CH636107A5 - Process for the preparation of maltopentaose - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose aus Amylose, insbesondere ein Verfahren, bei dem lösliche Amylose hergestellt und die Amylose mit dem Enzym Amylase umgesetzt wird.

Vor kurzem wurde gefunden, dass Maltopentaose eines aus einer begrenzten Zahl von Polysacchariden ist, die als Substrat bei einer bevorzugten diagnostischen Methode zur Messung der Serumamylase verwendet werden können. Hierzu wird beispielsweise auf die US-PS 3 879 263 verwiesen.

Maltopentaose ist zwar eines der Hydrolysenprodukte von Stärke, die mit verschiedenen Amylasen umgesetzt wird, jedoch überwiegen die anderen Produkte dieser Reaktion (d.h. Glucose und die anderen Polysaccharide, die durch die verknüpften Glucosemoleküle gebildet werden). Da nur ein sehr geringer Anteil des Reaktionsprodükts aus Maltopentaose besteht, eignet sich die Hydrolyse von Stärke mit Amylase nicht gut für ein Verfahren zur Grossherstellung von Maltopentaose.

Es ist bekannt, dass aus einer bestimmten Quelle, nämlich Bacillus licheniformis erhaltene Amylase bei Umsetzung mit Amylose oder Amylopektin einen höheren Anteil der Maltopentaose ergibt, als er bei Verwendung anderer Quellen der Amylase gebildet wird. Hierzu wird auf die Arbeit von Saito in «Archives of Biochemistry and Bio-physics», 155 (1963), 290, verwiesen. Die Ausbeute an Maltopentaose aus diesen Reaktionen ist jedoch aufgrund der begrenzten Löslichkeit der Amylose in dem für die biologische Hydrolyse erforderlichen wässrigen Medium immer noch niedrig.

Gegenstand der Erfindung ist ein mehrstufiges Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose in hoher Ausbeute; das Verfahren gemäss der Erfindung ist im vorangehenden Patentanspruch 1 gekennzeichnet.

Die sechste Lösung kann getrocknet werden, wobei ein Produkt, das feste Maltopentaose enthält, erhalten wird. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird als erstes organisches Lösungsmittel Dimethylsulfoxyd und als wässrige saure Lösung eine wässrige Schwefelsäurelösung verwendet, und die Inkubation, der vierten Lösung wird bei erhöhter Temperatur durchgeführt.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildung beschrieben, die ein Fliessschema einer speziellen Ausführangsform des Verfahrens darstellt.

Das Verfahren beginnt durch Mischen von Amylose, einem langkettigen linearen oder leicht verzweigten Glu-cosepolysaccharid, mit einer organischen Lösung, die die Amylose zu lösen vermag. Die linearen Amylosemoleküle sind normalerweise miteinander verflochten und in dieser Form in Wasser bei Konzentrationen von mehr als 2 g/ 100 ml Lösung unlöslich. Das bei diesem Verfahren verwendete organische Lösungsmittel dissoziiert die Amylose durch Solvatisieren der linearen Moleküle, so dass sie unter Bildung einer Lösung (nachstehend als erste Lösung bezeichnet) gelöst werden. Beliebige bekannte organische Lösungsmittel, die Amylose lösen, können beim Verfahren gemäss der Erfindung verwendet werden. Dimethylsulfoxyd (DMSO) ist ein Beispiel eines geeigneten organischen Lösungsmittels.

Die erste Amyloselösung wird dann mit einer wässrigen sauren Lösung gemischt, die das einzelne Amylosemolekül zu Segmenten von niedrigerem Molekulargewicht teilweise zu hydrolysieren vermag. Zahlreiche Säuren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, können in dieser zweiten Lösung verwendet werden. Geeignet ist beispielsweise Schwefelsäure. Eine wässrige Lösung ist notwendig, da Wasser als Reaktionsteilnehmer beim Hydrolysenpro-zess benötigt wird. Das Gemisch der ersten (dissoziierte Amylose enthaltenden) Lösung mit der wässrigen sauren Lösung bildet eine Lösung (nachstehend als zweite Lösung bezeichnet), und Teilhydrolyse wird erreicht, indem die zweite Lösung während einer zur Vollendung der Teilhy5

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drolyse genügenden Zeit auf eine erhöhte Temperatur gebracht wird. Eine gewisse Hydrolyse findet bei jeder Temperatur statt, wenn die Lösung für eine genügende Zeit bei dieser Temperatur gehalten wird. Damit jedoch eine ausreichende Hydrolyse in annehmbar kurzer Zeit stattfindet, sollte die zweite Lösung auf eine Temperatur oberhalb von etwa 100°C erhitzt werden.

Die zweite (hydrolysierte Amylose enthaltende) Lösung wird dann mit einem zweiten organischen Lösungsmittel unter Bildung einer dritten Lösung gemischt. Das zweite organische Lösungsmittel wird aufgrund seiner Fähigkeit gewählt, die Moleküle des ersten organischen Lösungsmittels aus der teilweise hydrolysierten Amylose abzustreifen, wodurch die teilweise hydrolysierte Amylose in der dritten Lösung unlöslich wird. Die in der dritten Lösung nicht mehr löslichen Amylosesegmente bilden eine Fällung, die aus einem Gemisch von linearen Glucosepolysacchari-den besteht, deren Länge im Bereich von 2 bis etwa 75 Glucoseeinheiten liegt. Das verwendete spezielle zweite organische Lösungsmittel hängt davon ab, welches erste organische Lösungsmittel verwendet wird, jedoch kann eine Reihe organischer Lösungsmittel, die das erste organische Lösungsmittel aus der teilhydrolysierten Amylose zu entfernen vermögen, leicht vom Fachmann gewählt werden. Als zweite organische Lösungsmittel, die bei Verwendung von DMSO als erstes organisches Lösungsmittel verwendet werden können, eignen sich Methanol, Aceton und Gemische von Methanol und Aceton.

Die Fällung, die als lösliche Amylose bezeichnet wird, wird aus der dritten Lösung entfernt, mit einem geeigneten bekannten organischen Lösungsmittel gewaschen und unter Bildung eines Feststoffs getrocknet. Der flüssige Rückstand wird verworfen.

Die lösliche Amylose wird mit Amylase, die aus dem Bakterium Bacillus licheniformis gewonnen worden ist, in einer wässrigen Lösung, die zur Optimierung der Amylase-aktivität gepuffert wird, gemischt. Ein beliebiger pH-Wert zwischen etwa 4 und 10 genügt. Das Mischen dieser beiden Komponenten zur Bildung einer vierten Lösungs erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur, die dicht bei 100°C liegt, aber 100°C nicht übersteigt. Die Amylase und die lösliche Amylose werden bei erhöhter Temperatur gemischt, weil die Amylosesegmente von höherem Molekulargewicht bei erhöhten Temperaturen länger in der vierten Lösung gelöst bleiben, wodurch der Amylase Gelegenheit gegeben wird, diese hochmolekularen Segmente zu Fragmenten von niedrigerem Molekulargewicht abzubauen. Nach der Zugabe der Amylase wird die vierte (Amylose/Amylase enthaltende) Lösung bei erhöhter Temperatur während einer zur Bildung einer fünften, Maltopentaose in hoher Konzentration enthaltenden Lösung genügenden Zeit bebrütet. Diese Stufe des Verfahrens ist eine Zeit/Temperatur/Amy-laseabhängige Stufe. Bei gegebener Temperatur und gegebener Amylasekonzentration steigt die Konzentration der Maltopentaose in der fünften Lösung in gegebener Zeit auf ein Maximum, worauf die Maltopentaosekonzentration zugunsten von Polysacchariden mit kürzerer Kettenlänge (d.h. Maltotetraose, Maltotriose, Maltose und Glucose) abzunehmen beginnt. Bei gegebener Temperatur und Amylasekonzentration kann die zur Bildung der maximalen Maltopentaosekonzentration in der fünften Lösung erforderliche Zeit durch Probenahme und Testen der fünften Lösung leicht bestimmt werden. Eine Temperatur zwischen etwa 50°C und 60°C und eine Reaktionszeit von etwa 24 Stunden werden routinemässig angewendet, um Maltopentaose in maximaler Konzentration zu bilden.

Nachdem die maximale Maltopentaosekonzentration erreicht ist, muss die Amylase in der fünften Lösung deaktiviert werden. Dies kann, nach verschiedenen Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, geschehen. Eine Möglichkeit besteht darin, die fünfte Lösung auf eine Temperatur oberhalb von 100°C, vorzugsweise von 120°C, während einer zur Zerstörung der Amylaseaktivität genügenden Zeit zu erhitzen. Die fünfte Lösung (mit deaktivierter Amylase)

wird dann zur Entfernung von feinteiligen Verunreinigungen filtriert und zur Isolierung der Maltopentaose fraktioniert. Eine Möglichkeit der Gewinnung der Maltopenta-osekomponenten der fünften Lösung ist die Verwendung einer Trennkolonne. Die Methode der Abtrennung verschiedener organischer Fraktionen aus wässrigen Lösungen ist allgemein bekannt und wird hier nicht beschrieben. Mit wenig oder ohne Expérimentation kann eine nachstehend als sechste Lösung bezeichnete, an Maltopentaose reiche Lösung aus der Trennkolonne erhalten werden.

Die sechste Lösung kann dann getrocknet werden, wobei ein an Maltopentaose reiches festes Produkt gebildet wird. Das Trocknen kann nach verschiedenen Methoden erfolgen, jedoch ist die Gefriertrocknung des Produkts eine befriedigende Methode. Die sechste Lösung kann so eingestellt werden, dass sie bis zu 98 % Maltopentaose zusammen mit geringen Anteilen von Maltotetraose und Malto-hexaose als Verunreinigungen enthält.

Beispiel

Ein 10 Liter-Messzylinder, der einen Rührstab enthält, wird auf einen Kohle-Parmer-Magnetrührer gestellt. In den Messzylinder werden 4,73 Liter DMSO gegeben, worauf der Rührstab mit mässiger Geschwindigkeit gedreht wird. In den Messzylinder wird 1 kg Amylose so eingeführt, dass die Amylose sich gleichmässig im DMSO mischt und keine Klumpen gebildet werden. Der Rührstab wird auf maximale Drehzahl gebracht, und diese erste Lösung wird über Nacht oder bis zur vollständigen Auflösung der Amylose gerührt. Geeignet sind, beliebige Konzentrationen der Amylose im DMSO, jedoch enthält diese erste Lösung bei der bevorzugten Ausführungsform etwa 15 bis 20 Gew.-Teile Amylose pro 100 Raumteile DMSO.

Dann werden 60 ml 10%ige Schwefelsäure (V/V) in den Messzylinder gegeben und mit dem Inhalt des Messzylinders gut gemischt, wobei eine zweite Lösung gebildet wird. Der Messzylinder mit Inhalt wird dann in einen Autoklaven gestellt und 55 Minuten bei 121°C gehalten, wodurch die Amylose in der zweiten Lösung teilweise hydro-lysiert wird. Auch hier tritt bei jeder beliebigen Konzentration der Säure in der Lösung eine gewisse Hydrolysierung ein, jedoch enthält die zweite Lösung bei der bevorzugten Ausführungsform etwa 0,05 bis 0,20% H2S04.

15 Liter Methanol und 7,5 Liter Aceton werden auf eine Temperatur von 4°C gebracht und dann in einem 38 Liter Behälter gemischt. Nachdem der Messzylinder mit Inhalt auf 100°C gekühlt worden ist, wird sein Inhalt in die kalte Methanol-Aceton-Lösung gegossen und gerührt. Die als dritte Lösung bezeichnete erhaltene Lösung wird dann während einer zur Bildung einer Fällung genügenden Zeit stehengelassen. Durch Stehenlassen des Gemisches über Nacht setzt sich der grösste Teil der ausgefällten löslichen Amylose aus der dritten Lösung ab. Der flüssige Rückstand wird dekantiert und verworfen und die Fällung unter Verwendung eines Büchnertrichters und von grobem Filterpapier abfiltriert. Die Fällung wird in 3,8 Liter Methanol gewaschen und dann durch Filtration vom Methanol entfernt, wobei wiederum ein Büchnertrichter und ein Filterkolben verwendet werden. Bei beiden Trennstufen muss darauf geachtet werden, dass die Luftfeuchtigkeit die Amylose nicht lösen kann.

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Die Fällung wird in eine Gefrierschale gegeben und über Nacht in einem Hull-Gefriertrockner getrocknet, wobei trockene lösliche Amylose erhalten wird.

Eine wässrige Pufferlösung wird unter Verwendung von 5 Liter Trisma-Puffer hergestellt, dem 12,1 g Trisma-Base und genügend Essigsäure zur Einstellung des pH-Werts der Pufferlösung auf 8,0 + 0,2 zugesetzt werden. Diese Pufferlösung wird in ein 20 Liter-Gefäss aus nicht-rostendem Stahl gefüllt und im Autoklaven 15 Minuten bei 121°C gehalten.

Nach Entfernung des Puffers aus dem Autoklaven werden, während die Temperatur über 90°C liegt, 0,5 ml Amylase, die von Bacillus licheniformis gewonnen worden ist, der Pufferlösung zugesetzt, worauf diese mit einem Magnetrührstab gerührt wird. (Diese Amylase ist unter der Handelsbezeichnung «Thermamyl 60» von Novo Chemical Company erhältlich.)

Nachdem die Amylase in der Pufferlösung dispergiert worden ist, werden 1000 g lösliche Amylose, die in der oben beschriebenen Weise hergestellt worden ist, der Pufferlösung so zugesetzt, dass keine grossen Aggregate von löslicher Amylose gebildet werden. Diese vierte Lösung wird 15 Minuten bei 121°C autoklaviert. Die Lösung wird dann, während sie noch heisser als 90°C ist, aus dem Autoklaven genommen, worauf weitere 0,5 ml der gleichen Amylase der Pufferlösung zugesetzt werden. Wenn die Temperatur der Pufferlösung auf 85°C gefallen ist, wird weitere 1,0 ml Amylase zugesetzt, und weitere Portionen von je 1,0 ml Amylase werden nach einem Abfall der Temperatur von je 5°C bis hinab auf 55°C einschliesslich zugegeben. Die insgesamt zugesetzte Amylasemenge beträgt 8,0 ml.

Diese vierte Lösung wird über Nacht unter Verwendung einer beheizten Rührplatte bei 50° bis 55°C gehalten. Eine fünfte Lösung mit hoher Konzentration an Maltopentaose wird hierbei gebildet.

Nach etwa 24 Stunden wird eine Probe von 1 ml dieser fünften Lösung genommen, und die Kohlenhydratzusam-5 mensetzung der Probe wird nach üblichen chromatographischen Methoden bestimmt. Wenn auf der Grundlage dieser Analyse festgestellt worden ist, dass der Anteil der Maltopentaose im gesamten Kohlenhydrat höher ist als etwa 25%, wird die gesamte Lösung 15 Minuten im Autoklaven io bei 121°C gehalten, um die Amylase zu deaktivieren. Wenn die Maltopentaosefraktion des Kohlenhydrats in der fünften Lösung geringer ist als etwa 25%, wird zusätzliche Amylase der Lösung zugegeben, worauf die Inkubation fortgesetzt wird, bis der richtige Gehalt an Maltopentaose erreicht ist. 15 Nachdem die Amylaseaktivität in der Lösung durch die Behandlung im Autoklaven zerstört worden ist, wird die Lösung auf etwa 50°C gekühlt, und alle feinteiligen Stoffe werden durch Filtration oder Zentrifugieren aus der Lösung entfernt. Der Überstand wird dekantiert, und die festen 20 Verunreinigungen werden verworfen.

Der Überstand wird dann unter Verwendung einer Trennkolonne getrennt, die mit Gel P2 einer Teilchengrösse von 37 {i und weniger (bezogen von Bio-Rad) gefüllt ist Unter Anwendung üblicher Methoden werden aus der Säule 25 ablaufende Fraktionen, die in erster Linie Maltopentaose enthalten, aufgefangen. Diese als sechste (Maltopentaose-reiche) Lösung bezeichneten Fraktionen enthalten, wenn sie zusammengegossen werden, etwa 95 bis 98 % Maltopentaose mit geringen Anteilen von Maltotetraose und 30 Maltohexaose. Die zusammengegossenen Fraktionen werden dann nach üblichen Methoden gefriergetrocknet, wobei ein an Maltopentaose reiches festes Produkt erhalten wird.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

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1. Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Amylose in einem ersten organischen Lösungsmittel löst, das die Amylose unter Bildung einer ersten Lösung zu dissoziieren und zu lösen vermag,

b) die erste Lösung mit einer wässrigen Säurelösung mischt, die die Amylose teilweise zu hydrolysieren vermag und hierdurch eine zweite Lösung bildet,

c) die zweite Lösung erhitzt und hierdurch die dissoziierte Amylose teilweise zu Segmenten von niedrigerem Molekulargewicht hydrolysiert,

d) die die teilweise hydrolysierte Amylose enthaltende zweite Lösung mit einem zweiten organischen Lösungsmittel mischt, das das erste organische Lösungsmittel aus der hydrolysierten Amylose zu entfernen vermag und hierdurch eine dritte Lösung bildet, und die Bildung einer Fällung in der dritten Lösung zulässt,

e) die Fällung isoliert, wäscht und trocknet und hierdurch wasserlösliche Amylose bildet,

f) von Bacillus licheniformis erhaltene Amylase und die lösliche Amylose in einer gepufferten wässrigen Lösung mischt und hierdurch eine vierte Lösung bildet,

g) die vierte Lösung während einer Zeit inkubiert, die zur Bildung einer fünften Lösung genügt, die einen hohen Prozentsatz Maltopentaose enthält,

h) die Amylase in der fünften Lösung deaktiviert und i) die fünfte Lösung fraktioniert und hierbei eine sechste Lösung gewinnt, die reich an Maltopentaose ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die sechste Lösung trocknet und hierdurch ein Maltopentaose enthaltendes festes Produkt gewinnt.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als erstes organisches Lösungsmittel Di-methylsulfoxyd verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässrige Säurelösung eine Schwefelsäure enthaltende wässrige Lösung verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die zweite Lösung wenigstens 30 Minuten auf eine Temperatur von mehr als 100°C erhitzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zweites organisches Lösungsmittel verwendet, das Aceton, Methanol oder ein Gemisch von Aceton und Methanol enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Mischen der Amylase mit der löslichen Amylose zur Bildung der vierten Lösung bei erhöhter Temperatur vornimmt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Amylase deaktiviert, indem man die Temperatur der fünften Lösung auf mehr als 100°C erhöht.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fraktionierung der fünften Lösung mit einer Trennkolonne durchführt.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man das Trocknen der sechsten Lösung zur Bildung eines Maltopentaose enthaltenden Produkts durch Gefriertrocknen der sechsten Lösung vornimmt.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation der vierten Lösung bei erhöhter Temperatur durchführt.