CA2301978A1 - Gene coding for androctonine, vector containing same and transformed disease-resistant plants obtained - Google Patents
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Abstract
Description
_ WO 99/09189 1 PCT/FR98/01814 Gène codant pourl'androctonine, vecteur le contenant et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour l'androctonine, un vecteur la contenant pour la transformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation dudit organisme.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules végétales et des plantes, l'androctonine produite par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à
transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à même d'assurer leur défense contre ces maladies.
On connaît différentes substances d'origine naturelle. en particulier des peptides, présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à
trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
Les androctonines sont des peptides produits par les scorpions, en particulier de l'espèce Androctonus australes. Une androctonine et sa préparation par synthèse chimique est décrite par Ehret-Sabatier & coll., de même que ses propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro.
On a maintenant identifié les gènes des androctonines, et on a également trouvé
qu'ils pouvaient être insérés dans un organisme hôte, en particulier une plante, pour exprimer une androctonine tant pour la préparation et l'isolation de cette androctonine que pour conférer au dit organisme hôte des propriétés de résistance aux maladies fongiques et aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement avantageuse au WO 99/09189 " PCT/FR98/01814 problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un fragment d'acide nucléique codant pour une androctonine, un gène chimère comprenant ledit fragment codant pour une androctonine ainsi que des éléments de régulation en position S' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier dans les plantes et un vecteur pour la transformation des organismes hôtes contenant ce gène chimère, et l'organisme hôte transformé. Elle concerne aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide nucléique codant pour une androctonine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule, en particulier régénérée à partir de cette cellule. Elle concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention.
Par androctonine, on entend selon l'invention tout peptide pouvant être produit et isolé des scorpions, en particulier de l'espèce Arrdroctonz~s australes ces peptides comprenant au moins 20 acides aminé, de préférence au moins 25, et 4 résidus cystéine formant entre eux des ponts disulfure. De manière avantageuse, l'androctonine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I) suivante Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae (I) dans laquelle Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, Xab représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xac représente un reste peptidique de S acides aminés, Xad représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et Xae représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé.
De manière avantageuse, Xab et/ou Xad et/ou Xae comprennent au moins un acide aminé basique, de préférence 1. Par acides aminé basique, on entend selon l'invention les acides aminés choisis parmi la lysine, l'aspargine ou l'homoaspargine.
De manière préférentielle, Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Val, dans laquelle Xaa' représente NH2 ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, et/ou Xab représente la séquence peptidique -Arg-Xab'-Ile, dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xac représente la séquence peptidique -Arg-Xac'-Gly-, dans laquelle Xae' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xad représente la séquence peptidique -Tyr-Xad'-Lys, dans laquelle Xad' représente un reste peptidique de 1 acide aminé, et/ou Xae représente la séquence peptidique -Thr-Xae', dans iaqueile Xae' représente COOH ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé
De manière plus préférentielle, Xaa' représente la séquence peptidique Arg-Ser-, et/ou Xab' représente la séquence peptidique -Gln-Ile-Lys-, et/ou Xac' représente la séquence peptidique -Arg-Arg-Gly-, et/ou Xad' représente le reste peptidique -Tyr-, et/ou Xae' représente la séquence peptidique -Asn-Arg-Pro-Tyr.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'androctonine est représentée par la séquence peptidique de 25 acides aminés décrite l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1) et les séquences peptidiques homologues.
Par séquences peptidiques homologues, on entend toute séquence équivalente comprenant au moins 65 % d'homologie avec la séquence représentée par l'identificateur de séquence n° 1, étant entendu que les 4 résidus cystéine et le nombre d'acides aminés les séparant restent identiques, certains acides aminés étant remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant pas de modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. De préférence, les séquences homologues comprennent au moins 75 % d'homologie, plus préférentiellement au moins 85 % d'homologie, encore plus préférentiellement 90 % d'homologie.
Le résidu NH2-terminal de l'androctonine peut présenter une modification post traductionnelle, par exemple une acétylation, alors que le résidu C-terminal peut présenter une modification post traductionnelle, par exemple une amidation.
Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I), on entend non seulement les séquences définies ci-dessus, mais également de telles séquences comprenant ~ l'une ou (autre de leurs extrémités, ou les deux, des résidus peptidiques nécessaires à leur expression et ciblage dans un organisme hôte, en particulier une cellule végétale ou une plante.
Il s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-androctonine » ou « androctonine-peptide », avantageusement « peptide-androctonine », dont la coupure par les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de l'androctonine, WO 99/09189 't PCT/FR98/01814 définie ci-dessus. Le peptide fusionné à l'androctonine peut être un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de l'androctonine de manière spécifique dans une partie de l'organisme hôte, en particulier de la .cellule végétale ou de la plante, comme par exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice extracellulaire.
Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut être un signal N-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un peptide d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le lieu où sont pris en charge par la « machinerie cellulaire » des opérations de maturation de la protéine 1~ produite. comme par exemple le clivage du peptide signal.
Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 508 909.
Comme peptide de transit utile selon l'invention, on peut citer en particulier le peptide signal du gène PR-la du tabac (WO 95/19443), représenté avec sa séquence codante par l'identificateur de séquence n° 2 (SEQ ID NO 2) et fusionné
à l'androctonine par l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), en particulier correspondant à la protéine de fusion correspondant aux bases 12 à 176 de cette séquence, en particulier lorsque l'androctonine est produite par des cellules végétales ou des plantes, ou le précurseur du facteur Mat al lorsque l'androctonine est produite dans des levures..
La présente invention concerne donc d'abord un fragment d'acide nucléique, en particulier d'ADN, codant pour l'androctonine définie ci-dessus. Il peut s'agir selon l'invention d'un fragment isolé de Androctonus australes, ou encore un fragment dérivé, adapté pour l'expression de l'androctonine dans l'organisme hôte où le peptide sera exprimé. le fragment d'acide nucléique peut être obtenu selon les méthodes standards d~isolation et de purification, ou encore par synthèse selon les techniques usuelles d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniaues sont notamment décrites par Ausubel & colt.
Selon la présente invention, on entend par « fragment d'acide nucléique » une séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, en particulier ADNc, notamment double brin.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le fragment d'acide nucléique codant pour l'androctonine est la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence, plus particulièrement la partie codante de cette SEQ ID NO1, correspondant aux bases 1 à 75.
Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence 1 ~ nucléotidique décrite par I'identificateur de séquence n° 1 et codant pour l'androctonine.
Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre 2U la séquence de référence décrite par l'identificateur de séquence n°
1 et l'homologue peuvent être importantes, d'autant plus qu'il s'agit d'un fragment d'ADN de taille inférieure â 1 UO acides nucléiques, réalisable par synthèse. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications 25 sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de l'androctonine résultante.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier 30 les cellules végéales ou les plantes, liés de manière fonctionnelle à
ladite séquence codante, ladite séquence codante comprenant au moins un fragment d'ADN codant pour l'androctonine tel que défini ci-dessus (y compris le peptide de fusion «
peptide-androctonine » ou « androctonine-peptide »).
Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production d'androctonine. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacylovirus, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes. des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention. tout organisme multicellulaire différencié
capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac. le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression du fragment d'ADN codant pour l'androctonine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des peptides de transit, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifïer et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.
Pour la transformation des microorganismes comme les levures ou les bactéries, les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de trancription, des peptides de transit, des séquences terminatrices et des codons start et stop.
Pour diriger l'expression et la sécrétion du peptide dans le milieu de culture de la levure, un fragment d'ADN codant l'héliomycine est intégré dans un vecteur navette qui comprend les éléments suivants - des marqueurs perméttant de sélectionner les transformants, - une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du plasmide dans la levure.
- une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du plasmide dans E. coli, - une cassette d'expression constituée WO 99/09189 ~ PCT/FR98/01814 . ( 1 ) d'une séquence de régulation promotrice, (? ) d'une séquence codant pour un peptide signal (ou prépeptide) en association avec un peptide d'adressage (ou propeptide, (3) d'une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation.
Ces éléments ont été décrits dans plusieurs publications dont Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24 et Michaut et al., 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10 .
De manière préférentielle, on transforme des levures de l'espèce S. cerevisiae avec le plasmide d'expression par la méthode à l'acétate de lithium (Ito et al., 1993, J.
Bacteriol, 153, pp 163-168).
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes.
Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) ou d'un gène de 1 ~ virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-la du tabac, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à
une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington &
Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
Selon la présente invention, le gène chimère peut également être associé à un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. II pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes.
WO 99/09189 g PCT/FR98/01814 . La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication, et le cas échéant un marqueur de sélection approprié.
Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'ùn virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprïé, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d Agrobacterium rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou félectroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant une quantité efficace d'un gène chimère comprenant une séquence codante pour l'androctonine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La WO 99/09189 9 PCT/P'R98/01814 . régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US
4,459,355, S US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP
672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US
5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US
5,554,798, US
5.489,520, US S,S 10,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à
certaines maladies fongiques ou bactériennes. De ce fait, la séquence d'ADN
codant pour 1 S l'androctonine peut être intégrée avec pour objectif principal la réalisation de plantes résistantes aux dites maladies, l'androctonine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Cercospora, en particulier Cercospora beticola, Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusariarm, en particulier Fusarium culmorum ou Fttsaritun graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora cinncnnomi.
Le gène chimère pourra également ëtre associé, et de manière avantageuse, à au moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aux herbicides.
La séquence d'ADN codant pour l'androctonine peut également être intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences 2S codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de (homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour l'androctonine, d'autres séquences hétérologues codant pour des protéines d'intérêt comme d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique, et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de tolérance aux herbicides, notamment définies èi-dessus et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de résistance aux insectes, comme les protéines Bt notamment.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur comprenant le gène chimère selon l'invention, lequel comprend une séquence codant pour l'androctonine, et comprenant au moins un autre gène comprenant une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, l'un portant le gène selon l'invention codant pour l'androctonine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Parmi les séquences codant pour d'autres peptides antifongiques, on peut citer celle codant pour la drosomicine, décrite dans la demande de brevet FR 2 725 992 et par 1 ~ Fehlbaum & colt. ( I 994), et dans la demande de brevet non publiée FR 97 09115 déposée le 24 juillet 1997.
La présente invention concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention. le procédé consistant à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un milieu de culture, en particulier d'un champ, approprié
pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité
souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
Par composition agrochimique, on entend selon l' invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité
complémentaire de celle de l'androctonine produite par les plantes transformées selon l' invention.
Par produit présentant une activité complémentaire de celle de l'androctonine, on entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité
complémentaire, c'est . à dire un. produit qui sera actif contre des attaques de contaminants (champignons, bactéries ou virus) insensibles à l'androctonine., ou encore un produit dont le spectre d'activité recouvre celui de l'androctonine, totalement ou en partie, et dont la dose d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de l'androctonine produite par la plante transformée.
Enfin, la culture des organismes hôtes transfomrés permet de produire de l'androctonine à large échelle. La présente invention concerne donc également un procédé
de préparation de l'androctonine, comprenant les étapes de culture de l'organisme hôte transformé comprenant un gène codant pour l'androctonine tel que défini ci-dessus dans un milieu de culture approprié, puis l'extraction et la purification totale ou partielle de l'androctonine obtenue.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation de la séquence codant pour l'androctonine, du gène chimère, du vecteur d'intégration et des plantes transformëes. Les figures 1 à 5 en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des gënes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiques.
E~cemple 1: Çonstruction des gènes chimères Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans Ausubel & coll.
pRPA-MD-P: Création d'un plasmide contenant le signal peptide du gène PR-la du tabac.
Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 1 et Oligo 2 ci-après, sont hybridés à 65 °C pendant 5 minutes puis par diminution lente de la température à 30°C pendant 30'.
Oligol: 5' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC
ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3' Oligo2: 5' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA
GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3' Après hybridation entre l'Oligo 1 et l'Oligo 2, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et Nael et cloné dans le plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction.
On obtient alors un clone comprenant la région codant pour peptide signal du gène PR-la du tabac (SEQ ID NO 2).
pRPA-PS-PRla-andro: Création d'une séquence codant pour l'androctonine fusionée au signal peptide PR-la sans région non transcrite en 3'.
Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 3 et Oligo 4 selon les conditions opératoires décrites pour pRPA-MD-P.
Oligo 3: 5 ' AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG
GTGG 3' Oligo 4: S ' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG
GCCTGTTAGT GCACTTGTAG TAGCAACCAC CCCTCCTCCT
GCAGATCTTG ATCTGCC 3' Après hybridation entre l'Oligo 3 et l'Oligo 4, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. Cet oligonucléotide double brin contenant la partie codante de l'androctonine (SEQ ID NO 1) est ensuite cloné
directement dans le plasmide pRPA-MD-P qui a été digéré avec l'enzyme de restriction Nael.
L'orientation correcte du clone obtenu est vérifiée par séquençage. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine située entre les sites de restriction Ncol à l'extrémité N-terminale et Scal, Sacll et BamHl à
l'extrémité C-terminale (SEQ ID NO 3).
pRPA-RD-238: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine.
Le plasmide pRTL-2 GUS, dérivé du plasmide pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.
WO 99/09189 1 ~ PCT/FR98/01814 Jim Carrington (Texas A&M University, non décrit). Ce plasmide dont ia structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 355 dupliqué
isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x355; Odell &
coll., 1985) qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en 5' du virus etch du tabac (TEV 5' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gène de la ~i-glucuronidase de E.
coli (GUS Jefferson & coll., 1987) suivi du site de polyadenylation de TARN
355 de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll., 1985).
Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et BamHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-PS-PRIa-andro est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétise une protéine de fusion PR-la-androctonine. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. c PR-la-1 ~ androctonine » représente la région codante pour la protéine de fusion PR-1 a-androctonine de pRPA-RD-230. L'androctonine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action du peptide signal PR-la.
pRPA-RD-195: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple ?0 modifié.
Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 5 et Oligo 6 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P.
OligoS: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
CATGC 3' Oligo6: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT
GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3' L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été
préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRl et Hindlll et rendu bouts WO 99/09189 I'~ PCT/FR98/01814 francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymérase 1 de E. cvli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobacteriurn terrnejaciens. La structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur Ia tïgure 3.
pRPA-RD-233: Introduction de la cassette d'expression de PR-la-androctonine de pRPA-RD-230 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-230 est digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-19~ qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll et déphosphorylé avec la phosphatase intestinale de veau.
pRPA-RD-174: Plasmide dérivé de pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) contenant le gène de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).
Le gène de tolérence au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est cloné dans le site EcoRl de pRPA-BL-150A qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à proximité de sa bordure droite, un gène de tolérance à la kanamycine à proximitë de sa bordure gauche et un site de clonage multiple entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 4. Sur cette figure, "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983). "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NPT II"
représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E
coli (Rothstein & coll., 1981), "35S pro" représente le promoteur 35S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX" représente le gène de la nitrilase isolé de K. ozaenae (Stalker & coll., 1988), "RB" et "LB" représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens.
pRPA-RD-184: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD-174.
Les oligonuclëotides synthétiques complémentaires Oligo 7 et Oligo 8 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P.
Oligo7: 5' CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3' Oligo8: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA
CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
GTGGCCTGAC TGG 3' L'oligonucléotide double brin hybridé (95 paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174 est digéré avec l'enzyme de restriction Xmal, et le grand fragment d'ADN est purifié. Les deux fragents d'ADN obtenus sont ensuite liés.
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de sélection.
La structure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure ~
où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro", "35S pro", "BRX gene", "RB" et "LB"
ont la même signification que pow la figwe 4.
pRPA-RD-236: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la construction du géne codant pour fandroctonine dirigée vers la matrice extracellulaire.
La plasmide pRPA-RD-233 est digéré avec les enzymes de restriction Pmel et Ascl et le fragment d'ADN contenant le gène de PR-la-androctonine est purifié. Le plasmide pRPA-RD-184 est digéré avec les même enzymes de restriction. Le fragment d'ADN
contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est ensuite liée dans pRPA-RD-184. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la séquence codant pow la protéine de fusion PR-la-androctonine qui conduit à (expression de l'androctonine dans la matrice extracellulaire de la plante.
WO 99/09189 16 PCT/FR98/o1814 Exemple 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés. _ WO 99/09189 1 PCT / FR98 / 01814 Gene encoding androctonine, vector containing it and transformed plants obtained disease resistant The subject of the present invention is a DNA sequence coding for androctonine, a vector containing it for the transformation of an organism host and the process for transforming said organism.
The invention relates more particularly to the transformation of cells vegetable and plants, the androctonine produced by the transformed plants their conferring a resistance to diseases, in particular of fungal origin.
There is a growing need today to make plants resistant against particularly fungal diseases in order to reduce, or even avoid, having use of treatments with antifungal protection products, in order to protect the environment. One way to increase resistance to disease is to transform plants so that they produce substances capable of to ensure their defense against these diseases.
We know different substances of natural origin. especially peptides, with bactericidal or fungicidal properties, especially against mushrooms responsible for plant diseases. However, the problem is find such substances that can not only be produced by plants transformed but still retain their bactericidal or fungicidal properties and confer them to say plants. For the purposes of the present invention, the term “bactericide” or fungicide both bactericidal or fungicidal properties proper as the properties bacteriostatic or fungistatic.
Androctonines are peptides produced by scorpions, in particular of the Androctonus australes species. An androctonine and its preparation by chemical synthesis is described by Ehret-Sabatier & coll., as are its properties antifungals and antibacterial in vitro.
We have now identified the genes of androctonines, and we have also find that they could be inserted into a host organism, especially a plant, for express an androctonine both for the preparation and the isolation of this androctonine that to give said host organism disease-resistant properties fungal and bacterial diseases, providing a particularly solution advantageous to WO 99/09189 "PCT / FR98 / 01814 problem stated above.
The subject of the invention is therefore firstly a nucleic acid fragment encoding for an androctonine, a chimeric gene comprising said fragment coding for a androctonine as well as regulatory elements in position S 'and 3' heterologists who can function in a host organism, especially in plants and a vector for the transformation of host organisms containing this chimeric gene, and the organism host transformed. It also relates to a transformed plant cell containing at least minus one nucleic acid fragment coding for an androctonine and a plant resistant to diseases containing the said cell, in particular regenerated from this cell. She finally relates to a process for growing transformed plants according to the invention.
By androctonine is meant according to the invention any peptide which can be product and isolated from scorpions, in particular from the species Arrdroctonz ~ s australes these peptides comprising at least 20 amino acids, preferably at least 25, and 4 residues cysteine forming disulfide bridges between them. Advantageously, androctonine understands essentially the peptide sequence of general formula (I) below Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae (I) in which Xaa represents a peptide residue comprising at least 1 amino acid, Xab represents a peptide residue of 5 amino acids, Xac represents a peptide residue of S amino acids, Xad represents a peptide residue of 3 amino acids, and Xae represents a peptide residue comprising at least 1 amino acid.
Advantageously, Xab and / or Xad and / or Xae comprise at least one acid basic amino, preferably 1. By basic amino acids is meant according to the invention them amino acids chosen from lysine, aspargine or homoaspargine.
Preferably, Xaa represents the peptide sequence Xaa'-Val, in which Xaa 'represents NH2 or a peptide residue comprising at least 1 amino acid, and / or Xab represents the peptide sequence -Arg-Xab'-Ile, in which Xab ' represents a peptide residue of 3 amino acids, and / or Xac represents the peptide sequence -Arg-Xac'-Gly-, in which Xae ' represents a peptide residue of 3 amino acids, and / or Xad represents the peptide sequence -Tyr-Xad'-Lys, in which Xad ' represents a peptide residue of 1 amino acid, and / or Xae represents the peptide sequence -Thr-Xae ', in the island Xae' represents COOH or a peptide residue comprising at least 1 amino acid More preferably, Xaa 'represents the peptide sequence Arg-Ser-, and / or Xab 'represents the peptide sequence -Gln-Ile-Lys-, and / or Xac 'represents the peptide sequence -Arg-Arg-Gly-, and / or Xad 'represents the peptide residue -Tyr-, and / or Xae 'represents the peptide sequence -Asn-Arg-Pro-Tyr.
According to a preferred embodiment of the invention, androctonine is represented by the peptide sequence of 25 amino acids described the identifier of sequence No. 1 (SEQ ID NO 1) and the homologous peptide sequences.
By homologous peptide sequences is meant any equivalent sequence comprising at least 65% homology with the sequence represented by the sequence identifier n ° 1, it being understood that the 4 residues cysteine and the number amino acids separating them remain identical, some amino acids being replaced by different but equivalent amino acids on non-inducing sites no substantial change in the antifungal or antibacterial activity of the said homologous sequence. Preferably, the homologous sequences comprise at least minus 75% homology, more preferably at least 85% homology, again more preferably 90% homology.
NH2-terminal residue of androctonine may show post-modification translational, for example acetylation, while the C-terminal residue can present a post-translational modification, for example an amidation.
By peptide sequence essentially comprising the peptide sequence of general formula (I) means not only the sequences defined above on it but also such sequences comprising ~ one or (other of their ends, or the two, peptide residues necessary for their expression and targeting in a organization host, in particular a plant cell or plant.
In particular, it is a peptide-androctonin fusion peptide or "Androctonine-peptide", advantageously "peptide-androctonine", the cut by plant cell enzyme systems allows the release of androctonine, WO 99/09189 't PCT / FR98 / 01814 defined above. The peptide fused with androctonine can be a peptide signal or a transit peptide which makes it possible to control and direct the production of androctonine from specific way in a part of the host organism, especially the .cell plant or plant, such as the cytoplasm, the membrane cell, or in the case of plants in a particular type of cell compartment or tissue or in the extracellular matrix.
According to one embodiment, the transit peptide can be a signal addressing chloroplastic or mitochondrial, which is then cleaved in the chloroplasts or mitochondria.
According to another embodiment of the invention, the signal peptide can be a N-terminal or "prepeptide" signal, possibly in combination with a signal responsible for protein retention in the endoplasmic reticulum, or a peptide vacuolar or "propeptide" addressing. The endoplasmic reticulum is the place where are taken care of by the "cellular machinery" of maturation operations protein 1 ~ produced. such as for example the cleavage of the signal peptide.
Transit peptides can be either single or double, and in this case possibly separated by an intermediate sequence, i.e.
including, in the sense of transcription, a sequence coding for a transit peptide of a plant gene coding for a plastid localized enzyme, part of a sequence of the part mature N-terminal of a plant gene coding for a localized enzyme plastidial, then a sequence coding for a second transit peptide of a plant gene coding for a plastid localization enzyme, as described in application EP 0 508 909.
As transit peptide useful according to the invention, there may be mentioned in particular the signal peptide of the tobacco PR-la gene (WO 95/19443), represented with its sequence coding by sequence identifier n ° 2 (SEQ ID NO 2) and merged androctonine by sequence identifier No. 3 (SEQ ID NO 3), in particular corresponding to the fusion protein corresponding to bases 12 to 176 of this sequence, in particular when androctonine is produced by plant cells or plants, where the precursor of the factor Mat al when androctonine is produced in yeasts ..
The present invention therefore relates firstly to a nucleic acid fragment, in particular DNA coding for androctonine defined above. he can act according to the invention of an isolated fragment of Androctonus australes, or a derived fragment, suitable for the expression of androctonine in the host organism where the peptide will be Express. the nucleic acid fragment can be obtained according to the methods standards isolation and purification, or by synthesis according to techniques usual successive hybridizations of synthetic oligonucleotides. These techniques are in particular described by Ausubel & colt.
According to the present invention, the term “nucleic acid fragment” means a nucleotide sequence which may be of DNA or RNA type, preferably of type DNA, in particular cDNA, in particular double strand.
According to one embodiment of the invention, the nucleic acid fragment coding for androctonine is the DNA sequence described by the identifier for sequence n ° 1 (SEQ ID NO 1), a homologous sequence or a sequence complementary to said sequence, more particularly the coding part of this SEQ ID NO1, corresponding to bases 1 to 75.
By "homologous" is meant according to the invention a nucleic acid fragment showing one or more sequence changes from the sequence 1 ~ nucleotide described by the sequence identifier n ° 1 and coding for androctonine.
These modifications can be obtained according to the usual techniques of mutation, or again by choosing the synthetic oligonucleotides used in the preparation of said sequence by hybridization. With regard to the multiple combinations of acids that can lead to the expression of the same amino acid, differences between 2U the reference sequence described by sequence identifier no.
1 and the counterpart may be important, especially since it is a DNA fragment of cut less than 1 UO nucleic acids, achievable by synthesis. So advantageous, the degree of homology will be at least 70% compared to the reference sequence, of preferably at least 80%, more preferably at least 90%. These changes 25 are generally neutral, that is, they do not affect the primary sequence of the resulting androctonine.
The present invention also relates to a chimeric gene (or cassette expression) comprising a coding sequence as well as elements of regulation in position 5 ′ and 3 ′ heterologous which can function in a host organism, in particular 30 plant cells or plants, operably linked to said sequence coding, said coding sequence comprising at least one DNA fragment coding for androctonine as defined above (including the fusion peptide "
peptide-androctonine "or" androctonine-peptide ").
By host organism is meant any mono or multicellular organism, lower or higher, in which the chimeric gene according to the invention can be introduced, for the androctonine production. These are in particular bacteria, for example E. coli, from yeasts, in particular of the genera Saccharomyces or Kluyveromyces, Pichia, of fungi, in particular Aspergillus, of a bacylovirus, or preferably cells plants and plants.
By "plant cell" is meant according to the invention any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, tissues differentiated such only embryos, parts of plants. plants or seeds.
The term "plant" according to the invention. any multicellular organism differentiated capable of photosynthesis, in particular monocots or dicots, more particularly crop plants intended or not intended for food animal or human, like corn, wheat, rapeseed, soy, rice, sugarcane, beet, tobacco. cotton, etc.
The regulatory elements necessary for the expression of the DNA fragment encoding for androctonine are well known to those skilled in the art depending on the organism host. They include, in particular, promoter sequences, activators of transcription, transit peptides, terminator sequences including codons start and stop. The means and methods to identify and select the elements of regulation are well known to those skilled in the art.
For the transformation of microorganisms like yeasts or bacteria, the regulatory elements are well known to those skilled in the art, and include including promoter sequences, trancription activators, peptides from transit, terminator sequences and start and stop codons.
To direct the expression and secretion of the peptide in the culture medium of the yeast, a DNA fragment encoding heliomycin is integrated into a vector shuttle which includes the following - markers for selecting the transformants, - a nucleic acid sequence allowing replication (origin of replication) of the plasmid in yeast.
- a nucleic acid sequence allowing replication (origin of replication) of the plasmid in E. coli, - an expression cassette made up WO 99/09189 ~ PCT / FR98 / 01814 . (1) a promoter regulatory sequence, (?) of a sequence coding for a signal peptide (or prepeptide) in association with an addressing peptide (or propeptide, (3) a terminating regulatory or polyadenylation sequence.
These elements have been described in several publications including Reichhart and al., 1992, Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24 and Michaut et al., 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10.
Preferably, yeasts of the species S. cerevisiae are transformed.
with the expression plasmid by the lithium acetate method (Ito et al., 1993, J.
Bacteriol, 153, pp 163-168).
The invention relates more particularly to the transformation of plants.
As promoter regulatory sequence in plants we can use any sequence promoter of a gene expressing itself naturally in plants in particular a promoter of bacterial, viral or plant origin such as, for example, that of a gene the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit or a gene 1 ~ plant virus such as that of cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or a promoter inducible by pathogens such as tobacco PR-la, all known suitable promoter which can be used. Preferably we use a promoter regulatory sequence that promotes sequence overexpression coding of constitutively or induced by the attack of a pathogen, such as by example, that comprising at least one histone promoter as described in application EP 0 507,698.
According to the invention, it is also possible to use, in combination with the sequence of promoter regulation, other regulatory sequences, which are located between the promoter and the coding sequence, such as transcription activators ("enhancer"), like by example the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in the application WO 87/07644, or the etch tobacco virus (VTE) described by Carrington &
Freed.
As terminating or polyadenylation regulatory sequence, use any corresponding sequence of bacterial origin, such as for example the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, or of plant origin, as by example one histone terminator as described in application EP 0 633 317.
According to the present invention, the chimeric gene can also be associated with a selection marker adapted to the transformed host organism. Such markers of selection are well known to those skilled in the art. It could be a gene for resistance antibiotics, or a herbicide tolerance gene for plants.
WO 99/09189 g PCT / FR98 / 01814 . The present invention also relates to a cloning vector or expression for the transformation of a host organism containing at least one chimeric gene such as defined above. This vector comprises, in addition to the above chimeric gene, minus one origin of replication, and where appropriate an appropriate selection marker.
This vector can consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus, transformed by the introduction of the chimeric gene according to the invention. Such vectors of transformation into function of the host organism to be transformed are well known to humans profession and widely described in the literature.
For the transformation of plant cells or plants, it will be especially a virus that can be used for plant transformation developed and further containing its own elements of replication and expression. Of way preferential, the vector for transforming plant cells or plants according the invention is a plasmid.
The invention also relates to a process for the transformation of organisms hosts, in particular plant cells by integration of at least one acid fragment nucleic acid or a chimeric gene as defined above, a transformation which may be obtained by any known suitable means, widely described in the literature specialized and in particular the references cited in this application, more particularly by the vector according to the invention.
A series of methods involves bombarding cells, protoplasts or of tissues with particles to which the DNA sequences are attached. A
other series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhi ~ ogenes.
Other methods can be used such as micro-injection or Felectroporation, or direct precipitation using PEG.
Those skilled in the art will choose the appropriate method depending on the nature of the host organism, in particular of the plant cell or of the plant.
The present invention also relates to host organisms, in particular plant cells or plants, transformed and containing an effective amount of a gene chimera comprising a coding sequence for androctonine defined above.
The present invention also relates to plants containing cells transformed, especially plants regenerated from cells transformed. The WO 99/09189 9 PCT / P'R98 / 01814 . regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
For plant cell transformation and regeneration processes of plants, in particular the following patents and patent applications: US
4,459,355, S US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP
672,752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US
5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US
5,554,798, US
5,489,520, US S, S 10,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 and WO 95/06128.
The present invention also relates to the transformed plants derived from the cultivation and / or crossing of the above regenerated plants, as well as seeds transformed plants.
Plants transformed in this way are resistant to certain diseases, particular to certain fungal or bacterial diseases. Therefore, the DNA sequence coding for 1 S androctonine can be integrated with the main objective of plant making resistant to said diseases, androctonine being effective against fungal diseases such as those caused by Cercospora, especially Cercospora beticola, Cladosporium in particular Cladosporium herbarum, Fusariarm, in particular Fusarium culmorum or Fttsaritun graminearum, or by Phytophthora, in particular Phytophtora cinncnnomi.
The chimeric gene may also be associated, and advantageously, with the minus a selection marker, such as one or more tolerance genes to herbicides.
The DNA sequence coding for androctonine can also be integrated as a selection marker when transforming plants with others sequences 2S coding for other peptides or proteins of interest, such as for example genes of herbicide tolerance.
Such herbicide tolerance genes are well known to those of skill in the art.
and in particular described in patent applications EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 or WO 97/04103.
Of course, the cells and plants transformed according to the invention can understand in addition to the sequence coding for androctonine, other sequences heterologists coding for proteins of interest like other complementary peptides susceptible to give the plant resistance to other diseases of origin bacterial or fungal, and / or other sequences encoding tolerance proteins herbicides, in particular defined above and / or other sequences coding for protein resistance to insects, such as Bt proteins in particular.
The other sequences can be integrated using the same vector comprising the chimeric gene according to the invention, which comprises a sequence coding for androctonine, and comprising at least one other gene comprising another sequence encoding another peptide or protein of interest.
They can also be integrated by means of another vector comprising at minus the said other sequence, according to the usual techniques defined above above.
The plants according to the invention can also be obtained by crossing parents, one carrying the gene according to the invention coding for androctonine, the other wearing a gene encoding at least one other peptide or protein of interest.
Among the sequences coding for other antifungal peptides, there may be mentioned that coding for drosomicin, described in patent application FR 2 725 992 and through 1 ~ Fehlbaum & colt. (I 994), and in the unpublished patent application FR 97 09115 filed July 24, 1997.
The present invention finally relates to a method for cultivating plants.
transformed according to the invention. the process of planting seeds said plants transformed in a surface of a culture medium, in particular of a field, suitable for the cultivation of said plants, to apply on said surface a composition agrochemical, without substantially affecting said seeds or say plants then harvest the cultivated plants when they arrive at the maturity desired and possibly to separate the seeds from the harvested plants.
By agrochemical composition is meant according to the invention any composition agrochemical comprising at least one active product having one of the activities following, herbicide, fungicide, bactericide, virucide or insecticide.
According to a preferred embodiment of the culture method according to the invention, the agrochemical composition comprises at least one active product having at least a fungicidal and / or bactericidal activity, more preferably having a activity complementary to that of androctonine produced by plants transformed according to the invention.
By product having an activity complementary to that of androctonine, we means according to the invention a product having an activity spectrum complementary is . to say one. product that will be active against contaminant attacks (mushrooms, bacteria or viruses) insensitive to androctonine., or a product whose spectrum of activity covers that of androctonine, wholly or in part, and of which the dose application will be substantially reduced due to the presence of androctonine produced by the transformed plant.
Finally, the culture of the transfected host organisms makes it possible to produce large-scale androctonine. The present invention therefore also relates to a method preparation of androctonine, including the stages of cultivation of the host organism transformed comprising a gene coding for androctonine as defined above above in an appropriate culture medium, then extraction and total purification or partial of the androctonine obtained.
The examples below illustrate the invention, the preparation of the coding sequence for androctonine, the chimeric gene, the integration vector and transformed plants. Figures 1 to 5 in the appendix describe the structures schematics of certain plasmids prepared for the construction of chimeric genes. In these figures, the different restriction sites are marked in italics.
Example 1: Construction of chimeric genes All the techniques used below are standard techniques of laboratory. The detailed protocols of these techniques are notably described in Ausubel & coll.
pRPA-MD-P: Creation of a plasmid containing the peptide signal of the PR-la gene tobacco.
The two complementary synthetic oligonucleotides Oligo 1 and Oligo 2 above after, are hybridized at 65 ° C for 5 minutes then by reduction slow temperature at 30 ° C for 30 '.
Oligol: 5 'GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC
ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3 ' Oligo2: 5 'TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA
GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3 ' After hybridization between Oligo 1 and Oligo 2, the DNA remained single strand is used of klenow fragment matrix of E. coli polymerase 1 (under the conditions standard recommended by the manufacturer (New England Biolabs)) for the creation of the oligonucleotide double strand from the 3 'end of each oligo. The oligonucleotide double strand obtained is then digested with the restriction enzymes Sacll and Nael and cloned in the plasmid pBS II SK (-) (Stratagene) digested with the same restriction enzymes.
We then obtains a clone comprising the region coding for signal peptide of the gene PR from tobacco (SEQ ID NO 2).
pRPA-PS-PRla-andro: Creation of a sequence coding for androctonine fused to the signal peptide PR-la without region not transcribed in 3 '.
The two synthetic oligonucleotides complementary to sequences Oligo 3 and Oligo 4 according to the operating conditions described for pRPA-MD-P.
Oligo 3: 5 'AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG
GTGG 3 ' Oligo 4: S 'CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG
GCCTGTTAGT GCACTTGTAG TAGCAACCAC CCCTCCTCCT
GCAGATCTTG ATCTGCC 3 ' After hybridization between Oligo 3 and Oligo 4, the single stranded DNA is used of klenow fragment matrix of E. coli polymerase 1 (under the conditions standard recommended by the manufacturer (New England Biolabs)) for the creation of the oligonucleotide double strand from the 3 'end of each oligo. This oligonucleotide double strand containing the coding part of androctonine (SEQ ID NO 1) is then cloned directly in the plasmid pRPA-MD-P which was digested with the restriction enzyme Nael.
The correct orientation of the clone obtained is verified by sequencing. We obtain then a clone comprising the region coding for the PR-la- fusion protein androctonine located between Ncol restriction sites at the N-terminus and Scal, Sacll and BamHl at the C-terminal end (SEQ ID NO 3).
pRPA-RD-238: Creation of an expression vector in plants comprising the the coding sequence for the PR-la-androctonine fusion protein.
Plasmid pRTL-2 GUS, derived from plasmid pUC-19, was obtained from Dr.
WO 99/09189 1 ~ PCT / FR98 / 01814 Jim Carrington (Texas A&M University, not described). This plasmid which ia structure schematic is shown in Figure 1, contains the CaMV 355 promoter duplicated isolated from cauliflower mosaic virus (Promoter CaMV 2x355; Odell &
coll., 1985) which directs the expression of an RNA containing 5 'untranslated sequence etch virus tobacco (TEV 5 'UTR; Carrington & Freed, 1990), the gene for ~ i-glucuronidase from E.
coli (GUS Jefferson & coll., 1987) followed by the TARN polyadenylation site 355 from CaMV (CaMV polyA; Odell & al., 1985).
The plasmid pRTL-2 GUS is digested with the restriction enzymes Ncol and BamHI and the large DNA fragment is purified. The plasmid pRPA-PS-PRIa-andro East digested with restriction enzymes Ncol and BamHI and the small fragment DNA
containing the region encoding the fusion protein PR-la-androctonine is purified. The two purified DNA fragments are then linked together in a cassette expression in plants that synthesize a PR-la-androctonine fusion protein. The structure schematic of this expression cassette is shown in Figure 2. c PR-la-1 ~ androctonine "represents the coding region for the PR- fusion protein 1 a-androctonine of pRPA-RD-230. Androctonine is transported to the extra matrix cell of the plant by the action of the signal peptide PR-la.
pRPA-RD-195: Creation of a plasmid containing a multiple cloning site ? 0 changed.
Plasmid pRPA-RD-195 is a plasmid derived from pUC-19 which contains a site modified multiple cloning. Complementary synthetic oligonucleotides Oligo 5 and Oligo 6 below, are hybridized and made double stranded according to the procedure described for pRPA-MD-P.
OligoS: 5 'AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
CATGC 3 ' Oligo6: 5 'CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT
GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3 ' The double-stranded oligonucleotide obtained is then linked in pUC-19 which has been previously digested with restriction enzymes EcoRl and Hindlll and rendered tips WO 99/09189 I '~ PCT / FR98 / 01814 francs using the klenow fragment of DNA polymerase 1 from E. cvli. We get a vector containing multiple cloning sites to facilitate introduction Cassette tapes of expression in a vector plasmid of Agrobacteriurn terrnejaciens. The structure Schematic of this multiple cloning site is shown in Figure 3.
pRPA-RD-233: Introduction of the PR-la-androctonine expression cassette pRPA-RD-230 in pRPA-RD-195.
The plasmid pRPA-RD-230 is digested with the restriction enzyme HindIII. The DNA fragment containing the expression cassette for PR-la-androctonine is purified. The purified fragment is then linked in pRPA-RP-19 ~ which has been previously digested with the restriction enzyme Hindlll and dephosphorylated with phosphatase intestinal calf.
pRPA-RD-174: Plasmid derived from pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) containing the gene of tolerance to bromoxynil of pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).
The bromoxynil tolerance gene is isolated from pRPA-BL-237 by a gene amplification by PCR. The resulting fragment is blunt-ended and is cloned in the EcoRl site of pRPA-BL-150A which was made blunt by the action of polymerase klenow under standard conditions. We obtain an Agrobacterium vector tumefaciens which contains the bromoxynil tolerance gene near its border right, a gene tolerance to kanamycin near its left border and a site of cloning multiple between these two genes.
The schematic structure of pRPA-RD-174 is shown in Figure 4. On this figure, "nos" represents the polyadenylation site of nopaline synthase of Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983). "OUR pro" represents the promoter nopaline synthase from Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NPT II"
represents the neomycin phosphotranspherase gene of the transposon Tn5 of E
coli (Rothstein & coll., 1981), "35S pro" represents the 35S promoter isolated from virus cauliflower mosaic (Odell & coll., 1985), "BRX" represents the gene for nitrilase isolated from K. ozaenae (Stalker & coll., 1988), "RB" and "LB" represent respectively the right and left borders of the sequence of a Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens.
pRPA-RD-184: Addition of a new, unique restriction site in pRPA-RD-174.
The complementary synthetic oligonucleotides Oligo 7 and Oligo 8 below, are hybridized and made double stranded according to the procedure described for pRPA-MD-P.
Oligo7: 5 'CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3 ' Oligo8: 5 'CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA
CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
GTGGCCTGAC TGG 3 ' The hybridized double-stranded oligonucleotide (95 base pairs) is purified after separation on an agarose gel (3% Nusieve, FMC). Plasmid pRPA-RD-174 East digested with the restriction enzyme Xmal, and the large DNA fragment is purified. Both DNA fragments obtained are then linked.
A plasmid derived from pRPA-RD-174 is obtained comprising other sites of restriction between the bromoxynil tolerance gene and the kanamycin marker Selection.
The schematic structure of the plasmid pRPA-RD-184 is shown in the figure ~
where the terms "nos", "NPT II", "NOS pro", "35S pro", "BRX gene", "RB" and "LB"
have the same meaning as pow figwe 4.
pRPA-RD-236: Creation of an Agrobacterium tumefaciens vector containing the construction of the coding gene for fandroctonin directed towards the matrix extracellular.
The plasmid pRPA-RD-233 is digested with the restriction enzymes Pmel and Ascl and the DNA fragment containing the PR-la-androctonine gene is purified. The plasmid pRPA-RD-184 is digested with the same restriction enzymes. The DNA fragment containing the PR-la-androctonine expression cassette is then linked in pRPA-RD-184. This gives an Agrobacterium tumefaciens vector containing the sequence coding pow the fusion protein PR-la-androctonine which leads to (expression of androctonine in the extracellular matrix of the plant.
WO 99/09189 16 PCT / FR98 / o1814 Example 2: Tolerance to herbicides in processed tobacco.
2;1- Transformation Le vecteurs pRPA-RD-236 est introduit dans la souche d'A~~;robacterium tumefaciens EHA 1 O 1 (Hood & coll., 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari &
coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & colt.
{ 1985).
2-2- Régénération La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/1 de saccharose ainsi que 200 pg/ml de kanamycine. Les expiants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et régénérées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose contenant 0,05 mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 1 ~ jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
2-3- Tolérance au bromoxvnil Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-R.D-236. Ces plantes ont été traitées en serre au stade S
feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare.
Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont ensuites employées dans différentes expérimentations qui montrent que l'expression de l'androctonine par les plantes transformées les rend résistantes aux agressions fongiques.
REFERENCES
Ausubel, E. A. & colt. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology.
Publ. Wiley & Sons.
Bevan, M. & colt. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.
Carnngton and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.
Ehret-Sabatier & colt. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-29544.
Horsch & colt. (1985). Science 227:1229-1231.
Jefferson & colt. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
Komari & colt. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
Rothstein & colt. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.
Stalker & colt. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
Odell, J.T. & colt. (1985). Nature 313:810-812.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: LYON
(E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 69009 (ü) TITRE DE L'INVENTION: Gène codant pourl'androctonine, vecteur le contenant et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 11 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 110 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADN
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..75 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys TAC TAC AAG TGC ACT AAC AGG CCA TAC TGAGCTCGGC GAGGCGAACG g5 Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr TGTCGACGGA TCCGG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 106 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:12..101 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT 9g Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg GCC GGCGA
Ala 106 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
(A) LONGUEUR: 211 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linaire (ii)TYPE DE MOLCULE: ADN
(ix)CARACTRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:12..176 (xi)DESCRIPTION DE LA SQUENCE: SEQ ID NO: 3:
C
ATG
GGT
TTC
GTG
CTT
TTC
TCT
CAG
CTT
CCA
TCT
TTC
CTT
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu CTTGTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT 9g TGC CGT
LeuVal Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg GCCAGG TCC GTG TGC AGG CAG ATC AAG ATC TGC AGG AGG AGG
GGT GGT
AlaArg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly TGCTAC TAC AAG TGC ACT AAC AGG CCA TAC TGAGCTCGGC GAGGCGAACG
CysTyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr TGTCGACGGA TCCGG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: 2; 1- Transformation The vector pRPA-RD-236 is introduced into the strain of A ~~; robacterium tumefaciens EHA 1 O 1 (Hood & al., 1987) carrying the cosmid pTVK291 (Komari &
coll., 1986). The transformation technique is based on the procedure of Horsh & colt.
{1985).
2-2- Regeneration The regeneration of PBD6 tobacco (from SEITA France) from explants foliar is carried out on a Murashige and Skoog (MS) base medium including 30 g / 1 of sucrose as well as 200 pg / ml of kanamycin. The leaf explants are taken from plants grown in greenhouses or in vitro and regenerated using the technique some discs leaves (Horsh & coll., 1985) in three successive stages: the first understands induction of shoots on a medium supplemented with 30 g / 1 of sucrose containing 0.05 mg / 1 of naphthylacetic acid (ANA) and 2 mg / 1 of benzylaminopurine (BAP) for 15 days. The shoots formed during this stage are then developed for 10 days per culture on an MS medium supplemented with 30 g / l of sucrose but not containing no hormone. Then we take developed shoots and we cultivate them on an environment of rooting MS with half content of salts, vitamins and sugar and not containing not hormone. After about 1 ~ days, the rooted shoots have gone into Earth.
2-3- Tolerance to bromoxvnil Twenty transformed plants were regenerated and put in the greenhouse for the construction pRPA-RD-236. These plants were treated in the greenhouse at stage S
leaves with an aqueous Pardner suspension corresponding to 0.2 kg of active material bromoxynil per hectare.
All plants showing complete tolerance to bromoxynil are then used in different experiments which show that the expression of androctonine from transformed plants makes them resistant to fungal attacks.
REFERENCES
Ausubel, EA & colt. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology.
Publ. Wiley & Sounds.
Bevan, M. & colt. (1983). Nuc. Acids Res. 11: 369-385.
Carnngton and Freed (1990). J. Virol. 64: 1590-1597.
Ehret-Sabatier & colt. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-29544.
Horsch & colt. (1985). Science 227: 1229-1231.
Jefferson & colt. (1987). EMBO J. 6: 3901-3907.
Komari & colt. (1986). J. Bacteriol. 166: 88-94.
Rothstein & colt. (nineteen eighty one). Cold Spring Harb. Nice. Quant. Biol. 45: 99-105.
Stalker & colt. (1988). J. Biol. Chem. 263: 6310-6314.
Odell, JT & colt. (1985). Nature 313: 810-812.
LIST OF SEQUENCES
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: RHONE-POULENC AGROCHEMISTRY
(B) STREET: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) CITY: LYON
(E) COUNTRY: France (F) POSTAL CODE: 69009 (ü) TITLE OF THE INVENTION: Gene coding for androctonine, vector the container and transformed plants obtained resistant to diseases (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 11 (iv) COMPUTER-DETACHABLE FORM:
(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: l:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 110 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: DNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..75 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys TAC TAC AAG TGC ACT AAC AGG CCA TAC TGAGCTCGGC GAGGCGAACG g5 Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr TGTCGACGGA TCCGG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 106 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 12..101 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT 9g Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg GCC GGCGA
Ala 106 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) FEATURES OF THE SQUENCE:
(A) LENGTH: 211 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLCULE: DNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 12..176 (xi) DESCRIPTION OF THE SQUENCE: SEQ ID NO: 3:
VS
ATG
GGT
Tax incl.
GTG
CTT
Tax incl.
TCT
CAG
CTT
CCA
TCT
Tax incl.
CTT
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu CTTGTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT 9g TGC CGT
LeuVal Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg GCCAGG TCC GTG TGC AGG CAG ATC AAG ATC TGC AGG AGG AGG
GGT GGT
AlaArg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly TGCTAC TAC AAG TGC ACT AAC AGG CCA TAC TGAGCTCGGC GAGGCGAACG
CysTyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr TGTCGACGGA TCCGG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
3 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 75 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 1"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 72 paires de bases (8) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 2"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléeotide synthétique 3"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 97 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique 3 (i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 75 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "synthetic oligonucleotide 1"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 72 base pairs (8) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "synthetic oligonucleotide 2"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 44 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "synthetic oligonucleotide 3"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 97 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid
4 (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 4"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: B5 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 5~~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC $ç
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucl,ique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 6~~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
TAGAGG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 7~~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG g3 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 8~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG g3 4 (A) DESCRIPTION: / desc = ~~ 4 "synthetic oligonucleotide (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: B5 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = ~~ synthetic oligonucleotide 5 ~~
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC $ ç
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 66 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: Other nuclear acid (A) DESCRIPTION: / desc = ~~ synthetic oligonucleotide 6 ~~
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
TAGAGG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 93 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = ~~ synthetic oligonucleotide 7 ~~
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG g3 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 93 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = ~~ synthetic oligonucleotide 8 ~
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG g3
Claims (39)
en ce que l'androctonine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I) suivante:
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae (I) dans laquelle Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, Xab représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xac représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xad représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et Xae représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé. 4. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 to 3, characterized in that androctonin essentially comprises the peptide sequence of formula general (I) following:
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae (I) in which Xaa represents a peptide residue comprising at least 1 amino acid, Xab represents a peptide residue of 5 amino acids, Xac represents a peptide residue of 5 amino acids, Xad represents a peptide residue of 3 amino acids, and Xae represents a peptide residue comprising at least 1 amino acid.
en ce que, Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Val, dans laquelle Xaa' représente NH2 ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, et/ou Xab représente la séquence peptidique -Arg-Xab'-Ile, dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xac représente la séquence peptidique -Arg-Xac'-Gly-, dans laquelle Xac' représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xad représente la séquence peptidique -Tyr-Xad'-Lys, dans laquelle Xad' représente un reste peptidique de 1 acide aminé, et/ou Xae représente la séquence peptidique -Thr-Xae', dans laquelle Xae' représente COOH ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé. 7. Nucleic acid fragment according to one of claims 4 to 6, characterized in that, Xaa represents the peptide sequence Xaa'-Val, in which Xaa' represents NH2 or a peptide residue comprising at least 1 amino acid, and/or Xab represents the peptide sequence -Arg-Xab'-Ile, in which Xab' represents a peptide residue of 3 amino acids, and/or Xac represents the peptide sequence -Arg-Xac'-Gly-, in which Xac' represents a peptide residue of 3 amino acids, and/or Xad represents the peptide sequence -Tyr-Xad'-Lys, in which Xad' represents a peptide residue of 1 amino acid, and/or Xae represents the peptide sequence -Thr-Xae', in which Xae' represents COOH or a peptide residue comprising at least 1 amino acid.
en ce que l'androctonine est représentée par la séquence peptidique de 25 acides aminés décrite l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1) et les séquences peptidiques homologues. 9. Nucleic acid fragment according to one of claims 1 to 8, characterized in that androctonin is represented by the peptide sequence of 25 amino acids described the sequence identifier No. 1 (SEQ ID NO 1) and the peptide sequences counterparts.
3 (SEQ ID NO 3), une séquence homologue ou une séquence complémentaire, plus particulièrement la partie codante de cette SEQ ID NO 3, correspondant aux bases 12 à 176 de cette séquence. 17. Nucleic acid fragment according to claim 16, characterized in that that the coding sequence is represented by sequence identifier no.
3 (SEQ ID NO 3), a homologous sequence or a complementary sequence, more particularly the part code of this SEQ ID NO 3, corresponding to bases 12 to 176 of this sequence.
caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimère défini selon l'une des revendications 19 à 21. 28. Host organism, in particular plant cell or plant, transformed characterized in that it comprises a chimeric gene defined according to one of claims 19 at 21.
partir des cellules végétales transformées. 31. Plant according to claim 30, characterized in that it is regenerated to from transformed plant cells.
consistant à
planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un milieu de culture, en particulier d'un champ, approprié pour la culture des dites plantes, à
appliquer sur ladite surface une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les grains des plantes récoltées. 36. Process for cultivating transformed plants according to one of the claims 30 to 34, or obtained by the process according to claim 27, said process consists in planting the seeds of said transformed plants in a surface of a culture centre, in particular of a field, suitable for the cultivation of said plants, to apply on said surface an agrochemical composition, without substantially affecting say them seeds or said transformed plants, then harvesting the plants grown when they reach the desired maturity and eventually separate the grains from the harvested plants.
fongicide et/ou bactéricide. 37. Process according to claim 36, characterized in that the composition agrochemical comprises at least one active product having at least one activity fungicide and/or bactericidal.
défini selon l'une des revendications 28 ou 29 dans un milieu de culture approprié, puis l'extraction et la purification totale ou partielle de l'androctonine obtenue. 39. Process for the preparation of androctonin defined according to one of claims 1 to 18, comprising the steps of culturing the host organism transformed defined according to one of claims 28 or 29 in a culture medium appropriate, then the extraction and total or partial purification of the androctonin obtained.
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