CH716482A2 - Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden Mittels zur Metastasenunterdrückung. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden Mittels zur Metastasenunterdrückung. Download PDFInfo
- Publication number
- CH716482A2 CH716482A2 CH00987/19A CH9872019A CH716482A2 CH 716482 A2 CH716482 A2 CH 716482A2 CH 00987/19 A CH00987/19 A CH 00987/19A CH 9872019 A CH9872019 A CH 9872019A CH 716482 A2 CH716482 A2 CH 716482A2
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- separated
- rpm
- minutes
- phosphate buffer
- tumor cells
- Prior art date
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 42
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 24
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 230000016507 interphase Effects 0.000 claims description 9
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 2
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 2
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001237 metamyelocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010015287 Erythropenia Diseases 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000610107 Homo sapiens Pre-B-cell leukemia transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102100040171 Pre-B-cell leukemia transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 210000001167 myeloblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M sodium;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoate;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoic acid;(2r,3r,4r,5s)-6-(methylamino)hexane-1,2,3,4,5-pentol Chemical compound [Na+].CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1275—Lipoproteins or protein-free species thereof, e.g. chylomicrons; Artificial high-density lipoproteins [HDL], low-density lipoproteins [LDL] or very-low-density lipoproteins [VLDL]; Precursors thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Hierin ist ein Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden therapeutischen Mittels offenbart, umfassend die folgenden Schritte: Abtrennen von Tumorzellen aus einer Biomaterialprobe eines Subjekts; Behandeln der abgetrennten Tumorzellen in einem Kulturmedium bei 37°C und 5% CO 2 während 24-72 h oder Behandeln der abgetrennten; Abtrennen einer Exosomenzusammensetzung aus dem Kulturmedium; Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer, um das Exosomen enthaltende therapeutische Mittel zu erhalten; dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium umfasst (i) entweder eine 1:1-Mischung von DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12) und HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure), 2 mmol/ml oder 3,65 mg/10 ml L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 10% fötales Rinderserum; oder (ii) 79 Gew.-% RPMI, 20 Gew.-% fötales Rinderserum und 1 Gew.-% Streptomycin.
Description
Gebiet der Offenbarung
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden therapeutischen Mittels zur Unterdrückung von Metastasen und ein Verfahren zur Behandlung mit einem Exosomen enthaltenden therapeutischen Mittel.
Hintergrund,Stand der Technik
[0002] RO 2593003 C2 offenbart ein Verfahren zur Tumorimmuntherapie, das auf der Verabreichung eines Exosomen enthaltenden Medikaments an den Patienten beruht, wobei Krebspatienten mit Exosomen behandelt werden, die aus der Zellkultur K562/i-S9 isoliert wurden, die es nicht erlaubt, spezifische Exosomen zu erhalten, weshalb es nicht möglich ist, eine hohe Effizienz der Immunantwort zu erreichen, im Gegensatz zu den Exosomen, die von patienteneigenen Tumorzellen produziert werden - die spezifische Antigene, ähnlich den Antigenen von Tumorzellen, enthalten, welche es erlauben, eine hocheffektive Immunantwort zu erzielen. Infolgedessen ist das bekannte Verfahren nicht genug wirksam.
Kurzdarstellung der Offenbarung
[0003] Es ist bekannt, dass Exosomen an verschiedenen Stadien von Immunantwortreaktionen beteiligt sind. Insbesondere Exosomen, die von B-Zellen sezerniert werden, tragen auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für MHC II (den Haupthistokompatibilitätskomplex II), co-stimulierende und anhaftende Moleküle, was ihre Fähigkeit zeigt, CD4-positive T-Zellen direkt zu stimulieren. [B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, Liejendekker R., Harding CV, Melief CJ, Geuze HJ, J. Exp. Med., 1. März 1996; 183 (3) :1161-72.] Um diesen Effekt zu verstärken, werden Exosomen beispielsweise durch Magnetkügelchen konzentriert und mit Peptiden beladen. Neben der Fähigkeit zum Aktivieren von CD4-positiven Zellen, sind Exosomen, die aus dendritischen Zellen gewonnen und mit Peptiden von prozessierten Tumorantigenen gepoolt werden, in der Lage, tumorspezifische zytotoxische Lymphozyten zu aktivieren und dadurch das Tumorwachstum zu hemmen. [Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi-Castagnoli P, Raposo G, Amigorena S, Nat. Med., Mai 1998; 4(5):594-600.]
[0004] So wirken von Tumorzellen sezernierte Exosomen auch als Aktivatoren des Immunsystems, aber im Verlauf des Tumorprozesses kommt es zu Transformationen, die es atypischen Zellen erlauben, der Wirkung immunkompetenter Zellen zu entgehen. Eine dieser Transformationen ist die Unfähigkeit von Lymphozyten, Exosomen als Träger von genetischem Material des Tumors zu erkennen. Bei der Anwendung von Exosomen, die aus dem Patienten erhalten wurden, per os besteht ein Kontakt zwischen den Zellen des Immunsystems und den von den Tumorzellen synthetisierten Exosomen, was zur Aktivierung von Antitumorimmunität führen kann.
[0005] Es ist eine allgemeine Aufgabe der Erfindung, ein weiterentwickeltes therapeutisches Mittel zur Unterdrückung von Metastasen bereitzustellen. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein therapeutisches Mittel mit erhöhter Wirksamkeit bereitgestellt.
[0006] In einem ersten Aspekt der Erfindung wird die allgemeine Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden therapeutischen Mittels, umfassend die folgenden Schritte:
Abtrennen von Tumorzellen aus einer Biomaterialprobe eines Subjekts;
Behandeln der abgetrennten Tumorzellen in einem Kulturmedium bei 37°C und 5% CO2während 24-72 h oder Behandeln der abgetrennten;
Abtrennen einer Exosomenzusammensetzung aus dem Kulturmedium;
Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer, um das Exosomen enthaltende therapeutische Mittel zu erhalten;dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium umfasst: (i) entweder eine 1:1-Mischung von DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12, gemäß Dulbecco, R. & Freeman, G. (1959) Virology 8, 396, und Smith et al. (1960) Virology 12, 185) und HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure), 2 mmol/ml oder 3,65 mg/10 ml L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 10% fötales Rinderserum; oder (ii) 79 Gew.-% RPMI, 20 Gew.-% fötales Rinderserum und 1 Gew.-% Streptomycin.
[0007] Wie der Fachmann versteht, ist RPMI, auch bekannt als RIMO 1640, ein in der Zellkultur verwendetes Wachstumsmedium (Atlas RM, Snyder JW (2006). Handbook of Media for Clinical Microbiology (2. Aufl.). Boca Raton, Florida: CRC Press. S. 427).
[0008] Es versteht sich, dass das Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden therapeutischen Mittels und insbesondere der Schritt der Abtrennung von Tumorzellen in vitro durchgeführt wird.
[0009] Typischerweise wird das Abtrennen von Tumorzellen aus einer Biomaterialprobe eines Subjekts mittels Zentrifugation erreicht.
[0010] In einigen Ausführungsformen wird das Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer so durchgeführt, dass ein Verhältnis von 1:5 bis 1:20 von abgetrennter Exosomenzusammensetzung zu Phosphatpuffer erhalten wird.
[0011] In weiteren Ausführungsformen besteht die Biomaterialprobe aus venösem Blut. Alternativ ist es auch möglich, intraoperativ gewonnenes peripheres Blut oder Tumorgewebe des Subjekts oder eine Aszites/Pleurites-Flüssigkeit metastatischer Herkunft zu verwenden.
[0012] In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Abtrennen der Tumorzellen: a. Exposition des Biomaterials an ein EDTA-Antikoagulans; b. Verdünnen mit Hanks-Salzlösung um einen Faktor 2; c. Auftragen der verdünnten Mischung auf eine Ficoll-Urografin (F-U))-Lösung mit einer Dichte von 1,077 g/cm<3>in einem Verhältnis von 1:4, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 2000 U/min; d. Sammeln eines erzeugten Interphasenrings; e. Verdünnen des Interphasenrings mit einer Phosphatpufferlösung in einem Verhältnis von 1:15 bis 1:20 und anschließendes 10-minütiges Zentrifugieren bei 1500 U/min, um ein Sediment bereitzustellen; f. Sammeln des Sediments, Hinzufügen von Lysierlösung und 10-minütiges Halten des gesammelten Sediments und der Lysierlösung bei 15-25°C; g. Mischen mit einem Phosphatpuffer mit 0,9 M CaCl2-Lösung h. Sammeln der Tumorzellen.
[0013] Der Vorteil dieses Verfahren zum Isolieren von Tumorzellen besteht in der Fähigkeit, einen bestmöglich quantitativen Pool von Tumorzellen zu erhalten, während ihre Lebensfähigkeit und Sterilität erhalten bleiben. Gleichzeitig erlaubt dieses Verfahren, bei minimalen Verlusten an Tumorzellen, Zellen zu beseitigen, die nicht in den interessierenden Pool fallen, wie etwa rote Blutzellen, Leukozyten und, teilweise Blutplättchen. Die Verwendung gewisser Typen von Enzymen, wie Accutase, minimiert die Schädigung von Zelloberflächenrezeptoren und antigenen Determinanten. Die Zentrifugationsbedingungen werden so gewählt, dass eine Unterscheidung von Zelltrümmern (Zellfragmenten und Zersetzungsprodukten) mit Exosomen von Zellen ermöglicht wird, wobei es, bei den Arbeitsstufen mit einem Überstand, der ein Präzipitat mit Zellfragmenten, Zersetzungsprodukten und Exosomen enthält, die beschriebenen Arbeitsbedingungen erlauben, eine Fraktion mit dem höchsten Gehalt an Exosomen aus dem Gesamtsediment zu gewinnen.
[0014] In einigen Ausführungsformen umfasst der Schritt des Abtrennens der Exosomenzusammensetzung von dem Kulturmedium ferner eine Differentialzentrifugation.
[0015] In weiteren Ausführungsformen wird die Differentialzentrifugation während 10 min bei 3000 U/min durchgeführt, gefolgt vom Sammeln eines erzeugten ersten Überstands und vom Zentrifugieren des ersten Überstands während 30 min bei 10 000 U/min, gefolgt vom Sammeln eines erzeugten zweiten Überstands und vom Ultrazentrifugieren des zweiten Überstands während 2 h bei 100 000 U/min, wobei nach jedem Zentrifugationsschritt eine Exosomenzusammensetzung abgetrennt wird.
[0016] Gemäß einem zweiten Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung der Metastasenentstehung bei einem Subjekt gerichtet, umfassend:
Entnehmen einer Biomaterialprobe des Subjekts;
Abtrennen von Tumorzellen aus der Biomaterialprobe;
Behandeln der abgetrennten Tumorzellen in einem Kulturmedium bei 37°C und 5% CO2während 24-72 h oder Behandeln der abgetrennten;
Abtrennen einer Exosomenzusammensetzung aus dem Kulturmedium;
Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer, um das Exosomen enthaltende therapeutische Mittel zu erhalten;
intravenöses Verabreichen des therapeutischen Mittels an das Subjekt;
dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium umfasst: (i) entweder eine 1:1-Mischung von DMEM/F12 und HEPES, 2 mmol/ml oder 3,65 mg/10 ml L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 10% fötales Rinderserum; oder (ii) 79 Gew.-% RPMI, 20 Gew.-% fötales Rinderserum und 1 Gew.-% Streptomycin.
[0017] In einigen Ausführungsformen wird das Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer so durchgeführt, dass ein Verhältnis von 1:5 bis 1:20 von abgetrennter Exosomenzusammensetzung zu Phosphatpuffer erhalten wird.
[0018] In weiteren Ausführungsformen besteht die Biomaterialprobe aus venösem Blut. Alternativ ist es auch möglich, intraoperativ gewonnenes peripheres Blut oder Tumorgewebe des Subjekts oder eine Aszites/Pleurites-Flüssigkeit metastatischer Herkunft zu verwenden.
[0019] In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Abtrennen der Tumorzellen: a. Exposition des Biomaterials an ein EDTA-Antikoagulans; b. Verdünnen mit Hanks-Salzlösung um einen Faktor 2; c. Auftragen der verdünnten Mischung auf eine Diatrizaoat)(Urografin))-Lösung mit einer Dichte von 1,077 g/cm<3>in einem Verhältnis von 1:4, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 2000 U/min; d. Sammeln eines erzeugten Interphasenrings; e. Verdünnen des Interphasenrings mit einer Phosphatpufferlösung in einem Verhältnis von 1:15 bis 1:20 und anschließendes 10-minütiges Zentrifugieren bei 1500 U/min, um ein Sediment bereitzustellen; f. Sammeln des Sediments, Hinzufügen von Lysierlösung und 10-minütiges Halten des gesammelten Sediments und der Lysierlösung bei 15-25°C; g. Mischen mit einem Phosphatpuffer mit 0,9 M CaCl2-Lösung h. Sammeln der Tumorzellen.
[0020] In einigen Ausführungsformen umfasst der Schritt des Abtrennens der Exosomenzusammensetzung aus dem Kulturmedium ferner eine Differentialzentrifugation.
[0021] In weiteren Ausführungsformen wird die Differentialzentrifugation während 10 min bei 3000 U/min durchgeführt, gefolgt vom Sammeln eines erzeugten ersten Überstands und vom Zentrifugieren des ersten Überstands während 30 min bei 10 000 U/min, gefolgt vom Sammeln eines erzeugten zweiten Überstands und vom Ultrazentrifugieren des zweiten Überstands während 2 h bei 100 000 U/min, wobei nach jedem Zentrifugationsschritt eine Exosomenzusammensetzung abgetrennt wird.
Exemplarische Ausführungsformen
[0022] Patient, 14 Jahre alt, Schüler, medizinische Vorgeschichte ohne Anomalien, akute B-lymphoblastische Leukämie, zytogenetische Variante t(1;19) (q23;p13), E2A/PBX1. Blasten im Knochenmarkaspirat (CD19+, CD79+, CD22cyt+, TdT+, HLADR+) 17,5%, die Leukozytenkomponente überschreitet die Obergrenze, neutrophile Metamyelozyten sind am stärksten erhöht (bis zu 67%), Myeloblasten sind nicht definiert. Im Hämogramm liegen vor: Blastenzellen 9%, Metamyelozyten 3%, Erythropenie bis zu 2,9*10^12/Liter, Leukopenie 2,3*10^9/Liter. Im Stadium der Erhaltungstherapie wurden, zusammen mit 6-Mercaptopurin, Exosomen, die aus autologen Tumorzellen erhalten worden waren, zweimal pro Woche per os verabreicht.
[0023] Zwei Monate nach der Arzneimittelverabreichung und bei Erhaltungstherapie zeigte der Patient eine Abnahme der Leukopenie von 2,3*10^9/Liter auf 3,1*10^9/Liter, was auf einen allmählichen Anstieg des Anteils reifer Leukozyten im Blutstrom hinweist; die Anzahl an Blasten im Knochenmarkaspirat sinkt von 17,5% auf 14%, Blastenzellen im Hämogramm werden nicht festgestellt. Bei den immunologischen Parametern ist ein Anstieg der zytotoxischen Aktivität von NK (Natural Killer)-Zellen von 65% vor der Arzneimittelverabreichung auf 78% nach der Arzneimittelverabreichung zu verzeichnen (mit einem Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen von 1:5). Diese Veränderungen untermauern die Verbesserung des Zustands des Patienten und die Stabilisierung des Prozesses.
[0024] Die Tumorzellen wurden aus dem venösen Blut des Patienten isoliert. Das venöse Blut wird in ein Reagenzglas mit einem Antikoagulans EDTA abgenommen, sodann wird das resultierende Blut 2-fach mit Hanks-Lösung verdünnt, dann wird es auf eine Fikoll-Urographin-Lösung mit einer Dichte von 1,077 g/cm<2>bei einem Verhältnis von 1:4 aufbeschichtet, dann 15 Minuten bei 4°C bei 2000 U/min zentrifugiert, dann wird der während der Zentrifugation gebildete Interphasenring abgesammelt und Phosphatpuffer-Salzlösungspuffer wird bei einem Verhältnis von 1:15 zugegeben, und dann wird 10 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert, woraufhin der Niederschlag isoliert wird und 2 ml der Lyselösung zugegeben werden, und die resultierende Mischung wird 10 Minuten lang bei 15°C gehalten, wonach der Phosphatpuffer-Salzlösungspuffer zu der Mischung beim Verhältnis 1:10 zugesetzt und verrührt wird. Dies wird dann 10 Minuten bei 1500 U/min zentrifugiert, danach wird der Überstand ausgegossen und 4 ml Phosphatpuffer-Salzlösungspuffer werden zum Niederschlag gegeben, ferner enthaltend 0,9 M CaCl2, und verrührt, dann werden Tumorzellen aus der erhaltenen Suspension in Form eines Niederschlags isoliert, indem diese durch ein Mikro-Röhrchen hindurchgeleitet wird. Der resultierende Niederschlag mit Tumorzellen wird sodann in einem Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung kultiviert: 79% RPMI, 20% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung, und zwar unter Bedingungen von t=37°C und 5% CO2, während 72 Stunden, wobei der Überstand alle 24 Stunden isoliert und dem verbleibenden Niederschlag Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 79% RPMI, 20% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung, im Volumen des isolierten Überstands hinzugesetzt wird.
[0025] Eine Isolierung von Exosomen enthaltendem Sediment aus dem resultierenden Kulturmedium wird durch Differentialzentrifugation vorgenommen, nämlich: Das resultierende Kulturmedium wird 10 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert, dann wird der resultierende Überstand abgesammelt und 30 Minuten bei 10 000 U/min weiter zentrifugiert. Dann wird der resultierende Überstand gesammelt und eine Ultrazentrifugation bei 100 000 U/min während 2 Stunden durchgeführt, danach wird der gebildete Niederschlag isoliert.
[0026] 1.1. Zur Erstellung eines Tumormodells zum Zwecke des Untersuchens der Prozesse der Metastasierung und Aktivierung der Immunantwort wurden immunkompetente männliche Mäuse der C57BL/6-Linie im Alter von nicht mehr als 4 Wochen ausgewählt. n = 27,1 × 10<5>Zellen der murinen Melanomlinie F10/B16 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 100 000 Zellen/0,1 ml PBS) wurden in die Schwanzvene aller Tiere injiziert. Der Metastasierungsprozess fand während 8 Tagen bis zum Zeitpunkt der Exposition statt.
[0027] 1.2. Zum Erhalten eines Präparats wurden die Zellen des murinen Melanoms der Linie F10/B16 aufgetaut und 72 h lang kultiviert, um die Menge von 6 000 000 zu erreichen. Danach wurden sie bei 3000 U/min zentrifugiert, der Überstand wurde an den Kunden übergeben, um das Präparat herzustellen.
[0028] 1.3. Die Tiere wurden in 3 Gruppen eingeteilt: Nr. 1 (i.v.-Injektion), Nr. 2 (orale Verabreichung), Nr. 3 (Kontrolle).
[0029] 1.4. Die Mäuse wurden unter standardmäßigen Vivariums-Bedingungen mit freiem Zugang zu brikettförmigem Futter und Wasser gehalten. Das Präparat wurde am 8. und 11. Tag nach dem Inokulationsdatum verabreicht: • in Gruppe 1 wurden 100 µg Präparat in die Schwanzvene injiziert, • in Gruppe 2 wurden 100 µg Präparat per os verabreicht, • in Gruppe 3 wurden 100 µg reines PBS (ohne Präparat) in die Schwanzvene injiziert.
[0030] Die Schlachtung erfolgte 16 Tage nach der Inokulation der Tumorzellen mithilfe der Genickbruch-Methode. Zur Beurteilung des Metastasierungsprozesses wurde eine visuelle Bewertung des Vorhandenseins und der Anzahl von Metastasen in der Leber durchgeführt und deren Masse gemessen. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse im Programm SPSS 22 bewertet. • Durchschnittliche Anzahl von Lebermetastasen in Gruppe Nr. 1: 5,5 +-0,5. Durchschnittliche Lebermasse: 1,2+-0,1. • Durchschnittliche Anzahl von Lebermetastasen in Gruppe Nr. 2: 3,8 +-0,3. Durchschnittliche Lebermasse: 1,1+-0,2 • Durchschnittliche Anzahl von Lebermetastasen in Gruppe Nr. 3: 9,0+-2,1. Durchschnittliche Lebermasse: 1,4+-0,2
[0031] Die Unterschiede in der Anzahl an Metastasen in den Beobachtungsgruppen gegenüber der Kontrolle sind signifikant (p<0,05). Der Unterschied in der Anzahl an Metastasen zwischen Gruppe 1 und 2 ist am Rande der Signifikanz (p<0,1). Die Lebermasse in den Beobachtungs- und Kontrollgruppen unterschied sich insignifikant (p>0,05).
[0032] Zum Beurteilen der Aktivierung des Immunsystems wurden Splenozyten aus der tierischen Milz isoliert, wobei der Prozentsatz an cytotoxischen CD8<+>-T-Lymphozyten mittels der Durchflusszytometrie-Methode bestimmt wurde. Zu diesem Zweck wurden die Splenozyten nach der Isolierung in PBS gewaschen und eine Stunde bei 4°C mit Anti-CD8-Antikörpern inkubiert, wobei eine weitere Analyse auf dem Durchflusszytofluorometer von Beckman&Dickinson erfolgte.
[0033] Der durchschnittliche Prozentsatz an CD8<+>-T-Lymphozyten in Gruppe Nr. 1: 27%
[0034] Der durchschnittliche Prozentsatz an CD8<+>-T-Lymphozyten in Gruppe Nr. 2: 36%
[0035] Der durchschnittliche Prozentsatz an CD8<+>-T-Lymphozyten in Gruppe Nr. 2: 17%
[0036] Die Werte „Beobachtung-Kontrolle“ unterscheiden sich signifikant (p<0,05). Der Unterschied zwischen den Gruppen 1 und 2 ist signifikant (p<0,05).
[0037] Die orale Verabreichung des Präparats hemmt den Metastasierungsprozess vergleichsweise stärker als die intravenöse Injektion. Ähnliche Beobachtungen wurden während der Analyse des Aktivierungsgrades des Immunsystems festgestellt. Der Prozess kann mit der Makrophagen-vermittelten Antigenpräsentation des Tumors an T-Killer zusammenhängen.
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden therapeutischen Mittels, umfassend die Schritte:
- Abtrennen von Tumorzellen aus einer Biomaterialprobe eines Subjekts;
- Behandeln der abgetrennten Tumorzellen in einem Kulturmedium bei 37°C und 5% CO2während 24-72 h oder Behandeln der abgetrennten;
- Abtrennen einer Exosomenzusammensetzung aus dem Kulturmedium;
- Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer, um das Exosomen enthaltende therapeutische Mittel zu erhalten;
dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium umfasst:
(i) entweder eine 1:1-Mischung aus DMEM/F12 und HEPES, 2 mmol/ml oder 3,65 mg/10 ml L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 10% fötalem Rinderserum; oder
(ii) 79 Gew.-% RPMI, 20 Gew.-% fötales Rinderserum und 1 Gew.-% Streptomycin.
2. Verfahren von Anspruch 1, wobei das Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer so durchgeführt wird, dass ein Verhältnis von 1:5 bis 1:20 von abgetrennter Exosomenzusammensetzung zu Phosphatpuffer erhalten wird.
3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Biomaterialprobe aus venösem Blut besteht.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Abtrennen der Tumorzellen Folgendes umfasst:
- Exposition des Biomaterials an ein EDTA-Antikoagulans;
- Verdünnen mit Hanks-Salzlösung um einen Faktor 2;
- Auftragen der verdünnten Mischung auf eine Ficoll-Urografin (F-U)-Lösung mit einer Dichte von 1,077 g/cm<3>in einem Verhältnis von 1:4, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 2000 U/min;
- Sammeln eines erzeugten Interphasenrings;
- Verdünnen des Interphasenrings mit einer Phosphatpufferlösung in einem Verhältnis von 1:15 bis 1:20 und anschließendes 10-minütiges Zentrifugieren bei 1500 U/min, um ein Sediment bereitzustellen;
- Sammeln des Sediments, Hinzufügen von Lysierlösung und 10-minütiges Halten des gesammelten Sediments und der Lysierlösung bei 15-25°C;
- Mischen mit einem Phosphatpuffer mit 0,9 M CaCl2-Lösung
- Sammeln der Tumorzellen.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt des Abtrennens der Exosomenzusammensetzung aus dem Kulturmedium ferner eine Differentialzentrifugation umfasst.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Differentialzentrifugation während 10 min bei 3000 U/min durchgeführt wird, gefolgt vom Sammeln eines erzeugten ersten Überstands und vom Zentrifugieren des ersten Überstands während 30 min bei 10 000 U/min, gefolgt vom Sammeln eines erzeugten zweiten Überstands und vom Ultrazentrifugieren des zweiten Überstands während 2 h bei 100 000 U/min, wobei nach jedem Zentrifugationsschritt eine Exosomenzusammensetzung abgetrennt wird.
7. Verfahren zur Behandlung der Metastasenentstehung in einem Subjekt, umfassend:
- Entnehmen einer Biomaterialprobe des Subjekts;
- Abtrennen von Tumorzellen aus der Biomaterialprobe;
- Behandeln der abgetrennten Tumorzellen in einem Kulturmedium bei 37°C und 5% CO2während 24-72 h oder Behandeln der abgetrennten;
- Abtrennen einer Exosomenzusammensetzung aus dem Kulturmedium;
- Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer, um das Exosomen enthaltende therapeutische Mittel zu erhalten;
- intravenöses Verabreichen des therapeutischen Mittels an das Subjekt;
dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium umfasst:
(iii) entweder eine 1:1-Mischung von DMEM/F12 und HEPES, 2 mmol/ml oder 3,65 mg/10 ml L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 10% fötales Rinderserum; oder
(iv) 79 Gew.-% RPMI, 20 Gew.-% fötales Rinderserum und 1 Gew.-% Streptomycin.
8. Verfahren von Anspruch 7, wobei das Lösen der abgetrennten Exosomenzusammensetzung in einem Phosphatpuffer so durchgeführt wird, dass ein Verhältnis von 1:5 bis 1:20 von abgetrennter Exosomenzusammensetzung zu Phosphatpuffer erhalten wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die Biomaterialprobe aus venösem Blut besteht.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Abtrennen der Tumorzellen umfasst:
- Exposition des Biomaterials an ein EDTA-Antikoagulans;
- Verdünnen mit Hanks-Salzlösung um einen Faktor 2;
- Auftragen der verdünnten Mischung auf eine Ficoll-Urografin (F-U)-Lösung mit einer Dichte von 1,077 g/cm<3>in einem Verhältnis von 1:4, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 2000 U/min;
- Sammeln eines erzeugten Interphasenrings;
- Verdünnen des Interphasenrings mit einer Phosphatpufferlösung in einem Verhältnis von 1:15 bis 1:20 und anschließendes 10-minütiges Zentrifugieren bei 1500 U/min, um ein Sediment bereitzustellen;
- Sammeln des Sediments, Hinzufügen von Lysierlösung und 10-minütiges Halten des gesammelten Sediments und der Lysierlösung bei 15-25°C;
- Mischen mit einem Phosphatpuffer mit 0,9 M CaC12-Lösung;
- Sammeln der Tumorzellen.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei der Schritt des Abtrennens der Exosomenzusammensetzung aus dem Kulturmedium ferner eine Differentialzentrifugation umfasst.
12. Verfahren von Anspruch 11, wobei die Differentialzentrifugation während 10 min bei 3000 U/min durchgeführt wird, gefolgt vom Sammeln eines erzeugten ersten Überstands und vom Zentrifugieren des ersten Überstands während 30 min bei 10 000 U/min, gefolgt vom Sammeln eines erzeugten zweiten Überstands und vom Ultrazentrifugieren des zweiten Überstands während 2 h bei 100 000 U/min,
wobei nach jedem Zentrifugationsschritt eine Exosomenzusammensetzung abgetrennt wird.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH00987/19A CH716482B1 (de) | 2019-08-05 | 2019-08-05 | Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden Mittels zur Metastasenunterdrückung. |
| US16/668,581 US20220105132A9 (en) | 2018-10-31 | 2019-10-30 | Method for Producing an Exosome Containing Agent for Metastasis Suppression |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH00987/19A CH716482B1 (de) | 2019-08-05 | 2019-08-05 | Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden Mittels zur Metastasenunterdrückung. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH716482A2 true CH716482A2 (de) | 2021-02-15 |
| CH716482B1 CH716482B1 (de) | 2023-02-15 |
Family
ID=74499602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH00987/19A CH716482B1 (de) | 2018-10-31 | 2019-08-05 | Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden Mittels zur Metastasenunterdrückung. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CH (1) | CH716482B1 (de) |
-
2019
- 2019-08-05 CH CH00987/19A patent/CH716482B1/de unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CH716482B1 (de) | 2023-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE102017127984B4 (de) | Verfahren für die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen | |
| DE69328481T2 (de) | In vitro bildung von dentritischen zellen | |
| DE60026561T2 (de) | Suppressorzellen zur prävention und behandlung von immunantworten bei transplantationen | |
| DE69839215T2 (de) | Dendritische zellhybride | |
| DE60218302T2 (de) | Verfahren zur gewinnung antigenspezifischer tr1-regualtorischer lymphozyten | |
| DE69826288T2 (de) | Zelluläres vesikel 'exosome', seine herstellung und verwendung zur stimulierung einer immunantwort | |
| DE69005885T2 (de) | Ablösen von Zellen von Affinitätsmatrizen. | |
| DE69734989T2 (de) | Antigenpräsentierende zellen, ein verfahren zur deren herstellung und deren verwendung als zelluläre impfstoffen | |
| EP0755439A1 (de) | Verfahren zur herstellung von dendritischen zellen, so erhaltene zellen und behälter zur durchführung dieses verfahrens | |
| EP1311658A1 (de) | Verfahren zur herstellung gebrauchsfertiger, antigenbeladener oder -unbeladener, kryokonservierter, reifer dendritischer zellen | |
| WO2006040076A2 (de) | Impf-adjuvanzien pam3cys, poly (i:c), imiquimod, loxoribine, r-848 und cpg-dna zusammen mit mhc i oder mhc ii epitopen | |
| JP2003511064A (ja) | ヒト末梢血単核細胞由来の樹状細胞の産生および特徴付け | |
| DE69505376T2 (de) | Alpha b crystallin zur verwendung in diagnose und therapie von autoimmunkrankheiten, besonders multipler skerose | |
| EP1308167A1 (de) | Antigenpräsentierende Vesikel | |
| CH716482A2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Exosomen enthaltenden Mittels zur Metastasenunterdrückung. | |
| EP1305041B1 (de) | Arzneimittel zur immuntherapie maligner tumoren | |
| DE60130634T2 (de) | Identifizierung von antigenen peptiden durch zytotoxische t-lymphozyten aktiviert von dendritischen zellhybriden | |
| DE60130206T2 (de) | Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von antigen-präsentierenden zellen | |
| EP1381387B1 (de) | Verwendung von stimulierten mononuklearen zellen des peripheren blutes zur behandlung von krebserkrankungen | |
| DE69012105T2 (de) | Proliferation von cd4-lymfocyten. | |
| US20240209317A1 (en) | Umbilical cord mesenchymal cell extracellular vesicles for the treatment of osteoarticular and autoimmune diseases | |
| CN114507642B (zh) | 一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法 | |
| US20210038641A1 (en) | Method for Producing an Exosome Containing Agent for Metastasis Suppression | |
| DE60038119T2 (de) | Dendritische zellen, aktiviert in anwesenheit von glucocorticoiden hormonen, sind in der lage, die antigenspezifische t-zell-antwort zu unterdrücken | |
| WO2000004918A2 (de) | Mittel zur immuntherapie von tumorerkrankungen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PK | Correction |
Free format text: BERICHTIGUNG |