CN100338226C - 微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法 - Google Patents
微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法 Download PDFInfo
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Abstract
微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，属于微生物制备技术，涉及一种以赭曲霉为菌种，坎利酮为底物，采取分批发酵技术制备11α羟基坎利酮的方法。本发明解决了微生物间歇补料法制备11α羟基坎利酮生产周期长、工艺复杂，转化过程中需补加碳源、氮源及抗生素，不仅成本高，而且由于转化过程中生物量不断增长，菌体甚至会暴露于空气中，给生产控制带来相当难度等问题。其技术方案是以赭曲霉为菌种，坎利酮为底物，经产孢和生产斜面制备、孢子悬液制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化的分批发酵技术制得。本发明工艺简单、转化时间短、染菌机率低、转化率高于90%，从而为大规模工业化生产奠定了基础，具有较大经济效益。
Description
技术领域
本发明属于微生物制备技术。涉及一种微生物转化法生产11α羟基坎利酮的制备工艺，特别涉及以赭曲霉为菌种，坎利酮为底物，采取分批发酵技术制备11α羟基坎利酮的方法。
背景技术
11α羟基坎利酮(11αOH Canrenone)，化学名孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，11，17-二羟基-3-氧-γ-内酯。是合成依普利酮(Eplerenone)的重要医药中间体。依普利酮是由11α羟基坎利酮出发经由六步化学反应最终合成，主要用于治疗充血性心衰(CHF)。
11α羟基坎利酮由坎利酮通过微生物转化在11位上羟基得到。由于市场潜力巨大，很早就有了坎利酮11α羟化反应的报道。
1971年，B.lunt等就已经尝试用坎利酮生产11α羟基坎利酮。在坎利酮投料量为0.5g/l时，转化率达到90％。
1980年Deshayes在优化后的条件下，1.5g/l坎利酮能得到95％的转化率。这被认为是该领域一个巨大的进步，但其投料量不高，不适于大规模工业化生产。
1996年，Ng；John S.等采用间歇补料，虽然投料量大为提高，但由于间歇补入碳源、氮源、抗生素(如盐酸四环素，硫酸卡那霉素等)，使成本大大提高；而且过程中生物量不断增长，菌体甚至会暴露于空气中，搅拌转速500-1000rpm，给生产控制带来相当难度；转化时间140-180h，由于转化时间长，无形中加大了生产成本。
综上所述，现有的微生物发酵法生产11α羟基坎利酮生产工艺仍存在生产周期长，成本高，工艺复杂等问题，限制了该产品的推广与应用。所以研究和开发一种工艺简单、经济实用的11α羟基坎利酮生产工艺是当务之急。
发明内容
要解决的问题：
针对上述问题，本发明目的是解决现有的微生物间歇补料发酵法，制备11α羟基坎利酮生产周期长、成本高、工艺复杂等问题；提供一种工艺简单、投料量高、转化过程中不需要补料、经济实用、适于大规模生产的11α羟基坎利酮的分批发酵法制备技术。
技术方案：
微生物分批发酵转化法生产11α羟基坎利酮的制备技术是以赭曲霉(AS3.4411)为生产菌种，坎利酮为底物，经过产孢和生产斜面制备、孢子悬液制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化的分批发酵技术最终得到目标产物，具体方法如下：
(1)产孢和生产用斜面制备
生产菌种为赭曲霉(AS 3.4411)，将该菌置于葡萄糖土豆汁斜面PDA培养基或小米斜面上，25-28℃恒温培养4-7天生成黄色孢子，覆盖在斜面上，颜色为灰黄色，于PDA斜面背面可以观察到红色色素，然后转接在酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖斜面培养基YPDA斜面上，25～28℃培养7-10天，可生成金黄色孢子，即生产用斜面，于4℃冰箱中保藏，保藏时间在15天以内；
(2)孢子悬液制备
将5ml2％吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬液浓度为4-8×108个/100ml；
(3)一级种子培养
种子培养基由碳源、氮源组成，用10％H3PO4(w/v)调节pH 5.0～6.0，120～125℃灭菌15～25min，每100ml种子培养基接入1ml孢子悬液，在摇床转速150-200r/min下，25-30℃培养18～24h即得到适于接种的种子培养物；
(4)二级发酵培养
发酵培养基由碳源、氮源、磷源组成，用10％HCl(w/v)调节pH至4.0～6.0，120～125℃灭菌15～25min。将生长良好的种子培养液按2％～5％(v/v)的接种量接入到发酵罐中，在发酵过程中初始转速为100～200r/min，通气量为70～100L/h，罐压为0.05～0.1Mpa，培养温度25～28℃。通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平保持在20％～30％，培养18-22小时后，残糖降至10-14g/L时，即得适宜于转化的菌体培养液；
(5)底物的转化
·发酵
采用干粉投料，将底物进行预处理，底物要预先粉碎，要求粒度小于100μ，于50～100℃烘4h，投料量10～20g/L，在转化过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在10～30％，转化60-70h；
·检测
转化60h之后，通过薄层层析TLC和高效液相HPLC检测其转化率，其中采用TLC方法分析时，选用展开系统为苯∶丙酮＝3～5∶1～4或氯仿∶乙酸乙酯＝2～4∶1～5，采用HPLC分析时，选用C18柱，检测波长为280nm，选用70-90％甲醇水或乙腈水作为流动相，当转化率高于90％后放罐。
需要说明的是：
种子培养基由蛋白胨和酵母膏组成复合氮源，葡萄糖作为碳源，其组成含量为：
葡萄糖 16～26g/L；
蛋白胨 15～23g/L；
酵母膏 16～24g/L；
pH 5.0～6.0。
发酵培养基由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及KH2PO4构成。其组成含量为：
葡萄糖 16～26g/L；
蛋白胨 15～23g/L；
酵母膏 16～24g/L；
KH2PO4 1～5g/L；
pH 4.0～6.0；
转化时底物粉碎粒度推荐为10-20μ。底物烘烤温度60℃、转化时间60-70h为宜。
转化时采用TLC方法分析时，选用展开系统推荐为苯∶丙酮＝4∶1(v/v)或氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)；采用HPLC分析时，推荐选用80％甲醇水(v/v)作为流动相。
坎利酮11α羟化反应如下：
有益效果：
本发明提供一种投料量高、转化过程中不需要补料、经济实用适于大规模生产的分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的生产技术。本工艺与以往间歇补料发酵法生产工艺相比，工艺简单，从而降低了生产成本。菌体生物量达到峰值后持续下降，不存在菌体暴露于空气中的现象，解决了发酵液上层菌体不能参与转化反应的缺点。由于过程简单，染菌的机率很低，且转化时间短。终了转化率仍高于90％。本发明是一种新的、经济实用的、用生物技术生产11α羟基坎利酮方法，为大规模工业化生产奠定了基础，具有较大经济效益。
具体实施方式
实施例1：
生产菌种为赭曲霉(AS 3.4411)，该菌在PDA斜面(葡萄糖土豆汁斜面培养基)置于25℃恒温培养7天生成黄色孢子。覆盖在PDA斜面上，颜色为灰黄色，于斜面背面可以观察到红色色素。然后转接在YPDA斜面上，28℃培养5天，可生成金黄色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏10天后使用。将5ml2％吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬液浓度为4×108个/100ml。种子培养基由碳源、氮源组成，即：
葡萄糖 20g/L；
蛋白胨 20g/L；
酵母膏 20g/L；
pH 6.0；
用10％H3PO4(w/v)调节pH＝6，120～125℃灭菌15min。每100ml种子培养基接入1ml孢子悬液(4×108个)，在摇床转速150r/min下，28℃培养18h即得到适于接种的种子培养物。
发酵培养基组成：
葡萄糖 20g/L；
蛋白胨 20g/L；
酵母膏 20g/L；
KH2PO4 3.3g/L；
pH 4.5；
采用7L发酵罐，装液量为4.5L。用10％HCl(w/v)调节pH至4.5，120～125℃灭菌20min。将生长良好的种子培养液按3％(v/v)的接种量(135ml)接入到上述发酵培养基中。初始转速为100r/min，通气量为70L/h，罐压为0.05Mpa，28℃培养，过程中通过调节转速，通气量，罐压来维持溶解氧在30％左右。培养18h，残糖浓度为10g/L时即可得到适合转化的发酵培养物。采用干粉投料，要求底物粒度在30-50μ，投料前于80℃烘箱中烘3h之后投料。投67.5g底物坎利酮，转化过程中调节转速，通气量，罐压维持溶解氧在20％左右。转化60h之后，取样通过TLC和HPLC检测转化率，其中TLC方法分析，选用展开系统为苯∶丙酮＝4∶1(v/v)。HPLC分析时选用80％甲醇水(v/v)作为流动相。检测波长为280nm，选用C18柱。待转化率高于90％之后放罐。
实施例2：
生产菌种为赭曲霉(AS 3.4411)，该菌在小米斜面上置于28℃恒温培养5天生成黄色孢子。覆盖在PDA斜面上，颜色为灰黄色，于斜面背面可以观察到红色色素。然后转接在YPDA斜面上，26℃培养7天，可生成金黄色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏15天后使用。将5ml2％吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬液浓度为8×108个/100ml。
种子培养基由碳源、氮源组成，即：
葡萄糖 24g/L；
蛋白胨 23g/L；
酵母膏 16g/L；
pH 6.0；
用10％H3PO4(w/v)调节pH，120～125℃灭菌15min。每100ml种子培养基接入1ml孢子悬液(8×108个孢子)，在摇床转速180r/min下，28℃培养18h即得到适于接种的种子培养物。
发酵培养基组成：
葡萄糖 24g/L；
蛋白胨 17g/L；
酵母膏 22g/L；
KH2PO4 2g/L；
pH 4.0；
将108g葡萄糖溶于270ml水中配制成40％溶液。110℃灭菌10～15min。将蛋白胨76.5g，酵母膏99g，KH2PO4 9g溶于4.23L水中。用10％HCl(w/v)调节pH 4.0后装于7L罐中。120～125℃灭菌25min。将生长良好的种子培养液按5％(v/v)的接种量(225ml)连同葡萄糖接入到上述发酵培养基中。初始转速为200r/min，通气量为100L/h，罐压为0.1Mpa，26℃培养，过程中通过调节转速，通气量，罐压来维持溶解氧在30％左右。培养24h，残糖浓度为14g/L时即可得到适合转化的发酵培养物。采用干粉投料，要求底物粒度在10-20μ，投料前于60℃烘箱中烘4h之后投料。投90g底物坎利酮。投料后通过补加20％(w/v)NaOH溶液调节pH至6.0，转化过程中通过补加NaOH或HCl维持pH在6.0左右。转化过程中维持溶解氧在20％左右。转化70h之后，取样通过TLC和HPLC检测转化率，TLC分析时选用展开系统为氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)。HPLC分析时选用70％甲醇水(v/v)作为流动相。检测波长为280nm，选用C18柱。待转化率高于90％之后放罐。
实施例3：
生产菌种为赭曲霉(AS 3.4411)，该菌在PDA斜面(葡萄糖土豆汁斜面培养基)上置于28℃恒温培养7天生成黄色孢子。覆盖在PDA斜面上，颜色为灰黄色，于斜面背面可以观察到红色色素。然后转接在YPDA斜面上，28℃培养7天，可生成金黄色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏20天后使用。将5ml2％吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬液浓度为6×108个/100ml。
种子培养基由碳源、氮源组成，即：
葡萄糖 16g/L；
蛋白胨 22g/L；
酵母膏 15g/L；
pH 5.0；
用10％H3PO4(w/v)调节pH＝5，120～125℃灭菌15min。每100ml种子培养基接入1ml孢子悬液(6×108个孢子)，在摇床转速200r/min下，28℃培养20h即得到适于接种的种子培养物。
发酵培养基组成：
葡萄糖 16g/L；
蛋白胨 17g/L；
酵母膏 22g/L；
KH2PO4 4g/L；
pH 5.5；
7L发酵罐装液量为4.5L。用10％HCl(w/v)调节pH，120～125℃灭菌20min。将生长良好的种子培养液按5％(v/v)的接种量(225ml)接入到上述发酵培养基中。初始转速为150r/min，通气量为80L/h，罐压为0.1Mpa，26℃培养，过程中通过调节转速，通气量，罐压来维持溶解氧在30％左右。培养20h，残糖浓度为13g/L时即可得到适合转化的发酵培养物。采用干粉投料，要求底物粒度在20-30μ，投料前于70℃烘箱中烘4h之后投料。投90g底物坎利酮。转化过程中维持溶解氧在20％左右。转化70h之后，取样通过TLC和HPLC检测转化率，选用展开系统为氯仿∶乙酸乙酯＝4∶1(v/v)。HPLC分析时选用85％甲醇水(v/v)作为流动相。检测波长为280nm，选用C18柱。待转化率高于90％之后放罐。
Claims (6)
1、微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，其特征在于以赭曲霉为生产菌种，坎利酮为底物，经过产孢和生产斜面制备、孢子悬液制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化的分批发酵技术最终得到目标产物，具体方法如下：
(1)产孢和生产用斜面制备
生产菌种为赭曲霉，将该菌置于葡萄糖土豆汁斜面PDA培养基或小米斜面上，25-28℃恒温培养4-7天生成黄色孢子，覆盖在斜面上，颜色为灰黄色，于PDA斜面背面可以观察到红色色素，然后转接在酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖斜面培养基YPDA斜面上，25～28℃培养7-10天，生成金黄色孢子，即生产用斜面，于4℃冰箱中保藏，保藏时间在20天以内；
(2)孢子悬液制备
将5m12％吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬液浓度为4-8×108个/100ml；
(3)一级种子培养
种子培养基由碳源、氮源组成，用10％H3PO4(w/v)调节pH 5.0～6.0，120～125℃灭菌15～25min，每100ml种子培养基接入1ml孢子悬液，在摇床转速150-200r/min下，25-30℃培养18～24h即得到适于接种的种子培养物；
(4)二级发酵培养
发酵培养基由碳源、氮源、磷源组成，用10％HCl(w/v)调节pH 4.0～6.0，120～125℃灭菌15～25min，将生长良好的种子培养液按2％～5％(v/v)的接种量接入到发酵罐中，在发酵过程中初始转速为100～200r/min，通气量为70～100L/h，罐压为0.05～0.1Mpa，培养温度25～28℃，通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平保持在20％～30％，培养18-22小时后，残糖降至10-14g/L时，即得适宜于转化的菌体培养液；
(5)底物的转化
·发酵
采用干粉投料，将底物进行预处理，底物要预先粉碎，要求粒度小于100μ，于50～100℃烘4h，投料量10～20g/L，在转化过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在10～30％，转化60-70h；
·检测
转化60h之后，通过薄层层析TLC和高效液相HPLC检测其转化率，其中TLC方法分析时，选用展开系统为苯∶丙酮＝3～5∶1～4或氯仿∶乙酸乙酯＝2～4∶1～5，HPLC分析时选用C18柱，检测波长为280nm，选用70-90％甲醇水或乙腈水作
为流动相，当转化率高于90％后放罐。
2、根据权利要求1所述的微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，其特征在于种子培养基由蛋白胨和酵母膏组成复合氮源，葡萄糖作为碳源，其组成含量为：
葡萄糖 16～26g/L；
蛋白胨 15～23g/L；
酵母膏 16～24g/L；
pH 5.0～6.0。
3、根据权利要求1所述的微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，其特征在于发酵培养基由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及KH2PO4构成，其组成含量为：
葡萄糖 16～26g/L；
蛋白胨 15～23g/L；
酵母膏 16～24g/L；
KH2PO4 1～5g/L；
pH 4.0～6.0。
4、根据权利要求1所述的微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，其特征在于转化时，底物粉碎粒度为10-20μ。
5、根据权利要求1所述的微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，其特征在于转化时底物烘烤温度为60℃，转化时间为60-70h。
6、根据权利要求1-5任意一项所述的微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，其特征在于转化时TLC方法分析，选用展开系统为苯∶丙酮＝4∶1(v/v)或氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)；HPLC分析时选用80％甲醇水(v/v)作为流动相。
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