CH715443B1 - Extrait purifié et concentré de polyphénols issu des fruits du palmier dattier Phoenix dactylifera. - Google Patents
Extrait purifié et concentré de polyphénols issu des fruits du palmier dattier Phoenix dactylifera. Download PDFInfo
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Abstract
Montré et décrit est un procédé d'extraction et de purification de composés polyphénoliques à partir du fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera. Selon l'invention, il est prévu que le procédé comprend les étapes : d'obtention et de préparation de la matière végétale, d'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant polaire et de récupération d'un extrait aqueux contenant des composés polyphénoliques, de concentration des composés polyphénoliques dans l'extrait aqueux, de purification des composés polyphénoliques de l'extrait aqueux par une méthode de chromatographie en phase solide, de récupération d'un extrait purifié concentré en composés polyphénoliques. En outre, montré et décrit est un extrait purifié de polyphénols issus du fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera et susceptible d'être obtenu par ledit procédé. Selon l'invention, il est prévu que l'extrait comprend, en poids par rapport au poids total de l'extrait purifié sec, jusqu'à 80% de composés polyphénoliques.
Description
DOMAINE TECHNIQUE
[0001] La présente invention concerne un extrait purifié concentré en composés polyphénoliques obtenu à partir du fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera, ainsi qu'un procédé d'extraction et de purification permettant d'obtenir un tel extrait.
[0002] Dans un souci de bien-être et de santé, la recherche et l'innovation industrielle s'orientent aujourd'hui vers l'utilisation de substances naturelles, aussi bien dans le domaine de la nutrition que dans ceux de la cosmétique ou de la pharmacie.
[0003] Plusieurs études phytochimiques ont montré que la bioactivité des extraits végétaux réside essentiellement dans leur richesse en antioxydants. En effet, les recherches actuelles sur les antioxydants et les radicaux libres ont confirmé que les espèces végétales riches en antioxydants jouent un rôle essentiel dans la prévention de certaines maladies cardio-vasculaires, cancers et maladies neurodégenératives. Par exemple, d'excellentes capacités à inhiber les réactions oxydatives ont été mises en évidence pour les extraits de romarin, sauge, thym, origan, clou de girofle et curcuma (Cuvelier et al. 1992 et 1996). Depuis, les recherches d'antioxydants naturels ont suscité beaucoup d'intérêt et ont fait l'objet de plusieurs recherches scientifiques (Bucic-Kojic et al. 2011).
[0004] Les polyphénols sont des composés antioxydants spécifiques du règne végétal, et dotés de diverses activités biologiques démontrées par de nombreuses études décrites dans la littérature scientifique. On citera notamment, en plus de leur activité antioxydante, des activités antiinflammatoires, antimicrobiennes, antivirales ou encore anticancéreuses.
[0005] Les polyphénols sont présents dans tous les organes de la plante. L'élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d'au moins un noyau benzénique, avec au moins un groupe hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction chimique telle que l'éther, l'ester, l'hétéroside. Les composés phénoliques présentent ainsi une très grande variété de structures. Ainsi, ils se répartissent dans différentes familles:
Les acides phénoliques, tels que les dérivés de l'acide hydroxybenzoique et les dérivés de de l'acide cinnamique,
Les falvonoides tels que les flavan-3-ols, dont les catéchines et les tanins, et les flavones, dont les flavonols.
[0006] Les dattes peuvent être considérées comme une source intéressante de polyphénols. En outre, une part importante de la production de dattes est transformée en produits dérivés, tels que des confitures, des jus et des sirops. Par conséquent, une grande quantité de noyaux de dattes et de fruits non commercialisés est produite comme un déchet qui peut être valorisé sur la base de sa teneur élevée en composés bioactifs et fibres alimentaires (Al-Farsi et al., 2008 ; Al-Shahib et Marshall, 2003).
[0007] Plusieurs travaux de recherches ont été réalisés afin d'estimer les teneurs en polyphénols totaux dans les dattes. Des études ont ainsi été menées sur les dattes fraîches et les dattes sèches (Al-Farsi et Lee, 2008 ; Mohamed et al., 2016), sur différentes variétés (Wu et al., 2004 ; Hammouda, 2014 ; Saafi et al, 2009, ou encore en fonction du stade de maturation, du cultivar et de la zone tissulaire étudiée (Hammouda, 2014).
[0008] Concernant les activités biologiques des extraits de dattes, des études ont démontré que les composés phénoliques de dattes présentaient des activités anti-tumorales et anti-cancéreuses (Hamed et al, 2017), antioxydantes, hypolipidimiques, cardioprotecteurs, anti-inflammatoires et anti-apoptotiques contre les dommages myocardiques (Taleb et al., 2016. ; Boutilali et al., 2017) et étaient de bons candidats en tant qu'agents antidtabétiques (Al-Maliki and Al Obaid, 2016; El Abed et al., 2017).
[0009] En raison de l'intérêt que représentent les composés phénoliques, la purification et la caractérisation de ces composés constituent un axe de recherche fondamental aujourd'hui.
[0010] Cependant les restrictions environnementales, économiques et sanitaires sont de plus en plus contraignantes sur la qualité des composés extraits des végétaux, qui peut être affectée par plusieurs facteurs Les paramètres et les techniques d'extraction mises en œuvre ainsi que les conditions environnementales, climatiques et géographiques sont déterminants pour la qualité des molécules extraites De nombreuses études ont été réalisées sur l'impact des différentes techniques d'extraction sur les rendements en antioxydants extraits (Bimakr et al. 2011; Benmeziane et al. 2014). La multiplicité et la diversité de ces paramètres à considérer en extraction végétale font qu'elle reste toujours difficile à modéliser.
[0011] L'invention, qui s'inscrit dans le cadre de la valorisation des substances naturelles, a été réalisée dans le but de l'amélioration des conditions d'extraction des molécules d'intérêt à partir du fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera, et de l'optimisation des rendements et de la stabilité des extraits obtenus L'invention a ainsi pour objectif de proposer un nouveau procédé d'extraction et de purification pour l'obtention des antioxydants naturels contenus dans cette matière végétale.
[0012] Le procédé selon l'invention se veut ainsi efficace, non polluant, non toxique et simple à mettre en œuvre.
EXPOSE DE L'INVENTION
[0013] Le but de la présente invention est ainsi de proposer un procédé d'extraction et de purification de composés polyphénoliques à partir du fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera, qui se caractérise en ce qu'il comprend les étapes : d'obtention et de préparation de la matière végétale, d'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant polaire et de récupération d'un extrait aqueux contenant des composés polyphénoliques, de concentration des composés polyphénoliques dans l'extrait aqueux, de purification des composés polyphénoliques de l'extrait aqueux par une méthode de chromatographie en phase solide, de récupération d'un extrait purifié concentré en composés polyphénoliques.
[0014] Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un extrait purifié contenant jusqu'à 80%, en poids, par rapport au poids sec de l'extrait, de composés polyphénoliques. De plus, l'extrait purifié peut contenir au moins 95%, préférentiellement au moins 99% de tanins, en poids par rapport au poids total de polyphénols.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Obtention et préparation de la matière végétale :
La matière végétale :
[0015] La matière végétale de depart est le fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera.
[0016] Ainsi, selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, l'étape d'obtention et de préparation de la matière végétale comprend l'obtention du fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera L., la séparation des tissus du fruit, le broyage des tissus, leur réduction sous forme d'une poudre et la lyophilisation de ladite poudre.
[0017] La séparation des tissus comprend l'isolement du noyau, de la peau et de la pulpe du fruit.
[0018] Préférentiellement, l'étape d'obtention et de préparation de la matière végétale comprend la sélection d'un fruit en fonction de son stade de maturité.
[0019] Le fruit du dattier comprend quatre stades de maturité Hababouk, Blah (Kimri), Besser (Khalal) et Tamar. La sélection du fruit en fonction de l'un de ses stades, et en fonction des tissus, permet d'obtenir des résultats différents en termes de teneur en polyphénols dans l'extrait sec purifié à l'issue du procédé.
[0020] De manière avantageuse, la préparation de la matière végétale comprend la congélation à l'azote liquide afin d'éviter toute réaction d'oxydation. En effet, lors de la séparation des tissus ou le découpage du fruit, on observe un brunissement enzymatique fort, lié à la quantité importante de tanins dans les tissus, qui provoque la transformation des couleurs de fruits aux stades 1, 2 et 3. La congélation à l'azote liquide permet d'éviter ce phénomène. La lyophilisation des tissus est réalisée après l'opération de broyage.
Extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant apolaire :
[0021] Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend, préalablement à l'étape d'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant polaire, l'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant apolaire et la récupération du résidu.
[0022] Cette étape d'extraction permet la séparation des composes apolaires, tels que les lipides, les chlorophylles et les caroténoïdes, des composés polaires dont les polyphénols Le résidu d'extraction est conservé pour la mise en œuvre de l'étape suivante du procédé. La phase liquide contenant les composés apolaires peut être valorisée par ailleurs.
[0023] Avantageusement, le solvant apolaire d'extraction est l'hexane.
[0024] Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant apolaire est réalisée successivement au moins deux fois.
Extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant polaire :
[0025] Cette étape d'extraction est réalisée successivement à l'étape d'extraction par solvant apolaire. Elle permet l'extraction et la récupération dans le solvant polaire d'un extrait contenant les polyphénols
[0026] Avantageusement, le solvant polaire de l'extraction solide-liquide est un mélange d'éthanol, d'eau et d'acide acétique, préférentiellement selon un ratio 80 :19 :1, ou un mélange d'acétone, d'eau et d'acide acétique, préférentiellement selon un ratio 50 :49 :1
[0027] Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant apolaire est réalisée successivement au moins deux fois, préférentiellement au moins trois fois Pour ce faire, les extraits obtenus sont mélangés après chaque extraction.
[0028] Par exemple, lorsque le procédé comporte trois étapes d'extraction successives, celui se déroule comme suit la première extraction en solvant polaire est réalisée sur le résidu obtenu après extraction en solvant apolaire. L'extrait aqueux obtenu est conservé et la seconde extraction est réalisée sur le résidu. L'extrait aqueux alors obtenu est également conservé et la troisième extraction est réalisée sur le résidu. L'extrait aqueux alors obtenu est également conservé. Les trois extraits aqueux sont poolés en un seul
[0029] Une centrifugation à 4500 tr/min pendant 10 min à 4°C a été réalisée afin de récupérer le surnageant.
Concentration des composes polyphénoliques dans l'extrait aqueux :
[0030] La concentration des polyphénols dans l'extrait aqueux est réalisée par évaporation du solvant polaire.
[0031] L'évaporation est réalisée en prenant la précaution d'éviter de concentrer l'acide acétique susceptible de dégrader les composés phénoliques, Pour ce faire, plusieurs étapes d'évaporation sont avantageusement réalisées, en ajoutant de l'eau entre chaque étape.
[0032] Par exemple pour un volume total de 100 ml, l'évaporation est réalisée jusqu'à réduction de la moitié du volume, c'est-à-dire jusqu'à obtention de 50 ml. Puis 25 ml d'eau sont ajoutés et on relance l'évaporation de nouveau jusqu'à la moitié de ce volume, environ 37ml. Une quantité d'eau est ajoutée de nouveau, la moitié de 37ml, pour obtenir au final un volume de 56 ml environ. L'évaporation est relancée de nouveau jusqu'à l'obtention d'environ la moitié de ce volume.
[0033] L'étape d'évaporation est très importante afin d'éviter que les polyphénols ne soit pas élus par la colonne, lors de l'étape suivante. Cette étape d'évaporation permet de remplacer les solvants utilisés par de l'eau ultra pure. Cela permet aussi d'éviter une trop forte concentration de l'acide acétique susceptible de dégrader les molécules phénoliques. Si cette étape est non réalisée, les polyphénols ne vont pas être élués par la colonne et la fraction sera perdue.
[0034] La centrifugation juste avant le passage à la colonne est une autre étape importante dans le procédé selon l'invention, Cette étape permet d'éviter le colmatage du système de séparation.
[0035] Différents essais montrent que le protocole de purification qui suit ne peut pas être applicable sans la réalisation de ces deux étapes d'évaporation et de centrifugation
Purification des composés polyphénoliques de l'extrait aqueux par une méthode de chromatopraphie en phase solide :
[0036] La purification en phase solide est réalisée par chromatographie en phase inverse ou par échanges d'ions.
[0037] Préférentiellement, cette étape est réalisée par adsorption des polyphénols sur un support solide compris dans une cartouche ou une colonne de silice greffées par des chaînes hydrocarbonées en C18 ou de résine échangeuse d'ions non ioniques, l'élution des polyphénols à l'aide d'un éluant polaire et la récupération d'une fraction enrichie en polyphénols.
[0038] En particulier, les cartouches utilisées sont la cartouche de gel de silice greffée C18 et commercialisées sous la marque Sep-Pack C18 par la société Waters ou la cartouche en résine commercialisée sous la marque Amberlite FPX 66 par la société Rohm & Haas France SAS.
[0039] Selon un mode de réalisation de l'invention, l'éluant est composé d'un mélange d'éthanol, d'eau et d'acide acétique selon un ratio 50:49:1.
[0040] Avantageusement, suite à l'élution, une étape de lavage a l'ethanol peut être réalisée de manière à éliminer les composés très hydrophobes qui peuvent être encore fixés.
Récupération d'un extrait purifié concentre en composés polyphénoliques:
[0041] La fraction purifiée obtenue après élution a l'étape précédente est récupérée et concentrée par évaporation. Avantageusement cette fraction est ensuite séchée par atomisation ou lyophilisation.
[0042] Pour ce faire, l'évaporation est réalisée en prenant la précaution d'éviter de concentrer l'acide acétique susceptible de dégrader les composés phénoliques. Pour ce faire, plusieurs étapes d'évaporation sont avantageusement réalisées, en ajoutant de l'eau entre chaque étape, de la même manière que ce qui a été décrit lors de l'étape de concentration précédente.
[0043] L'invention concerne aussi un extrait purifié de polyphénols issu du fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera et susceptible d'être obtenu par le procédé décrit précédemment, l'extrait se caractérisant en ce qu'il comprend, en poids par rapport au poids total de l'extrait purifié sec, jusqu'à 80% de composés polyphénoliques
[0044] Avantageusement, l'extrait contient au moins 95%, préférentiellement au moins 99% de tanins, en poids par rapport au poids total de polyphénols.
[0045] Avantageusement encore, l'extrait est obtenu à partir du noyau, de la peau et/ou de la pulpe du fruit du dattier Phoenix dactylifera L., en particulier au stade Kimri de maturation.
[0046] Avantageusement encore, les tanins que contient l'extrait présentent un degré de polymérisation moyen inférieur à 30, préférentiellement inférieur à 27, plus préférentiellement inférieur à 20
[0047] L'invention concerne encore une composition cosmétique, pharmaceutique, alimentaire, nutraceutique, qui se caractérise en ce qu'elle comprend un extrait tel que décrit précédemment.
[0048] Enfin, l'invention concerne un extrait tel que défini précédemment pour son utilisation à titre d'agent antioxydant, anti-viral, anti-inflammatoire, anti-cancéreux, anti-allergique ou analgésique.
EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION
[0049] Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaitront plus clairement à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, ladite description étant faite en relation avec les dessins joints, parmi lesquels : La [Fig 1] est une représentation graphique des étapes d'un procédé selon l'invention, et Les [Fig. 2] et [Fig. 3] représentent des diagrammes en bâtons indiquant les rendements de purification obtenus pour différents modes de réalisation du procédé selon l'invention,
[0050] Les étapes de différents modes de réalisation du procédé selon l'invention sont schématisées sur la Fig.1.
Obtention et préparation du matériel végétal :
[0051] Les fruits de deux variétés de dattes, V1 (Deglet Nour) et V2 (Medjool) ont été sélectionnés selon les quatre stades de maturité suivants :
Hababouk (stade 1),
Blah (Kimri) (stade 2),
Besser (Khalal) (stade 3),
Tamar (stade 4).
[0052] Les fruits ont été calibrés manuellement et, pour chaque échantillon, deux lots ont été constitués pour les analyses des polyphénols.
[0053] Les tissus, c'est-à-dire la peau, la pulpe et le noyau, ont été séparés les uns des autres puis congelés à l'azote liquide afin d'éviter l'oxydation. Après une opération de broyage, la lyophilisation des tissus est réalisée.
[0054] Il convient de noter qu'au stade 1 de maturation, le fruit a été étudié entièrement sans séparation des tissus car le noyau n'est pas encore formé.
[0055] Les échantillons en poudre lyophilisés sont conservés à l'abri de la lumière dans un dessiccateur, contenant du pentoxyde de phosphore afin d'éviter toute reprise d'humidité. Les échantillons sont pesés avant et après préparation afin de déterminer le pourcentage de la matière sèche (% MS) et la masse moyenne d'un fruit.
Exemple 1 :obtention d'un témoin
[0056] Des lots témoins sont réalisés à partir des tissus des fruits réduits simplement en poudre, sans mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Exemple 2 :obtention d'extraits purifiés de polyphénols
[0057] Des extractions solides-liquides successives sont réalisées à partir des échantillons de la matière végétale préparée sous forme de poudre lyophilisée : une première extraction à l'aide d'un solvant apolaire puis une seconde extraction à l'aide d'un solvant polaire.
[0058] Extraction solide-liquide par solvant apolaire : 10g d'échantillon sous forme de poudre lyophilisée sont mis en contact avec 80 mL d'hexane durant 15 min., sous agitation, puis filtrés, lors d'une première extraction. L'extrait obtenu, nommé H1, est mis de côté, et le résidu obtenu est soumis à une seconde extraction par mise en contact avec 80 mL d'hexane durant 15 min., sous agitation puis filtré. L'extrait obtenu, nommé H2, est mis de côté, et le résidu obtenu est récupéré puis séché sous azote durant 1h.
[0059] Extraction solide-liquide par solvant polaire: le solvant polaire est composé d'éthanol/eau/acide acétique selon un ratio de 80 .19 :1 (V/V/V) (solvant hydro-alcoolique)
[0060] Le résidu sec de l'extraction précédente est mis en contact avec 30 ml de solvant polaire durant 15 min., sous agitation, puis filtré, lors d'une première extraction. L'extrait obtenu, nommé E1, est conservé, et le résidu obtenu est soumis à une seconde extraction par mise en contact avec 30 mL du même solvant durant 15 min., sous agitation puis filtré. L'extrait obtenu, nommé E2, est conservé et le résidu obtenu est récupéré et soumis à une troisième extraction par mise en contact avec 30 mL du même solvant durant 15 min., sous agitation puis filtré. L'extrait obtenu, nommé E3, est conservé.
[0061] Les extraits E1, E2 et E3 sont poolés.
[0062] Une centrifugation à 4500 tr/min pendant 10 min à 4°C est réalisée afin de récupérer le surnageant.
Concentration
[0063] L'évaporation des extrarts hydro-éthanoliques est réalisée à une température de 48°C en prenant la précaution de rajouter deux fois un volume d'eau entre chaque étape d'évaporation aboutissant à la réduction de la moitié du volume Cela permet d'éviter une trop forte concentration de l'acide acétique susceptible de dégrader les molécules phénoliques. La dernière étape d'évaporation est stoppée lorsque le volume atteint environ la moitié.
Purification:
[0064] Les extraits aqueux stockés à 2°C sous argon contiennent un dépôt important qui peut boucher le fritté de la cartouche SPE. Une centrifugation à 4500 tr/min pendant 10 min à 4°C est réalisée afin de récupérer le surnageant qui sera utilisé pour la cartouche Sep Pack C18 (commercialisée par la société Waters) pour la mise en œuvre d'une extraction en phase solide (SPE). Des cartouches SPE contenant 5 g de gel C18 sont conditionnées à l'éthanol (20 mL) puis équilibrées à l'eau acidifiée (40 mL) avant que ne soient déposés les extraits aqueux (40 ml) centrifugés de chaque échantillon. Un rinçage est effectué par 40 mL d'eau acidifiée (à 2% d'acide acétique), puis la fraction retenue est éluée par 40 mL de mélange éthanol/eau/acide acétique (50 : 49 :1 ; V/V/V). La colonne est ensuite lavée par 30 mL d'éthanol pour éliminer les polyphénols très hydrophobes qui peuvent être encore fixés.
Concentration et récupération d'une fraction purifiée de polyphénols
[0065] Une évaporation des extraits obtenus après purification est réalisée à une température de 48°C en prenant la précaution de rajouter deux fois un volume d'eau entre chaque étape d'évaporation aboutissant à la réduction de la moitié du volume. Cela permet d'éviter une trop forte concentration de l'acide acétique susceptible de dégrader les molécules phénoliques. La dernière étape d'évaporation est stoppée lorsque le volume atteint environ la moitié. Les suspensions aqueuses obtenues sont congelées à -80°C puis lyophilisées pendant deux jours pour obtenir des poudres sèches.
[0066] Les échantillons sont alors prêts pour la caractérisation par HPLC avec et sans phloroglucinolyse préalable.
Exemple 3 :
[0067] Des extraits purifiés de polyphénols sont obtenus à l'aide d'un procédé identique à celui décrit dans l'exemple 2 mis à part que l'étape de purification est réalisée à l'aide d'une colonne échangeuse d'ions FPX 66 (Société Rohm & Haas France SAS).
Exemple 4:
[0068] Des extraits purifiés de polyphénols sont obtenus à l'aire d'un procédé identique à celui décrit dans l'exemple 2 mis à part que l'étape d'extraction à l'aide du solvant polaire est réalisée à l'aide d'un solvant composé d'acétone/eau/acide acétique selon un ratio de 50 :49 :1 (V/V/V) (solvant hydro-acétonique).
Exemple 5 :
[0069] Des extraits purifiés de polyphénols sont obtenus à l'aire d'un procédé identique à celui décrit dans l'exemple 4 mis à part que l'étape de purification est réalisée à l'aide d'une colonne échangeuse d'ions FPX 66 (Société Rohm & Haas France SAS).
Analyse et caractérisation structurale des polyphénols des poudres témoins (exemple 1) et desextraits polyphénoliques purifiés (exemples 2,3,4,5) :
Mode opératoire
[0070] Pour chaque extrait phénolique de datte (ex. 2 à 5) ou chaque échantillon de poudre de datte (ex.1), une aliquote (de l'ordre de 3 mg, pesée précisément à 0.01 mg près) est placée dans un eppendorf. On ajoute 1200 µL d'acide acétique 1% dilué dans du méthanol. On disperse le mélange par passage dans un bain à ultra-son pendant environ 15 min et on filtre le surnageant à l'aide d'un filtre téflon (0,45µm de porosité et 13 mm de diamètre). Dans ces conditions, les extraits sont solubles et directement injectables en HPLC par LC-ESI/MS.
[0071] Hydrolyse acide : La méthode d'hydrolyse acide a été utilisée pour confirmer l'identification des aglycones conjugués des flavonols ou flavones présents dans les échantillons. Un millilitre de l'extrait méthanoïque de datte a été mélangé avec 1 ml de HCl (2N), le mélange a été chauffé à 90 ° C pendant 30 min dans des flacons en verre fermés. La neutralisation a été effectuée par addition de 1 ml de NaOH (2N) (Bloor, 2001). En vue d'obtenir une fragmentation suffisante des ions moléculaires aglycones, l'énergie de collision MS / MS a été fixée à 50% (unités arbitraires).
Appareillage
[0072] La séparation des composés est réalisée sur une chaîne HPLC constituée d'un système de dégazage SCM1000 (ThermoQuest, San Jose, CA, USA), un système d'injection automatique (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA), une pompe binaire 1100 Séries (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), et un détecteur à barrette de diodes Spectra system UV6000LP (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA). Le spectromètre de masse à piège d'ions LCQ Deca (ThermoFinnigan San Jose, CA, USA) est équipé d'une source d'ionisation Electrospray (SIE). La totalité des effluents du détecteur à barrette de diode est injectée dans le spectromètre de masse. Les échantillons injectés (5 µL) sont séparés sur une colonne Zorbax Eclipse XDB-C18 (2,1 mm x 150 mm, 3,5 µm, Agitent Technologies) où la température est maintenue à 30°C.
Conditions d'analyse
[0073] Les conditions d'analyse sont les suivantes :l'éluant A est l'acide formique (Fischer scientific, Loughborough, UK) dilué à 0,1 % dans l'eau ultrapure, et l'éluant B est l'acide formique à 0,1% dilué dans l'acétonitrile. Le gradient appliqué avec un débit de 0,2 mL/min est : état initial, 3% de B; 0-5 min, 9% B, linéaire ; 5-15 min, 16% B, linéaire ; 15-45 min, 50% B, linéaire ; puis un rinçage et un retour aux conditions initiales.
II.4.5 Paramètres SIE, MS et MSn
[0074] Le diazote (N2) sert à vaporiser l'échantillon sous forme de gouttelettes et à les assécher afin d'obtenir les ions pseudo-moléculaires.
[0075] Les analyses sont réalisées en mode négatif avec comme paramètres : tension 5 kV, le gaz N2 principal est à 67 u.a. le gaz N2 auxiliaire à 5 u.a. et la température du capillaire est fixée à 240°C. L'hélium est utilisé comme gaz de stabilisation, de focalisation et de collision pour fragmenter les ions en MSn. Ces ions sont ensuite convertis en pics d'intensités différentes que l'on peut observer sur les chromatogrammes. L'énergie de collision est fixée à 35 % pour la fragmentation en MSn.
[0076] Les spectres de la HPLC-MS sont acquis en „Full Scan“, sur l'ensemble de la gamme des masses (m/z) allant de 50 à 2000. L'ensemble des données est ensuite collecté et traité par le logiciel Xcalibur version 1.2.
Résultats :
[0077] Il convient de noter qu'au premier stade de maturation (Hababouk), la taille des fruits ne permet pas de considérer séparément les trois tissus. Les résultats ci-dessous sont obtenus par l'analyse par HPLC en phase inverse avec détection en UV-visible des extraits méthanoliques des poudres de tissus considérés et dépolymérisation par phloroglucinolyse. Il est donc possible de faire la distinction entre les unités catéchines terminales et les unités catéchines d'extension en donnant l'accès aussi au calcul de degré de polymérisation moyen (DPn) des flavan-3ols.
[0078] La quantification a été effectuée en reportant le résultat de l'intégration des différents pics chromatographiques dans l'équation d'une droite d'étalonnage obtenue avec les standards respectifs de chaque classe phénolique. La quantification des quatre plus importantes classes phénoliques de la datte, à savoir les flavan-3-ols, les flavones, les flavonols et les acides hydroxycinnamiques, a été réalisée. Pour la classe phénolique flavan-3-ols il a été distingué les catéchines monomères, les procyanidines oligomères jusqu'au pentamère et le reste des procyanidines (tanins condensés polymères) accessibles au dosage par l'intermédiaire de la phloroglucinolyse.
1)Analyse qualitative et quantification des polyphenols totaux dans les poudres de l'exemple 1
Quantification des polyphènols totaux:
[0079] Les quantités totales de polyphénols (en g/kg de MS), en fonction de la variété et du stade de maturation des fruits de dattes selon l'exemple 1, sont indiquées dans le Tableau 1.
Tableau 1:
[0080] Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Poudre stade 1 62.36 78.84 Poudre stade 2 50.33 66.78 54.92 62.43 49.54 75.76 Poudre stade 3 20.82 37.56 25.50 32.43 22.44 41.41 Poudre stade 4 22.77 19.09 17.06 23.78 20.43 11.38
Quantification des flavon-3-ols (tanins condensés) dans les polyphénols totaux:
[0081] Les pourcentages de tanins condensés dans les polyphénols totaux en fonction de la variété et du stade de maturation des fruits selon l'exemple 1 sont indiqués dans le Tableau 2.
Tableau 2:
[0082] Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Poudre stade 1 99.5 99,1 Poudre stade 2 99.67 98.03 99.11 99.32 99.76 99,95 Poudre stade 3 99.6 98.29 99.03 99.63 97.12 99.48 Poudre stade 4 99.33 97.73 99.12 99.44 97.93 99.51
Degré de polymérisation (DPn) des flavan-3-ols (tanins condensés)
[0083] Les degrés de polymérisation en fonction de la variété et du stade de maturation des fruits de dattes selon l'exemple 1 sont indiqués dans le Tableau 3.
Tableau 3
[0084] variété Tissus V1 Noyau 89.52(1) 83,54 (5,98) 93.27 (7.23) 78 25 (7.54) Peau 74,65 (3,43) 135,16 (4.95) 30.59 (2.84) Pulpe 71,41 (2,87) 61,95 (11,12) 69.12 (3.92) V2 Noyau 76.55(1) 66,99 (5,67) 31,04 (1,51) 31 44 (0,64) Peau 77,89 (2,87) 91,97 (7,36) 73,76 (3,05) Pulpe 45,77 (1,54) 31.57 (0,63) 31 34 (0.77)
[0085] Les résultats montrent la richesse des échantillons étudiés en polyphénols (Tableau 1). Par comparaison avec quelques fruits, on observe que le fruit de datte possède la forte teneur en polyphénols par une valeur qui dépasse 25 g/kg de matière fraîche. En revanche dans la pomme les teneurs en polyphénols ne dépassent pas 7 g/kg (Sanoner et al., 1999). Dans les raisins, les polyphénols totaux varient entre 0,5 et 5,7 g/kg de matière fraîche (Nile et al., 2013). La poire possède la faible teneur en polyphénols qui ne dépasse pas 2 g/kg de matière fraîche (Galvis Sanchez et al., 2003). Les analyses montrent que les teneurs en polyphénols diminuent du stade 1 au stade 2, puis une légère diminution au cours de la maturation où l'oxydation joue un rôle primordial pour cette décroissance au niveau des teneurs totales des polyphénols.
[0086] La caractérisation des composés phénoliques montre que la classe majoritaire des polyphénols de dattes dans les différents tissus est celle des flavan-3-ols (tanins) caractérisée par la présence des catéchines monomères et des procyanidines oligomers (Tableau 2). Les autres classes phénoliques sont présentes dans les poudres de dattes d'une façon minoritaire comme les acides hydroxycinnamiques (l'acide caféoylshikimique) ou les flavonols et les flavones.
[0087] Les résultats montrent également qu'au stade 1 les flavan-3-ols possèdent des degrés de polymérisation très élevés. Les DPn les moins élevés sont trouvés dans les échantillons du stade 4 de maturation (Tableau 3).
2) Analyse qualitative et quantification des polyphénols dans les extraits des exemples 2,3,4 et 5
[0088] De nombreux paramètres peuvent influencer les opérations d'extraction solide-liquide et de purification des polyphénols tels que les volumes des solvants, les durées d'extraction et la température. Il est important de bien les sélectionner afin d'assurer une extraction efficace. L'extraction fait partie des premières étapes pour isoler les composés phénoliques. Une procédure d'extraction efficace permet d'optimiser les rendements d'extraction et de garantir le maintien de la stabilité des polyphénols. De plus, la nature de système de séparation et de purification ainsi que les éluant utilisés peuvent changer les rendements massiques des produits purifiés.
[0089] Les exemples 2 à 5 illustrent le travail de sélection réalisé quant au choix des solvants d'extraction et du système de purification.
[0090] Pour rappel, selon l'exemple 2, les extraits sont obtenus après une extraction à l'aide d'un solvant polaire hydro-alcoolique composé d'éthanol/eau/acide acétique et une purification réalisée sur une colonne en phase inverse (Sep Pack C18).
[0091] Selon l'exemple 3, les extraits sont obtenus après une extraction à l'aide d'un solvant polaire hydro-alcoolique d'éthanol/eau/acide acétique et une purification réalisée sur une colonne FPX 66.
[0092] Selon l'exemple 4, les extraits sont obtenus après une extraction à l'aide d'un solvant polaire hydro-acétonique composé d'acétone/eau/acide acétique et une purification réalisée sur une colonne en phase inverse (Sep Pack C18)
[0093] Selon l'exemple 5, les extraits sont obtenus après une extraction à l'aide d'un solvant polaire hydro-acétonique composé d'acétone/eau/acide acétique et une purification réalisée sur une colonne FPX 66.
Rendements de purification
[0094] Les Figs. 2 et 3 indiquent, respectivement, les rendements (en g/kg) pour les extraits hydro-alcooliques obtenus par purification sur colonne Sep Pack C18 ou FPX 66 (Fig. 2), et pour les extraits hydro-acétoniques obtenus par purification sur colonne Sep Pack C18 ou FPX 66 (Fig. 3).
[0095] Sur ces figures sont indiqués les variétés et les stades de maturation : V1 : variété 1 ; V2 : variété 2 ; 1, 2,3,4 : stade de maturation.
[0096] Les résultats indiquent que la purification par la colonne FPX 66<®>donne les meilleurs rendements massiques par comparaison avec la colonne Sep Pack C18<®>. De même, les résultats indiquent qu'un meilleur rendement est obtenu à l'aide du solvant acétone/eau/acide acétique par comparaison avec le solvant éthanol/eau/acide acétique.
Quantification des polyphénols totaux:
[0097] Les quantités totales de polyphénols (en g/kg de MS), en fonction de la variété et du stade de maturation des fruits de dattes selon les exemples 2 à 5, sont indiquées dans le Tableau 4.
Tableau 4
[0098] Variétés V1 V2 Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Poudre stade 1 667.93 691.64 Poudre stade 2 603.99 584.9 516,29 652.24 607.39 408.11 Poudre stade 3 400.57 329.85 401 78 421.01 193.85 90.63 Poudre stade 4 101.72 198.42 128.46 396 52 219 11 67.79 Exemple 3 Variétés V1 V2 Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Poudre stade 1 730.00 750.91 Poudre stade 2 680.85 657.05 154.23 646.96 652.26 564.61 Poudre stade 3 575.03 567.00 439.08 568.52 560.14 441.22 Poudre stade 4 523.72 543.39 425.59 521.18 533.68 413.79 Exemple 4 Variétés V1 V2 Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Poudre stade 1 798.32 792.7 Poudre stade 2 792.58 727.55 617.00 777.67 723.22 598.79 Poudre stade 3 145.54 685.07 597.45 739.67 694.97 581.92 Poudre stade 4 723.64 673.63 576.01 713.13 662.59 571.99 Exemple 5 Variétés V1 V2 Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Poudre stade 1 782.77 765.45 Poudre stade 2 772.16 708.76 586.77 768.58 105.62 563.73 Poudre stade 1 684.54 634.13 566.88 674.67 622.29 571.23 Poudre stade 4 664.21 637.31 546.25 658.15 623.03 530.89
[0099] Par comparaison avec les quantités de polyphénols observées pour l'exemple 1, les résultats reportés dans le Tableau 4 indiquent que les deux colonnes de purification sont efficaces pour purifier les polyphénols.
[0100] Par comparaison des exemples 2 et 3, les résultats indiquent qu'en utilisant comme solvant d'extraction le mélange éthanol/eau/acide acétique, la colonne de purification FPX 66<®>permet d'obtenir une plus grande quantité de polyphénols (ex.3).
[0101] Par comparaison des exemples 3 et 5, les résultats indiquent qu'en utilisant la colonne de purification FPX 66<®>, le mélange acétone/eau/acide acétique permet d'obtenir une plus grande quantité de polyphénols.
[0102] Pour tous les exemples, les plus fortes teneurs en polyphénols sont trouvées au stade 1 de maturation. A ce stade, les extraits contiennent entre 66 et 80% de polyphénols. Aux stades 2 à 4 de maturation, c'est également toujours le noyau qui contient la plus forte teneur en polyphénols, comparativement aux autres tissus. Pour un même tissu, on note une légère baisse de la teneur en polyphénols du stade 1 au stade 4.
[0103] Par comparaison, entre les solvants d'extraction par des mélanges hydro-alcoolique et hydro-acétonique, le solvant le plus efficace pour la purification est l'acétone vu sa capacité pour extraire les molécules hautement polymérisées (exemple 2 versus exemple 4 et exemple 3 versus exemple 5).
Quantification des flavan-3-ols (tanins condensés) dans les polyohénols totaux:
[0104] Les pourcentages de flavan-3-ols dans les polyphénols totaux en fonction de la variété et du stade de maturation des fruits de dattes selon les exemples 2 à 5 sont indiqués dans le Tableau 5.
Tableau 5:
[0105] Variétés V1 V2 Tissus Noyau Peau Pulpe Nayau Peau Pulpe Extraits stade 1 99.1 99.3 Extraits stade 2 98.27 88.94 91.18 99.23 89.05 95.81 Extraits stade 3 99.1 77.49 90.24 99.31 76.62 78.09 Extraits stade 4 99.32 77.89 55.70 99.10 77.48 81.43 Exemple 3 Variétés V1 V2 Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Extraits stade 1 99.2 99.5 Extraits stade 2 98.54 94.44 94.93 99.42 93.49 97.00 Extraits stade 3 99.30 92.00 93.53 99.35 91.18 95.39 Extraits stade 4 99.44 94.19 92.99 99.39 93.84 96.96 Exemple 4 Variétés V1 V2 Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Extraits stade 1 99.6 99.0 Extraits stade 2 98.57 95.22 95.30 99.41 94.53 97.19 Extraits stade 3 99. 51 95.30 95.40 99.14 95.25 95.88 Extraits stade 4 99.56 95.60 95.29 99.51 95.38 96.12 Exemple 5 Variétés V1 V2 Tissus Noyau Peau Pulpe Noyau Peau Pulpe Extraits stade 1 99.7 99.3 Extraits stade 2 99.44 95,91 95.92 99.25 95.73 97.15 Extraits stade 3 99.40 96.30 95.94 99.60 96.68 96.61 Extraits stade 4 99.56 96.18 95.71 99.64 96.55 96.44
[0106] Les résultats montrent que la classe des flavan-3-ols (tanins) est la classe phénolique majoritaire dans les extraits de dattes et que cette classe est majoritairement sous forme des tanins condensés. Les pourcentages de ces derniers varient entre 55 et plus de 99%, ce qui rend les autres classes phénoliques comme les acides hydroxycinnamiques, les flavonols et les flavones minoritaires dans les fractions purifiées.
[0107] La plus forte concentration en flavan-3-ols est retrouvée dans les noyaux, quel que soit le stade de maturation et la variété végétale. En effet, quels que soient les exemples, les résultats indiquent que plus de 99% des polyphénols des noyaux sont des tanins. Les proportions de tanins les plus élevées sont trouvée aux stades 3 et 4.
[0108] La comparaison de ces résultats avec d'autres fruit montre que les tanins dans les dattes sont spécifiques.
[0109] Dans les pommes à cidre, les pourcentages des flavan-3-ols oscillent entre 49 et 86% (Guyot et al., 2003), par contre dans les pulpes des pommes à table est entre 68 et 81% et dans les peaux varient entre 72 et 86% (Guyot et al., 2002).
[0110] Les pourcentages des flavan-3-ols dans les poires sont plus faibles par comparaison avec les pommes ou notre fruit qui est la datte. Les résultats des travaux antérieurs montrent que les valeurs des pourcentages des flavan-3-ols dans les poires varient entre 1% et 31% qui est la valeur trouvée dans la variété coscia (Galvis-Sanchez et al., 2003).
[0111] Buendia et ses collaborateurs ont étudié plusieurs variétés de strawberry et d'après cette étude les pourcentages des flavan-3-ols dans les polyphénols dosés varient entre 32% et 72% (Buendia et al., 2010).
[0112] Des études ont été menées sur les pépins de raisin, les résultats montrent que les tanins représentent des pourcentages qui varient entre 27 et 34 % des polyphénols totaux (Bozan et al., 2008).
[0113] D'après les travaux antérieurs, les dattes peuvent être considérées parmi les fruits les plus riches en polyphénols où les tanins représentent les composés majoritaires.
[0114] Par ailleurs, la comparaison des exemples 3 et 5 montre que la colonne alimentaire FPX 66 est plus efficace pour purifier des fractions plus riches en polyphénols et majoritairement composés par des tanins. En effet, les pourcentages des flavan-3-ols (tanins) dans les polyphénols totaux dosés dans les extraits hydro-acétoniques purifiés par la colonne alimentaire FPX 66 sont très élevés (exemple 5). Les valeurs dépassent les 95% dans les extraits des pulpes et des peaux et dépassent les 99% dans les extraits des noyaux.
Degrés de polymérisation (DPn) des flavan-3-ols (tanins condensés)
[0115] Les degrés de polymérisation moyens (DPn) des flavan-3-ols dans les extraits des exemples 2,3,4 et 5 sont indiqués dans les Tableaux 6, 7, 8 et 9, respectivement.
Tableau 6
[0116] Example 2 Tissus V1 Noyau 31 (1) 21,54 (1,22) 17.97 (0.20) 18.82 (0.03) Peau 37,85 (1,41) 35,23 (1.58) 31.03 (0.85) Pulpe 26,24 (3,01) 24.82 (0.28) 7.21 (1.04) V2 Noyau 35 (1) 19,21 (0,98) 18.73 (0.67) 2053 (2.75) Peau 23,45 (1,23) 17.84 (0,29) 9,76 (0.17) Pulpe 20,21 (1,45) 12.13 (0. 08) 9.38 (1.71)
Tableau 7 :
[0117] Exemple 3 Tissus V1 Noyau 32 (1) 22 (2) 19 (1) 20 (2) Peau 39 (2) 38 (2) 30 (1) Pulpe 28 (3) 25 (1) 10 (1) V2 Noyau 28 (1) 21 (1) 20 (1) 21 (3) Peau 25 (2) 25 (3) 9 (1) Pulpe 20 (1) 12 (1) 10 (2)
Tableau 8
[0118] Exemple 4 Tissus V1 Noyau 77 (1) 55 (1) 44 (1) 45 (2) Peau 49 (1) 38 (2) 39 (1) Pulpe 29 (2) 25 (1) 12 (1) V2 Noyau 88 (2) 61 (1) 40 (1) 43 (1) Peau 55 (2) 35 (2) 41 (2) Pulpe 27 (1) 22 (1) 15 (1)
Tableau 9
[0119] Exemple 5 Tissus V1 Noyau 91 (1) 75 (2) 64 (2) 51 (1) Peau 59 (2) 48 (1) 44 (2) Pulpe 29 (1) 20 (1) 14 (1) V2 Noyau 99 (2) 72 (1) 61 (2) 53 (2) Peau 52 (1) 36 (1) 45 (1) Pulpe 19 (2) 16 (1) 17 (1)
[0120] Les valeurs montrent que lorsque l'on compare les tissus entre eux en fonction des stades de maturations les flavan-3-ols possèdent des degrés de polymérisation plus élevés au stade 2 par rapport aux autres stades 3 et 4 de maturation. Les DPn les moins élevés sont trouvés dans les extraits du stade 4. Généralement, les extraits de noyaux possèdent les DPn les plus élevés dans les exemples 4 et 5.
[0121] Il est intéressant de noter que dans les extraits purifiés par le mélange hydroacétonique, les DPn des flavan-3-ols sont légèrement supérieurs à ceux purifiés par le mélange hydro-alcoolique (exemple 2 versus exemple 4; exemple 3 versus exemple 5). De même, dans les extraits purifiés par la colonne FPX 66, les DPn des flavan-3-ols sont légèrement supérieurs à ceux purifiés par la colonne C18 (exemple 2 versus exemple 3; exemple 4 versus exemple 5).
[0122] Il est intéressant enfin de noter que les DPn des flavan-3-ols ou spécialement les tanins décroient au cours de la maturation. Une hypothèse est qu'au stade mûr les tanins de haut DPn peuvent être impliqués dans des mécanismes d'oxydation ou encore que ces derniers ont formé des complexes avec les composés pariétaux. Ces transformations chimiques peuvent rendre les tanins difficilement extractibles, ce qui entraîne une diminution des DPn.
[0123] Par comparaison avec les DPn obtenus dans l'exemple 1, les DPn des extraits purifiés sont en moyenne inférieurs.
Dosage de polyphénols totaux dans les extraits par la méthode de folin-ciocalteu et estimation de la quantité des polyphénols oxydés
[0124] L'objectif de ce paragraphe est le dosage des polyphénols totaux dans les extraits purifiés ainsi que l'évaluation de la quantité des polyphénols oxydés. Ce dosage s'effectue au moyen du réactif de Folin-Clocalteu. La démarche a été utilisée pour la caractérisation des produits d'oxydation. Une soustraction est réalisée entre le total des polyphénols en mg équivalent d'acide gallique et le total des polyphénols dosés par chromatographie en g/kg. La différence correspond aux polyphénols sous forme non-native (Tableau 9 concernant les exemples 2 et 3 ; Tableau 10 concernant les exemples 4 et 5).
Tableau 9
[0125] V1.1 720 806 668 730 52 76 7 9 V2.1 742 803 692 751 50 52 7 6 V1Pe2 623 762 585 657 38 105 6 14 V1Pu2 564 645 516 548 48 97 8 15 V1N2 655 791 604 681 51 110 8 14 V2Pe2 645 758 607 652 38 106 6 14 V2Pu2 439 662 408 565 31 97 7 15 V2N2 641 746 625 647 16 99 2 13 V1Pe3 523 675 330 567 193 108 37 16 V1Pu3 450 555 402 439 48 116 11 21 V1N3 465 689 401 575 64 114 14 17 V2Pe3 335 660 294 560 41 100 12 15 V2Pu3 159 546 91 441 68 105 43 19 V2N3 546 679 421 569 125 110 23 16 V1Pe4 359 657 198 543 161 114 45 17 V1Pu4 222 547 128 426 94 121 42 22 N4 515 646 402 524 113 122 22 19 V2Pe4 320 624 219 534 101 90 32 14 V2Pu4 162 517 68 414 94 103 58 20 V2N4 497 634 397 521 100 113 20 18 1, 2, 3, 4 : stades de maturation Pe : peau ; Pu : pulpe ; N : noyaux V1 : variété 1 , V2 : variété 2
Tableau 10
[0126] V1.1 886 830 798 783 88 47 10 6 V2.1 892 851 793 765 99 85 11 10 Pe2 849 801 728 709 122 92 14 12 V1Po2 680 624 617 587 63 37 9 6 V1N2 893 852 793 772 100 80 11 9 V2Pe2 869 804 723 706 146 98 17 12 V2Pu2 695 596 599 564 96 32 14 5 V2N2 882 846 778 769 105 77 12 9 V1Pe3 871 803 685 634 186 169 21 21 V1Pu3 698 671 597 567 101 104 14 15 V1N3 894 873 746 685 149 188 17 22 V2Pe3 883 864 695 622 188 741 21 28 V2Pu3 703 683 582 571 121 111 17 16 V2N3 895 842 740 675 155 167 17 20 V1Pe4 891 853 674 637 217 216 24 25 V1Pu4 702 683 576 546 126 136 18 20 20 V1N4 897 870 77.4 664 173 206 19 24 V2Pe4 882 844 663 623 219 221 25 26 V2Pu4 715 650 572 531 143 119 20 18 V2N4 893 856 713 658 179 198 20 23 1, 2, 3, 4 : stades de maturation Pe : peau ; Pu : pulpe N : novaux V1 : variété ; V2 : variété 2
[0127] Les résultats montrent que les pourcentages des polyphénols oxydés augmentent en fonction de la maturation avec très peu de différence entre le stade 1 et 2 de maturation. Au dernier stade de maturation (tamar), les pourcentages des polyphénols oxydés augmentent d'une façon remarquable avec des fortes valeurs dans les parties consommables des fruits (peau + pulpe). Une hypothèse est qu'au cours de la maturation, les polyphénols subissent des mécanismes d'oxydation ou des complexations avec les composés pariétaux, ce qui entraîne une modification d'extractibilité et une diminution des quantités des polyphénols natifs.
[0128] La comparaison entre les deux colonnes de purification montre que la colonne FPX66 est plus adéquate lorsque le solvant d'extraction est le mélange hydro-alcoolique tandis que la colonne SEP Pack C18 est plus adéquate lorsque le solvant d'extraction est le mélange hydro-acétonique.
Exemple 7 :Evaluation de pouvoir antioxydant par la méthode ORAC (Oxygen Radical AbsorbanceCapacity ou Capacité d'absorption des radicaux libres)
[0129] L'indice ORAC permet d'évaluer la capacité antioxydante d'un aliment. Il est calculé au moyen d'un test qui porte le même nom, et qui est bien connu de l'homme du métier. Le test ORAC est basé sur l'oxydation d'une sonde fluorescente via un transfert d'atomes d'hydrogène par des radicaux libres, qui sont souvent des radicaux péroxyles, mais peuvent aussi être des radicaux hydroxyles. Ces radicaux libres sont produits par un générateur. Au cours de l'expérience, les radicaux libres endommagent la sonde et diminuent donc l'intensité de la fluorescence.
Préparation des solutions à caractère hydrophile
[0130] Une solution mère de fluorescéine ou F1Na de travail à 1 mM (qui peut être conservée au congélateur) est préparée extemporanément dans une solution tampon phosphate à 75 mM et pH 7,4. Les solutions fille à 1 µM et petite-fille à 30 nM qui en découlent sont aussi réalisées dans la solution tampon phosphate.
[0131] La solution de 2,2'-azobis (2-méthyl-propionamidine) dihydrochloride ou AAPH est fraîchement préparée avant l'injection dans un tube à hémolyse en y déposant 42,4 mg de poudre dans 1 ml de solution tampon phosphate.
[0132] Enfin, une solution mère tamponnée de Trolox<®>à 1 mM est réalisée.
Préparation des solutions à caractère amphiphile/lipophile
[0133] Une solution de β-cyclodextrineméthylée (RMCD) (7 % (w/v)), et une solution de Trolox<®>sont préparées dans un mélange acétone/eau à 50 % (v/v). Une solution fille de Trolox<®>de 100 µM à 20 % (v/v) est réalisée dans la solution de RMCD. Le mélange est ensuite mis sous agitation pendant 1 h à température ambiante, et à l'abri de la lumière pour le tracé de la droite d'étalonnage. Ces proportions seront, ensuite, conservées pour les études des extraits. Les solutions de travail de FINa et d'AAPH sont réalisées suivant le procédé décrit précédemment.
Mode opératoire
[0134] Le test ORAC est appliqué aux extraits présentant un caractère hydrophile en suivant la méthode développée par Ou et al. (2001). Il existe une variante qui consiste à introduire la β-cyclodextrineméthylée pour permettre la solubilisation d'antioxydants lipophiles en solution aqueuse par formation de complexes d'inclusion. Le test consiste à mélanger, directement dans les cuves en verre, 200 µl d'extrait dilué ou de méthanol avec 2000 µl de solution FINa. Les cuves sont alors placées dans le passeur d'échantillon sous agitation mécanique à 37°C. Deux cents µl de solution d'AAPH sont, ensuite, ajoutés au milieu pour déclencher la génération de radicaux libres. Une mesure de fluorescence (λexcitation = 485 nm et λémission = 520 nm) est effectuée toutes les minutes pendant 30 min.
Droite d'étalonnage, et expression des résultats
[0135] Chaque concentration d'échantillon génère une courbe cinétique différente. Ainsi, les aires sous les courbes de chaque échantillon reflétant les cinétiques de réaction sont-elles calculées avec la formule suivante : AUC = 1 + f1/f0 + f2/f0 + ... + f29/f0 + f30/f0
[0136] Avec f0 = la fluorescence initiale lue à 0 min et fi = la fluorescence lue au temps i
[0137] Le résultat est alors exprimé en aire nette (AUCnette) que l'on obtient avec la formule suivante : AUC nette = AUC échantillon - AUC blanc
[0138] Il est donc possible de tracer une droite d'étalonnage de la forme à partir de solutions de Trolox<®>aux différentes concentrations. Elle a, alors, pour équation :
AUC nette = a x [Trolox<®>] + b
„a“ représente la pente et „b“ l'ordonnée à l'origine de la régression linéaire.
[0139] Le calcul de l'activité antioxydante d'un extrait d'une concentration donnée est également basé sur la détermination de son AUC nette. En reportant cette AUCnet sur la droite d'étalonnage du Trolox<®>, le résultat peut finalement être exprimé en µmol d'équivalent Trolox<®>par gramme d'extrait sec et par gramme de matière sèche.
Résultats :
[0140] L'indice ORAC est exprimé en µmole Trolox/g d'échantillon c'est-à-dire la micromole d'équivalent Trolox par gramme d'échantillon. Plus le chiffre est grand, plus l'échantillon est antioxydant.
[0141] Les résultats montrent que les valeurs ORAC trouvées dans les poudres de dattes (exemple 1) ou les extraits phénoliques purifiés selon l'invention (exemples 2 à 5) sont très élevées par rapport aux produits commercialisés qui ont servi de référence, notamment un extrait sec de pépins de raisin ou de grenade.
[0142] Par comparaison entre les valeurs ORAC des extraits selon l'invention (exemples 2 à 5) en fonction des différents stades de maturation, on remarque que les valeurs sont très élevées au stade 2. Précédemment, à ce stade, il a été démontré que les extraits purifiés contenaient des flavan-3-ols avec les degrés de polymérisation (DPn) les plus élevés (voir Tableaux 6 à 9).
[0143] Par ailleurs, les noyaux possèdent des activités antioxydantes fortes ce qui valide l'hypothèse que l'activité antioxydante dans les extraits purifiés est proportionnelle à la teneur en tanins qui existe dans ces extraits. Les pourcentages des tanins dans les polyphénols des extraits de noyaux des exemples 2 a 5 dépassent en effet 98%, voire 99%, comme indiqué dans le tableau 5, et les noyaux possèdent les activités ORAC les plus élevées (Tableau 11).
Tableau 11
[0144] V1.1 10406 V1.1 653,67 V2.1 9442 V2.1 248,74 V1.Pe.2 8647 V1.Pe.2 211 V1.Pu.2 7765 V1. Pu.2 549 V1.N.2 12057 V1.N.2 954 V2.Pe.2 11406 V2.Pe+Pu.2 2196 V2.Pu.2 11110 V2.Pu.2 688 V2.N.2 17169 V2.N.2 1872 V1.Pe.3 5748 V1.Pe.3 139 V1.Pu.3 5477 V1.Pu.3 117 V1.N.3 6125 V1.N.3 321 V2 Pe.3 4042 V2.Pe.3 297 V2.Pu.3 2109 V2.Pu.3 153 V2.N.3 5984 V2.N.3 320 V1.Pe.4 3943 V1.Pe.4 115 V1.Pu.4 4146 V1.Pu.4 74 V1.N.4 7224 V1.N.4 302 V2.Pc.4 7243 V2.Pe.4 125 V2.Pu.4 4165 V2.Pu.4 79 V2.N.4 6405 V2.N.4 238 Extrait sec de pépin de raisin 19700 Oxxynéa 51.9 Extrait sec de grenade 3051 Baies d'açai 997
Exemple 6 :
[0145] A titre de comparaison, le procédé selon l'invention a été mis en œuvre en utilisant de l'eau acidifié à 1 % d'acide acétique en tant que solvant de l'extraction polaire. Les résultats montrent que ce solvant donne de faibles valeurs en fractions phénoliques purifiées. Les rendements massiques en poudre lyophilisée des extraits phénoliques obtenus sont assez faibles par rapport aux résultats trouvés par les mélanges hydro-alcooliques et hydro-acétoniques. Les résultats montrent que les teneurs en composés phénoliques dosés par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) ou par la méthode d'estimation des polyphénols totaux par le réactif folin-ciocalteu sont généralement faibles.
Exemple 7 :
[0146] Des extraits phénoliques à partir des fruits de dates ont été obtenus à l'aide du procédé selon l'invention mais sans la mise en œuvre de l'étape d'extraction solide-liquide par solvent apolaire, c'est à dire, sans passage par l'étape de délipidation par l'hexane comme solvant organique. Les résultats montrent qu'il y a très peu de différence entre les quantités de polyphénols obtenues selon cet exemple et les quantités obtenues dans les exemples 2 à 5. La différence entre avec ou sans hexane n'est pas significative, les pourcentages ne dépassant pas 2%.
Conclusions :
[0147] Les différents extraits purifiés à l'aide du procédé selon l'invention sont majoritairement riches en tanins, avec un pourcentage moyen de 95% dans les extraits phénoliques de la partie consommable de fruit et 99% dans les extraits des noyaux. Les autres classes phénoliques sont présentes d'une façon minoritaire.
[0148] Concernant le choix des solvants d'extraction, bien que les deux solvants soient très satisfaisants, les résultats indiquent que le meilleur solvant pour la purification est le mélange hydro-acétonique acidifié. Le dosage par le réactif folin ciocalteu montre que les extraits hydro-acétoniques des peaux et noyaux contiennent des pourcentages en polyphénols de 90% et des pourcentages qui dépassent 50% dans les extraits des pulpes.
[0149] L'utilisation de deux colonnes de séparation telles que la colonne C18<®>et la colonne alimentaire FPX 66<®>, a permis de faire la comparaison entre les deux systèmes. La purification par la colonne FPX 66<®>a donné les meilleurs rendements massiques en poudre et les meilleures teneurs en polyphénols en utilisant le mélange hydro-alcoolique acidifié. Dans le cas de mélange hydro-acétonique comme solvant, la FPX 66<®>donne les meilleurs rendements massiques en poudre mais avec des teneurs moins élevées par comparaison avec la C18 comme colonne de séparation.
[0150] Le pouvoir antioxydant, mesuré par la méthode ORAC, montre que les extraits purifiés obtenus dans le cadre de l'invention possèdent des pouvoirs antioxydants très élevés, en particulier au stade 2 de maturation pour lequel les valeurs sont les plus élevées (Tableau 11). Les résultats montrent que, pour un même stade de maturation, ce sont les noyaux qui possèdent les activités les plus fortes par rapport aux autres tissus, ce qui indique que l'activité antioxydante dans les extraits purifiés est proportionnelle à la teneur en tanins dosée dans les fractions obtenues. En effet, les noyaux possèdent, par rapport aux autres tissus, les quantités de tanins les plus élevées. Dattes (Phoenix dactyfifera), variante V1 (Deglet Nour) Tunisie Dattes (Phoenix dactyfifera), variante V2 (Medjool) L'Arable Saoudite
Claims (20)
1. Procédé d'extraction et de purification de composés polyphénoliques à partir du fruit du palmier dattier Phoenix dactylifera, qui se caractérise en ce qu'il comprend les étapes :
- d'obtention et de préparation de la matière végétale,
- d'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant polaire et de récupération d'un extrait contenant des composés polyphénoliques,
- de concentration des composés polyphénoliques dans l'extrait, par évaporation du solvant polaire,
- de purification des composés polyphénoliques de l'extrait par une méthode de chromatographie en phase solide, en phase inverse ou par échanges d'ions,
- de récupération d'un extrait purifié concentré en composés polyphénoliques.
2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'obtention et la préparation de la matière végétale comprennent la séparation des tissus du fruit, le broyage des tissus, leur réduction sous forme d'une poudre et la lyophilisation de ladite poudre.
3. Procédé selon la revendication 1ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant polaire, l'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant apolaire et la récupération du résidu.
4. Procédé selon la revendication précédente, et caractérisé en ce que le solvant apolaire est l'hexane.
5. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que l'extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant apolaire est réalisée successivement au moins deux fois.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant polaire de l'extraction solide-liquide est un mélange d'éthanol, d'eau et d'acide acétique, préférentiellement selon un ratio 80 :19 :1, ou un mélange d'acétone, d'eau et d'acide acétique, préférentiellement selon un ratio 50 :49 :1.
7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'extraction liquide à l'aide d'un solvant polaire est réalisée successivement au moins deux fois, préférentiellement au moins trois fois.
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la purification en phase inverse est réalisée par adsorption des polyphénols sur un support solide compris dans une cartouche ou une colonne de silice greffées par des chaînes hydrocarbonées en C18 ou de résine échangeuse d'ions non ioniques, l'élution des polyphénols à l'aide d'un éluant polaire et la récupération d'une fraction enrichie en polyphénols.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'éluant est composé d'un mélange d'éthanol, d'eau et d'acide acétique selon un ratio 50 :49 :1.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fraction enrichie en polyphénols est concentrée par évaporation puis séchée par atomisation ou lyophilisation.
11. Extrait purifié de polyphénols obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend, en poids par rapport au poids total de l'extrait purifié sec, jusqu'à 80% de composés polyphénoliques.
12. Extrait selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il contient au moins 95%, préférentiellement au moins 97%, plus préférentiellement au moins 99% de tanins, en poids par rapport au poids total de polyphénols.
13. Extrait selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir du noyau, de la peau et/ou de la pulpe du fruit du dattier Phoenix dactylifera L., en particulier au stade Kimri de maturation.
14. Extrait selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que les tanins qu'il contient présente un degré de polymérisation moyen inférieur à 30, préférentiellement inférieur à 27, plus préférentiellement inférieur à 20.
15. Poudre de pulpe, de noyau et/ou de peau du fruit du dattier Phoenix dactylifera L., en particulier au stade Kimri de maturation comme produit intermédiaire apparaissant au cours du procédé selon l'une des revendications 1 à 10.
16. Composition cosmétique comprenant un extrait selon l'une des revendications 11 à 14.
17. Composition pharmaceutique comprenant un extrait selon l'une des revendications 11 à 14.
18. Composition nutraceutique comprenant un extrait selon l'une des revendications 11 à 14.
19. Composition alimentaire comprenant un extrait selon l'une des revendications 11 à 14.
20. Extrait selon l'une des revendications 11 à 14 comme agent antioxydant.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH01241/18A CH715443B1 (fr) | 2018-10-11 | 2018-10-11 | Extrait purifié et concentré de polyphénols issu des fruits du palmier dattier Phoenix dactylifera. |
| PCT/EP2019/059901 WO2020074134A1 (fr) | 2018-10-11 | 2019-04-17 | Extrait de polyphénols issu des fruits du palmier dattier phoenix dactylifera pour son utilisation nutraceutique |
| PCT/EP2019/059899 WO2020074133A1 (fr) | 2018-10-11 | 2019-04-17 | Extrait de polyphenols issu des fruits du palmier dattier phoenix dactylifera pour son utilisation pharmaceutique |
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