32-P]ATP(5000Ci/mmol)。反应结束后，在室温下用5％三氯乙酸/1％焦磷酸钠溶液洗胶直至溶液中不再有放射性。胶版染色、脱色、制干胶后，进行放射自显影。结果表明ABA不处理时，ABF1可以被分子量为58kD的蛋白激酶磷酸化，而ABF4可以被分子量为58kD和67kD的蛋白激酶磷酸化。ABA处理后，至少增加了两个可以磷酸化ABF1和ABF4的蛋白激酶，它们的分子量为42kD，44kD(图6中A和B)。其中，58kD处的蛋白激酶可能是CPK4和CPK11，在双突变体中，58kD这一位置的磷酸化信号明显降低。
用50uM(±)ABA处理生长三周的Col、cpk4-1、cpk11-2和cpk4-1cpk11-2的120min.取样，提取总蛋白。总蛋白(50ug/mL)加入到0.5mL免疫沉淀缓冲液中。免疫沉淀缓冲液组成：20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM EGTA，1mMNa3V04，1mM NaF，10mM b-glycerophosphate，1mM phenylmethylsulfonylfluoride，5μg mL-1antipain，5μg mL-1aprotinin，5μg mL-1leupeptin，and 0.5％Triton X-100。加入anti-CPK11(3ug)，或同样量的免疫前兔血清(作为对照)，4℃孵育2h。加入25ul Protein A-agarose，继续孵育2h。低速离心，并用免疫沉淀缓冲液洗三次，用于激酶活性分析。
在包埋有0.5mg/ml His-ABF1或His-ABF4的分离胶内进行12％SDS-PAGE电泳。电泳后，将凝胶放入洗涤缓冲液(50mmol/L Tris-Cl pH8.0，1mmol/L DTT，20％丙醇)室温下洗两次，每次1h，洗去SDS-PAGE胶内的SDS；接着再用变性缓冲液(50mmol/L Tris-Cl pH8.0，0.1mmol/L EDTA，5mmol/L巯基乙醇，6mol/L盐酸胍)洗涤1h；随后4℃轻摇过夜复性，复性缓冲液为：50mmol/L Tris-Cl pH8.0，0.1mmol/L EDTA，5mmol/L巯基乙醇，0.04％(v/v)Tween20。期间至少换洗6次，每次3h。然后在室温下进行预反应30min，预反应液为：40mmol/L Hepes-NaOH pH7.5，0.45mmol/L EGTA，0.55mmol/L CaCl2，10mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT；再在反应液中室温下进行磷酸化反应1小时，反应液为：40mmol/L Hepes-NaOH pH7.5，0.45mmol/L EGTA，0.55mmol/L CaCl2，10mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT 20μmol/L ATP和8μCi/ml[32-P]ATP(5000Ci/mmol)。反应结束后，在室温下用5％三氯乙酸/1％焦磷酸钠溶液洗胶直至溶液中不再有放射性。胶版染色、脱色、制干胶后，进行放射自显影。
结果表明和CPK4可以明显地磷酸化ABF1和ABF4，并且在双突变体中CPK4和CPK11引起的磷酸化条带完全消失(图6中C和D)。图6中，+ABA表示用50μMμM ABA处理，-ABA表示未经ABA处理；图6中C和D的相对酶活由电子成像系统扫描条带强度确定，以Col中CPK4和CPK11的总量为100％，其它与之相比得到相对值。
以上数据表明，受ABA激活的CPK4和CPK11(图5和图6)，可能通过磷酸化并激活ABF1和ABF4，包括其它ABFs，传递信号。值得注意的是，其它蛋白激酶，甚至是其它分子量为58kD的除CPK4和CPK11外的蛋白激酶也可能参与了ABFs磷酸化调控(图6中A和B)。
3、CPK4的过表达影响ABA相应基因的表达
对CPK4过表达植株中，ABA诱导基因的表达进行了检测，包括RD29A(Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1994).A novel cis-actingelement in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought.low-temperature，or high-salt stress.Plant Cell6，251-264.)，RAB18(Lang，V.and Palva，E.T.(1992).The expression of a rab-related gene，rab18，isinduced by abscisic acid during the cold acclimation process of Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.Plant Mol.Biol.20，951-962.)，KIN1和KIN2(Kurkela，S.and Borg-Franck，M.(1992).Structure and expression of kin2，one of twocold-and ABA-induced genes of Arabidopsis thal iana.Plant Mol.Biol.19.689-692.)，ERD10(Kiyosue，T.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1994).Characterization of two cDNAs(ERD10 and ERD14)corresponding togenes that respond rapidly to dehydration stress in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol.35，225-231.)，。结果表明除了ABI4外，所有上述基因的表达都受到了ABA的诱导；与野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比，CPK4过表达植株中RD29A、RAB18，KIN1和KIN2的表达量明显上调；但是，CPK4的过表达，不影响ERD10的表达(图7)。图7中，+ABA表示用50μM ABA处理4小时，-ABA表示未经ABA处理。
利用实时定量PCR检测ABA响应基因的表达情况。除了分析ABI3的表达量是将生长4天的幼苗移到含或不含50μM ABA的平板上生长5天后，取样外，其它基因的取样如下：用50μM ABA(mixed isomers；Sigma，St.Louis，MO)处理三周龄的苗子。利用the RNasy Plant Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)提取植物总RNA，用the Superscript II RT kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)反转录得到cDNA单链。反转录体系为25ul，42℃，1h。制备得到cDNA模板。ABA相关基因的PCR分析的引物为：RD29A(At5g52310)正向引物5’ATCACTTGGCTCCACTGTTGTTC-3’和反向引物5’-ACAAAACACACATAAACATCCAAAGT-3’；MYB2(At2g47190)正向引物
5’-TGCTCGTTGGAACCACATCG-3’和反向引物5’-ACCACCTATTGCCCCAAAGAGA-3’；
MYC2(At1g32640)正向引物5’-TCATACGACGGTTGCCAGAA-3’和反向引物
5’-AGCAACGTTTACAAGCTTTGATTG-3’；RAB18(At5g66400)正向引物
5’-CAGCAGCAGTATGACGAGTA-3’和反向引物5’-CAGTTCCAAAGCCTTCAGTC-3’；
KIN1(At5g15960)正向引物5’-ACCAACAAGAATGCCTTCCA-3’和反向引物
5’-CCGCATCCGATACACTCTTT-3’；KIN2(At5g15970)正向引物
5’-ACCAACAAGAATGCCTTCCA-3’和反向引物5’-ACTGCCGCATCCGATATACT-3’；
ERD10(At1g20450)正向引物5’-TCTCTGAACCAGAGTCGTTT-3’和反向引物
5’-CTTCTTCTCACCGTCTTCAC-3’；ABI1(At4g26080)正向引物
5-AGAGTGTGCCTTTGTATGGTTTTA-3’和反向引物
5’-CATCCTCTCTCTACAATAGTTCGCT-3’；ABI2(At5g57050)正向引物
5’-GATGGAAGATTCTGTCTCAACGATT-3’和反向引物
5’-GTTTCTCCTTCACTATCTCCTCCG-3’；ABI3(At3g24650)正向引物
5’-TCCATTAGACAGCAGTCAAGGTTT-3’和反向引物
5’-GGTGTCAAAGAACTCGTTGCTATC-3’；ABI4(At2g40220)正向引物
5’-GGGCAGGAACAAGGAGGAAGTG-3’和反向引物
5’-ACGGCGGTGGATGAGTTATTGAT-3’；ABI5(At2g36270)正向引物
5’-CAATAAGAGAGGGATAGCGAACGAG-3’和反向引物
5’-CGTCCATTGCTGTCTCCTCCA-3’；ABF1(At1g49720)正向引物
5’-TCAACAACTTAGGCGGCGATAC-3’和反向引物5’-GCAACCGAAGATGTAGTAGTCA-3’；
ABF2(At1g45249)正向引物5’-TTGGGGAATGAGCCACCAGGAG-3’和反向引物
5’-GACCCAAAATCTTTCCCTACAC-3’；ABF3(At4g34000)正向引物
5’-CTTTGTTGATGGTGTGAGTGAG-3’和反向引物5’-GTGTTTCCACTATTACCATTGC-3’；
ABF4(At3g19290)正向引物5’-AACAACTTAGGAGGTGGTGGTC-3’和反向引物
5’-CTTCAGGAGTTCATCCATGTTC-3’。以拟南芥中Actin2/8基因的表达水平作为对照，按照上述方法进行实时定量PCR。CPK4过表达植株和野生型哥伦比亚生态型拟南芥重复处理三次，每次重复10株，重复PCR检测三次。
四、CPK4过表达植株在逆境中延迟生长的效果
该实验中CPK4过表达株系均做了10个株系，都得到了一致的结果。下面仅以其中一个株系为例显示该结果。
该实验中用外源ABA模拟逆境，测定CPK4过表达植株在逆境中的生长情况，结果表明1μmol/L的2-顺式(+)-ABA使CPK4过表达植株延迟萌发，0.5-5μmol/L的2-顺式(+)-ABA延迟CPK4过表达植株幼苗的生长。在实际应用中，可通过提高作物中CPK4的表达量，延迟作物的种子萌发和生长，使植株顺利渡过逆境，如倒春寒。其中，延迟植物生长，可使植株顺利渡过逆境，如倒春寒，春季天气回暖过程中，常因冷空气的侵入，使气温明显降低，对作物造成危害，这种“前春暖，后春寒”的天气称为倒春寒。倒春寒对早稻、棉花、花生等农作物生产非常不利，通过延迟作物生长，可以明显提高植株抗寒性。另外，在干旱的逆境条件下，延迟作物生长，可以降低蒸腾作用，有利于植物体内水分的保持，从而也可以提高作物的耐旱性。
1、延迟萌发
将野生型哥伦比亚生态型拟南芥种子(Col)、步骤一中的CPK4过表达植株所结的种子，播于MS培养基上(Sigma，货号#，M5524)，培养基中加入0.5μmol/L的2-顺式(+)-ABA(Sigma)，先置于4℃春化3天，然后放于20℃的光照条件下生长24、36、48、60或72小时后，统计萌发(以胚根出现为标准)情况，计算种子萌发率(种子萌发率＝已萌发的种子数/种子总数)。每个处理100株。结果如图8所示，结果表明经0.5μmol/L的2-顺式(+)-ABA处理，CPK4过表达植株与野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比，延迟种子萌发。图8中的Col表示野生型哥伦比亚生态型拟南芥；4OE12表示CPK4过表达植株。
2、延迟幼苗生长
将野生型哥伦比亚生态型拟南芥种子(Col)、步骤一中的CPK4过表达植株所结的种子，在普通MS培养基上层积萌发48小时，然后移到含有不同浓度的2-顺式(+)-ABA(0、0.5、1、3、5、10、20、40或80μmol/L)的MS培养基上，进行垂直培养。10天后拍照记录，用标尺测量各植株的主根长度，统计幼苗生长情况。每个处理100株。结果如图9和图10所示，表明CPK4过表达植株与野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比，幼苗的生长明显受到抑制。图9和图10中的Col表示野生型哥伦比亚生态型拟南芥；4OE12表示CPK4过表达植株。
将野生型哥伦比亚生态型拟南芥种子(Col)、步骤一中的CPK4过表达植株所结的种子，在普通MS培养基上层积萌发48小时，然后移到MS培养基上，进行垂直培养4天后，移到含有1μmol/L 2-顺式(+)-ABA的培养基上(其组成为MS基本培养基，4％蔗糖，1.2％琼脂，以及1.0mM CaCl2，0.5mM MgSO4，0.4mM KH2PO4，6.0mM KNO3，7.0mM NH4NO3和1μmol/L 2-顺式(+)-ABA；其pH为5.7)生长10天后，拍照，用标尺测量各植株的侧根长度，统计幼苗生长情况，同时以移到不含2-顺式(+)-ABA的培养基上(其组成为MS基本培养基，4％蔗糖，1.2％琼脂，pH5.7，以及1.0mM CaCl2，0.5mM MgSO4，0.4mM KH2PO4，6.0mM KNO3和7.0mM NH4NO3；其pH为5.7)的植株作为对照。每个处理100株。结果如图11所示，表明CPK4过表达植株与野生型哥伦比亚生态型拟南芥相比，幼苗的侧根生长明显受到抑制。图11中，Col表示野生型哥伦比亚生态型拟南芥，40E12表示CPK4过表达植株；上部图片为植株照片；下部图片为每株幼苗侧根长度总和，其中左侧的柱为对照，右侧的柱为1μmol/L 2-顺式(+)-ABA处理。
以上的实验中，通过胶内磷酸化试验，发现拟南芥植株中的CPK4可以被外源ABA处理激活。利用T-DNA插入突变纯合体，发现在种子萌发，幼苗生长等方面都表现出ABA脱敏的表型。另外，CPK4的过表达植株则与突变体相反，表现为对ABA超敏。为了进一步研究这个CDPKs在ABA信号通路中的分子机制，借助于体外磷酸化试验，发现CPK4和可以磷酸化已知的参与ABA信号通路的转录因子ABF1和ABF4；并且CPK4突变体和过表达植株中ABA相关的下游基因的表达水平受到了相应的影响，说明CPK4可能通过调控ABFs，介导了ABA信号转导通路。以上实验结果证明，CPK4是植物体内CDPK/Ca2+介导的ABA信号通路中重要的正向调控因子。
序列表
<160>2
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
catgccatgg cgatggagaa accaaaccct ag 32
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gaagatcttt actttggtga atcatcaga 29
Claims (5)
1.一种培育抗旱和/或在逆境中延迟生长植物的方法，是提高目的植物中CPK4的表达量，得到抗旱和/或在逆境中延迟生长植物；所述CPK4的氨基酸序列如GenBankAccession Number NP_192695所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述延迟生长为延迟种子萌发。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述延迟生长为延迟植株的主根和/或侧根生长。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中CPK4的表达量方法为将所述CPK4的编码基因通过植物表达载体导入所述目的植物中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述CPK4的编码基因通过重组植物表达载体pCAMBIA-35S-CPK4导入目的植物中；所述pCAMBIA-35S-CPK4是将所述CPK4的编码基因插入pCAMBIA-1304的多克隆位点得到的。
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| 段金秀,等.钙依赖蛋白激酶基因表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化.草业科学24 3.2007,24(3),51-55. * |
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