CN101140269A - 一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法，其特征在于采用高效液相色谱法，以磷酸溶液和乙腈为流动相，以没食子酸为对照品，进行制剂鞣质的检测分析；其中磷酸溶液是磷酸与水体积比为1∶10000－4∶10000的溶液；通过实验确证，本申请检测分析方法比现有技术中鞣质的检测分析方法灵敏度要高。

Description

一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法。

本发明含有丹参的药物制剂包括以丹参单味药制备的药物制剂，比如丹参注射液等制剂。

背景技术

鞣质(tannins)又称单宁，是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。鞣质广泛存在于植物界，约70％以上的生药中含有鞣质类化合物，尤以在裸子植物及双子叶植物的杨柳科、山毛榉科、蓼科、蔷薇科、豆科、桃金娘科和茜草科中为多。鞣质存在于植物的皮、木、叶、根、果实等部位，树皮中尤为常见，某些虫瘿(galls)中含量特别多，如五倍子所含鞣质的量可高达70％以上。在正常生活的细胞中，鞣质仅存在于液泡中，不与原生质接触，大多呈游离状态存在，部分与其它物质(如生物碱类)结合而存在；鞣质具收敛性，内服可用于治疗胃肠道出血，溃疡和水泻等症；外用于创伤、灼伤，可使创伤后渗出物中蛋白质凝固，形成痂膜，可减少分泌和防止感染，鞣质能使创面的微血管收缩，有局部止血作用，鞣质能凝固微生物体内的原生质，故有抑菌作用，有些鞣质具抗病毒作用，如贯众能抑制多种流感病毒。鞣质可用作生物碱及某些重金属中毒时的解毒剂。鞣质具较强的还原性，可清除生物体内的超氧自由基，延缓衰老。此外，鞣质还有抗变态反应、抗炎、驱虫、降血压等作用。

鞣质虽然具有一定的药理作用，但由于其分子量较大、分子量不等，结构复杂，在水或乙醇中成胶体溶液，能够与蛋白质结合，生成不溶于水的沉淀，因此，在中药有些制剂中(水针剂、输液剂、粉针剂、滴眼剂等)，必须设法除尽，主要原因是鞣质能够产生很大的副作用，比如疼痛等(分析其原因，当含有鞣质制剂与肌肉接触后，鞣质与组织中的蛋白质结合成不溶性的鞣质蛋白，鞣质蛋白难于被吸收，因此造成疼痛、红肿及硬结等现象发生)。综上所述，建立准确、有效的鞣质的检测方法是非常必要的。

丹参为常用活血中药，临床上应用于心绞痛、冠心病等心血管疾病的治疗，试验证实丹参水溶性有效成分为其主要活性成分，其中含有丹酚酸A、B、C、D等13种缩酚酸类成分，丹参缩酚酸类成分均由丹参素与咖啡酸的衍生物聚合或酯化而成，为邻苯二羟基化合物，与鞣质的结构相似，与蛋清及明胶发生结合，使检查结果呈阳性，因此目前常规的检查方法：比如药典收载的鞣质检查方法、明胶氯化钠试液法、纸层析法、透析法、葡聚糖凝胶法等，都不适合于含丹参的制剂的鞣质的检测分析。所以，建立一种新的检测含丹参的药物制剂的鞣质的检测方法，是十分重要的。

发明内容

基于上述原因，我们科研人员经过长时间的创造性劳动，针对丹参中的鞣质和有效成分进行深入的分析，通过系列的劳动建立一种全新的检测鞣质的方法：鞣质均由多分子没食子酸缩合而成，经水解后可生成没食子酸，而丹参酚酸分子中不含没食子酸单元结构，经水解后无法生成没食子酸。因此设计试验，将丹酚酸A样品水解，检测样品经水解后产生的没食子酸的含量。若样品中不含鞣质，则无没食子酸的色谱斑点(或峰)出现，若有鞣质则样品经过水解将产生没食子酸的色谱斑点(或峰)，经过检测没食子酸的含量，即可达到测定样品中鞣质的含量的目的。本申请的鞣质的检测方法，比现有技术的检测分析方法灵敏度要高。

本申请通过以下技术方案实现的。

根据以上分析，设计了以没食子酸为对照，采用高效液相色谱法，以磷酸溶液和乙腈为流动相，对含有丹参的药物制剂进行制剂鞣质的检测分析。

其中含有丹参的药物制剂包括以丹参单味药制备的药物制剂。

其中磷酸溶液是磷酸与水体积比为1∶10000-4∶10000的溶液。

其中磷酸溶液是磷酸与水体积比为2.5∶10000的溶液。

其中检测分析方法为：

照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm，流动相为：0-10分钟，磷酸溶液比例为95％，乙腈比例为5％；

供试品水解溶液的制备：取样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷，水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液；

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加甲醇制成溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液；

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

其中供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，其色谱峰峰面积与没食子酸对照溶液主峰面积的比例为大于等于0且小于0.001。

一、方法选择实验

我们先设计了以没食子酸及鞣质水解液为对照，以丹参酚酸A水解液为供试品，进行薄层色谱分析的方法，对本品鞣质进行考察。经试验(参照中国药典2005年版一部五倍子项下鞣质含量测定方法)，采用以下前处理方法处理样品：

供试品水解溶液的制备：取样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，水解液蒸干，放冷，精密加入甲醇使溶解，作为供试品水解溶液。

鞣质水解溶液的制备：取鞣质，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，水解液蒸干，放冷，精密加入甲醇使溶解，作为鞣质水解溶液。

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，加甲醇，作为没食子酸对照品溶液。

阴性对照溶液的的制备：取样品，加甲醇超声使溶解，作为阴性对照溶液。

经试验，确定薄层色谱法如下：

照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一块已活化的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸(4∶1∶0.7)为展开剂，展开，取出，喷以三氯化铁显色剂，在100℃加热至斑点显色清晰。在供试品色谱中，在与没食子酸对照品及鞣质水解液色谱相应的位置上不得显斑点。此法阴性对照无干扰，专属性强，可以用于样品的鞣质检查。

薄层色谱检测法的检测限鞣质检查为一限度检查，为考察此方法的灵敏度，我们对其检测限度进行了研究，具体试验为，取以上鞣质水解溶液逐步稀释，并将稀释液按上述薄层色谱法试验，得此方法可检出的鞣质的最低限量为1μg。。

由于薄层色谱法检测灵敏度相对较低，此法的检测限度只有1μg(1μg/10μl)，而此方法中，样品最大的点样浓度约20μg/μl(20mg/ml)，浓度更高时，色谱峰拖尾严重，无法检测。所以此方法相当于能检测出样品中的鞣质含量约为0.5％，即当样品中鞣质的量大于0.5％时，此法可以准确检出，当样品中鞣质的量小于0.5％时，此法无法检出。

实验结果：通过上述实验表明，薄层层析法因为灵敏度较低，不适合含有丹参的药物制剂的鞣质的检测。

二、方法的确证实验

由于薄层色谱法检出灵敏度较差，因此，研究采用高效液相色谱法进行测定，经过研究，我们保留薄层色谱法的前处理过程，经过实验，最终确定如下检测方法：

采用高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm。A相为0.025％磷酸水溶液，B相为乙腈。按以下程序进行梯度洗脱：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			010121920	9595101095	5590905
30	95	5

供试品水解溶液的制备：取样品，精密称定或量取，置具塞锥形瓶中，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷。水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液。

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，加甲醇制成每含的溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液。

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，在供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，应不显色谱峰。若有色谱峰，其峰面积不得大于没食子酸对照溶液主峰面积(0.1％)。

注：在上述色谱条件中，没食子酸峰在10分钟内洗脱，但因本品水解后，有较多强保留杂质产生，出峰时间晚，因此，后四步是连续测定的两个洗脱程序之间的过渡步骤。其中，12～19分钟的程序是为了将系统中的强保留杂质充分洗脱，以节约洗脱时间；19～20分钟的程序是为了将系统从上一梯度的结束过渡到下一梯度的开始，不采取突然切换梯度有利于色谱柱的平衡；20～30分钟的程序是为了将色谱系统进行充分的平衡，经过系统平衡会使得采集的精密度与重现性提高。

三、检测限试验

实验方法：取鞣质约100mg，置100ml具塞锥形瓶中，加入4mol/L盐酸溶液30ml，水浴中加热水解3.5h，放冷。水解液用滤纸滤过，滤液全部移入100ml量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用50％甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液1ml置200ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为1溶液，精密吸取20μl注入液相色谱仪，观察主成分峰高度，远大于10倍基线噪音；精密量取1溶液1ml置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为2溶液，精密吸取20μl注入液相色谱仪，观察主成分峰高度，约10倍于基线噪音，计算此时鞣质的浓度为0.05ng/μl，鞣质的量为1ng，精密量取2溶液3ml置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为3溶液，精密吸取20μl注入液相色谱仪，观察主成分峰高度，约3倍于基线噪音，计算此时鞣质的浓度约为0.015ng/μl，鞣质的量为0.3ng，故此方法鞣质的定量限为1ng，检测限为0.3ng。

我们对药典两种检测方法的检测限度也进行了研究，经试验，第一法的检测限度约为20μg，第二法的检测限度约为200μg。而本研究方法的检测限为0.6ng，故本申请的检测分析方法的灵敏度远远高于药典的检测方法，比药典方法灵敏10000倍以上，故可用此法作为本品中鞣质的检测方法。

四、实施例

实施例1

丹参丹酚酸冻干粉针剂的鞣质的检测分析(以丹参药材为原料药制备的有效部位冻干粉针剂)

照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm，流动相为：0-10分钟，磷酸溶液比例为95％，乙腈比例为5％；

供试品水解溶液的制备：取丹参丹酚酸冻干粉针剂样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷，水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液；

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加甲醇制成溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液；

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

磷酸溶液是磷酸与水体积比为1∶10000的溶液，即0.01％的磷酸溶液。

供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，其色谱峰峰面积与没食子酸对照溶液主峰面积的比例为0.00075。

实施例2

复方丹参注射液的鞣质的检测分析(复方丹参注射液是以丹参、降香为原料制备的注射液)

照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm，流动相为：0-10分钟，磷酸溶液比例为95％，乙腈比例为5％；

供试品水解溶液的制备：取丹参丹酚酸冻干粉针剂样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷，水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液；

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加甲醇制成溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液；

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

磷酸溶液是磷酸与水体积比为4∶10000的溶液，即0.04％的磷酸溶液。

供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，，其色谱峰峰面积与没食子酸对照溶液主峰面积的比例为0.00097。

实施例3

丹参丹酚酸A冻干粉针剂的鞣质的检测分析(以丹参为原料制备的有效成分冻干粉针剂)

照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm，流动相为：0-10分钟，磷酸溶液比例为95％，乙腈比例为5％；

供试品水解溶液的制备：取丹参丹酚酸冻干粉针剂样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷，水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液；

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加甲醇制成溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液；

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

磷酸溶液是磷酸与水体积比为2.5∶10000的溶液，即0.025％的磷酸溶液。

供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，，其色谱峰峰面积与没食子酸对照溶液主峰面积的比例大于等于0且小于0.025％。

实施例4

丹参丹酚酸A水针剂的鞣质的检测分析(以丹参为原料制备的有效成分水针剂)

照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm，流动相为：0-10分钟，磷酸溶液比例为95％，乙腈比例为5％；

供试品水解溶液的制备：取丹参丹酚酸冻干粉针剂样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷，水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液；

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加甲醇制成溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液；

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

磷酸溶液是磷酸与水体积比为2.5∶10000的溶液，即0.025％的磷酸溶液。

供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，其色谱峰峰面积与没食子酸对照溶液主峰面积的比例大于等于0且小于0.025％。

实施例5

眼活肽滴眼液的鞣质检测分析(以麝香、熊胆、珍珠、川芎、丹参等16味中药制备的滴眼液)

照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm，流动相为：0-10分钟，磷酸溶液比例为95％，乙腈比例为5％；

供试品水解溶液的制备：取丹参丹酚酸冻干粉针剂样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷，水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液；

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加甲醇制成溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液；

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

磷酸溶液是磷酸与水体积比为1.5∶10000的溶液，即0.015％的磷酸溶液。

供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，其色谱峰峰面积与没食子酸对照溶液主峰面积的比例0.00099。

实施例6

丹参丹酚酸B药用盐注射制剂的鞣质的检测分析

照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm，流动相为：0-10分钟，磷酸溶液比例为95％，乙腈比例为5％；

供试品水解溶液的制备：取丹参丹酚酸冻干粉针剂样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷，水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液；

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加甲醇制成溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液；

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

磷酸溶液是磷酸与水体积比为3.5∶10000的溶液，即0.035％的磷酸溶液。

供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，其色谱峰峰面积与没食子酸对照溶液主峰面积的比例小于0.00090。

注：本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。

Claims (6)

1.一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法，其特征在于采用高效液相色谱法，以磷酸溶液和乙腈为流动相，以没食子酸为对照品，进行制剂鞣质的检测分析。

2.根据权利要求1所述的一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法，其中含有丹参的药物制剂包括以丹参单味药制备的药物制剂。

3.根据权利要求1所述的一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法，其中磷酸溶液是磷酸与水体积比为1∶10000-4∶10000的溶液。

4.根据权利要求1所述的一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法，其中磷酸溶液是磷酸与水体积比为2.5∶10000的溶液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法，其中检测分析方法为：

照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS预柱，柱温35℃，检测波长为273nm，流动相为：0-10分钟，磷酸溶液比例为95％，乙腈比例为5％；

供试品水解溶液的制备：取样品，加入盐酸溶液，水浴中加热水解，放冷，水解液用滤纸滤过，滤液全部移入量瓶中，具塞锥形瓶及滤纸上的残渣用甲醇反复洗涤，洗涤液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品水解溶液；

没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加甲醇制成溶液，摇匀，滤过，作为没食子酸对照品溶液；

精密吸取以上各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

6.根据权利要求5所述的一种含有丹参的药物制剂的鞣质的检测分析方法，其中供试品水解液色谱图中，在与没食子酸对照品色谱图主峰相应的位置上，其色谱峰峰面积与没食子酸对照溶液主峰面积的比例为大于等于0且小于0.001。