CN100392073C - 微生物和植物细胞的破碎方法 - Google Patents
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Abstract
微生物和植物细胞的破碎方法，将具有一定含水量的细胞经预冷丙酮处理后，放入高压容器中在适当压力和温度的超临界二氧化碳中作用1-3小时，打开放压阀迅速排空二氧化碳，使细胞破壁。本发明的优点是操作简便，成本低，在细胞破壁的过程中可以同时杀死所有的细胞，实现破壁和杀菌过程的统一，而对细胞内的酶活性无明显影响。该方法可以用于大规模生产当中且不含活菌，后处理过程大大简化。
Description
技术领域：
本发明涉及一种微生物和植物细胞的破碎方法，可以广泛应用在酶工程、灭菌、食品和医药等行业中。
背景技术：
在动植物和微生物机体中，普遍存在一类特殊蛋白质。它们参与生化反应，而且使反应进行得极快，这类物质是天然催化剂——酶类。酶是生物细胞合成的，它们催化相应的生化反应以维持细胞的活力。存在于细胞内的称为胞内酶，由细胞内合成而分泌到细胞外起作用的酶称作胞外酶，将这些酶提取纯化可以制成相应的酶制剂。胞外酶的分离纯化相对简单，可以直接对发酵液进行处理提取所需酶，而胞内游离存在的“游离酶”以及与颗粒体(如细胞核、线粒体、微粒体、质膜)结合的“结合酶”的制备就需要破碎细胞。此外，还有一些酶镶嵌在细胞膜上，称为膜蛋白，如脂酶、蛋白酶和肽酶等水解酶类大多集中在膜上，这些酶的分离也需要通过细胞破碎过程，因此细胞破壁是制备酶制剂的第一步。
对于不同的生物体，或同一生物体的不同组织的细胞，由于结构的差异，所采用的细胞破碎方法和条件也有所不同，必须根据细胞性质和处理量采用有针对性的方法，目前通常使用的细胞破壁方法可归纳为为物理法、化学法和生物化学法，但通常是多种方法的联合使用。
传统的破壁方法各有其优点，但是缺点同样明显。或者只能处理少量的样品，如超声波破碎方法对微生物的破碎效率比较高，但是只能在实验室中使用，无法在大生产中应用；或者处理周期长，如冷热交替处理法和自溶法等在生产中也无法使用；或者虽然能处理大量的样品，但是破碎效率比较低，处理过程中产生大量热量，导致细胞内酶活的丧失，如各种机械方法破碎；或者效率很高但是成本昂贵，如酶法消化法、高压均质处理和高压电场方法对细胞的破碎率都可达80％以上，但是会大大增加产品成本，在大生产中也无法推广使用。
本发明的目的就是为了克服己有技术的缺点，提供一种能处理从毫克级到公斤级的细胞量(包括动植物细胞、细菌、霉菌和酵母等)的细胞破碎方法，而且处理成本低，破碎效率高，操作简便，处理设备也易得。
发明内容：
将具有一定含水量的细胞经预冷丙酮处理后，放入高压容器中在适当压力和温度的超临界二氧化碳中作用1-3小时，打开放压阀迅速排空二氧化碳，使细胞破壁；所述细胞预冷丙酮处理为在细胞菌体中加入1-6倍体积预冷丙酮，经混匀，离心收集细胞后在通风条件下使丙酮挥发；所述在超临界二氧化碳中作用的二氧化碳压力、温度和密度计算方程式为：
P＝1770-3200D+4.1T exp(3.8D)
式中：P代表容器中二氧化碳的压力(psi)；D代表二氧化碳的密度(g/cd)；T代表二氧化碳的温度(℃)；二氧化碳温度和压力的设置须使二氧化碳的密度低于所处理的细胞的密度。
本发明的方法是物理法和化学法的结合，它利用二氧化碳能溶解脂类的特性，将细胞壁和膜上的脂溶性物质溶解，提高了细胞壁和膜的通透性，使二氧化碳容易渗入细胞，最终导致细胞壁的明塌。在一定的温度、压力条件下，超临界二氧化碳对脂类(尤其是各种油脂)有很好的溶解性，当细胞处于此种环境时，首先是细胞壁脂类发生溶解(对于植物，细胞外层的脂溶性物质首先遭到破坏)，导致细胞骨架出现了渗漏，高压下大量渗入的二氧化碳使细胞膜中大量脂类物质的溶出从而导致细胞膜的损伤，此时细胞死亡，大量二氧化碳更容易渗入细胞内部，经过一段时间，细胞内外二氧化碳压力达到平衡，当外压迅速降低时，内部压力将对细胞壁在瞬间产生极大冲击作用，另外，由于迅速减压，也会导致细胞内的二氧化碳处于固体状态，对细胞壁产生一定破坏作用，而细胞内的酶由于对二氧化碳不敏感而得以保存活性。
将一定量的生物细胞(微生物或动植物细胞)放入高压容器中，样品需经过预处理，以保证一定的含水量，投入样品量和容器的体积有一定的比例关系，并视生物细胞品种而有差异。将二氧化碳充入高压容器后，温度、压力和二氧化碳密度的选择与细胞来源有关，既可以选在液态区，也可以选在超临界区。样品在容器中的破壁时间也很重要，一般来说，相等的样品量比其他方法达到同样破壁率的操作时间要短的多。时间到达后，以适当方式释放二氧化碳至储罐(可重复使用)，将样品取出，用显微镜检查破壁效果，如果破壁细胞来自微生物，则可用涂平板方式检查是否有活菌存在。在最佳操作条件下的破壁率可达90％以上。
影响超临界二氧化碳破碎效率的主要有三个因素(压力、密度和温度)，根据本发明的方程式，只要知道了压力、密度和温度三个参数中的任何两个，都可以推算出另外一个参数。例如：已知D＝0.869g/cm3，T＝28℃，通过方程可以推知P＝2000psi。
本发明的优点在于：1、二氧化碳价格便宜，在实际操作过程中还可以回收利用。2、破壁工艺简单，设备要求不高，因此破壁成本低，适合大规模生产。3、在细胞破壁的过程中可以同时杀死所有的细胞，实现破壁和杀菌过程的统一，而对细胞内的酶活性无明显影响。该方法可以用于大规模生产当中且不含活菌，后处理过程大大简化。
具体实施方式：
下面以微生物为例说明本发明的实施例：
选取一株酵母菌，在锥形瓶中以液体培养基培养20小时，离心(5000转/分，10分钟)收集菌体并称其湿重。湿菌体中加入5倍体积预冷丙酮，充分振荡混匀，迅速离心(5000转/分，5分钟)收集菌体，菌体在通风橱中放置2-5小时，使丙酮挥发彻底。称取处理后的菌体2克于玻璃试管(根据菌量选择)中，然后置于超临界萃取机1升萃取罐(根据菌量选择)中，通入超临界状态的二氧化碳，当萃取罐中压力恒定为145个大气压，温度为35℃时开始记时，作用2小时后，打开放压阀在短时间内排空二氧化碳。取出玻璃试管，管底为菌体和干冰的混合物，在无菌条件下加入10毫升无菌水，充分振荡混匀，倒入50毫升离心管中并补充无菌水至20毫升。取一滴破碎悬液滴加于一滴碱性美兰染色液中，在显微镜下观察菌体破碎情况；另取100微升破碎液在完全培养基平板上涂布，30℃恒温培养箱中隔夜放置，检查杀菌效果。在此条件下，破碎率可达50％以上，无活菌存活。破碎悬液在适当条件下离心(5000转/分，10分钟)收集粗酶液。
Claims (2)
1.一种微生物和植物细胞的破碎方法，其特征在于：将具有一定含水量的细胞经预冷丙酮处理后，放入高压容器中在用下列方程式计算出的压力和温度的超临界二氧化碳中作用1-3小时，打开放压阀迅速排空二氧化碳，使细胞破壁，所述在超临界二氧化碳中作用的二氧化碳压力、温度和密度计算方程式为：
P＝1770-3200D+4.1T exp(3.8D)
式中：P代表容器中二氧化碳的压力(psi)；D代表二氧化碳的密度(g/cm3)；
T代表二氧化碳的温度(℃)。
2.根据权利要求1所述的一种微生物和植物细胞的破碎方法，其特征在于：所述细胞预冷丙酮处理为在细胞中加入1-6倍体积预冷丙酮，经混匀，离心收集细胞后在通风条件下使丙酮挥发。
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