CN101014717A - Atⅲ在全血及血浆中的直接激活 - Google Patents

Atⅲ在全血及血浆中的直接激活 Download PDF

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Abstract

公开了在血液中原位激活ATⅢ的方法，以及该方法和血制品在治疗感染性疾病，炎症疾病和由凝血酶激活作用介导的疾病和病症中的应用。

Description

ATⅢ在全血及血浆中的直接激活
相关申请
本申请要求于2004年7月7日申请的临时申请U.S.S.N.60/586,043的优先权，该申请的内容全文并入本文作为参考。
背景技术
尽管疫苗可以预防多种病毒感染，但并不是所有的病毒都能够通过疫苗预防，而且即使存在疫苗，也并不是所有的可能的易感者都能够接受疫苗接种。例如，不存在针对逆转录人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的、不能治愈的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的疫苗，患该病的患者身体免疫系统崩溃，使患者易受到机会感染，例如肺炎，和某些癌症，例如卡波西肉瘤。许多HIV患者都会共同感染丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)，或其他病毒。尽管存在针对某些病毒例如HBV的疫苗，但许多风险人群并没有接种疫苗或没有机会接种。另外，有些数据显示HBV疫苗对于已经感染了HIV的人群并非那么有效。
一旦发生了病毒感染，通常是不可治愈的。但是存在多种抗病毒药物，能够防止病毒复制和破坏身体免疫系统，即，能够减缓感染进程，延长患者的生命。但是这种治疗通常只能部分有效，还不确定需要怎样的病毒抑制率才能够获得持续的病毒学、免疫学和临床有效性。抗病毒药物通常毒性很高，能够引起严重的副作用，包括心脏损伤，肾衰竭和骨质疏松症。
例如，高效的抗逆转录病毒药物疗法(HAART)是一种广泛使用的抗-HIV治疗，其需要包括多种药物蛋白酶抑制剂的治疗方案来彻底抑制病毒的复制。肝的损伤是抗逆转录病毒疗法(HAART)引起的一个重要关注点，已经表明各类抗逆转录病毒疗法都会引起肝损伤。目前抗HIV疗法的效率进一步被治疗方案的复杂性、药丸容量和药-药相互作用所限制。逆转录病毒药物的毒副作用使得组合治疗的使用期限很难长久，许多患者不能承受长期的HAART治疗。此外，组合治疗方式的低粘附性(adherence)导致出现HIV的耐药菌株。
显而易见需要一种新的抗病毒药剂及其他治疗病毒感染的新方法。
发明概述
本发明基于以下意外发现：可以使用如肝素等糖类在血，血浆，血清白蛋白，重组血浆等血液制品中直接原位活化ATIII，再施用于患者。例如，一个患者的血液制品可以与肝素或其它糖类孵育，透析并再施用到该患者中。或者，来自另外来源(例如商品来源)的血液制品可以与肝素或其它糖类孵育，透析并施用到某个患者中。如此处理的血液制品含有治疗病毒感染有效剂量的活化的ATIII。这种新的疗法除去了对预先制备ATIII制剂的需要。如此处理的血液制品作为一种疗法是有益的，例如用于治疗病毒感染患者或由凝血酶活化作用所引起或促进的疾病或病症。本发明提供的该疗法可缩短前-临床以及临床试验时间。此外，这些疗法为现有使用纯化的活化ATIII药物制剂治疗病毒感染的方法提供了一种替代方案或补充。
由下述的详细说明以及权利要求可以明显看出本发明的其它特点以及优越性。
附图说明
图1表明在用LMW肝素处理的血液中HIV-I活性被抑制(如以下实施例4所述)。
图2表明活化的肝素的作用机理。来自Aventis(人来源)以及来自GTC(重组)的纯ATIII是无活性的。寡糖和ATIII孵育/或加热孵育会加速这些分子的相互作用以形成复合体，该复合体经历了构象变化产生活性形式。
发明的详细说明
1.定义
为了方便起见，本文集中了本说明书，实施例和附加权利要求中使用的某些术语。除非另有说明，否则，本文使用的所有专业和科学名词都具有本发明所属技术领域专业人员通常认为的含义。
本文所用量词″a″和″an″是指一个或一个以上(即，至少一个)语法上的物品对象。举例来说，“一个元件”意味着一个元件或多于一个元件。
术语“活化ATIII”或“以活化ATIII”指在适宜条件下处理ATIII，从而使ATIII变成高分子量ATIII并能够减少病毒负荷。
术语“施用”包括将药物组合物或治疗剂运送到患者系统之内或运送到患者体表或体内的特定区域的任何方法。本文所用短语“全身施用”“全身性施用”“外周施用”和“外围地施用”，不同于施用化合物、药物或其他材料使其直接进入中枢神经系统，是指进入患者全身并因此经受新陈代谢等过程，例如皮下给药。“肠道外施用”和“肠道外地施用”是指不同于肠内和局部给药的施用模式，通常通过注射，其包括但不限于静脉内的，肌内的，动脉内的，鞘内的，囊内的，眶内的，心内的，皮内的，腹膜内的，经气管的，皮下的，表皮下的，关节内的，包囊下的，蛛网膜下的，脊柱内的和胸骨内的注射和输注。
术语“ATIII”指抗凝血酶III。
术语“血液制品”指任何血液的制品或物质，或来源于血液的制品或物质。例如，血液制品包括但不限于，全血，血浆，血清，血清白蛋白制剂，及其人工制剂，比如重组血浆。
术语“哺乳动物”是本领域已知的，示例性的哺乳动物包括人，灵长类动物，牛科动物，猪科动物，犬科动物，猫科动物以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。
术语“高分子量ATIII”是指相对于野生型ATIII分子、经处理分子量增大了的ATIII，例如从58kDa增大到约60kDa到约240kDa。
将要通过本方法处理的“患者”“受试者”或“宿主”是指人或者非人动物。
短语“药学上可接受的”指组份及其剂量在合理的临床判断范围内，适用于与人类和动物组织接触，无过度毒性，刺激，过敏反应，或其它问题或并发症，以及合理的利益/风险比率。
短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料，组合物或载体，例如液相或固相填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂或封闭材料，涉及从一个器官或身体的部分携带或传送任何添加物或组合物，或其组份到另一器官或身体部分。
术语“药学上可接受的载体”指载体的“可接受”性，即，与组合物中的其它组分相适应，且不会对接受者有害。可充当药学上可接受的载体的一些实例包括：(1)糖，比如乳糖，葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，和其衍生物，比如羧甲基纤维素钠盐，乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末黄芪胶；(5)麦芽；(6)白明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，比如可可脂和栓剂蜡；(9)油，比如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和豆油；(10)二醇类，比如丙二醇；(11)多元醇，比如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)其它用于药物制剂的无毒配伍物质。
术语“糖类”包括单糖和多糖。
术语“能够活化ATIII的糖类”指任何能将野生型ATIII转化为能够减少病毒负荷的活化和/或高分子量ATIII的糖类。
术语“治疗有效量”指活化的ATIII，药物或其它分子的含量，当给需要这种治疗的受试者施用时该含量足以实现有效治疗。治疗有效量随所述待治疗患者和疾病病症、患者的体重和年龄、疾病病症的严重度、给药方式等等的不同而有所变化，该有效量可由本领域普通技术人员容易地测定。
本文所用术语“治疗”含义是包括治愈以及改善任一病症或疾病的至少一个症状，或疾病的进展被降低或杜绝。治疗可以在病态开始的预前或随后进行。
术语“病毒负荷”指病毒(例如HIV)在血液中的浓度。
除非另有陈述，说明书和权利要求所用的所有表示组分，反应条件等的数字，在任何情况下应被理解为被术语“约”修饰。  因此，除非标明与此相反，在说明书和附加权利要求中所述的数字参数均为近似值，可根据有待通过本发明来获得的性质的不同而发生变化。
2.ATIII的血液原位活化作用
抗凝血酶III(ATIII)是存在于血浆中的一种糖蛋白，具有明确的血液凝固作用。具体地，ATIII是一种有效的凝结级联反应的抑制剂，具有54kDa到65kDa之间的表观分子量(Rosenberg和Damus，J.Biol.Chem.248：6490-505(1973)；Nordenman等，Eur.J.Biochem.，78：195-204(1977)；Kurachi等，Biochemistry 15：373-7(1976))，其中百分之十是由四个葡糖胺-碱碳水化合物链所贡献(Kurachi等，Biochemistry 15：373-7(1976)；Petersen等，The PhysiologicalInhibitors of Coagulation and Fibrinolysis(Collen等，eds)Elsevier，Amsterdam，48页(1979))。
尽管从其名称含义来看是ATIII仅仅对凝血酶起作用，实际上ATIII能对几乎所有凝结酶起到至少一定程度的抑制作用。它抑制的主要的酶是Xa因子，IXa因子和凝血酶(IIa因子)。它还对因子XIIa，因子Xia和VIla因子与组织因子的复合体具有抑制作用，但对VIIa因子和活化的蛋白质C没有作用。ATIII还抑制胰蛋白酶，纤维蛋白溶酶和激肽释放酶(Charlotte和Church，Seminars in Hematology 28：3-9(1995))。其通过多种相互作用发挥限制凝结的功能，这使其成为一种主要的天然抗凝结蛋白质。
ATIII对其自身具有相对低效的抑制作用。但是，ATIII能通过一种简单的模板机理活化，或通过与肝素结合由变构构象变化活化(Skinner等，J.Mol.Biol.283：9-14(1998)；Huntington等，J.Mol.Biol.，293：449-55(1999)；Belar等，J.Mol.Biol.Chem.，275：8733-41(2000))。当ATIII结合肝素时，导致抑制发生的那些反应的速度大大加快。这种相互作用是基于肝素的抗凝作用治疗基础。
纯血浆来源或重组的ATIII对降低HIV病毒负荷无活性。但是，我们已经在U.S.S.N.10/436,872中表明：已经处理过的、具有更高分子量的，或“活化的”ATIII能在感染细胞中有效地减少HIV病毒负荷。该申请特征是包含治疗逆转录病毒感染的、有效量的高分子量抗凝血酶III(ATIII)的药物组合物，该申请全文并入本文作为参考。ATIII与肝素以各种组合方式孵育和/或加热均显示可活化ATIII并抑制逆转录病毒感染的增殖。
本发明基于以下意外发现，即可以使用肝素等糖类在血，血浆，血清白蛋白，重组血浆等血液制品中直接原位活化ATIII，再将其施用于患者。如此处理的血液制品含有活化的或高分子量ATIII。这种新的疗法不必预先制备ATIII，例如将其制备、纯化并制剂为药物组合物。如此处理的血液制品作为一种疗法是有益的，例如用于治疗病毒病患者或由凝血酶活化作用所引起或促进的疾病或病症。
例如，可以在适当条件下(约37到约40℃)将该患者自身的血液或血浆或血清白蛋白与肝素共同孵育，(不必使糖类浓度大大低于经处理的血液中的ATIII等摩尔浓度)，然后将活化的血制品注射回到该患者中。这种概念背后的基本原理是大部分的患者每公升血液具有约100到约150mg ATIII，而其仅仅需要很少量的肝素进行活化。
因此，在血液制品中原位制备活化的ATIII方法可包括：(a)向含有ATIII的血液制品中加入能够活化ATIII的糖类，所述糖类的数量足以活化所述ATIII；以及(b)在足以活化所述ATIII的条件下孵育血液制品和糖类的混合物。在某些具体实施方式中，所述的糖类的加入量可以多于血液制品中的ATIII数量，例如，血液制品中ATIII数量的约0.1到约1.0等摩尔的数量。
某些具体实施方式中足以活化ATIII的条件是，约37℃到约40℃，约24到约72小时。某些具体实施方式中该温度约为37℃到约38℃，约38℃到约39℃或约39℃到约40℃。某些具体实施方式中，孵育时间为约24到约36小时，约36到约48小时，约48到约60小时，或约60到约72小时。
该血液制品可以是血液或来源于血液的任何制品或物质。例如，血液制品包括但不限于，全血，血浆，血清，血清白蛋白制剂，及其人工制剂，比如重组血浆。
所述的糖类可以是例如寡糖，如任何形式的肝素，包括低分子量肝素(约2到约4kDa)，高分子量肝素(至少12kDa)，和标准的未被分级的肝素。在某些具体实施方式中，所述的糖类是五糖。此外，该糖可以是由糖苷酶或其它限制酶处理的寡糖。在某些具体实施方式中，该糖可以以该血液制品中ATIII的量的约0.1到约0.2，约0.2到约0.3，约0.3到约0.4，约0.4到约0.5，约0.5到约0.6，约0.6到约0.7，约0.7到约0.8，0.8到约0.9，或约0.9到约1.0等摩尔的量加入。可用于本发明方法的糖包括但不限于，单糖，二糖和多糖(包括五，七和六糖)，糖醇，和氨基糖。单糖的实例包括葡萄糖，果糖，半乳糖，甘露糖，阿拉伯糖和肌醇。二糖的实例包括蔗糖，乳糖，麦芽糖，果胶。糖醇的实例包括甘露糖醇，山梨糖醇，和木糖醇。氨基糖的实例包括葡糖胺，半乳糖胺，N-乙酰-D-葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺，能形成氨基糖苷类和肝素等更复杂寡糖的构筑单元。在某些具体实施方式中，所述的寡糖可以是低分子量(2-4kDa)肝素，高分子量(至少12kDa)肝素，标准的未被分级的肝素，果胶，五糖和氨基糖苷类。在某些具体实施方式中，所述的寡糖对ATIII有亲和性。本文所用的糖可与附加的小分子，如生物素，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白衍生。在某些具体实施方式中糖类可以是硫酸化寡糖或糖苷酶及通过其他限制酶反应鉴定的寡糖。
含有已被原位活化了的ATIII的血液制品也在本发明范围内。这种血液制品可以在例如无菌i.v.或孵育袋中包装。
3.处理的方法
上述处理血液制品以原位活化ATIII的方法及从而产生的活化的血液制品可以并入受试者疾病治疗方法中。因此，这种在需要治疗的受试者中治疗疾病的方法可包含：(a)向含有ATIII的血液制品中加入能够活化ATIII的糖类，糖类的数量足以活化所述ATIII；(b)在足以活化所述ATIII的条件下孵育血液制品和糖类的混合物；以及(c)将所述混合物施用到所述受试者以治疗疾病。在某些具体实施方式中，这种方法可进一步包含在注入步骤之前用透析等方法纯化所述混合物，以去除未反应的糖类。本发明的方法可用于人及动物受试者，如牛、马、犬、猫等。
在某些具体实施方式中，疾病由细菌或病毒造成。可以使用本发明原位活化ATIII的方法或血液制品治疗的病毒实例包括甲型肝炎病毒(HAV)感染，乙型肝炎病毒(HBV)感染，丙型肝炎病毒(HCV)感染，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，冠状病毒感染，巨细胞病毒感染(CMV)及重症急性呼吸性综合症(SARS)。在某些具体实施方式中，该病毒是逆转录病毒，比如人免疫缺陷病毒。在其它具体实施方式中，该疾病可以是由凝血酶活化作用所引起或促进的疾病或病症。
患者中与凝血酶活化作用相关的疾病包括败血病，损伤，急性呼吸窘迫综合征，血栓症，中风及再狭窄。该方法还可以用来治疗具有高风险患凝血酶相关的病理性疾病的患者，如再闭塞(reocclusion)及在经皮冠状动脉成形术中再狭窄；外科手术相关的血栓症，局部缺血/再灌注伤害；及在癌症或外科患者中的凝结异常。在该方法中施用的处理的血液制品可作为抗凝剂在下述治疗中发挥作用，例如，导致静脉及动脉的血栓症风险增大的先天性抗凝血酶III缺陷；或导致弥漫性血管内凝血的获得性抗凝血酶III缺陷；内皮损伤所导致的微血管病性溶血性贫血(即溶血-尿毒症综合症)及静脉闭塞的疾病(VOD)。所述方法及血液制品还可用来治疗半慢性疾病，如动脉的血栓及深静脉血栓形成。
单剂量给药、长期慢性多剂量治疗这两种治疗方法均包含在本发明范围内。
在某些具体实施方式中，该治疗方法可进一步包含向所述受试者施用其它药物组合物，比如抗病毒药物。例如，在某些具体实施方式中，抗病毒药物可以与该血液制品同时施用。在其它具体实施方式中，抗病毒药物可以在施用该混合物之后施用。在其它具体实施方式中，抗病毒药物既可以与该血液制品同时也可以随其后施用。可以向该混合物中加入抗病毒药物，或作为单独的组合物施用。
抗病毒药物的示例性实例包括逆转录酶抑制剂，比如齐多夫定、扎西他宾，去羟肌苷，司他夫定，拉米夫定，阿巴卡韦，替诺福韦，奈韦拉平，依法韦仑，地位韦啶；蛋白酶抑制剂，比如沙奎那韦，利托那韦，茚地那韦，奈非那韦，氨普奈韦，洛匹那韦，并及其他试剂，比如阿拉伯糖苷，阿拉伯糖苷5′单磷酸盐，无环鸟苷，鸟嘌呤，泛昔洛韦，拉米夫定，克来夫定，afedovir dipivoxil，恩替卡韦，IFN a-2b，IFN-a-2a，类淋巴母细胞IFN，共有序列-IFN，IFN-b，IFN-g，加入聚乙二醇的IFN-a-2a，糖皮质甾类，或胸腺素al，IL-2，IL-12，病毒唑，环孢菌素或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，融合抑制剂，比如T-20(恩夫韦地(enfuvirtide))，锌指抑制剂，及病毒唑。
推荐用高活性抗反转录病毒治疗(HAART)治疗HIV及其他病毒感染。在每日的服法中结合HAART与两个或更多抗病毒药疗法，亦称“鸡尾酒法”。鸡尾酒抗病毒药物为本领域技术人员所公知。例如，公知的抗HIV鸡尾酒组合包括但不限于，AZT，3TC及依法韦仑；奈韦拉平，司他夫定及拉米夫定；恩曲他滨(emtricitabine)及替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate)；茚地那韦，齐多夫定及拉米夫定(3TC)；和齐多夫定及3TC。一种有效的抗HCV鸡尾酒是病毒唑和干扰素。
本发明血液制品及其他抗病毒的结合可减少任一单一组分的所需剂量，这是因为不同组分作用的引发和持续可以是互补的(complimentary)。在这种结合疗法中，不同活性试剂可以同时或独立地施用，以及在一天内同时或在不同的时间施用。
可以同时，随后，或既同时又随后地施用的其它药物组合物包括ATIII以及干扰素或者干扰素来源的药物。例如，该血液制品可以是在加入寡糖以活化ATIII之前补充有额外的ATIII。在另一具体实施方式中，可以在本发明的血液制品用于治疗方法之前，单独或与肝素或五糖等糖类共同使用抗凝剂来处理本发明的血液制品，以便提高它们的效果。
此外，如待审的U.S.专利申请10/436,872所述的高分子量ATIII药物组合物可通过例如与所述处理的血液制品给药的同时，随后或既同时又随后地施用用于补充该疗法。
本发明的血液制品可以直接，或可以使用一个或多个生理学可接受的载体或赋形剂配制成常规的方式施用于受试者。对于这种疗法，本发明的化合物可配制成各种给药负荷，包括全身的和局部的或定位的给药。通常可以在Remmington′s Pharmaceutical Sciences，MeadePublishing Co.，Easton，PA获得技术和制剂。针对全身地施用，优选注射，包括肌内，静脉内，腹膜内，和皮下注射。可以配制该血液制品成以用于通过注射的肠道外方式施用，例如，通过快速浓注或连续输注。对于注射，本发明的血液制品可配置成液体溶液，优选生理学配伍的缓冲液，诸如Hank溶液或林格溶液。另外，该血液制品可以配制成固态并在即将使用之前再溶解或悬浮。还包括血液制品的冻干形式。
用于注射的制剂可以与加入的防腐剂一起以单位剂型存在，例如在安瓿或在多剂量容器中。该制剂可以是混悬液，在油性或液态载体中的溶液或乳剂，并可含有制剂用试剂，诸如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，该活性成分可以在使用之前以粉末形式与适当的载体组合，例如，无菌的无热原水。
此外，本领域技术人员可以理解，用于本发明方法的任一血液制品，试剂，化合物，药物等等的剂量可以因患者的症状，年龄及体重，待治疗或预防的病症的性质及严重度，给药途径，和补充手段的形式而不同。该制剂的任一形式都可以以任何适当的剂量施用，诸如以单个剂量或以等分剂量施用。根据本说明书的内容及其教导，本发明血液制品的剂量，无论是单独或与本发明的任何其它化合物一起，或与对特定紊乱，疾病或病症有用的任何化合物一起，均可以通过本领域技术人员公知技术容易地测定。本发明还提供一种或以上的受试化合物以及其它治疗剂的混合物。
已经证明当以约100U/kg/天的剂量施用时，ATIII耐药性很好(Warren等，JAMA 286：1869-78(2001))并显示完全被排出的半衰期为18.6h(Ilias等，Intensive Care Medicine 26：7104-7115(2000))。当根据症状，体重，性别，动物物种等等适当地确定剂量时，其用于成人通常为1-1,000单位/kg体重/天的ATIII(本发明处理的血液制品中所含的)，优选10-500单位/kg体重/天，该剂量是在一天内一次或多次施用。如果是静脉内给药，该剂量优选10-100单位/kg体重/天。
在指定患者中产生最有效治疗的任一特定制品或化合物的精确的给药时间及剂量将取决于特定化合物的活性，药物动力学，和生物利用率，该患者的生理情况(包括年龄，性别，疾病类型和阶段，全身的身体条件，对给药剂量的敏感度，和药物治疗类型)，给药途径，等等。本文的指导原则可以用于优化该治疗，例如，测定给药的最优化时间和/或剂量，其仅仅是包括监测该患者和调整剂量和/或时间等的常规实验。在某些具体实施方式中，例如当该血液制品是患者的血液时，施用方案还可能取决于ATIII在血液制品中的相对剂量。
对于正在进行治疗的患者，可以通过在24小时时间内在预定时间测量一个或多个相关指数来监测患者的健康。治疗，包括补充手段，剂量，给药时间和剂型在内，可以根据这种监测的结果最优化。可以通过测量相同的参数来周期性地重新评价该患者以测定改善程度，第一次的重新评价通常出现在治疗开始后四个星期末，随后的重新评价在治疗过程中每四到八周进行，此后每隔二个月进行。治疗可以持续数月乃至几年，人的常规治疗长度最少是一个月。可以根据这些重新评价调整施用的试剂剂量和给药时间。在与HAART方式一起施用该血液制品的具体实施方式中，可以在HAART间歇期间施用该血液制品。
可以以小于该制品或化合物的最优化剂量的较小剂量开始治疗。此后，可以小幅增加该剂量，直至达到最优化的治疗效果。
4.试剂盒
本发明还提供含有本发明组合物的试剂盒，以及任选地使用说明书。例如，用于实践本发明某些治疗方法的试剂盒可以包含一种能够活化ATIII的糖类以及使用说明书。用于实践本发明某些治疗方法的其它试剂盒可以包括含有已经原位活化的ATIII的血液制品。此外，本发明提供试剂盒，该试剂盒可在在血液制品中制备原位活化的ATIII的方法中使用。例如，这种试剂盒可含有能够活化ATIII的寡糖和使用说明书。
试剂盒组分可以包装成用于手动、或者部分或全部自动地实施上述方法。在涉及试剂盒的其它具体实施方式中，本发明设想的试剂盒包括本发明的组合物，以及任选地使用说明书。在其它具体实施方式中，试剂盒可进一步包括对照，试剂，缓冲液，和/或使用说明书。这种试剂盒可能具有各种应用，包括例如成像，诊断，治疗及其他应用。
实施例
上面对本发明进行了概括性的描述，参考下列实施例可更容易理解本发明，所述实施例仅仅为了说明本发明的某些方面和具体实施方式，并非限制本发明。
实施例1：使用标准的、未被分级的肝素在体外进行ATIII活化的方案
在无菌的孵育袋中将用于人的标准的、未被分级的肝素(1,000-10,000单位，或约2到约40mg)加入到500mL市场上可买到的人血浆样品中(含平均约120到约150mg的ATIII)。加入到袋中的肝素数量取决于患者的病毒负荷和期望的治疗方式。在室温下，37℃或40℃孵育所获混合物24-72小时。在孵育期需要轻微的混合。孵育的混合物可以进一步纯化以去除未反应的肝素，也可以不经纯化即注入到患者中。在本方法中，所述肝素剂量与血浆中的ATIII水平相比要低得多，这样就避免了产物混合物中的游离肝素，因此降低流血的风险。
实施例2：使用标准的，未被分级的肝素在体外血液中进行ATIII活化的方案
在无菌的孵育袋中将用于人的标准的、未被分级的肝素(1,000-20,000单位，或约2到约40mg)加入到1,000mL取自HIV或HCV患者的血液样品中(含平均约70到约150mg的ATIII)。在室温下，37℃或40℃孵育所获混合物24-72小时。在孵育期需要轻微的混合。孵育的混合物可以进一步纯化以去除未反应的肝素，也可以不经纯化即注入到患者中。在本方法中，所述肝素剂量与血浆中的ATIII水平相比要低得多，这样就避免了产物混合物中的游离肝素，因此降低流血的风险。
实施例3：使用低分子量肝素在体外血浆中进行ATIII活化的方案
在无菌的孵育袋中将用于人的低分子量(LMW)肝素(1,000-10,000单位，或约2-约20mg)加入到500mL市场上可买到的人血浆样品中(含平均约70到约150mg的ATIII)。在室温下，37℃或40℃孵育所获混合物24-72小时。在孵育期需要轻微的混合。孵育的混合物可以进一步纯化以去除未反应的肝素，也可以不经纯化即注入到患者中。在本方法中，所述肝素剂量与血浆中的ATIII水平相比要低得多，这样就避免了产物混合物中的游离肝素，因此降低流血的风险。
实施例4：使用低分子量肝素在体外血液中制备活化ATIII的方法
在无菌的孵育袋中将用于人的低分子量(LMW)肝素(1,000-20,000单位，或约2-约20mg)加入到1,000mL取自HIV或HCV患者的血液样品中(含平均约70到约150mg的ATIII)。在室温下，37℃或40℃孵育所获混合物24-72小时。在孵育期需要轻微的混合。孵育的混合物可以进一步纯化以去除未反应的肝素，也可以不经纯化即注入到患者中。在本方法中，所述肝素剂量与血浆中的ATIII水平相比要低得多，这样就避免了产物混合物中的游离肝素，因此降低流血的风险。
实施例5：使用肝素，肝素衍生物，或其它能够活化ATIII的寡糖在血液或血浆中活化ATIII
还可以使用0.1到1.0等摩尔量的任何肝素衍生的五糖或其它能够活化ATIII的寡糖，利用在以上实施例1-4中所述方法在血液或血浆中活化ATIII。这种实施例在上述详细说明中提供。
实施例6：以改良形式测定蛋白质结合肝素和游离肝素
为评估所述游离肝素和蛋白质结合肝素，按下述结合使用UV和折射率(RI)。
为校正所述通过UV和RI检测器进行的吸收检测中的差异建立了校正系数，其是根据下列公式利用两种检测器进行的纯蛋白质标准测定建立的：
K＝UV蛋白/RI蛋白或RI蛋白＝UV蛋白/K
总的RI整合可以按照下面表示为：
RI总数＝RI蛋白+RI肝素
因此，结合的肝素(B肝素)为
％B肝素＝[(RI总数-UV蛋白/K)/RI总数]×100
游离肝素(F肝素)根据下式计算：
％F肝素＝[F肝素/(F肝素+B肝素)]×100
实施例7：抑制HIV-I复制的试验
X4 HTLV-IIIB(在下文中写为X4 HIV；Chang等，NATURE，363：466-9(1993))，一种原型的T-向性(prototypical T-tropic)的HIV菌株(American Type Tissue Collection，Monassass，VA，USA；ATCC No.CRL-8543)，被用于评价ATIII活化方法对T-向性的HIV感染的效果。能感染细胞培养微量板上50％的孔、或试管的指定混悬液体积(例如0.1ml)中的病毒的数量被称为组织培养感染剂量50[TCID50]。TCID50用作一种通过噬菌斑(该方法给出PFU或噬菌斑形成单位的数值)测定病毒滴定度的替代手段。以1×10-2TCID50每毫升的MOI、用X4 HIV急性地感染表达人类白细胞抗原蛋白质(HLA)B6，Bw62和Cw3的人T淋巴样干细胞(H9细胞)。所述感染的H9细胞被重悬到5×105细胞/ml的R20细胞培养基中。用滴管吸取2毫升该混悬液到24孔微量滴定板的各孔中。然后在存在或不存在已经活化了的ATIII样品的条件下培养细胞直至12天。每隔两天(3，6，9和12天)，将1ml细胞上清液从试验孔去除并替换为等量的R20细胞培养培养基。同样处理对照孔，但接受的含样品培养基未被处理。
分别测量在0，3，6，9和12天获得的各样品中HIV病毒核心蛋白质p24(gag)的浓度(AllianceHIV-I p24 ELISA试剂盒，NENLife Science，Boston MA，USA)。
该结果列于图1，显示在用低分子量肝素处理的血液中HIV-I抑制活性。
等价物
本发明已经论述了特定的具体实施方式，以上说明书是说明性的而非限制性的。本领域技术人员依据说明书和下述权利要求的综述可显而易见的对本发明进行许多变动。例如，以上实施例中举出的反应物数量的变化，以及孵育时间的变化均属于本发明范围内。本发明的充分范围应该参考以下而定：权利要求，属于本发明范围内的等价物，说明书，并要考虑到这种变动。
本文提及的所有出版物和专利，包括下列的那些，均并全文入本文作为参考。在发生矛盾时，依照本申请，包括任何本文中的定义。Wright，BIOASSAY，18：453-64(1996)；Skinner et al.，J.MoI.Biol.283：9-14(1998)；Huntington et al.，J.MoI.Biol.293：449-55(1999)；Deeks，JAMA，286：224-6(2001)；Stephenson，JAMA，277：614-6(1997)；Carret al，Lancet，351：1881-3(1998)。

Claims (20)

1.对需要治疗的受试者进行治疗的方法，包括：(a)向含有ATIII的血液制品中加入能够活化ATIII的糖类，所述糖类的数量足以活化所述ATIII；(b)在足以活化所述ATIII的条件下孵育血液制品和糖类的混合物；以及(c)将所述混合物施用到所述患者。
2.权利要求1的方法，其中所述糖类是寡糖。
3.权利要求2的方法，其中所述寡糖是肝素，并且所述肝素选自：低分子量肝素，高分子量肝素，和标准的、未被分级的肝素。
4.权利要求2的方法，其中所述寡糖加入的数量多于所述血液制品中ATIII的数量。
5.权利要求1的方法，其中所述足以活化ATIII的条件为约37℃到约40℃、约24到约72小时的孵育。
6.权利要求2的方法，其中加入的所述寡糖的量是0.1-1.0等摩尔量的所述血液制品中ATIII的量。
7.权利要求1的方法，其中所述血液制品是血浆或人血清白蛋白。
8.权利要求1的方法，进一步包括在施用步骤之前纯化所述混合物以去除未反应的糖类。
9.权利要求1的方法，其中所述疾病是选自下述的病毒感染：甲型肝炎病毒HAV感染，乙型肝炎病毒HBV感染，丙型肝炎病毒HCV感染，人免疫缺陷病毒HIV感染，和冠状病毒感染。
10.权利要求9的方法，其中所述疾病是人类免疫缺陷性病毒HIV感染。
11.权利要求1的方法，其中所述疾病是由选自下述的由凝血酶活化所引起或促进的疾病或病症：败血病，损伤，急性呼吸窘迫综合征，血栓症，中风，再狭窄，再闭塞和经皮冠状动脉成形术中的再狭窄；与外科手术相关的血栓症，局部缺血/再灌注损伤；和癌症或外科患者中的凝血异常，抗凝血酶III缺陷，静脉的或动脉的血栓症，弥漫性血管内凝血，微血管病性溶血性贫血和静脉闭塞疾病VOD。
12.权利要求9的方法，进一步包括给所述患者施用一种抗病毒药物。
13.权利要求12的方法，其中所述抗病毒药物的施用是与所述混合物的施用同时进行。
14.权利要求12的方法，其中所述抗病毒药物的施用是在所述混合物的施用之后。
15.权利要求12的方法，其中还在给药之前向所述产物混合物中加入抗病毒药物。
16.权利要求1的方法，进一步包括在加入所述糖类之前向所述血液制品中补充额外的ATIII。
17.权利要求1的方法，进一步包括给所述患者施用一种干扰素或干扰素来源药物。
18.权利要求9的方法，其中所述混合物的施用使得病毒负荷降低。
19.一种在血液制品中原位制备活化的ATIII的方法，可包含：(a)向含有ATIII的血液制品中加入能够活化ATIII的糖类，所述糖类的数量足以活化所述ATIII；以及(b)在足以活化所述ATIII的条件下孵育血液制品和糖类的混合物。
20.一种用于在血液制品中原位制备活化的ATIII的试剂盒，包括一种能够活化ATIII的寡糖和使用说明书。
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