CA1050885A - Produit proteique, sa preparation et son application_ - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un produit protéique, caractérisé en ce que l'on dilue à l'eau un précipité III-1 obtenu par un procédé classique de fractionnement à l'éthanol d'extraits placentaires, traite la solution ainsi obtenue avec une solution de lactate de 2-éthoxy 6, 9-diamino acridine qui forme alors un précipité, élimine ledit précipité, ajoute au filtrat une solution aqueuse de sulfate d'ammonium à demi-saturation pour former un précipité qui est un produit protéique que l'on isole ensuite. Le produit obtenu selon l'invention est riche en gamma-globulines utilisables en thérapeutique directement par voie veineuse ou en association avec des gamma-globulines standard auxquelles il confère la tolérance clinique par voie intra-veineuse.

Description

~L~S~S
~a présente invention a pour ob~et un nouveau produit protéique, prépar~ ~ partir de ~ang humain contenu dans le pla-centa. Ce produit e~t riche en gamma-globulines utilisables directement par voie veineuse ou en association avec des gamma-globuline~ standard auxquelles il con~ère la tolérance clinique par voie intraveineus~. On peut obtenir ain~i une gamme-globuline intraveineu~e ~ partir de placenta~ dans de~ condition~ ~conomi-; que~ avantageuses, ~a~s faire appel ~ la saign~e d9être~ humains.
Qn sait que les gamma-globuline~ ont une activit~ an-ticorps qui le~ rendent utilisables en thérapeutique, par exem-ple dan~ le traitement ou la pr~ventio~ des infection~ d'origine mlcrobienne ou virale, en particulier dan~ le cas de~ malades ~ou~rant de carences immunitaires.
~es gamma-glob~line~ sont préparées ~ partir de sérum ou de sang extrait de placentasO ~e proc~d~ le plu8 souvent ~ ;
employé e~t un procéd~ de ~ractionnement par l~alcoolO
~e proc~dé de préparation de gamma-globuline~ ~ partir - de placenta~ a ét~ décrit par Ho~ ~AY~OR, J. AM. CHEM. SOC.
78, 1356 (lg56)o -Ce proc~dé con~i~te ~ traiter le filtrat d'une suspsn- ~
sion saline de placenta broyé de ~açon à obtenir une concentra- ~ ~;
tion dl~thanol égale ~ 25 % en volume. ~n recueille le précipi-; t~ I obtenu et le traite par 1~tha~ol ~ 8 % ~ pH 4, 8. On éli-~ mine le pr~cipit~ et recueille le surnageant I~ Par additlon ;~ d~al¢oo1 ~ ce surnageant ~usqu~ obtention d9une concentration de 25 % e~ volume on obtient la précipitat~on d~une fraction III
riche en gamma-globulinesO ~e précipit~ III est traité par 1~
thanol ~ 17 % ~ pH 5~ lo Q~ élimine le pr~cip~t~ IIX-l et re-~i cueille 12 ~urnageant III-lo Par addition d~éthanol au surnageant ~usquQà obtention d~une concentration de 25 % en Yolume, on ob-tient un pr~cipit~ 2 d~ gamma-globulinas analogue~ ~ celle~
obtenues par ~ranctionnement du plasma sangui~o .. ..

., .

` lOS~8135 On sait que les pr~parations de gamma-globulines obte-nues par fractiQnnement ~ thanol (appelées ci-aprè~ gamma-globulines standard) sont bien tolér~es :Lorsqu'elles sont ~dmi-: nistrées par voie intramusculaire9 Par contre des réactions ~ parfois tres graves ont été observée3 lorsque la voie intravei-neuse était utilisée.
Cette mauvaise tol~rance a ~té attribuée ~ u~e activi-tb anti-complémentaire due ~ la présence d'agrégats qui peuvent ~ixer le compl~ment comme le fait le complexe antigène~-anticorpsO
Cette ~ixation du complément correspond à une actiYation de plu- ~ . sieurs enzymes dont les produits so~t responsables des réactions d'intolérance enregistr~es après in~ection intraveineuse de gamma-glObUliIleB ~tandardO
On connait di~f~rents procédes qui permettent d'obtenir des gamma-globulines in~ectables par voie intra~einauseO Ces , .
proc~dés consistent à soumettre la gamm~-globuline standard soit à une incubation à pH 4, soit à une digestion enzymatique par la . pepsine~ la papaine ou la pla~ine.
~ DanB le procédé ~AY~OR rappel~ ci-deæsus~ le prec1pité
~ 20 III-l était éliminé.
Cn a maintenant découvert qu'en soumettant le pr~cipi-t~ II~l à un tr~itement appropri~, il est possible de r~cup~rer une fraction de gamma-globulines riches en plasmine qui ~tait perdue dans le procéd~ ~AY~OR et d'obtenir ainsl un produit pro-t~que qui peut atre utilis~ soit tel quel, soit pour isupprimer ~1 ou r~duire le pouvoir anticompl~mentaire de la gam~a-giobuline -1 standard tout en enrichissant en gamma-globulines la préparation . standard ainsi traitée9 ~ a pr~ente invention a pour obJet le produ~t indus-~ 30 triel nouveau que con8titue un produit protéique obtenu de la : façon ~ui~anteq le produit de d~part e3t le précipit~ l ob-te~nu lor~ du procédé ola88ique de ~ra~t~onneme~t ~ thsnol de ' . :
~.,

-2 ~ 5~ ~ 5 sang placent~ire qui a été rappelé ci-dessus; on dilue ~ 1'eau le précipit~ III 1, on élimine l'alcool résiduel pardialysé; on ajoute la solution obtenue une solu~ion aqueuse de lactate de 2 étho-2y 6, 9-diamino acridine (~EoDoAo); ~ pH 7,7 + 095 de pré~éren-~ce entre 7~5 et 8~09 on élimine le précipité formé; on ajoute au ;; filtrat une solution aqueuse de sulfate d'ammonium ~ une concen-tration correspondant enYiron ~ la demi saturation et isole le précipité ~orme qui est le produit protéi~uet objet de 19invention.
Ce produit protéique co~tient une enzyme protéolytique ~plasmine) dont la teneur est dé~inie ~ l'aide d~une "unit~ ca-~éinolytique"O
~ 'unit~ caséinolytique est dé~inie comme la quantité de ~:.
pla~mine produisant une augmentat~on de 450 ~g de tyrosine so-luble dans l~a¢ide trichloracétique sur de la oaæéine ~ 3 % p~n-dant 1 heure à ~7Co Voir "The preparation of human ~lbrinolyæin~
SCOURIS et Coll, Vox Sanguinis (1960) , 5, (4), pages 357-376 Généralement le produit protéique selon l'invention contient de 10 ~ 100 unites caséinolyt~ques par gramme de prot~i-neB, mal8 cette teneur peut être in~érieure à 10 Unit~sO
. . ~'invention a également pour objet le proc~dé de ... . .
: .préparation dudit.produit prot~ique. :~
Selon un mode d~e~é~ution pré~ér~, le traitement au lactate de 2-ethoxy 6~ 9-diamino acridine (~oEoDoAo ) eBt ef~ec~
tu~ à pH alcalinO Pour cela on ajoute ~ la solutio~ protéinique~
. avant addition du ~E~DoAo ~ une baseO Cette base est par ex-.1 , ~i emple un hydro~yde de métal alcalin tel que la soude. 1~ LoEoDoAo 1~
e~t a~outé en quantité suf~isa~te :pour obtenir une conce~tration :.
ae LoE~D~A~ telle que le poids de ~oE~D~Ao repr~sente en~iron 1/20 ~ 1/4 du poid~ de protéines présentes dans la solutionO la ;~
~30 teneur en prot~ines de la solution ~ traiter est g~n~ralementoomprise entre 5 et 30 ~litre etS de pré~érence, elle est de .~
1'ordre de 20 ~litreO ~h prenant comme exemple la teneur de 20 /litre en prot~ines~ 11 ¢onYient donc d1a~outer le ~EoDoA~ en '. ' ' ` ' ' .

. ~3~ .

~05~E~85 quantité suf~isante pour obtenir une concentration finale de ~oEoD~A~ compri~e entre 0,1 et 0,5 ~ e~lviron ~e précipité obtenu après addition de ~o~oD~Ao e~-t élimin~ par centri*ugationO On ajoute alors au filtrat une ~o-~ution aqueuse demi~saturée de sulfate d'ammonium, olest~à-dire - une solution contenant environ 300 g de sulfate d'ammonium p~r litreO On i~ole par filtration le précipité de produit protéique ~ormé.
Ce produit protéique peut ~tre purifié, si désiré~ par mise en solution aqueuse et dialyse.
Selon un mode d'e~écution préPéré, on effectue~ av~nt .. . . .
l'étape de traitement au ~oEoDoAo~ une étape préliminaire con-~i~tant à éliminer la fraction insoluble ~ pH 4~8 + 0~2~ notam-ment à pH 4~8 - 5~00 Pour cela on ajoute un acide9 tel que l'a-cide ¢hlorhydrique ~ la sol~tion du préciplté III_lo On ~limine ensuit~ par exemple par centri~ugation~ le précipité ~orméO
Cette ~tape prëliminaire~ non obligatoire~ facilite l'opération suivante de traitement au LoEoDoAo Elle a pour effet d'éliminer des lipoproté~es présente~ dans la solution.
~outes les étapes du procédé défini ci-dessu~ peuvent 8tre e~fectuées ~ température comprise entr0 0 et 25 ~ en~ironO
~invention a également pour objet l'application dudlt produit protéique ~ l'obtention de gamma-globulines utilisables par voie intra~eineuse~ soit directement~ soit en traitant une -gamma_globuline standard ~ l'aide de ce produit protéiqueO
.j .
Cette application e~t principalement caract~risée par le fa~t que l'on soumet une solution aqueuse dudit produit pro-té~que~ éventuellement mélang~e ~ une solution aqueuse de gamma-globuline~ standard, ~ une incubation jusqu'à dispariti~ du pouvoir anticomplémentaireO Par oonYentio~ on cons:Ld,~re qu0 le pouvoir anti-complémentaire a disparu lorsque la 50lution ~ 50 m~/ml ne neutralise pas (~e ~ixe pas) 2 unit~s de oo~plément ~ :
.

. .; _4,_ `- ~050~385 50 % (2 unités C' 50 %); en d~autres termes on considare que le pouvoir anticomplémentaire a disparu lorsqu9il ~aut une concen-- tration supérieure à 50 mg/ml pour ~ixer 2 unités de complément à 50 %0 ~Public Health .Monograph n 74,1'365, UoSoA~ Stan-~. dardised Diaignostic Complement ~ixation method and adaptation :. to microtest)O
. Selon un mode d'exécution pr~ére cette application ~ préæente les caractéristique~ indiquée~ c:i~apresO ~ .
~ ~a solution soumise a incubation peut contenir par .~. .
10 exemple de 50 ~ 160 g/litre de protéines. ~e t~tre en unités caséinolytiques de la solution soumlse ~ incubation est compris entre environ 1~25 et 10 unit~s ca~éinolytiques par gramme de . ~ .
~ protéine~ et notamment entre 4 et 6 unités ca~éinolytiques par ¦ gramme de protéines.
! ~'incubation est e~ectuée à pH compris entre 4 at 7 en~ronO ~a temp~rature d'incubation est comprise entre 10 et 45-C environ~ de pré~érence la température d'incubation est 37C.
. ~e temps de réaction d'incuba*ion dépend à la fois du pH, de la .l. température~ du titre en un~t~s caséinolytiques du m~lange de~ ~
départ et du titre maximum de pouvoir a~ti-complémentaire final.:
~ , oholsiO
.;.
~a durée dlincubation diminue lorsque le pH diminue et . lorsque la température augmenteO : ~
: ~or~que l'on effectue l~incubation à 37C et à pH 7,~ ~.
-. il ~aut généralement de 14 ~ 28 ~ours pour que le titre en pou~
' -~ . . . ................................ . ...
voir anti complémentaire soit sat~s~aisantO .~
~` ~orsque l'on opère ~ 37C ~ pH 4~ il su~fit de 18 heu-~ re~ d'incubation, ou pour plus de s~reté de 24 à 48 heures Il e~t souhaitable de soumettre apr~s l'incubation la ~olution de gamm~-globulines ~ l'action adsorbante de la bento~
.. ... .
`~ nite pour éliminer l'e~zyme protéolytique résiduelleO Qn peut . .
: par. exemple a~outer une su~pension de ~entonlte ~ 4 %7 Bt~riliSée .~' , ' , .
_5~
-. ..... .

- 1~50~85 l'autoclave9 de façon ~ introduire environ 5 grammes de ben-tonite pour 100 gramme de protéine~ contenues dans la solution.
On ajuste le pH entre 4 et 8, par e~emple ~ 5~5 environ et agite pendant quelques heures, ~ température comprise entre 20 et 37C
environ~ par exemple 2 heures ~ tem~rature ambiante (20 ~ 25C)~
`~ On élimine enfin la bentonite par exemple par centri~ugation.
Cependant, lorsque le titre des unités caséinolytiques est ~aible (par exemble in~érieur ~ 2 unités caséinolytiques par gramme de protéines) le traitement ~ la bentonite peut 8tre omis.
~orsque la solution obtenue après.l~cubation est py-rogane ou colorée~ il convient de la soumettre par exemple a¢tion adsorbante d~un gel d~alumine (gel obtenu selon la mé-thod'e de Will~t~tter en milieu aqueux)0 Pour cela on ajoute une : ~uantit~ de gel d~alumine comprise entre environ 0,25 ~ 1 foisle poids de protéines contenues dans la solutionO Ce traitement est e~ectué ~.pH.5,5 + Q,5,.environ.à températur.e comprise en-` tr~.. 20 et 45.C en~iron~ On agite pendant quelques heures, par . exemple ~ heures à 45Co L~alumine est~ensuite éliminée par cen-~, tri~ugationO ~ 'ha gamma-globuline ainsi obtenue se distingue de la gamma-globuline standard notamment par des caractéristique~ d~ul-. ~racentri~ugation~ de gel ~iltration~ et aussi par l~absene~ d~
pouvoir a~ticomplémentaire ~l~absence de pouvoir anticompl~men-~ taire étant dé~inie par convention ~ l~aide du seuil maximum '~
.,.
: indiqu~ ¢i-dessus)0 Des essais clini~ues ont montré que la gamma-globuline obtenue selon l~i~vention peut ~tre admini3trée par ole intraveineuse m~me ~ des ~ujets ne supporta~ pas la gamma-. globuline standard par voie ~ei~euseO ' ' ~ Pour conserver la gamma-globuli~e obtenue apr~s incu-'`3, 30 ~ation et ~ventuelle~ent après traitement ~ la bentonite ou ~
alum~ne~ on la 90Umet ~ une lyoph~lisation. On obtient ainsi .~' une prép~ration de gamMa-globullne~ qui peut être utllisée par . ", ~i, ' .

' ~ ~ S0 ~ 8 S
voie intraveineuse apr~s redissolution aqueuseO
On a d~couvert, et cela est ég~lement un objet de l~in vention~ que l~on obtient apras lyophilisation u~e poudre d~une solubilité et d'une stabilité améliorées lorsque la l~ophilisa-tion est ~aite en présence de glycocolle, à raison de 1 g de gly-cocolle pour 2 à 3 g de protéinest de préi~rence 1 g de glycocol-le pour 2,5 de protéines ~nviron. ~es exemples ~uivant~ illus-trent l~invention sans toute~ois la limi~er.
EXEMP~E 1 ~ ~ :
.
10 ~ Qn dissout le précipité ~ obtenu selon la méthode ~ :
décrite par H.~. ~AYIOR et Coll.~ dans une ~ois et demie son poids de solution aqueuse de chlorure de sodium a 8 grammes par litre~ r~froidie ~ oa. Qn sou~et la solution ~ une dlal~se 80U8 ;1 . .
eau courante ~ ~ 4~ pendant 3 ~ 4 ~ours, puis dilue 1~ liquide 'I dialys~ a~ec de lleau (10 fois le poids du précipité de départ)O . .
.' Qn aJuste si necessaire le pH ~ 4~8~ en ajoutant une solution , normale d~acide chlorhydriqueO On soumet le liqulde dilu~ à une ~i:
¢entri~ugatio'n et él~mine le précipité ~ormé.
On a~uste le pH du liquide surnageant a 7~ 7 par addi- ~:
tion d~une solution ~ormale de soude, pui~ a~oute du chlorure de ., .
, sodium ~ raison de 2 g pour lOOOo On a~ou~e du ~oEoD~Ao (sOus : forme d~une ~olution ~ 1%). Pour obtenir une bonne précipita-~! tlon~ c~est-à-dire un s~diment d~au,moins 50% et u~ surnageant par~aitement clair, il faut généralement ajouter le h~EoDoAo de : :
'I ~, ..
! $açon ~ obtenir une concentration de 1 ~ 5 grammes pour lOOOo Ia quantlté optimale de ~oEoDoAo peut être faoilement déterminée ~¦ ~ur.des prises d~essai~ auxquelle~ on ajoute des quantités pro-, ,~ , , .
. gressivement ¢roissa~tes de ~EoD~A~ 0~ laisse s~dimenter pen- :~
dan~ au moi~s deux heures~ élimine par centrifugatio~ le préci~
30 pité9 et a~oute au surnageant du chlorure de sodium afin de ;. : :
¢ristalllser le hoEo~ho en exc~s. On élimine par filtration le pré~ipi$~ XorméO

. ~ .
, ~:
_7_ . :
:., , . . .

On ajoute au filtrat du sul~ate d~ammonium à raison de ; 300 ~ramme~ par litre de ~iltrat. On agite pour dissoudre c~m-; plètement le sulfate d~ammonium~ et ~ri~ie le pH qui doit atre entre 6 et 70 On recueille par filtratioll le précipité form~O
'1/ On dialy~e.
... . .
'~ On ajoute au glycocolle pour obtenir une concentration de l~ et le pH est ajusté ~ 7,0. Gn ~iltre stérilement~
On obtient P;nsi une solution q~i sera désig~ée ci-apr~s par Ao On titre le pouvoir anticomplémentaire de la ~olution A. On incube si néce~saire ~ 37C ~usqu~ ce que le pouvolr anti-complémentaire soit satisfaisant~ c~est-à-dire supérieur à 50 mg/
ml ~ixan~ 2` unités C~ 50 %.
..
~or~que oe ré~ultat e~t atteint~ on arrete l~inouba- , tion. On dose les protélnes et détermine le titre en unités oaséinolytiquesO Si ¢elui-ci est supérieur à 0,2 unit~ par mil- `' ... .. .
~ lilitre,pour u~e solution ~100 grammesde protéines par litre, on ',~, eifectue un traitement a la bentoniteO Pour cela on aJoute una , . .
,~! Golution ~ 4 % de bentonite autoclavée en quantite suf~isante '20 pour avoir 5 grammes de bentonite'pour lOO grammes de protéines.
I , On a~u~te le pH ~ 5~ 5 par addition d9une ~olution normale d~a-oide ohlorhydriqus~ et agite pendant 2 heures à, température am-¦ bianteO On élimine la bentonite par centri~ugationO Si le titre ~, en unités caséinoIytiques est encore ~upérieur au seuil i~diqué
c1-dessus~ il oon~ie~t de recommencer le traitement ~ la bento-' niteO
'1~ On fait un traitement au gel d~alumine. En ~onction '~
,1 , de~,pyrogènes et de la couleurt on ajoute un poid~ de gel d~alu- ;
mine oompris èntre l ~ois et 0~25 ~ois le poids des protéines ~"1,~ 30 presentesO Dans l~exemple cité, on en a mi~ 0~5 fois le poid~ de protéine~ pré~ente~. On ajuste le p~ ~ 5, 5 et agite ~endant 3 ' ;'l - heures ~ 45Co On él~mine le gel d~alumine par centrifugatio~
: i .
. 1 ... . .
.~' o8 ' ' .
,, .

f~n fait le dosage des protéineis, af~fuste le pH ~ 7 piar addition d'une f~olution normale de soude, et ajoute de lleau distillée pour ajuster le titre des protfffines i~ 52 grammes par litre. On af~joute du chlorure de sodium pour obteni~ une con-centration de 1 griammfe par litre et du glycocolle pour obtenir - une concentration de 20 grammes par litreO ff~n ~iltre stérile-ment.
~ a solution obtenue est sounise i~ une lyophilisation.
&n obtie~t ainsi une préparation de gamma--globulines ~If~ peut être utilisée par voie intra~eineuse après redissolution aqueuse ~ -stérile. ~ j .
EXENELEf 2 ~n af~oute la solution A telle ~u'obtenue ~ l'exemple 1 a~a~t ~noubation i~ une solution de gamma-globulines standard de ~açon a af~jfuster le titrfe à 5 unitf~s caséinolytiques par gramme de protéinesO .:

;1 Si par exemple on désire traiter 10 litres de gamma-glQbulines standard conten~nt 154 grf~mme~ de protéine~ par litre, il faut af~outer X litrefff3 d'u~e aolution A telle qu'obtenue l'exemple 1 contenant 125 grammes de protéines par litre et ti-trfant 2000 unités caséinolytiques par litre.

X est ~a¢ilement dé~ferminf~ de ~ ~afr~ffon sui~ante:

, X ~ 2000 cu/l 5 , .,, = ,.

~ 125X~ 154 2 10 1 - ;
.
~ 7700 - ¢'est i~ dire X = 9 soit environ 5~6 litresO
j 1375 ! .~ " Apras v~rificatio~ de la stérilité le mf~flff~ge est incu-1 b~ if~ 37C et a pH 70 & contrafle réfgulièrement isur une prise ; d'e~sais~ par exemple tous lesffff 8 jours~ le poffuvoir a~ticomplémen-taire jusqu~ obtention de sa disparitionO Il ~aut en général . ~j .. ..

''''.,: :.. :

.'f ~ _90 ., , '.

lC3S0885 14 ~ 28 joursO On considère que le pouvoir anticomplémentaire a dispax~t lorsqu'il est superieur ~ 50 mg/ml fixant 2 unit~s C'50~.
On arr~te l'incubation et l'on traite par la bentonite et le gel - a~alumine dans les memes conditions que clans l'exemple lo -~ EXEMPIE 3 . On opere de manière analogue ~ celle décrite ~ llexem ; . ple 2~ mais on ajoute la ~olution A telle qu'obtenue ~ l'exemple 1 dans des condition~ de pH et de concentration enzymatique dif-férentes.
. 10 IQ concentration enzymatique est ajustée ~ 1~25 unités ~ oaséinolytiques par gramme de protéines. ~'incubatio~ est ef~ec-; :
il tuée ~ pH 4 pendant 18 heures à la température de 37C. On opère ensuite comme à l'exemple 1~ mais on omet le traitement a la ~I bentoniteO
.~ On obtient une préparation de gamma-globulines qui peut . 8tre utilisée par voie intra~eineuse après dissolution aqueuseO

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Claims (8)

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé de préparation d'un produit protéique, caractérisé en ce que l'on dilue à l'eau un précipité III-1 obtenu par un procédé classique de fractionnement à l'éthanol d'extraits placentaires, obtient une solution que l'on traite avec une solution de lactate de 2-éthoxy 6,9-diamino acridine qui forme lors un précipité, élimine ledit précipité, ajoute au filtrat une solution aqueuse de sulfate d'ammonium à demi-saturation pour former un précipité qui est un produit protéique que l'on isole ensuite.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue le traitement avec la solution de lactate de 2-éthoxy 6,9-diamino acridine à pH alcalin, de l'ordre de 7,7 ? 0,5.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute le lactate de 2-éthoxy 6,9-diamino acridine de façon à obtenir une concentration comprise entre 0,1 et 0,5%
environ.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le précipité final est isolé par centrifugation.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on soumet le produit protéique obtenu à une dialyse, après mise en solution aqueuse.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue, avant le traitement au lactate de 2-éthoxy 6,9-diamino acridine, une étape préliminaire consistant à élimi-ner la fraction insoluble à pH 4,8 ? 0,2.

7. Produit protéique, chaque fois qu'il est obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 4 et 5 ou son équivalent chimique manifeste.

8. Produit protéique, chaque fois qu'il est obtenu par un procédé selon la revendication 6, ou son équivalent chimique manifeste.