CH710195B1 - Verfahren zur Isolation spezifischer miRNA-Typen von Exosom-haltigen biologischen Flüssigkeiten. - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie, und insbesondere ein Verfahren zur Isolierung von microRNA von Exosom-haltigen biologischen Flüssigkeiten. Das Verfahren schliesst aufeinanderfolgende Zentrifugation, Ultrafiltration und Ultrazentrifugation eines konzentrierten Kulturmediums, das Lösen des erhaltenen Präzipitats in einem Phosphat-Salz-Puffer und zusätzliche Zentrifugation ein. Das erhaltene Präzipitat wird in Wasser gelöst, und die Lösung wird einer Free-Flow-Elektrophorese unter Verwendung einer FEE-System-Vorrichtung unterzogen. Jede erhaltene Fraktion durchläuft anschliessend eine Zentrifugation. Jede Fraktion wird mittels Filtration und Zentrifugation von den Zellwänden der Exosome befreit, und es wird eine Reverse-Transkriptionsreaktion mithilfe von Reverser-Transkriptase (Exiqon) durchgeführt. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 95 °C während einer Zeitdauer von 5 Minuten gestoppt.

Description

[0001] Die Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie, insbesondere das Trennverfahren spezifischer miRNA-Typen von Exosom-haltigen biologischen Flüssigkeiten, und sieht vor, verschiedene miRNA-Typen aus unterschiedlichen Exosom-haltigen biologischen Proben aufzutrennen, um die individuellen exosomalen Fraktionen zu analysieren.

[0002] Exosome sind kleine sphärische Blasen, 20–100 nm, die bei der Zell-Wechselwirkung gebraucht werden. Die Exosome enthalten Komplexe von Proteinen und miRNAs, die als diagnostische Marker von Wert sind und zur Bildung einer Antitumor-Immunantwort in der Onkologie verwendet werden können. Um jedoch die Exosome effizient einzusetzen, ist es notwendig, eine reine Fraktion zu erhalten.

[0003] Exosome sind äusserst stabil in biologischen Flüssigkeiten, Blut, Urin, Speichel, Aszitesflüssigkeit oder Zellkulturüberstand im Falle einer Kultivierung. Dies ermöglicht eine nicht-invasive Diagnose des Entstehungsortes eines Tumors mittels Exosomen in Plasma und Urin.

[0004] Exosome werden von Zellen des Immunsystems – dendritische Zellen und B-Zellen, von Neuronen, insbesondere sekretorische Gewebe und Tumorzellen, aktiv sekretiert (K. Denzer et. al 2000, Huber et al. 2005, P. Wearsch 2009). Im Falle von dendritischen Zellen werden die Exosome ausgeschieden. Sie enthalten kleine Polypeptide (8–12 Aminosäuren), die in Verbindung mit dem Antigen der MHC-l-KIasse-Moleküle präsentiert werden und an die relevanten Rezeptoren von zytotoxischen CD8+-T-Zellen, NK-Zellen binden, sowie grosse Polypeptide (12–16 Aminosäuren) in Verbindung mit dem Antigen der MHC-Il-Klasse-Moleküle, die an die relevanten Rezeptoren von zytotoxischen CD8+-T-Zellen binden. Exosome, die von Tumorzellen sekretiert werden, können mit der Bildung der Antitumor-Immunantwort von zytotoxischen T-Zellen interferieren, da sie mit DC oder Makrophagen-Exosomen konkurrieren, wenn man bedenkt, dass die Konzentration an Exosomen im Blutplasma und Blutserum im Falle einer Krebsentwicklung um ungefähr das 50-Fache ansteigt (Taylor et al. 2008, lero 2008).

[0005] Exosome enthalten MHC-I-Klasse- und MHC-lI-Klasse-Moleküle des Histokompatibilitätskomplexes, Rab-Proteine von Integrinen, sowie miRNA-Moleküle und Strukturen, die durch die Gewebsspezifizität und die individuellen Charakteristika der Zelltypen definiert sind. So wurde festgestellt, dass Exosome aus menschlichem Urin 295 Proteine enthalten (Pistikum et al, 2004). Ungefähr 50 Proteine werden regelmässig in allen Exosomen nachgewiesen (Gonzales et al., 2009). Im Falle eines Tumors können gewebsspezifische Protein-Strukturen und gewebsspezifische miRNA-Strukturen für eine Frühdiagnose oder zur Begründung von Behandlungsschemen verwendet werden (Baj-Krzyworzeka et al, 2007)

[0006] Zur Untersuchung von Tumor-spezifischen Exosomen, ist die Durchführung einer massgeschneiderten Auftrennung und Differenzierung notwendig. Die Konzentration an spezifischer miRNA ist ein Kriterium für die Auswahl von Exosomen von spezifischen Zellen.

[0007] Gemäss einer Methode, die für die Trennung von Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten eingesetzt wird (siehe Shtam T.A. et al. Tsitologyia, 2012, 54(5), 430), wird Kulturflüssigkeit (KC) gesammelt und aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 2000 und 10 000 g durchgeführt. Danach wird die erhaltene KC von 500 ml mithilfe von Ultrafiltration (Centrikon plus-70, 100 kDa, Millipore) auf ein Endvolumen von 10 ml konzentriert. Anschliessend wird eine Ultrazentrifugation mithilfe der Avanti-301-(JA-30.50 Rotor)-Zentrifuge bei 100 000 g während 2 Stunden durchgeführt, um die Exosomen von den erhaltenen, konzentrierten KC-Wirkstoffen zu trennen. Nach der Zentrifugation wird die Überstandsflüssigkeit in ein separates Reagenzglas gegeben und mittels Laser-Korrelationsspektroskopie untersucht (LCS), um die Abwesenheit von Partikeln in exosomaler Grösse zu prüfen. Der Rückstand wird in maximalem Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst und nochmals unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Der erhaltene Rückstand wird in 100 Mikroliter Wasser (MiliQ) oder PBS gelöst, in Aliquote aufgetrennt, welche bei –80 °C für eine weitere Proteomanalyse gefroren werden.

[0008] Das wohlbekannte Verfahren bietet keine Gelegenheit, Exosome in unterschiedliche, zu verschiedenen Geweben gehörige Fraktionen aufzutrennen und somit den miRNA-Gehalt in den ausgewählten Proben zu bestimmen.

[0009] Der technische Effekt des dargelegten Verfahrens besteht in der Möglichkeit, individuelle miRNA-Typen von Exosom-haltigen biologischen Flüssigkeiten aufzutrennen, insbesondere wird die Möglichkeit einer Auftrennung verschiedener Typen, wie z.B. gewebsspezifische und tumorspezifische miRNA, in Zukunft die Gelegenheit bieten, Impfstoffe basierend auf Exosomen von Tumorzellen herzustellen.

[0010] Der obengenannte technische Effekt wird erzielt durch Anwendung des Trennverfahrens von spezifischen miRNA-Typen aus Exosom-haltigen, biologischen Flüssigkeiten, einschliesslich aufeinanderfolgender Zentrifugationen bei 2000 und 10 000 g, der Ultrafiltration der erhaltenen Überstandsflüssigkeit mittels des Rotor-Konzentrators Centrikon plus-70, 100 kDa, Millipore zu einem Endvolumen von 10 ml und Ultrazentrifugation mittels der Avanti-301-(JA-30.50 Rotor)-Zentrifuge bei 100 000 g während 2 Stunden, des Lösens des erhaltenen Rückstandes in PBS, wiederholte Zentrifugation unter denselben Bedingungen und des Lösens des erhaltenen Rückstandes in 100 Mikroliter Wasser. Gemäss der vorliegenden Erfindung wird die erhaltene Lösung dann einer Free-Flow-Elektrophorese in Kammern zur Stabilisierung von Anode und Kathode mithilfe des FFE-Systems unterzogen zur weiteren Selektion von separaten Fraktionen, und zwar unter folgenden Bedingungen: die Gesamtzeit der Free-Flow-Elektrophorese beträgt 5 Minuten, die angelegte Spannung – 900 V, Strom – 34 mA, die Probe und der Marker werden bei einer Fliessgeschwindigkeit von 2.5 ml/h beziehungsweise 280 ml/h injiziert, die Reihe wird in FF-ZE-zyklischem Intervall von 85 ml/h durchgeführt, und die fraktionierte Probe wird bei 320 ml/h eluiert, wobei der folgende Puffer für die Anodenstabilisierung verwendet wird: 1.5 M Thioharnstoff + 6 M Harnstoff + 100 mM H2SO4 + 25 mM 2-Pyridinpropanol + 300 mM 2-Pyridinethanol.

[0011] Das Medium zur Auftrennung hat die folgende Zusammensetzung: 1.8 M Thioharnstoff + 6 M Harnstoff + 55 mM MOPS + 55 mM 2-Pyridinpropanol; der folgende Puffer wurde für die Kathodenstabilisierung verwendet: 1.8 M Thioharnstoff + 76 M Harnstoff + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM MOPS + 280 mM EPPS, danach werden die aufgetrennten Fraktionen wiederum mittels der Avanti-301-(JA-30.50 Rotor)-Zentrifuge bei 100 000 g während 2 Stunden zentrifugiert. Danach wird der Aufschluss der miRNAs aus jeder einzelnen Fraktion durchgeführt, d.h., 5 mM Proteinase K wird zu jeder einzelnen Fraktion hinzugegeben und bei 56 °C für eine Stunde inkubiert, danach wird sie auf eine Exiqon-Säule aufgetragen und einer weiteren Zentrifugation bei 2000 g unterzogen.

[0012] Anschliessend wird die Säule dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Auf jedes Waschen folgt eine weitere Zentrifugation bei 2000 g mittels der Eppendorf-5104-Zentrifuge. Danach werden 20 Mikroliter Nuklease-freies Wasser auf die Säule aufgetragen, und die Säule wird für 10 Minuten stehen gelassen und dann bei 3000 g zentrifugiert. Darauf folgt die Reverse-Transkriptionsreaktion mithilfe von Reverser-Transkriptase (Exiqon), wobei 8 Mikroliter des Reagens zu 8 Mikroliter der Probe gegeben werden und bei 60 °C für eine Stunde inkubiert wird. Anschliessend wird die Reaktion durch Erhitzen auf 95 °C während 5 Minuten gestoppt.

[0013] Darauffolgend wird die Polymerasekettenreaktion mit Real-Time-Nachweis unter Verwendung des 7500-Applied-Biosystems mit Primern von spezifischen Typen, beispielsweise gewebsspezifische und tumorspezifische miRNA, verwendet, um die spezifischen miRNA-Typen zu definieren, welche sind: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-3p, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-3p, miR-432, miR-438, miR-574-3p, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c.

[0014] Danach kann durch Verwendung der GenEx-qPCR-Software die Zahl jeder der untersuchten miRNAs, die von jeder Fraktion abgetrennt wurden, berechnet werden. Anschliessend werden die Daten in Form einer Tabelle wiedergegeben, um die Expressionsprofile der miRNAs in Proben verschiedener Gewebe zu vergleichen.

Experimentelle Beispiele

[0015] 600 ml von einem gesunden Donor entnommener Urin wird aufeinanderfolgenden Zentrifugationen bei 2000 g und 10000 g unterzogen, danach wird die erhaltene Überstandsflüssigkeit von 500 ml mittels Ultrafiltration (Centrikon plus-70, 100 kDa, Millipore) auf ein Endvolumen von 10 ml konzentriert. Anschliessend ist die Anwendung von Ultrazentrifugation mittels der Avanti-301-(JA-30.50 Rotor)-Zentrifuge bei100 000 g während zwei Stunden notwendig, um die Exosome aufzutrennen.

[0016] Nach der Zentrifugation wird die Überstandsflüssigkeit in ein separates Reagenzglas gegeben und mittels Laser-Korrelationsspektroskopie (LCS) untersucht, um die Abwesenheit von Partikeln in exosomaler Grösse zu prüfen. Der Rückstand wird in maximalem Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst und nochmals unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Der erhaltene Rückstand wird in 100 Mikroliter Wasser (MiliQ) oder PBS gelöst. Danach wird die analysierte Probe einer Free-Flow-Elektrophorese in freiem Fluss und Kammern unter Verwendung des FFE-Systems (FFE Service GmbH) unter den folgenden Bedingungen unterzogen: die Gesamtzeit der Free-Flow-Elektrophorese beträgt 5 Minuten, die angelegte Spannung – 900 V, Strom – 34 mA.

[0017] Die Probe und der Marker werden bei einer Fliessgeschwindigkeit von 2.5 ml/h beziehungsweise 280 ml/h injiziert. Die Reihe wird in FF-ZE-zyklischem Intervall bei 85 ml/h durchgeführt, und die fraktionierte Probe wird bei 320 ml/h eluiert. Der folgende Puffer wird für die Anodenstabilisierung verwendet: 1.5 M Thioharnstoff + 6 M Harnstoff + 100 mM H2S04 + 25 mM 2-Pyridinpropanol + 300 mM 2-Pyridinethanol.

[0018] Das Medium zur Auftrennung hat die folgende Zusammensetzung: 1.8 M Thioharnstoff + 6 M Harnstoff + 55 mM MOPS + 55 mM 2-Pyridinpropanol; der folgende Puffer wurde für die Kathodenstabilisierung verwendet: 1.8 M Thioharnstoff + 76 M Harnstoff + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM MOPS + 280 mM EPPS, mit anschliessender Sammlung der aufgetrennten Fraktionen, Ultrazentrifugation der Proben aus separaten Pools mittels Ulrazentrifugation mithilfe der Avanti-301-(JA-30.50 Rotor)-Zentrifuge bei 100 000 g während 2 Stunden.

[0019] Danach wird der Aufschluss der miRNAs aus jeder einzelnen Fraktion mittels folgendem Verfahren durchgeführt: 5 mM Proteinase K wird zu jeder einzelnen Fraktion hinzugegeben und bei 56 °C für eine Stunde inkubiert, danach wird sie auf eine Exiqon-Säule aufgetragen (zur Reinigung der miRNAs wird die Probe auf die Säule aufgetragen) unter weiterer Zentrifugation bei 2000 g mittels der Eppendorf-5104-Zentrifuge. Danach wird die Säule dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Auf jedes Waschen folgt eine weitere Zentrifugation bei 2000 g mittels der Eppendorf-5104-Zentrifuge. Danach werden 20 Mikroliter Nuklease-freies Wasser auf die Säule aufgetragen, und die Säule wird für 10 Minuten stehen gelassen und dann bei 3000 g mittels der Eppendorf-5104-Zentrifuge zentrifugiert. Darauf folgt die Reverse-Transkriptionsreaktion mithilfe von Reverser-Transkriptase (Exiqon), wobei 8 Mikroliter des Reagens zu 8 Mikroliter der Probe gegeben werden und bei 60 °C für eine Stunde inkubiert wird. Anschliessend wird die Reaktion durch Erhitzen auf 95 °C während 5 Minuten gestoppt.

[0020] Anschliessend wird die Polymerasekettenreaktion mit Real-Time-Nachweis unter Verwendung des 7500 Applied Biosystems mit Primern von den folgenden miRNAs angewendet: miR-141, miR-200a; miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-3p, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-3p, miR-432; miR-438, miR-574-3p, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c. Die Resultate werden mithilfe der GenEx-qPCR-Software analysiert und in Form einer Tabelle dargestellt (siehe Fig. 1 – Auftrennung pro Vertiefung von miRNAs aufgetrennt aus 500 ml Urin eines gesunden Donors. Die Konzentration ist als Logarithmus auf der Basis 2 der miRNA-Kopien in Mikroliter wiedergegeben).

[0021] 600 ml Urin von einer Patientin mit Brustkrebs wird aufeinanderfolgenden Zentrifugationen bei 2000 g und 10 000 g unterzogen, danach wird die erhaltene Überstandsflüssigkeit von 500 ml mittels Ultrafiltration (Centrikon plus-70, 100 kDa, Millipore) auf ein Endvolumen von 10 ml konzentriert. Anschliessend ist die Anwendung von Ultrazentrifugation mittels der Avanti-301-(JA-30.50 Rotor)-Zentrifuge bei 100 000 g während zwei Stunden notwendig, um die Exosome aufzutrennen.

[0022] Nach der Zentrifugation wird die Überstandsflüssigkeit in ein separates Reagenzglas gegeben und mittels Laser-Korrelationsspektroskopie (LCS) untersucht, um die Abwesenheit von Partikeln in exosomaler Grösse zu prüfen. Der Rückstand wird in maximalem Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst und nochmals unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Der erhaltene Rückstand wird in 100 Mikroliter Wasser (MiliQ) oder PBS gelöst. Danach wird die analysierte Probe einer Free-Flow-Elektrophorese in freiem Fluss und Kammern unter Verwendung des FFE-Systems (FFE Service GmbH) unter den folgenden Bedingungen unterzogen: die Gesamtzeit der Free-Flow-Elektrophorese beträgt 5 Minuten, die angelegte Spannung – 900 V, Strom – 34 mA.

[0023] Die Probe und der Marker werden bei einer Fliessgeschwindigkeit von 2.5 ml/h beziehungsweise 280 ml/h injiziert. Die Reihe wird in FF-ZE-zyklischem Intervall bei 85 ml/h durchgeführt, und die fraktionierte Probe wird bei 320 ml/h eluiert. Der folgende Puffer wird für die Anodenstabilisierung verwendet: 1.5 M Thioharnstoff + 6 M Harnstoff + 100 mM H2SO4 + 25 mM 2-Pyridinpropanol + 300 mM 2-Pyridinethanol.

[0024] Das Medium zur Auftrennung hat die folgende Zusammensetzung: 1.8 M Thioharnstoff + 6 M Harnstoff + 55 mM MOPS + 55 mM 2-Pyridinpropanol; der folgende Puffer wurde für die Kathodenstabilisierung verwendet: 1.8 M Thioharnstoff + 76 M Harnstoff + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM MOPS + 280 mM EPPS, mit anschliessender Sammlung der aufgetrennten Fraktionen, Ultrazentrifugation der Proben aus separaten Pools mittels Ulrazentrifugation mithilfe der Avanti-301-(JA-30.50 Rotor)-Zentrifuge bei 100 000 g während 2 Stunden.

[0025] Danach wird der Aufschluss der miRNAs aus jeder einzelnen Fraktion mittels folgendem Verfahren durchgeführt: 5 mM Proteinase K wird zu jeder einzelnen Fraktion hinzugegeben und bei 56 °C für eine Stunde inkubiert, danach wird sie auf eine Exiqon-Säule aufgetragen (zur Reinigung der miRNAs wird die Probe auf die Säule aufgetragen) unter weiterer Zentrifugation bei 2000 g mittels der Eppendorf-5104-Zentrifuge. Anschliessend wird die Säule dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Auf jedes Waschen folgt eine weitere Zentrifugation bei 2000 g mittels der Eppendorf-5104-Zentrifuge. Danach werden 20 Mikroliter Nuklease-freies Wasser auf die Säule aufgetragen, und die Säule wird für 10 Minuten stehen gelassen und dann bei 3000 g mittels der Eppendorf-5104-Zentrifuge zentrifugiert. Darauf folgt die Reverse-Transkriptionsreaktion mithilfe von Reverser-Transkriptase (Exiqon), wobei 8 Mikroliter des Reagens zu 8 Mikroliter der Probe gegeben werden und bei 60 °C für eine Stunde inkubiert wird. Danach wird die Reaktion durch Erhitzen auf 95 °C während 5 Minuten gestoppt.

[0026] Anschliessend wird die Polymerasekettenreaktion mit Real-Time-Nachweis unter Verwendung des 7500-Applied-Biosystems mit Primern von den folgenden miRNAs angewendet: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-3p, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-3p, miR-432, miR-438, miR-574-3p, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR~517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c Die Resultate werden mithilfe der GenEx-qPCR-Software analysiert und in Form einer Tabelle dargestellt (siehe Fig. 2 – Auftrennung pro Vertiefung von miRNAs aufgetrennt aus 500 ml Urin eines Patienten mit pulmonalem Adenokarzinom. Die Konzentration ist als Logarithmus auf der Basis 2 der miRNA-Kopien in Mikroliter wiedergegeben).

[0027] Tabellen 1 und 2 zeigen, dass die Pools der 61–66 miRNAs (miR-17-3p, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192) im Patienten mit pulmonalem Adenokarzinom und nicht im Urin des gesunden Patienten festgestellt wurden. Dies weist darauf hin, dass nur Exosome von Tumorzellen von pulmonalem Adenokarzinom in diese Pools dringen. Daraus folgt, dass das beanspruchte Verfahren eine Auftrennung reiner Fraktionen von spezifischen miRNA Typen, einschliesslich gewebsspezifische und tumorspezifische miRNAs von Exosom-haltigen biologischen Flüssigkeiten, erlaubt.

Kurze Beschreibung der Figuren

[0028] <tb>Fig. 1<SEP>zeigt in Tabellenform die Verteilung pro Vertiefung von micro-RNA, aufgetrennt aus 500 ml Urin eines gesunden Donors. Die Konzentration ist als Logarithmus auf der Basis 2 der micro-RNA-Kopien in Mikroliter wiedergegeben. <tb>Fig. 2<SEP>zeigt in Tabellenform die Verteilung pro Vertiefung von micro-RNA, aufgetrennt aus 500 ml Urin eines Patienten mit pulmonalem Adenokarzinom. Die Konzentration ist als Logarithmus auf der Basis 2 der micro-RNA-Kopien in Mikroliter wiedergegeben .

Claims (2)

1. Verfahren zur Isolation spezifischer micro-RNA-Typen von Exosom-haltigen biologischen Flüssigkeiten, wobei das Verfahren (i) aufeinanderfolgende Zentrifugationen der Flüssigkeit bei 2000 und 10 000 g, Ultrafiltration der erhaltenen Überstandsflüssigkeit zu einem Endvolumen von 10 ml, (ii) Ultrazentrifugation bei 10 000 g während 2 Stunden, (iii) anschliessendem Lösen des erhaltenen Präzipitats in Phosphat-Kochsalz-Puffer, gefolgt von einer weiteren Ultrazentrifugation bei 100 000 g während 2 Stunden und das Lösen des erhaltenen Präzipitats in 100 Mikroliter Wasser umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass a) die erhaltene Lösung dann einer Free-Flow-Elektrophorese in individuellen Kammern zur Stabilisierung von Anode und Kathode unter Verwendung des Free-Flow-Elektrophorese Systems mit anschliessender Sammlung der Fraktionen unterzogen wird, wobei – die Gesamtzeit der Free-Flow-Elektrophorese 5 Minuten beträgt, – die angelegte Spannung 900 V und der Strom 34 mA beträgt, – die Probe und der Marker bei einer Fliessgeschwindigkeit von

2.5 ml/h beziehungsweise 280 ml/h eingeführt werden, – der Verlauf in einem zyklischen Free-Flow-Zone-Elektrophorese-Intervall von 85 ml/h durchgeführt wurde und die fraktionierte Probe bei 320 ml/h eluiert wird, – der für die Anodenstabilisierung verwendete Puffer aus 1.5 M Thioharnstoff + 6 M Harnstoff + 100 mM H2SO4 + 25 mM 2-Pyridinpropanol + 300 mM 2-Pyridinethanol besteht, – das zur Auftrennung verwendete Medium aus 1.8 M Thioharnstoff + 6 M Harnstoff + 55 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure + 55 mM 2-Pyridinpropanol zusammengesetzt ist, und – der für die Kathodenstabilisierung verwendete Puffer aus 1.8 M Thioharnstoff + 76 M Harnstoff + 180 mM NaOH + 25 mM Tris + 35 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure + 280 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-propansulfonsäure besteht; b) danach die aufgetrennten Fraktionen wiederum mittels einer Zentrifuge bei 100 000 g während 2 Stunden zentrifugiert werden, und c) anschliessend die micro-RNA aus jeder einzelnen Fraktion isoliert wird, indem – 5 mM Proteinase K zu jeder einzelnen Fraktion hinzugegeben wird, bei 56 °C für eine Stunde inkubiert wird, – danach auf eine Säule aufgetragen wird, – gefolgt von einer weiteren Zentrifugation bei 2000 g, – wonach die Säule dreimal mit Waschpuffer gewaschen wird und nach jedem Waschen eine Zentrifugation bei 2000 g mittels einer Mikrozentrifuge durchgeführt wird, – schliesslich 20 Mikroliter Nuklease-freies Wasser auf die Säule aufgetragen und die Säule anschliessend für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen wird, dann bei 3000 g zentrifugiert wird und – schliesslich eine Reverse-Transkriptionsreaktion mithilfe von Reverser-Transkriptase durchgeführt wird, wobei 8 Mikroliter des Reagens zu 8 Mikroliter der Probe gegeben und bei 60 °C für eine Stunde inkubiert, und anschliessend die Reaktion durch Erhitzen auf 95 °C während 5 Minuten gestoppt wird.