CH630096A5 - Process for the preparation of nitroaromatic glycosides - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von nitroaromatischem Glykosin der Formel (I)

ch2oh

(I) ,

worin n eine ganze Zahl von 2,3 oder 4 und R ein substituierter aromatischer Rest der Formel oder ist, worin X und Y unabhängig voneinander für H, no2, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, OR1 oder co2r1 stehen, mit R1 ein Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen ist mit der Massgabe, dass wenigstens einer der Reste X und Y für no2 steht.

Die US-PS 3 879 263 beschreibt die Bestimmung des a-Amylasegehalts von biologischen Proben durch Zusatz von Maltotetraose oder Maltopentaose zu einer Probe bei konstanter Temperatur und konstantem pH-Wert. Die Methode ermöglicht eine schnelle Bestimmung der a-Amylase und kann angewendet werden, um zwischen a-Amylase im Speichel und a-Amylase im Pankreassekret zu differenzieren. Die letztere bildet Glucose, während die erstere keine Glucose bildet. Die gebildete Glucose kann spektrophotome-trisch, z.B. durch Absorption von Nicotinamid-Adenindinu-cluotid (reduzierte Form) (NADH) bei 340 nm bestimmt werden. Da diese Bestimmungsmethode von Glucose abhängig ist, ist eine Glucose-Nachweisreaktion notwendig. Ferner muss Glucose, die in der Probe vorhanden ist, entweder entfernt oder kompensiert werden. Die Verbindungen gemäss der Erfindung unterscheiden sich hiervon insofern,

als 4-Nitrophenol als Substanz frei wird, die dann zu a-Amylase in Beziehung gebracht werden kann. Hierdurch wird die so Bestimmung unabhängig vom Schritt zum Nachweis von Glucose.

A.P. Jansen und P.G.A.B. Wydeveld stellen in Nature 162 (1958) 525 fest, dass a-(p-Nitrophenyl)maltosid als Substrat für die Amylasebestimmung geeignet sein könnte. Diese Ver-55 öffentlichung zeigt jedoch, dass die Verfasser nie das aktive Agens, das für ihre Beobachtungen verantwortlich ist, identifizierten. Sie berichten: 1) Durch Bebrüten von menschlichen Urin- oder Speichelproben mit a-(p-Nitrophenyl)maltosid bei 37°C für 16 Stunden wurde 4-Nitrophenol gebildet, das 60 spektrophotometrisch durch Mischen des Hydrolysats mit 0,02n-Natriumhydroxyd identifiziert wurde. 2) Die Hydrolyse wurde durch Fällungsmittel für Protein, z.B. 10%ige Trichloressigsäure und 0,5n-Silbernitrat, verhindert. 3) Die Hydrolyse war pH-abhängig und am wirksamsten bei pH 5,9 65 bis 7,0. Die Verfasser geben an, dass dies der Nachweis für «das mögliche Vorhandensein einer nicht identifizierten Car-bohydrase» war. Es wird nicht angenommen, dass a-(4-Nitrophenyl)maltosid für eine Amylasebestimmung geeignet

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ist, weil die Spaltung dieser Verbindung durch a-Amylase extrem langsam verläuft.

ch2oh

/

OH

oh ch-2oh

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von nitroaromatischem Glykosin der Formel (I)

ch2oh

0

(I)

worin n eine ganze Zahl von 2,3 oder 4 und R ein substituierter aromatischer Rest der Formel oder ist, worin X und Y unabhängig voneinander für H, no2, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, OR1 oder co2r1 stehen, mit R1 ein Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen ist mit der Massgabe, dass wenigstens einer der Reste X und Y für no2 steht,

ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.

Die Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen ist im vorangehenden Patentanspruch 10

25 charakterisiert.

Die nitroaromatischen Glykoside, die gemäss der Erfindung erhalten werden, sind Abkömmlinge einer Reihe von Oligomeren und Polymeren von Glucose, die a[-^4] verknüpft sind. Diese Reihe von Glykosiden hat die nachste-30 hend genannte, allgemeine Formel. Die Gn-Nomenklatur ist zweckmässig für die Kurzbezeichnung der a[l-»4]-verknüpften Glucoseeinheiten.

HO

CHoOH oh cho0h ci oh ch2oh

„ j4>-

oh

0

CHpOH

Wc n

oh a-D-Glucose(Gi) n = 0 Maltose (g2)

n = 1 Maltotriose (G3) n = 2 Maltotetraose (G4) n = 3 Maltopentaose (G5) n = 4 Maltohexaose (G6) n = 2000 Amylose

Nomenklatur von Glucose-[l —-4]-oligosacchariden

Der Kürze halber werden bei der Beschreibung der Erfindung die in Tabelle I genannten Trialbezeichnungen und 45 Kurzbezeichnungen verwendet. Diese beziehen sich auf die in Tabelle I genannten systematischen Bezeichnungen. Die Regeln hierfür sind in «Naming and Indexing of Chemical Substances for Chemical Abstracts Düring the Ninth Collective Period (1972-1976)», Chemical Abstracts Service, so Columbus, Ohio (1973), dargelegt.

Tabelle I

Kurzbezeichnung Trivialname

Systematische Bezeichnung

Gì g2 g3

g4

Gs

Ge

D-Glucose

Maltose

Maltotriose

Maltotetraose

Maltopentaose

Maltohexaose

D-Glucose

4-O-a-D-Glucopyranosyl-D-glucose

0-a-D-Glucopyranosyl-( 1 —4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l —4)-D-glucose

0-a-D-Glucopyranosyl-(l —4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l -*4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l—4)-D-glucose

0-a-D-Glucopyranosyl-( 1 —4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l -*4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l —4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l —4)-D-glucose

0-a-D-Glucopyranosyl-(l—4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l—*4)-0-

a-D-glucopyranosyl-(l-*4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l-»4)-0-a-

D-glucopyranosyl-(l-*4)-D-glucose

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Tabelle I (Fortsetzung) Nomenklatur von Glucose-[ 1 -*4]-oligosacchariden

Kurzbezeichnung Trivialname

Systematische Bezeichnung

G4pNp a-(4-Nitrophenyl)maltotetraosid

GsPnP a-(4-Nitrophenyl)maltopentaosid

G3(Ac)io Deccaacetylmaltotriosyl G4(Ac)i3 Tridecaacetylmaltotetraosyl

4-Nitrophenyl-0-a-D-glucopyranosyl-(l—4)-0-a-D-glucopyra-nosyl-( 1 - *4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l — 4)-a-D-glucopyranoside 4-Nitrophenyl-0-a-D-glucopyranosyl-(l-*4)-0-a-D-glucopyra-nosyl-( 1 -*4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l —4)-0-a-D-glucopyrano-syl—( 1 —4)-a-D-glucopyranoside

2,3,6,2' ,3' ,6' ,2' ' ,3" ,4" ,6" -Decaacetyl-O-cc-D-glucopyranosyl-( 1 — 4)-0-a-D-glucopyranosyl-( 1 -^4)-0-a-D-glucopyranosyl 2,3,6,2' ,3' ,6' ,2" ,3" ,6" ,2" ' ,3" ' ,4" ' ,6" ' -Tridecaacetyl-O-a-D-glucopyranosyl-(l —4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l —4)-0-a-D-glucopyranosyl-(l—4)-0-a-D-glucopyranosyl

Die als Ausgangsmaterialien verwendeten Glucoseoligo-meren, d.h. Maltotetraose, Maltopentaose und Maltohexaose, können nach dem Verfahren hergestellt werden, entweder das von R.L. Whistler und Mitarbeitern in J. Amer. Chem. Soc. 76 (1954) 1671 und 77 (1955) 1017,5761 oder von Thomas John Pankratz in der US-Patentanmeldung 675 649 der Anmelderin beschrieben wird. Die bevorzugten nitroaro-matischen Glykoside von G4 und Gs können aus reinem G4 und Gs hergestellt werden, die durch Chromatographie des Hydrolysats von Amylose auf die von W. Pigman in «The

Carbohydrates», Academic Press, New York 1957, Seite 678-679 beschriebene Weise hergestellt worden sind. Das 2o Reaktionsschema II veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung der bevorzugten Verbindungen gemäss der Erfindung. Die Einzelheiten jeder Stufe werden nachstehend beschrieben.

Die einzelnen Stufen des Verfahrens zur Herstellung der 2s Verbindungen gemäss der Erfindung werden nachstehend ausführlich beschrieben.

CH20H

OH

Gn=G3 oderG4

Ac20, NaOAc

 "

CHz0Ac

Gn=G3( Ac) i o oder G4( Ac) 13

CeHsOH, ZnCh

A

CHjOAc

CHJOäc

Gn=G3(Ac)iooder G4(Ac)i3

oc6h5

Gn=G3(Ac)io oder G4(Ac)i:

NoOMe

MeOH

CH20H

Gn=MALTO-N-OSIDE RESIDUE ct[l-4] Ac=CH3CO

n0z G3(Ac)io=DECAACETYLMALTOTRIOSYL

G4(Ac)i3=TRIDECAACETYLMALTOTETRAOSYL

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Acetylierungsreaktion

Die Acetylierung von Glucoseoligomeren mit einem Gemisch von Essigsäureanhydrid und wasserfreiem Natrium-acetat bei erhöhten Temperaturen ist bekannt (W. J. Whelan und P. J. Roberts, J. Chem. Soc. (1953) 1298, W. J. Whelan, J. M. Bailey und P. J. P. Roberts, J. Chem. Soc. (1953) 1293, A. Thompson und M. L. Wolfrom, J. Amer. Chem. Soc. 74 (1954) 3612, M. L. Wolfrom, L. W. Georges, A. Thompson und I. L. Miller, J. Amer. Chem. Soc. 71 (1949) 2875. Hierbei werden die vollständig acetylierten Derivate mit dem Substi-tuenten am anomeren Kohlenstoffatom in ß-Konfiguration erhalten. Durch Verwendung von Zinkchlorid oder Säuren als Katalysator an Stelle von Natriumacetat wird die «-Konfiguration in dieser Stellung begünstigt (W. Pigman, loc. cit., Seite 140-142), jedoch ist im Rahmen der Erfindung die ß-Konfiguration erwünscht, damit das Phenol in der nächsten Stufe die anomere Acetoxygruppe durch einen Inversionsmechanismus verdrängen und eine a-Phenylglykosid-bindung bilden kann. Die Acetylierung wird in Essigsäureanhydrids als Lösungsmittel und Reaktionsteilnehmer durchgeführt. Die Menge des Essigsäureanhydrids entspricht dem 5-bis 50fachen Gewicht von G4 oder Gs. Bevorzugt wird die 5-bis 1 Ofache Gewichtsmenge von G4 bzw. Gs, damit genügend Reagens vorhanden ist, um die Reaktionsteilnehmer in Lösung zu halten, und um die Isolierung des Produkts zu ermöglichen, wenn das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen wird. Das wasserfreie Natriumacetat kann in einer Menge von 1 bis 10, vorzugsweise von 5 bis 6 molaren Äquivalenten pro molares Äquivalent von G4 bzw. Gs verwendet werden.

Die Reaktionstemperatur kann bei 100°C bis 140°C, d.h. bei der Rückflusstemperatur von Essigsäureanhydrid liegen und liegt vorzugsweise zwischen 110 und 120°C. Unterhalb von 100°C verläuft die Acetylierung sehr langsam und unvollständig, und oberhalb von 140°C (z.B. in einem Druck-gefäss) verläuft die Reaktion sehr heftig und führt zu einem dunkelfarbigen Produkt.

Die Reaktionszeit kann 1 bis 6 Stunden betragen und beträgt vorzugsweise etwa 2 Stunden. Durch längeres Erhitzen bei erhöhten Temperaturen wird ebenfalls ein dunkles Produkt erhalten. Der Einsatz der Reaktion macht sich dadurch bemerkbar, dass das Reaktionsgemisch zu einer homogenen Lösung und die Reaktion leicht exotherm wird.

Das vollständig acetylierte Produkt wird isoliert, indem das gekühlte Reaktionsgemisch in Eiswasser, dessen Menge dem 5- bis 20fachen Volumen des Essigsäureanhydrids entspricht, gegossen, das Gemisch einige Minuten kräftig gerührt und dann wenigstens 24 Stunden bei 0° bis 5°C stehen gelassen wird. Das feste Produkt, dessen Kristallisation gegebenenfalls durch Impfen verbessert und beschleunigt werden kann, wird abfiltriert, an der Luft getrocknet und aus einem geeigneten Lösungsmittel wie Äthanol oder Methanol umkristallisiert.

Die Identität dieser und anderer Zwischenprodukte wird durch die üblichen Spektraleigenschaften und -analysen bestätigt. Die Stereochemie des anomeren Kohlenstoffs lässt sich leicht durch kernmagnetische Resonanzspektroskopie der Protonen ('H NMR) insbesondere bei hohen Frequenzen, z.B. 220 MHz und gegebenenfalls durch Untersuchungen der optischen Drehung feststellen. Im NMR-Spek-trum von Aldopyranoseacetaten lässt sich ein anomeres Proton in a-Konfiguration (Hia) von einem anomeren Proton in ß-Konfiguration (Hiß) unterscheiden. Im NMR-Spektrum von Aldopyranoseacetaten hat ein anomeres Proton in der a-Konfiguration (Hia) eine chemische Verschiebung (8) in der Nähe von 5,75 ppm feldabwärts vom inneren Tetramethysilan, und das Signal erscheint als Dublett mit einer axial-axialen Kupplungskonstante (J) von

7 bis 9 Hz. Ein anomeres Proton in ß-Konfiguration (Hiß) gibt ein Signal von 0,2 bis 0,65 ppm feldabwärts von dieser Stellung und hat ebenfalls ein Dublett mit einer axial-äquato-rialen oder äquatorial-äquatorialen Kupplungskonstante von 3 bis 4 Hz (siehe beispielsweise L.M. Jackman «Applications of NMR Spectroscopy in Organic Chemistry», Seite 86 und 116, Pergamon Press (London 1959).

Acetatverdrängungsreaktion

Die Verdrängung der anomeren Acetatgruppe in einem vollständig acetylierten Zucker findet leichter statt als die der anderen Acetatgruppen. Dies ist eine nützliche Eigenschaft für Synthesezwecke, weil sie eine bevorzugte Reaktion an dieser Stellung ermöglicht. Wenn beispielsweise Tetradeca-acetylmaltotetraosid oder Heptadecaacetylmaltopentaosid mit Phenol und wasserfreiem Zinkchlorid (ZnCk) bei erhöhten Temperaturen gerührt wird, wird die anomere ß-Acetoxygruppe durch eine a-Phenoxygruppe ersetzt. Während wenigstens ein molares Äquivalent Phenol pro molares Äquivalent Acetylverbindung erforderlich ist, um der Stö-chiometrie der Reaktion zu genügen, kann die Reaktion mit 3 bis 20 molaren Äquivalenten, vorzugsweise mit 4 bis 8 molaren Äquivalenten Phenol durchgeführt werden, damit genügend Material zur Bildung einer homogenen Lösung vorhanden ist. Die Zinkchloridmenge kann 0,25 bis 5 molare Äquivalente pro molares Äquivalent Acetylverbindung betragen und liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 1,5 molaren Äquivalenten. Diese Reaktion kann bei Temperaturen im Bereich von 80°C bis 120°C durchgeführt werden, wobei Temperaturen im Bereich von 100 bis 110°C aus den gleichen Gründen, die vorstehend für die erste Stufe des Verfahrens genannt wurden, bevorzugt werden. Die Reaktionszeit kann 0,25 bis 6 Stunden betragen. Im allgemeinen genügen 1 bis 3 Stunden. Eine Lösung von Zinkchlorid in einem Gemisch von Essigsäure und Essigsäureanhydrid (beispielsweise mit einem Volumenverhältnis von 95:5) ist eine vorteilhafte Modifikation des vorstehend genannten Lösungsmittel- und Katalysatorsystems für die Einführung der a-Phenoxygruppe.

Das als Katalysator dienende wasserfreie Zinkchlorid kann durch Säuren, z.B. p-Toluolsulfonsäure, und durch andere wasserfreie kovalente Metallchloride, z.B. Titan(IV)-chlorid (TiCU), Zinn(IV)-chlorid (SnCk) und Eisen(III)-chlorid (FeCb) ersetzt werden.Die Verdrängungsreaktion verläuft ohne Lösungsmittel, weil durch den niedrigen Schmelzpunkt des Phenols (43 °C) sichergestellt ist, dass bei Verwendung von überschüssigem Phenol, um die Reaktion zur Vollendung zu bringen, das Gemisch bei der Reaktionstemperatur eine homogene Lösung bleibt. Ähnliche Reaktionen sind auch zu erwarten, wenn überschüssige Mengen von Phenolen, die bei der Reaktionstemperatur flüssig sind, sowohl als Lösungsmittel als auch als Reaktionsteilnehmer verwendet werden, z.B. 2-Kresol (Schmelzpunkt 30°C),

3-Kresol (Schmelzpunkt 11°C), 4-Kresol (Schmelzpunkt 35°C), 2-Chlorphenol (Schmelzpunkt 8°C), 3-Chlorphenol (Schmelzpunkt 29°C), 4-Chlorphenol (Schmelzpunkt 37°C),

4-Bromphenol (Schmelzpunkt 64°C), 2-Nitrophenol (Schmelzpunkt 45°C), 2-Methoxyphenol (Guaiacol, Schmelzpunkt 32°C), 4-Methoxyphenol (Schmelzpunkt 53°C), 2-Methyl-5-isopropylphenol (Carvacrol, Schmelzpunkt 1°C), 2-Isopropyl-5-methylphenol (Thymol, Schmelzpunkt 51°C) und Methylsalicylat (Schmelzpunkt -8°C). Bei Phenolen mit höherem Schmelzpunkt sowie bei den vorstehend genannten Phenolen ist es auch möglich, die Reaktion in einem Lösungsmittel, z.B. Benzol (Siedepunkt 80°C), Toluol (Siedepunkt 110°C) oder Heptan (Siedepunkt 98°C), durchzuführen. Bei Verwendung der höherschmelzenden Phenole, z.B. 3-Nitrophenol (Schmelzpunkt 96°C), 4-Nitro-

6

s

10

IS

20

25

30

35

40

45

SO

SS

60

65

7

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phénol (Schmelzpunkt 114°C), 2,4-Dinitrophenol (Schmelz- sylderivat blockiert ist. Der Grad der m-Substitution ist ver-punkt 113°C), 1 -Naphthol (Schmelzpunkt 94°C) und nachlässigbar.

2-Naphthol (Schmelzpunkt 122°C) macht die Lösungsmittel- Beim Nitroniumtetrafluorborat-Verfahren beträgt die methode das Gemisch homogen und verhindert Verkohlung bevorzugte Reaktionszeit 0,25 bis 1 Stunde und die bevor-des Acetylderivats. Als Lösungsmittel eignet sich auch einer s zugte Reaktionstemperatur etwa 25°C. Das Molverhältnis der vorstehend genannten Katalysatoren, der bei der Reak- von Nitroniumtetrafluorborat zu acetyliertem Glykosid kann tionstemperatur flüssig ist, z.B. Titan(I V)-chlorid (Siede- zwischen 1:1 und 20:1 liegen, wobei ein Verhältnis von 10:1

punkt 136°C) oder Zinn(IV)-chlorid (Siedepunkt 114°C). bevorzugt wird, um vollständige Einführung einer Nitro-

Falls gewünscht, kann das Produkt der Reaktion mit dem gruppe zu gewährleisten. Ausser dem bevorzugten Dichlor-

Phenol nach dem Verfahren der ersten Stufe reacetyliert io methan können Chloroform und 1,2-Dichloräthan als werden, um etwaige freie Hydroxylgruppen zu schützen, die Lösungsmittel verwendet werden. Das Nitroniumtetrafluor-durch Deacetylierungsnebenreaktionen während der Einfüh- borat-Verfahren wird wegen seiner leichten Durchführbar-rung der Phenoxygruppe entstanden sein können. keit bevorzugt.

Das erhaltene nitrierte Produkt des ersten Verfahrens kann Nitrierungsreaktion is aus dem Gemisch von Salpetersäure, Essigsäure und Schwe-

Die direkte Verwendung von 4-Nitrophenol zur Herstel- feisäure isoliert werden, indem das Reaktionsgemisch in lung von 4-Nitrophenylglykosiden wurde zwar beschrieben Wasser (im allgemeinen etwa die 5- bis 20fache Volumen-und kann angewendet werden (T. D. Audichya, T.R. Ingle menge) gegossen und das rohe Produkt entweder abfiltriert und J.L. Bose, Indian J. Chem. 9 (1971) 315, A.P. Jansen und oder mit Chloroform extrahiert wird. Beim Nitroniumtetra-P.G.A.B. Wydeveld, loc. cit.), jedoch wird das im Schema II 20 fluorborat-Verfahren wird die Dichlormethanlösung kalter beschriebene, zu oc-(4-Nitrophenyl) tridecaacetylmaltote- gesättigter Natriumchloridlösung zugesetzt, über Natrium-

traosid und a-(4-Nitrophenyl)hexadecaacetylmaltopentaosid sulfat getrocknet und eingedampft, wobei das rohe Glykosid führende Verfahren wegen der leichten Durchführung bevor- zurückbleibt.

zugt. Die Nitrierung kann in einem Gemisch von Essigsäure und Schwefelsäure mit Salpetersäure oder in Dichlormethan 2s mit einer Nitroniumverbindung, z.B. Nitroniumtetrafluor- Deacetylierungsreaktion borat (N02+BF4-) Nitroniumhexafluorphosphat (NCh+PFô") Die selektive Entfernung von O-Acetylgruppen von einem oder Nitroniumtrifluormethansulfonat (NOa+CFìSOs) acetylierten Polyolderivat erfolgt vorzugsweise entweder mit durchgeführt werden. Alle diese Verfahren werden von L.F. einer katalytischen Menge Natriummethoxyd (im allge-Fieser und M. Fieser «Reagents for Organic Synthesis»5 30 meinen 0,01 bis 0,1 molares Äquivalent) in Methanol oder ( 1975) 477, Wiley-Interscience, New York, beschrieben. durch eine Lösung von wasserfreiem Ammoniak in Methanol.

Nitroniumtetrafluorborat wird bevorzugt und dient zur Ausser dem bevorzugten Natriummethoxyd können

Beschreibung dieses Aspekts des Verfahrens. Beim ersten andere niedere Alkalialkoxyde, z.B. Kaliummethoxyd, Verfahren wird eine Lösung des phenylacetylierten Glyko- Natrium- und Kaliumäthoxyd und Kalium-t-butoxyd, die im sids in einem Gemisch von Schwefelsäure und Essigsäure bei 35 entsprechenden Alkohol enthalten sind, verwendet werden. 0° bis 25°C mit einem 5- bis 30fachen molaren Überschuss Diese Deacetylierungsreaktionen finden leicht bei Tempera-von 70%iger Salpetersäure, die in Essigsäure gelöst ist, turen von 0° bis 25°C innerhalb von 12 bis 24 Stunden statt,

behandelt. Die Salpetersäure wird vorzugsweise in einer Das deacetylierte Produkt wird durch Abdampfen des Alko-

Menge von 10 bis 20 molaren Äquivalenten pro molares hols isoliert, von anorganischen Ionen durch Durchleiten

Äquivalent des Acetylderivats verwendet. Die Reaktionstem- 40 durch eine saure Ionenaustauschersäule befreit (falls peratur liegt zwischen 0° und 25°C (vorzugsweise etwa 0°C), gewünscht) und aus einem geeigneten Lösungsmitel, z.B. um eine weitere Nitrierung des aromatischen Ringes und Methanol oder Äthanol, umkristallisiert. Bei einem anderen

Spaltung der Ester- und Glykosidbindungen weitgehend aus- Deacetylierungsverfahren wird eine 3%ige Lösung von zuschalten. Die Reaktionszeit kann 1 bis 10 Stunden betragen Chlorwasserstoff in Methanol (L.F. und M. Fieser «Reagents (bevorzugt werden etwa 4 Stunden), jedoch sollte man die 45 for Organic Syntheses», Seite 11, Wiley, New York 1967) bei Reaktion möglichst vollständig ohne Bildung der vorstehend Temperaturen von 0° bis 25°C für eine Dauer von 4 bis 24 genannten weiteren Produkte ablaufen lassen. Die Nitrierung Stunden verwendet. Dies ist besonders vorteilhaft für Dini-der aromatischen Glykosidacetate, die aus den vorstehend im troverbindungen.

Zusammenhang mit der Verdrängungsreaktion genannten Bei einer alternativen Synthese wird eines der Phenole zur

Phenolen hergestellt worden sind, folgt dem üblichen 50 Verdrängung des Halogens von Tridecaacetylmaltotriosyl-

o-p-Substitutionsschema, wobei die p-Stellung begünstigt oder Hexadecaacetylmaltopentaosylchlorid oder -bromid wird, falls sie nicht durch eine andere Gruppe wie im 4-Kre- der folgenden Struktur verwendet:

X = Cl oder Br

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Diese Halogenide werden entweder durch Behandlung des vollständig acetylierten Oligosaccharids mit wasserfreiem Halogen wasserstoff, Lösungen von Halogenwasserstoff in Gemischen von Essigsäureanhydrid und Essigsäure, Lösungen von Aluminiumchlorid und Phosphorpentachlorid oder von Titantetrachlorid in Chloroform oder aus dem Oligosaccharid selbst durch Behandlung mit Acetylchlorid hergestellt (W. Pigman, loc. cit., Seite 150-151).

Das Halogenatom wird entweder mit Phenol oder einem substituierten Phenol in Gegenwart eines Halogenakzeptors wie Silber(I)-oxyd (Ag20), Silber(I)-carbonat (Ag2C03), Quecksilber(II)-acetat (Hg(CH3COO)2) oder mit Eisen(III)-chlorid (Koenigs-Knorr-Reaktion) oder mit dem Natriumoder Kaliumsalz des Phenols verdrängt (W.Pigman, loc. cit., Seite 194-198). Der Rest der Synthese ist der gleiche, wie oben beschrieben.

Der Ablauf aller vorstehend beschriebenen Reaktionen kann durch Dünnschichtchromatographie (DSC) an Kieselgel in einem geeigneten Lösungsmittelsystem oder durch NMR-Spektroskopie verfolgt werden. Die Reinheit der Pro15

20

dukte der Reaktionen kann durch Hochleistungs-Flüssig-chromatographie (high-performance liquid chromatography [HPLC]), durch Plarimetrie und durch UV-Spektroskopie und Hochfrequenz (220 MHz)-NMR-Spektroskopie bestimmt werden.

Es wurde gefunden, dass die nitroaromatischen Glykoside gemäss der Erfindung vorteilhafte Substrate für die Bestimmung von a-Amylase im Serum sind. Die Bestimmungsmethode ist im Schema I für die bevorzugten Verbindungen gemäss der Erfindung, a-(4-Nitrophenyl)maltotetraosid und a-(4-Nitrophenyl)maltopentaosid, veranschaulicht. Die a-Amylase im Serum wandelt diese beiden Verbindungen in ein Gemisch von G2 oder G3 und a-(4-NytrophenyI)maltosid um. Das letztere wird dann mit a-Maltase zu Glucose und 4-Nytrophenyl hydrolysiert. Durch Behandlung mit verdünntem Alkali wird das 4-Nytrophenolatanion gebildet, das spektroskopisch identifizierbar und von etwaigem nicht umgesetztem Glykosid unterscheidbar ist und mit der Konzentration an a-Amylse im Serum in Beziehung gebracht werden kann.

Schema I: Bestimmung von a-Amylase im Serum

CKjOH

A,max 290-305 nm

R=4-02NCeH4 n=2 a-(4-Nitrophenyl)maltotetraosid n=3 a-(4-Nitrophenyl)maltopentaosid la-Amylase

CHoOH

G2oder g3 +

R = 4-O2NC6H4 n = O a-(4-Nitrophenyl)maltosid a-Maltase

V

4 oder 5 Gì +

HO—V 7—N02

4-Nitrophenol

OH-

0—(f y—N0j

4-Nitrophenolatanion A,max410nm

9 630096

Die nitroaromatischen Glykoside gemäss der Erfindung amid-Adenindinucleotidphosphat).

haben die folgenden Vorteile bei der Bestimmung der a-Amy- Mehrere Ausführungsformen der Erfindung werden in den läse im Serum: Gemäss der US-PS 3 879 263 wird der a-Amy- folgenden Beispielen beschrieben. Alle Mengenangaben in lasegehalt im Serum zu der aus G4 oder Gs gebildeten Glucose Teilen und Prozentsätzen beziehen sich auf das Gewicht, falls in Beziehung gebracht. Demzufolge muss die Glucose im s nicht anders angegeben. Die chemischen Verschiebungen im

Serum vor der Bestimmung chromatographisch aus der kernmagnetischen Resonanzspektrum der Protonen (' H

Probe entfernt werden. Dies erfordert den Zeitaufwand für NMR) sind, falls nicht anders angegeben, in Teilen pro Mil-

die Vorbereitung der Probe und zusätzliche Apparaturen. Bei lion vom inneren Tetramethylsilan in Chloroform-d (CDCb)

Verwendung der Verbindungen gemäss der Erfindung wird angegeben. Die qualitativen 1 H-NMR-Ergebnisse wurden der a-Amylasegehalt im Serum auf die Nitrophenole io bei 60 MHz ermittelt. Genauere Messungen wurden bei 220

bezogen, die unabhängig vom Glucosegehalt im Serum aus MHz vorgenommen. Die Dünnschichtchromatogramme den nitroaromatischen Glykosiden von G4, Gs oder G6 herge- (DSC) wurden an Kieselgel unter Verwendung von 250 nm-

stellt worden sind. Hierdurch wird nicht nur das Chromato- Platten für die Analysenarbeit und 2-mm-Platten für die prä-

graphiesystem zur Entfernung der Serumglucose überflüssig, parative Arbeit aufgenommen. Die Hochleistungs-Flüssig-

sondern auch das Nachweissystem durch Ersatz der Hexaki- 15 Chromatographie (HPLC) wurde mit dem Gerät «Du Pont nase-ATP-NADP-Einheit durch verdünntes Alkali verein- 830» für die Analysenarbeit und mit dem Gerät «Du Pont facht (ATP-NADP ist das Adenosintriphosphat und Nicotin- 841 » für die präparative Arbeit durchgeführt.

Beispiel 1

A. Herstellung von Maltotetraose-ß-tetradecaacetat

CH20AC

k OAc A

AcO^j 1 O

OAc

CHo0Ac

0-OAc.

CH?OAc - Q CAc l\p|^

OAc

Ein Gemisch von 10,0 g (15,0 mMol) Maltotetraose mit analytisch bestätigter Struktur, 10,0 g (0,15 Mol) wasserfreiem Natriumacetat und 50 ml Essigsäureanhydrid wurde 2 Stunden bei 100°C gerührt und dann in 300 ml Eiswasser gegossen. Nach 48 Stunden bei 5°C wurde die farblose kristalline Masse abfiltriert und an der Luft getrocknet, wobei 20,96 g rohes Produkt erhalten wurden. Dieses Produkt wurde aus 40 ml Methanol umkristallisiert, wobei 18,18 g (14,49 mMol, 96%) kristalline Maltotetraose-ß-tetradeca-acetat in zwei Kristallisaten von 2,98 g und 15,20 g erhalten wurden. Das erste Kristallisat hatte einen Schmelzpunkt von 124 bis 126°C. Seine Struktur wurde durch die folgenden Werte bestätigt:

Vmax (CHCb) 1750,1370,1230 und 1030 cm-1; W (EtOH) 210nm(8 740);[a]g5° + 104°(c 1,03 CHCb); 'H NMR(220

MHz); 8 5,76 (d J = 7) (Hia), 5,43-5,25 (mehrere Gruppen von Multipletts) 27H (OCH, OCH2) und 2,19-2,00 (Reihe von Singletts) 42H (COCH3).

Elementaranalyse für C52H70O35:

Ber.: C 49,76; H 5,62

Gef.: C 49,08; H 5,76

C 49,24; H 5,73

Bei mehreren weiteren Versuchen bis zum Doppelten des vorstehenden Massstabes betrug die Produktausbeute nach ss der Umkristallisation 72-77%. Der Schmelzpunkt betrug 122-128°C.

B. Herstellung der a- und ß-Phenyltridecaacetylmaltotetraoside

CH^OAc

OAc

CBpOAc

OAc

OAc

OAc OAc

ZnCh

OH

630096

10

CH20Ac f(oAc^>! J'

o j—{ o - J

OAc

CIloOAc

./"À,

"wo-

OAc

CH^OAc

Ein Gemisch von 11,0 g (8,77 mMol) Maltotetraose-ß-tetradecaacetat, hergesellt gemäss Abschnitt (A), 8,0 g (85 mMol) Phenol und 2,0 g (14 mMol) wasserfreiem Zinkchlorid wurde sachte erhitzt, bis es dünnflüssig wurde, und dann 3 Stunden mechanisch bei 100°C gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser und Benzol verdünnt und getrennt. Die Benzolschicht wurde nacheinander dreimal mit je 50 ml 5%igem Natriumhydroxyd und zweimal mit je 50 ml gesättigter wässriger Natriumchloridlösung extrahiert, getrocknet und eingedampft, wobei 10,09 g (7,8 mMol, 89%) des rohen Phenylderivats in Form eines gelben kristallinen Feststoffs erhalten wurden. Dieses Material wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie wie folgt gereinigt:

Insgesamt 3,06 g des rohen Phenylderivats wurden auf 14 2-mm-Platten für die präparative Dünnschichtchromatographie gegeben und dreimal mit einem Gemisch von Benzol und Methanol (95:5) entwickelt. Die Bande bei Rf 0,13-0,27 wurde mit Chloroform und Methanol extrahiert, wobei 0,90 g (29%) Produkt erhalten wurden, das aus Äthanol umkristallisiert wurde, wobei 0,58 g eines Gemisches von a- und ß-Phe-

10

nyltridecaacetylmaltotetraosiden erhalten wurden. Die analytische HPLC (polare Siliconmikrokügelchen) ergab ein Produkt mit einer Retentionszeit von 8,99 Minuten und einer kleineren Verunreinigung (2,4%) bei 8,23 Minuten. Die Struktur des kristallinen Phenyltridecaacetylmaltotetraosids wurde durch die folgenden Werte bestätigt:

Vmax(CHCb) 1745,1595, 1585, 1365, 1225 und 1030 cm-' ; ?lmax (EtOH) 273 nm (s 800), 266 (960), 260 (730), 210 (7860); [a]g5° + 132° (c 1,00 CHCb); 'H NMR (220 MHz), Ô 7,37-7,25 (m) 2H, 7,14-6,95 (m) 3H (CeHs), 5,00-3,86 (m) 28H (OCH, OCH2) und 2,19-1,97 ppm (Reihe von Singletts), 39H (COCHa).

Elementaranalyse für C56H72Q34:

15

Ber.: C 52,17; Gef.: C 51,44; H 5,35;

H 5,63 H 51,94; H 5,60;

H 51,60 H 5,39

25

30

Eine Gesamtmenge von 4,25 g des rohen Phenylderivats wurde auch durch präparative HPLC an einer Säule von Spherosil (44-50) von 1 m x 23 mm gereinigt, wobei mit einem l:l-Gemisch von Pentan und Dioxan (Wassergehalt 1,5%) eluiert wurde und 1,07 g (Ausbeute 25%) farbloses kristallines Phenyltridecaacetylmaltotetraosid vom Schmelzpunkt 82-83°C erhalten wurden. Dieses Produkt war gemäss den Spektraldaten und chromatographischen Daten mit dem durch Dünnschichtchromatographie gereinigten Material identisch. Die Analyse durch HPLC ergab, dass diese Probe eine Reinheit von 99,7% hatte.

C. Herstellung von a- und ß-Phenyltridecaacetylmaltotetraosiden (alternatives Verfahren)

AcO

CHjjOAc oi—r 0

OAc

OAc

OAc

CII?0Ac

4T-

Oll

ZnCh/Ac0H/Ac20

OAc

CHpOAc

/\

K OAc A

AcO 1 1 0

OAc

CHpOAc

Np^l- 0.

OAc

CHpOAc

OAc V '

2,75 g (2,19 mMol) Maltotetraose-ß-tetradecaacetat und 2,27 g (24,2 mMol) Phenol wurden in einem Dreihalskolben unter Stickstoff gemischt. Nach Zugabe einer Lösung von 0,55 g Zinkchlorid in 2,0 ml eines Gemisches von Essigsäure und Essigsäureanhydrid (95:5) wurde das Reaktionsgemisch langsam erwärmt. Als das Gemisch homogen wurde (Temperatur etwa 45°C), wurde der Innendruck allmählich auf 23 mm Hg gesenkt und das Reaktionsgemisch 2,5 Stunden bei 100°C gerührt. Das Gemisch wurde in einen Scheidetrichter unter Verwendung von 200 ml warmem Benzol überführt. Das gekühlte Gemisch wurde zweimal mit 18%igem wäss-rigem Natriumchlorid, zweimal mit 50 ml 2,5%igem Natriumhydroxyd und zweimal mit 30 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft und der Rückstand mit 3,0 g wasserfreiem Natriumacetat und 15 ml Essigsäureanhydrid behandelt. Das erhaltene Gemisch wurde 1,0 Stunde auf 120°C erhitzt, gekühlt und mit 200 ml Eiswasser behandelt. Hierbei wurden etwaige ungeschützte Hydroxylgruppen, die bei der Behandlung mit Phenol entstehen, erneut acetyliert. Der Feststoff, der sich beim Stehenlassen bei 0°C bildete, wurde abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 55 2,85 g. Dieses Material wurde an Kieselgel (Mallinckrodt SilicAR CC-7) chromatographiert. Durch Elution mit einem Gemisch von Benzol und Methanol (97:3) wurden insgesamt 2,07 g (71%) reines Phenyltridecaacetylmaltotetraosid nach Umkristallisation aus Äthanol erhalten. Dieses Material 60 hatte einen Schmelzpunkt von 112-117°C. Seine Struktur wurde durch die folgenden Daten bestätigt:

[a]jf + 135° (c 1,0 CHCb), >H NMR (220 MHz) 5 7,38-6,96 (m) 5H (C6H5), 5,77 (dd J = 9,5 Hz) (Hia) und 5,61 (d J = 4 es Hz) (Hiß) 1H, 5,45-3,82 (Reihe von Multipletts) 27H (OCH, OCH2) und 2,24-1,95 ppm (Reihe von Singletts) 39H (COCH3); die Integration stimmte mit einem 75:25-Gemisch von a:ß-Phenyltridecaacetylmaltotetraosiden überein.

11 630 096

D. Herstellung von a- und ß-(4-Nytrophenyl)tridecaacetylmaltotetraosid (Salpetersäure-Verfahren)

CILOAc aÌWo-

OAc

CHpOAc

^-<1

nÇAc /

f—| 0

OAc i

Cll,,OAc

J^-Ko

OAc

HN03, H2SO4

■

HOAc

CII?OAc

'Ö II

0^— 0 — J

CHpOAc

AcO

Ein Gemisch von 2,0 ml Essigsäure, 1,0 ml Essigsäureanhydrid und 0,38 g (0,29 mMol) eines durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigten, gemäss Abschnitt (B) hergestellten Gemisches von a- und ß-Phenyltridecaace-tylmaltotetraosid wurde auf 0°C gekühlt und mit einem Gemisch von 1,0 g Schwefelsäure und 2,0 g Essigsäure und dann mit einem Gemisch von 0,5 g 70%iger Salpetersäure und 1,0 ml Essigsäure behandelt. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei 25°C gerührt, in 25 ml Eiswasser gegossen und filtriert, wobei 0,40 g eines fast farblosen Feststoffs erhalten wurden. Diese Probe bestand zu etwa 50% aus dem 4-Nitro-phenylderivat, wie der Wert von ^max (EtOH) von 290 nm (£ 3100) zeigte.

Die Reaktion wurde im grösseren Massstab (5 g rohes Phe-nyltridecaacetylmaltotetraosid) wiederholt, wobei 4,35 g (84%) der rohen Nitroverbindung erhalten wurde, die an 200 g Kieselgel (Mallinckrodt SilicAR CC-7) chromatographiert wurde. Das mit 4% Methanol in Benzol eluierte Produkt (gewonnen wurden 2,27 g) hatte ebenfalls eine Reinheit von etwa 50%.

Eine Probe von 2,6 g der rohen ausgefällten Nitroverbindung wurde durch präparative HPLC-Trennung unter Ver-

20 wendung einer 2 m x 2,3 cm grossen Säule des Produkts «Spherosil (44-50)» gereinigt. Die Säule wurde mit einem l:l-Gemisch von Pentan und Dioxan (Wassergehalt 1,5%) eluiert. Die Fraktionen wurden durch Dünnschgichtchroma-tographie und UV-Spektroskopie untersucht. Von den mitt-25 leren Schnitten wurden 0,2557 g (0,19 Mol, 8%) reines a- und ß-(Nitrophenyl)tridecaacetylmaltotetraosid erhalten. Nach Umkristallisation aus 5 ml Äthanol hatte dieses Material einen Schmelzpunkt von 112-114°C. Die Struktur des Materials wurde durch die folgenden Werte bestätigt:

30

Vmax(CHCb) 1745,1580, 1520,1420, 1370 und 1220cm-1;A,max (EtOH) 290 nm (e 7180); [a],f + 156° (c 0,525 CHCb);1H NMR (220 MHz), 8 8,26 (d J = 8) und 7,26 (d J = 8) 4H (CóHt), 5,75 (m) IH (Hiaund Hiß), 5,52-3,95 (Reihe von Mul-35 tipletts) 27H (OCH, OCH2) und 2,25-2,01 ppm (Reihe von Singletts) 39H(COCH3).

Elementaranalyse für C56H71NO36:

40 Ber.: C 50,41; H 5,36 Gef.: C 49,95; H 5,54

E. a- und ß-(4-Nitrophenyl)tridecaacetylmaltotetraosid(Nitroniumtetrafluorborat-Verfahren)

CHpCAc

CHpOAc

\fVo Jxî-ro<Q>

OAc OAc

OAc

CHpOAc

ICOAc

AcO i

Eine Aufschlämmung von 1,91 g (14,5 mMol) Nitroniumtetrafluorborat in 8 ml trockenem Methylenchlorid wurde mit einer Lösung von 1,24 g (0,96 mMol) Phenyltridecaace-tylmaltotetraosid aus Teil (C) in 10 ml Dichlormethan behandelt. Das erhaltene Gemisch wurde 20 Minuten unter einer Argonatmosphäre gerührt. Das Gemisch wurde zu 60 ml Eiswasser gegeben, getrennt und mit kalter wässriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Der organische Teil

0-

CllpOAc &

OAc

N02+BF4-CH2CI2

CH~0fcc

Kpvi

OAc

VQ,

J ?

wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 1,30 g a- und ß-(4-Nitro-phenyl)tridecaacetylmaltotetraosid in Form eines gelben glasartigen Feststoffs erhalten wurden. Die Hälfte dieses Pro-65 dukts wurde aus Äthanol umkristallisiert, wobei 0,48 g (75%) eines cremefarbenen Feststoffs vom Schmelzpunkt 116-119°C erhalten wurden. Die Struktur des Produkts wurde durch die folgenden Daten bestätigt:

630096

12

'H NMR (220 MHz), ô 7,75 (AA'BB') 4 H (CeH4), 5,75 (d J = (COCHs); W (EtOH) 288 nm (e 5840); [a]g° + 152° (c 0,5 4 Hz) (Hiß) und 5,81—3,86 (Reihe von Multipletts) 28H (Hia, CHCb).

OCH, OCH2) und 2,25-1,95 (Reihe von Singletts) 39H

F. Herstellung von a- und ß-(4-Nitrophenyl)maltotetraosid

CHgOAc

OAc OAc t/*~q

CHpOAc

CHpOAc f\ A rv '

NaOCHs/CHsOH

NO.

CHgOll

-"fò-P

OH

CH-OH

OH

CH-OH

£>o

OH

tfo.

-J 2

Ein Gemisch von 6,76 g (5,1 mMol) (4-Nitrophenyl)-tride-caacetylmaltotetraosid aus Teil (D), das der Säulenchromatographie unterworfen worden war, 50 ml Methanol und 50 mg Natriummethoxyd wurde über Nacht bei 25°C gehalten. Das Gemisch wurde zur Entfernung einer geringen Menge eines gelben Feststoffs filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft, wobei 3,17 g (4,02 mMol, 79%) eines gelben Feststoffs zurückblieben. 3 g dieser Probe wurden durch präparative Dünnschichtchromatographie an 11 Platten durch Entwicklung in einem Gemisch von Chloroform, Essigsäure und Wasser (3:3,5:0,5) gereinigt. 0,5027 g Material aus der Bande

Rf 0,16-0,29 bestand aus einem Gemisch von a- und ß-(4-

2s Nitrophenyl)maltotetraosid mit einer Reinheit von etwa 50% (gemäss UV-Spektrum). Das Produkt war ein gelber Feststoff vom Schmelzpunkt 68-70°C. Seine Struktur wurde durch die folgenden Werte bestätigt:

Vmax (Nujol) 3300 und 1020 cm-'; W (H2O) 305 nm (e 3740);

30 [<x&5° + 104° (c 1,06 H2O); 'H-NMR(220 MHz), S 8,25 (d J = 10) und 7,35 (d J = 10) (CeHt), 7,91 (t J = 7) und 7,70 (t J = 7) (anderes aromatisches Material), 5,88-5,79 (m) (Hia und Hiß), 5,30 (m) (OCHO), 4,98 (s) (HOD) und 4,02-3,48 ppm (m) (OCH, OCH2).

G. (4-Nitrophenyl)maltotetraosid (alternatives Verfahren) CII^OAc CHpOAc CHpOAc

OAc OAc OAc

NaOCHs/CHsOH

CH..0H

„o<lVo

OH

Ein Gemisch von 250 mg (0,19 mMol) (4-Nitrophenyl)tri-decaacetylmaltotetraosid aus Teil (E) in 2,5 ml Methanol wurde mit 3,3 ml einer 7,8 x 10"3-molaren Lösung von Natriummethoxyd in Methanol behandelt und 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der in der Mindestmenge Methanol (2 ml) gelöste Rückstand wurde tropfenweise zu 40 ml Äther gegeben. Das hierbei gebildete gelbe Pulver wurde abgetrennt, in Methanol gelöst und durch eine Säule des Ionenaustauscherharzes «Sephadex LH-20» von 2,5 x 20 cm geleitet. Als Elutionsmittel wurde Methanol verwendet. Hierbei wurden 134 mg (90%) festes Produkt erhalten, das erneut chromatographiert wurde, wobei 90 mg (60%) eines mittleren Schnitts erhalten wurden, dessen Struktur durch die

^ 2

55 folgenden Werte bestätigt wurde:

Uax (H2O) 303 nm (e 6350), 217 (e 5000); >H NMR (220 MHz), 8 (CD3OD) 7,77 (AA' BB', Jab = 9,5 Hz) 4H (CsH»), 5,69 (d J = 4 Hz) 1H (Hiß), 5,27 = 5,09 (m) 3H (OCHO), 4,87 (s) 13H (HOD), 4,20-4,05 (m) (geringfügige Verunreinigung) 60 und 4,01-3,40 ppm (m) (OCH, OCH2).

H. (4-Nitrophenyl)maltotetraosid (alternatives Verfahren) Auf die in Teil (G) beschriebene Weise wurde eine rohe Probe von (4-Nitrophenyl)maltotetraosid mit folgenden 65 Kennzahlen hergestellt: ?unax (H2O) 302 nm (e 5900), 217 (4650); [ccß5° + 158° (c 1,1, CH3OH). Ein Teil dieser Probe wurde durch Fraktionierung an einer jx Bondapak/Kohlen-hydrat-Säule (Waters Associates) gereinigt, wobei mit einem

13

630096

Gemisch von Acetonitril und Wasser (87:13) eluiert wurde. Die nach Gefriertrocknung erhaltene gereinigte Hauptkomponente der Probe zeigte Xmax (H2O) 302 nm (e 9425), 220 (6500).

Beispiel 2

A. Herstellung von Maltopentaose-ß-heptadecaacetat

CHo0H

CH-Oll

011

CH,0H

Na0Ac/Ac20

AcO

Ein Gemisch von 2,00 g (2,41 mMol) Maltopentaose, 2,0 g (30 mMol) Natriumacetat und 20 ml Essigsäureanhydrid wurde 2,0 Stunden auf 130°C erhitzt. Das gekühlte Gemisch wurde zu 75 g Eis gegeben und bei 0°C stehen gelassen. Der hierbei gebildete Feststoff wurde pulverisiert und abfiltriert, wobei 3,35 g (90%) eines weisslichen Feststoffs erhalten wurden, der aus 40 ml Äthanol umkristallisiert wurde. Hierbei wurden 3,16 g (85%) Maltopentaose-ß-heptadeca-acetat vom Schmelzpunkt 117 bis 120°C erhalten. Die Struktur wurde durch die folgenden Kennzahlen bestätigt:

[a]lf + 122° (c 0,7, CHCb); 'H NMR (60 MHz) 5 5,85-3,78 (m) 35H (OCH, OCH2), und 2,34-1,83 ppm (Reihen von 25 Singletts) 51H (COCH3); 'H NMR 220 MHz) 5 5,76 ppm (d J = 8 Hz), 1H (Hia);

Elementaranalyse für C64H86O43:

30 Ber.: C 49,80; H 5,62 Gef.: C 49,11; H 5,54 C 49,28; H 5,71

B. Herstellung von a- und ß-Phenylhexadecaacetylmaltopentaosid

CHpOAc

CII,,0Ac

CHpOAc

*0Ac OAc OAc

OH

ZnCk

>

AcO

CHo0Ac OAc

CHpOAc

^°<Q>

OAc N '

Ein Gemisch von 3,00 g (1,95 mMol) Maltopentaose-ß-heptadecaacetat aus Teil (A), 1,95 g (20,8 mMol) Phenol und 0,46 g (3,38 mMol) wasserfreiem Zinkchlorid wurde 3 Stunden unter Argonatmosphäre bei 100°C gehalten. Das gekühlte Gemisch wurde in 200 ml Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit je 30 ml Wasser, zweimal mit je 25 ml 5%igem Natriumhydroxyd und zweimal mit je 25 ml Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein gelbes Pulver erhalten wurde, das mit 3,0 g Natriumacetat und 15 ml Essigsäureanhydrid behandelt und dann 2,0 Stunden auf 125°C erhitzt wurde, um etwaige freie Hydroxylgruppen wieder zu acetylieren. Das gekühlte Gemisch wurde zu 125 g Eiswasser gegeben und bei 5°C stehen gelassen. Das hierbei gebildete feste a- und ß-Phe-nylhexadecaacetylmaltopentaosid wurde pulverisiert, abgetrennt und an der Luft getrocknet, wobei 2,45 g eines weiss55

60

65

liehen Pulvers erhalten wurden. Dieses Material wurde an 150 g Kieselgel chromatographiert, wobei mit einem Gemisch von Benzol und Methanol (97:3) eluiert wurde. Das 'H-NMR-Spektrum (220 MHz) des Rückstandes aus einem mittleren Schnitt zeigte 8 7,38 bis 7,27 (m) 2H und 7,17-6,97 (m) 3H (CsHs), 5,77 (dd J = 9,5 Hz), 5,63 (d J = 4 Hz) (Hip), 5,82-3,83 (Reihe von Multipletts) 35H (OCH, OCH2) und 2,23-1,93 ppm (Reihe von Singletts) 48H (CH3CO).

Reines Phenylhexadecaacetylmaltopentaosid wurde aus dem vorstehend genannten festen Produkt durch HPLC unter Verwendung von Säulen aus Kieselgelkügelchen von >40 |i. mit einer beweglichen Phase aus 1% Methanol, 49% Pentan und 50% Dichlormethan erhalten. Die Integration des 220 MHz 'H-NMR-Spektrums zeigte, dass dieses Material aus etwa 75% a-Phenylhexadecaacetylmaltopentaosid und 25% ß-Phenylhexadecaacetylmaltopentaosid bestand.

630096

14

C. Herstellung von a- und ß-Phenylhexadecaacetylmaltopentaosid (alternatives Verfahren) CHo<

CU OAc

CHpOAc

/l - J— °X 0AC OAc r\

OH

ZnCh/Ac0H/Ac20

OAc

CIUOAc

OAc OAc

CHgCAc

Ein Gemisch von 3,00 g (1,95 mMol) Maltopentaose-ß-heptadecaacetat aus Teil (A) und 1,95 g (20,8 mMol) Phenol in einem Dreihalskolben unter Stickstoff wurde mit einer Lösung von 0,49 g Zinkchlorid in 2,0 ml eines 95:5-Gemi-sches von Essigsäure und Essigsäureanhydrid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam erwärmt. Als das Reaktionsgemisch homogen wurde, wurde der Innendruck allmählich auf 23 mm Hg gesenkt und das Gemisch 2,5 Stunden bei 100°C gerührt. Der Rückstand wurde mit 200 ml Benzol und 18%iger wässriger Natriumchloridlösung behandelt. Die organische Phase wurde zweimal mit je 50 ml 2,5%iger Natriumhydroxydlösung und zweimal mit 50 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit 3,0 g wasserfreiem Natriumacetat und 15 ml Essigsäureanhydrid behandelt. Das Gemisch wurde 1,0

Stunde auf 120°C erhitzt, gekühlt und mit 200 ml Eiswasser 20 behandelt. Das feste Produkt, das sich beim Stehenlassen bei 0°C bildete, wurde pulverisiert, abfiltriert und an der Luft getrocknet, wobei 2,97 g eines weisslichen Pulvers erhalten wurden. Dieses Material wurde an einer Kieselgelsäule chro-matographiert, wobei mit einem 97:3-Gemisch von Benzol 25 und Methanol eluiert wurde. Hierbei wurden insgesamt 2,00 g (65%) reines a- und ß-Phenylhexadecaacetylmaltopentaosid vom Schmelzpunkt 119-125°C erhalten. [a]ß° + 137° (c 1,0, Chloroform).

30 Elementaranalyse für CósHssCte:

Ber.: C 51,77; H 5,62 Gef.: C 51,62; H 5,70 C 51,13; H 5,47

D. Herstellung von (4-Nitrophenyl)hexadecaacetylmaltopentaosid

OlgOAc Clf^OAc OAc OAc

CH-OAc

./•""A

r AC . .

OAc

CHpOAc

+ NO2+BF4-

OAc

CHpOAc

CH^OAc

AC„kfVo-Mi-i^F-

CH2CI2

Eine Aufschlämmung von 0,85 g (6,4 mMol) Nitroniumte- erhalten wurden. Die Struktur des Produkts wurde durch die trafluorborat in 10 ml trockenem Dichlormethan wurde unter folgenden Werte bestätigt:

einer Argonatmosphäre mit einer Lösung von 1,00 g (0,64

mMol) Phenylhexadecaacetylmaltopentaosid aus Teil (C) in «> ^£ax0H 290 nm (e 5550), 210 nm (e 7750); 'H-NMR-Spektrum 12 ml Dichlormethan behandelt. Das erhaltene Gemisch (220 MHz) 8 7,75 (AA'BB', Jab = 9,5 Hz) 4H (CöHj), 5,75 (d wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und unter J = 4 Hz) (Hiß), 5,78-3,85 (Reihe von Multipletts) (OCH, Rühren in 70 ml kalte gesättigte Natriumchloridlösung OCH2) und 2,22-1,93 ppm (Reihe von Singletts) 48H

gegossen. Die abgeschiedene organische Schicht wurde über (CH3CO).

Magnesiumsulfat getrocknet. Durch Abdampfen des ß Durch zwei Umkristallisationen des rohen (4-Nitro-

Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurden 1,05 g phenyl)-hexadecaacetylmaltopentaosid aus Äthanol wurde eines gelben Feststoffs erhalten, der aus 30 ml Äthanol eine Probe mit A,max (CH3OH) 290 nm (e 6650) und 212 (7700)

umkristallisiert wurde, wobei 0,87 g eines weisslichen Pulvers erhalten.

15

E. Herstellung von (4-Nitrophenyl)maltopentaosid

630 096

CJ^OAc CHoOûc CHpOAc

J-\ J-\ _ 1

OAc OAc OAc

NaOCHs/CHsOH

CH?0H

■ x0H

HO }—H 0 • OH

CllpCH

|0..

OH

CH?CH

/"X,

N6,

OH

Eine Lösung von 430 mg (0,27 mMol) (4-Nitro-phenyl)hexadecaacetylmaltopentaosid aus Teil (D) in 5 ml Methanol wurde mit 4,7 ml einer 7,8 x 10-4-molaren Lösung von Natriummethoxyd in Methanol behandelt. Das Gemisch wurde 17,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde unter strömendem trockenem Stickstoff eingeengt. Der Rückstand wurde unter Rühren mit 40 ml Äther behandelt, wobei ein Feststoff ausgefällt wurde, der abfiltriert und an der Luft getrocknet wurde. Hierbei wurden 247 mg (98%) eines leicht gelben Pulvers erhalten, /.max (H2O) 303 nm (e 5980), 215 (5530). Die HPLC (|i Bondapak/Kohlenhy-drat von Waters Associates, 80% Acetonitril/Wasser, 254 nm, UV-Detektor) des Produkts ergab zwei Peaks von gleicher Intensität mit Retentionszeiten von 10,9 und 12,3 Minuten entsprechend 4-(Nitrophenyl)maltopentaosid und einem nicht identifizierten Material.

Beispiele 3 bis 32 Die in den Beispielen 1 (B), 1 (C), 2 (B) bzw. 2 (C) beschriebenen Versuche wurden wiederholt, wobei jedoch an Stelle des bei den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Versuchen verwendeten Phenols als Reaktant die nachstehend in der Spalte A von Tabelle II genannten substituierten Phenole verwendet wurden. Hierbei wurden die in Spalte B genannten a-(substituierten Aryl)polyacetylglykoside erhalten. Durch Nitrierung dieser Produkte auf die in den Beispielen 1 (D), 1 (E) bzw. 2 (D) beschriebene Weise wurden die in Spalte C genannten a-(substituierten Nitroaryl)polyacetylglykoside

20 erhalten. Durch Deacetylierung der in Spalte C genannten Produkte auf die in den Beispielen 1 (F), 1 (G), 1 (H) bzw. 2 (E) beschriebene Weise wurden die in Spalte D genannen a-(substituierten Nitroaryl)-glykoside erhalten.

Maltohexaose-ß-eicosaacetat (GôAc2o) kann durch Acety-25 lierung von Maltohexaose auf die in den Beispielen 1 (A) und 2 (A) beschriebene Weise hergestellt werden. Maltotetraose, Maltopentaose und Maltohexaose werden auf die bereits beschriebene Weise hergestellt.

Von den in Spalte A von Tabelle II genannten Ausgangs-30 materialien sind die folgenden Verbindungen im Handel erhältlich: 2-, 3- und 4-Methylphenol (o-, m- und p-Kresol), 2-, 3- und 4-Chlorphenol, 2-Fluorphenol, 3-Bromphenol, 4-Jodphenol, 2-, 3- und 4-Nitrophenol, 4-Methoxyphenol, 2-Isopropyl-5-methylphenol (Thymol), Methylsalicylat, 3s 3-Äthylphenol, 4-t-Butylphenol, 1- und 2-Naphthol, 4-Chlor-1-naphthol und 4-Hydroxybenzoesäure (für die Herstellung von Hexyl-4-hydroxybenzoat). Die folgenden Ausgangsmaterialien sind sämtlich in «Dictionary of Organic Compounds», 4. Auflage, herausgegeben von I. Heilborn, Oxford 40 University Press (1965) auf den genannten Seiten beschrieben: 2-Methyl-5-isopropylphenol (Carvacrol, Seite 568), 2-Methoxyphenol (Guaiacol, Seite 1549) und 3-Metho-xyphenol (Seite 2857). Hexyl-4-hydroxybenzoat kann durch säurekatalysierte Veresterung von 4-Hydroxybenzoesäure 45 mit 1-Hexanol nach dem für Methylsalicylat von A.I. Vogel «Practical Organic Chemistry», 3. Auflage, Longmans Green, London 1959, Seite 782, beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Tabelle II

Beispiel

Spalte A

Spalte B

3

2-CH3C6H4OH

G4(Ac)l3(2-CH3C6H4)

4

3-CH3C6H40H

G4(Ac)i3(3-CH3C«H4)

5

4-CH3C6H4OH

G5(Ac)i6(4-CH3CeH4)

6

2-C1C6H40H

G5(Ac)i6(2-ClC6H4)

7

3-C1C6H40H

Gs(Ac)i6(3-ClC6H4)

8

4-C1C6H40H

G4(AC)13(4-C1C6H4)

9

2-FC6H40H

G4(Ac)i3(2-FC6Ht)

10

3-BrC6H40H

Gs(Ac)i6(3-BrC6H4)

11

4-IC6H40H

G4(AC)13(4-IC6H4)

12

2-O2NC6H4OH

G4(Ac)l3(2-02NC6H4)

13

3-O2NC6H4OH

Gs(Ac)i6(3-02NC6H4)

14

4-O2NC6H4OH

Gs(Ac)l6(4-02NC6H4)

15

2-CH3OC6H4OH

G4(Ac)i3(2-CH30CóH4)

16

3-CH3OC6H4OH

Gs(Ac)i6(3-CH30C6H4)

17

4-CH3OC6H4OH

G4(AC)13(4-CH30C6H4)

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17

Tabelle II (Forts.)

630096

Beispiel

Spalte C

Spalte D

28

G6(Ac)i9(2-C1-4-02NC6H3)

G6(2-Cl-4-02NC6H3)

29

G6(Ac)19(3,5-(02N)2C6H3)

G6(3,5-(02N)2C6H3)

30

G6(AC)19(2-CH30-4~02NC6H3)

G6(2-CH20-4-02NC6H3)

31

G6(Ac)i9(4-02N-1 -C ioH?)

G6(4-02N-1-CioH7)

32

G6(Ac)i9(4-02NCeH4)

G6(4-02NCeH4)

Claims (10)

1. 630096 2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von nitroaromatischen Glykosiden der Formel (I)

   ch2oh

   CHjOH

   ch2oh

   (I) ,

   worin n eine ganze Zahl von 2,3 oder 4 und R ein substituierter aromatischer Rest der Formel

   X -

   oder ist, worin X und Y unabhängig voneinander für H, no2, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, OR1 oder co2r1

   Massgabe, dass mindestens einer der Reste X und Y für no2 steht, dadurch gekennzeichnet, dass man stehen, mit R1 ein Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen ist mit der a) acetylierte Glykoside der Formel

   CH-OA r

   2 C

   AcO

   QAc

   CH-OA ■ 2 c

   \ OAc

   OAc n

   CH-OÄ 2 C

   K

   worin Ac ein Acetylrest und n die oben angegebene Bedeutung hat, mit einem Phenol der Formel y

   oder odr wobei höchstens einer der Substituenten X und Y für no2 steht, in Gegenwart eines Katalysators bei einer Temperatur im Bereich von 80 bis 120°C umsetzt,

   b) das in der Stufe a) gebildete Produkt nitriert, indem man es mit

   I) Salpetersäure, die in einem Gemisch von Essigsäure und Schwefelsäure enthalten ist, oder

   II) einer aus Nitroniumtetrafluorborat, Nitroniumhexaflu-orphosphat und Nitroniumtrifluormethansulfonat ausgewählten und in Dichlormethan, Chloroform oder 1,2-Di-chloräthan enthaltenen Nitroniumverbindung zusammenführt und c) das in der Stufe b) erhaltene Produkt deacetyliert, indem ss man es mit

   I) einer katalytischen Menge eines im entsprechenden Alkohol enthaltenen Alkalimetall-niederalkoxyds oder

   60 II) einer Lösung von wasserfreiem Ammoniak oder HCl in Methanol zusammenführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Katalysator in der Stufe a) p-Toluolsulfonsäure

   65 oder ein wasserfreies kovalentes Metallchlorid, insbesondere Zinkchlorid verwendet und die Reaktion in der Stufe a) bei einer Temperatur im Bereich von 100° bis 110°C durchführt.
3. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch

   3

   630 096

   gekennzeichnet, dass man die Nitrierungsreaktion in der Stufe b) durchführt, indem man das Produkt der Stufe a) mit Nitroniumtetrafluorborat, das in Dichlormethan, Chloroform oder 1,2-Dichloräthan enthalten ist, bei einer Temperatur von etwa 25°C zusammenführt, wobei das Molverhältnis von Nitroniumtetrafluorborat zum Produkt der Stufe a) im Bereich von 1:1 bis 20:1, insbesondere bei 10:1 liegt.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Deacetylierungsreaktion in der Stufe c) durchführt, indem man das Produkt der Stufe b) mit 0,01 bis 0,1 molaren Äquivalenten Natriummethoxyd, das in Methanol enthalten ist, bei einer Temperatur im Bereich von etwa 0° bis 25°C zusammenführt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R in den dabei enthaltenen Produkteverbindungen der Formel (I) für steht.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass X in den dabei erhaltenen Produkteverbindungen der Formel (I) für no2 und Y für H steht.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R in den dabei erhaltenen Produkteverbindungen der Formel (I) ein 4-Nitrophenylrest ist.
8. 8. Verbindungen der Formel (I), hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
9. 9. Verbindungen gemäss Patentanspruch 8, hergestellt ch2oh

   15 nach dem Verfahren gemäss Patentansprüchen 5 bis 7.
10. 10. Verwendung der Verbindungen der Formel (I) gemäss Patentanspruch 8 für die Bestimmung der a-Amylase in biologischen Medien.

    20