CH703256A1

CH703256A1 - Method and apparatus for automatic and direct analysis of dried blood spots samples by LC-MS system.

Info

Publication number: CH703256A1
Application number: CH00895/10A
Authority: CH
Inventors: Werner Doebelin
Original assignee: Werner Doebelin
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2011-12-15
Also published as: WO2011151083A3; WO2011151083A2; EP2577286A2

Abstract

Verfahren und Vorrichtung zum automatischen Injizieren einer Probe, welche sich in Form eines DBS auf einem DBS Probenträger befindet, in ein HPLC System, dadurch gekennzeichnet, dass der DBS Probenträger zwischen zwei Adapter mit Innenhohlraum druckdicht eingeklemmt wird, mittels einer Ventilschaltung und einer Pumpe ein Extraktions-Lösungsmittel zugeführt wird, eine definierte Menge ISTD mit dem DBS Extrakt verdünnt auf eine SPE Säule geladen wird, die SPE Säule mittels einer Ventilschaltung dem analytischen System zugeschaltet wird, während der Analyse der Hohlraum in den Adapter ohne DBS Probenträger druckdicht verschlossen und gewaschen wird, das Wechseln der DBS Probenträger automatisch erfolgt.Method and apparatus for automatically injecting a sample, which is in the form of a DBS on a DBS sample carrier, in an HPLC system, characterized in that the DBS sample carrier is clamped pressure-tight between two adapter with internal cavity, by means of a valve circuit and a pump extraction Solvent is supplied, a defined amount of ISD diluted with the DBS extract is loaded onto an SPE column, the SPE column is connected to the analytical system by means of a valve circuit, during the analysis, the cavity is pressure-sealed and washed without DBS sample holder in the adapter, the DBS sample carrier is changed automatically.

Description

[0001] Die Erfindung betrifft ein automatisches Probenhandling- und Mess- System für DBS (dried blood spots) Proben mittels Hochleistungs-Flüssikeitschromatographie (LC-MS) und einer Einrichtung zum Eluieren, Injizieren, Zugeben von ISTD (Internem Standard) und Präparieren der Proben ohne das die DBS ausgestanzt werden. The invention relates to an automatic sample handling and measuring system for DBS (dried blood spot) samples by means of high performance liquid chromatography (LC-MS) and means for eluting, injecting, adding ISTD (Internal Standard) and preparing the samples without punching out the DBS.

[0002] Beim DBS Probenhandling für die Hochleistungs-Flüssikeitschromatographie werden seit langem grosse Anstrengungen unternommen um mit geringem Aufwand möglichst automatisch exakte und reproduzierbare Resultate zu erhalten. Oft sind nur Methoden möglich welche mehrere aufwendige manuelle Arbeitsschritte benötigen, auch birgt das manuelle Aufarbeiten der DBS Proben eine Vielzahl von möglichen Fehlern welche das analytische Resultat verfälscht oder gar unbrauchbar macht. Verschleppungen der Probe (Crosscontamination) Verwechslungen, Fehler beim Pipettieren und Dosieren erfolgen vorwiegend bei manuellen Arbeitsschritten. When DBS sample handling for high-performance liquid chromatography long efforts have been made to obtain as accurate as possible automatically accurate and reproducible results. Often, only methods are possible which require several elaborate manual work steps, and the manual processing of the DBS samples also entails a large number of possible errors which makes the analytical result falsified or even unusable. Carry-over of the sample (cross-contamination) Mix-ups, errors during pipetting and dosing are mainly carried out during manual work steps.

[0003] Die Herkömmlichen Systeme zum Abarbeiten von DBS Proben mittels der Hochleistungs-Flüssikeitschromatographie decken jeweils nur Teilbereiche der notwendigen Arbeitsschritte ab, sind zu komplex oder nicht robust. Typischerweise werden die DBS Probenträger ausgestanzt und in einer Lösung ausgewaschen so dass der Analyt in die Lösung übergeht. Diese Probenlösung wird dann gefiltert oder zentrifugiert damit mögliche Partikel die Hochleistungs-Flüssikeitschromatographie nicht beeinträchtigen. Je nach Methode erfolgen weitere manuelle Schritte der Probenaufarbeitung bevor die Probelösung in ein Hochleistungs-Flüssikeitschromatographie injiziert werden kann. The conventional systems for processing DBS samples by means of high-performance liquid chromatography cover only partial areas of the necessary steps, are too complex or not robust. Typically, the DBS sample carriers are punched out and washed out in a solution so that the analyte passes into the solution. This sample solution is then filtered or centrifuged so that possible particles do not interfere with high performance liquid chromatography. Depending on the method, further manual steps of sample preparation are carried out before the sample solution can be injected into a high-performance liquid chromatography.

[0004] Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde ein Verfahren und eine Vorrichtung bereit zu stellen mit dem die DBS Proben automatisch, sicher und schnell aufgearbeitet werden und direkt in das LC-MS System injiziert und analysiert werden können. The invention is therefore based on the object of providing a method and a device with which the DBS samples are processed automatically, safely and quickly and can be directly injected into the LC-MS system and analyzed.

[0005] Erfindungsgemäss wird dies dadurch erreicht, dass der DBS Probenträger automatisch in eine Hochdruck Durchflusskammer gespannt wird, der Analyt ausgewaschen wird, der ISTD und eine Verdünnungslösung zugegeben werden kann, die Probenlösung direkt auf eine SPE Säule gepumpt wird, der Analyt mittels HPLC Säulenschaltung aufkonzentriert gereinigt und getrennt werden kann, die Messung mittels LC-MS erfolgen kann, die Durchflusskammer auch ohne DBS Probenträger dicht verschlossen und zur Reinigung durchspühlt werden kann, die einzelnen Funktionen einander zeitlich überlagert werden können und die DBS Probenträger automatisch gewechselt und elektronisch erfasst werden können. According to the invention this is achieved in that the DBS sample carrier is automatically stretched in a high pressure flow chamber, the analyte is washed, the ISTD and a dilution solution can be added, the sample solution is pumped directly to a SPE column, the analyte by HPLC column circuit can be purified and separated in a concentrated manner, the measurement can be carried out by means of LC-MS, the flow chamber can be tightly sealed even without DBS sample carrier and flushed through for cleaning, the individual functions can be superimposed on each other and the DBS sample carriers can be automatically changed and recorded electronically ,

[0006] Im Folgenden werden anhand der beiliegenden Zeichnungen bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben. In the following, preferred embodiments of the invention will be described with reference to the accompanying drawings.

[0007] Es zeigen <tb>Fig. 1<sep>DBS Probenträger XYZ Roboter <tb>Fig. 2<sep>Fluss- und Ventil-System <tb>Fig. 3<sep>Adapter SystemShow <Tb> FIG. 1 <sep> DBS sample carrier XYZ robot <Tb> FIG. 2 <sep> flow and valve system <Tb> FIG. 3 <sep> adapter system

[0008] Die Fig. 1 zeigt eine YXZ Roboterarm 1 mit einem Greifer 2 mit dem die DBS Probenträger 3 aus dem Rack 4 genommen und zurückgestellt werden. Der DBS Probenträger kann zum elektronischen Lesekopf 5 geführt werden und kann auch zwischen dem Druckkammer inlet Adapter 6 und dem Druckkammer outlet Adapter 7 positioniert werden. Der inlet Adapter 6 und der outlet Adapter 7 können den DBS Probenträger so einspannen, dass über die Zuleitung 8 und der Ableitung 9 der DBS ausgewaschen werden kann. Fig. 1 shows a YXZ robot arm 1 with a gripper 2 with the DBS sample carrier 3 taken out of the rack 4 and reset. The DBS sample carrier can be guided to the electronic read head 5 and can also be positioned between the pressure chamber inlet adapter 6 and the pressure chamber outlet adapter 7. The inlet adapter 6 and the outlet adapter 7 can clamp the DBS sample carrier in such a way that the DBS can be washed out via the feed line 8 and the discharge line 9.

[0009] Die Fig. 2 zeigt das Fluss- und Ventil-System mit einem 10-Port Ventil 10 bei dem in der Stellung A die Verbindungen 11 aktiv sind und in der Stellung B die Verbindungen 12 aktiv sind, so wie das 6-Port Ventil 13 bei dem in der Stellung A die Verbindungen 14 und in der Stellung B die Verbindungen 15 aktiv sind. Wird der inlet Adapter 6 und der outlet Adapter 7 zusammengepresst entsteht eine dichte Verbindung zwischen der Zuleitung 8 und der Ableitung 9 unabhängig ob ein DBS Probenträger 3 dazwischen ist oder nicht. Sind beim 10-Port Ventil 10 die Verbindungen 12 aktiv und die Adapter 6 und 7 sind zusammengepresst kann die Waschlösung 28 mittels der Waschpumpe 16 die Ableitung 9 die Zuleitung 8, so wie der Innenbereich der Adaptor 6 und 7 gespült werden und die ISTD Schlaufe 17 mit der ISTD Ladespritze 19 über die ISTD Zuleitung 18 mit ISTD gefüllt werden. Die Überläufe fliesen in den Abfall 20. Befindet sich ein DBS Probenträger 3 zwischen den zusammengepressten Adapter 6 und 7 und beim 10-Port Ventil 10 sind die Verbindungen 11 aktiv so kann das Lade-Laufmittel 26 mittels der Ladepumpe 21 den ISTD aus der ISTD Schlaufe 17, durch die Zuleitung 8, durch den inlet Adapter 6, durch den DBS Probenträger 3, durch den outlet Adapter 7, durch die Ableitung 9, durch Verbindungsleitung 22 auf die SPE Säule 23 gespült werden sofern Verbindung 14 im 6-Port Ventil 13 aktiv ist. Mittels der Verdünnungspumpe 24 kann über das T-Stück 25 das Lade-Laufmittel 26 mit dem Verdünnungs-Laufmittel 27 verdünnt werden. Wird durch diesen Vorgang ein Analyt aus dem DBS welcher sich auf dem DBS Probenträger 3 zwischen den Adapter 6 und 7 gewaschen und mit den richtigen Laufmitteln betrieben so wird der Analyt mit dem ISTD auf der SPE Säule 23 aufkonzentriert. Wird nun das 6-Port Ventil 13 so geschaltet, dass die Verbindungen 15 aktiv sind so kann mittels der HPLC Gradienten Pumpe 29 der Analyt und der ISTD von der SPE Säule durch die analytische Säule gespült und analysiert werden. Fig. 2 shows the flow and valve system with a 10-port valve 10 in which in the position A, the compounds 11 are active and in the position B, the compounds 12 are active, such as the 6-port Valve 13 in which in the position A, the compounds 14 and in the position B, the compounds 15 are active. When the inlet adapter 6 and the outlet adapter 7 are compressed, a tight connection between the supply line 8 and the discharge line 9 is created independently of whether a DBS sample carrier 3 is in between or not. If the connections 10 are active in the 10-port valve 10 and the adapters 6 and 7 are pressed together, the washing solution 28 can be flushed through the washing pump 16, the lead 8, as well as the inner area of the adapter 6 and 7, and the ISTD loop 17 be filled with ISTD via the ISTD supply line 18 with the ISTD charging syringe 19. The overflows tilts into the waste 20. If a DBS sample carrier 3 is located between the compressed adapters 6 and 7 and the 10-port valve 10 the connections 11 are active, then the charge-elutriation means 26 by means of the charge pump 21 the ISTD from the ISTD loop 17, are flushed through the inlet 8, through the inlet adapter 6, through the DBS sample carrier 3, through the outlet adapter 7, through the outlet 9, through connection line 22 to the SPE column 23 if compound 14 in the 6-port valve 13 is active is. By means of the dilution pump 24, the charge-eluent 26 can be diluted with the diluting solvent 27 via the T-piece 25. If an analyte from the DBS, which has been washed on the DBS sample carrier 3 between the adapters 6 and 7 and operated with the correct mobile phase, is being concentrated by this process, the analyte is concentrated with the ISTD on the SPE column 23. If now the 6-port valve 13 is switched so that the compounds 15 are active, then by means of the HPLC gradient pump 29 the analyte and the ISTD can be purged from the SPE column through the analytical column and analyzed.

[0010] Die Fig. 3 zeigt das Adapter System mit dem inlet Adapter 6 und dem outlet Adapter 7 und der flexiblen Zuleitung 8 und der flexiblen Ableitung 9. Die beiden Adapter 6 und 7 können auf der Achse 31 zusammengepresst werden. Befindet sich ein DBS Probenträger 3 dazwischen so dient dieser auch als Dichtscheibe zwischen den Dichtfläche 32 des inlet Adapters 6 und der Dichtfläche 33 des outlet Adapters 7. Im Bereich des zentrischen Hohlraums 34 kann der Analyt aus dem DBS welcher sich auf dem DBS Probenträger 3 befindet ausgewaschen und durch den Filter 35 im outlet Adapter 7 und durch die Ableitung 9 gespült werden. Werden die Adapter 6 und 7 auf der Achse 31 zusammengepresst ohne dass sich ein DBS Probenträger 3 dazwischen befindet dichtet der O-Ring auf der Dichtfläche 32 dadurch kann der Hohlraum 34 und die Zuleitung 8 und Ableitung 9 ausgewaschen werden. Fig. 3 shows the adapter system with the inlet adapter 6 and the outlet adapter 7 and the flexible lead 8 and the flexible lead 9. The two adapters 6 and 7 can be pressed together on the axis 31. If a DBS sample carrier 3 is located in between, it also serves as a sealing washer between the sealing surface 32 of the inlet adapter 6 and the sealing surface 33 of the outlet adapter 7. In the region of the centric cavity 34, the analyte can be located on the DBS sample carrier 3 from the DBS washed out and rinsed through the filter 35 in the outlet adapter 7 and through the drain 9. If the adapters 6 and 7 are pressed together on the axis 31 without a DBS sample carrier 3 being located therebetween, the O-ring seals on the sealing surface 32, as a result the cavity 34 and the feed line 8 and discharge line 9 can be washed out.

Claims

1. A method for automatically injecting a sample, which is in the form of a DBS on a DBS sample carrier, in an HPLC system, characterized in that the DBS sample carrier between two adapter with internal cavity pressure-tight clamped, by means of a valve circuit and a pump extraction Solvent is supplied, a defined amount of ISD diluted with the DBS extract is loaded onto an SPE column, the SPE column is connected to the analytical system by means of a valve circuit, during the analysis, the cavity is pressure-sealed and washed without DBS sample holder in the adapter, Changing the DBS sample carrier is done automatically.

2. The method according to claim 1, characterized in that the DBS sample carrier and the DBS is labeled and is automatically identified.

3. The method according to claim 1, characterized in that the adapter close pressure-tight with and without DBS sample carrier.

4. Apparatus for carrying out the method according to claim 1, characterized by the valve circuit with the supply of the ISTD and the dilution solution, a SPE column for concentrating the DBS extract, with pressure-tight adapters, temporally superimposed wash and analyze function, automatic processing of the DBS and change the DBS sample carrier.