BRPI0718483A2

BRPI0718483A2 - Variantes de mutação múltipla de serina protease

Info

Publication number: BRPI0718483A2
Application number: BRPI0718483-2A2A
Authority: BR
Inventors: Wolfgang Aehle; David A Estell; Ronaldus W J Hommes; Brian E Jones; Marc Kolkman; Chris Leeflang; Hiroshi Oh; Ayrookaran J Poulose; Andrew Shaw; Der Kleij Wilhelmus A H Van; Leo Van Marrewijk
Original assignee: Danisco Us Inc Genencor Div
Priority date: 2006-10-19
Filing date: 2007-08-29
Publication date: 2013-11-26
Also published as: CA2667043A1; US7985569B2; WO2008048392A1; US8455234B2; US20110251116A1; US20140005094A1; KR20140136033A; KR20090075825A; MX2009003936A; RU2009118608A; EP2084273A1; US20080063774A1; US8865449B2; JP5775666B2; US20150072913A1; JP2010506590A; RU2558261C2

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTES DE MUTAÇÃO MÚLTIPLA DE SERINA PROTEASE".

A presente invenção refere-se a um depósito International U.S. número de série 11/809.104, depositado em 31 de maio de 2007, que é uma 5 continuação em parte de pedido de patente U.S. pendente número de série 11/583.334, depositado em 19 de outubro de 2006, que é uma continuação em parte de pedido de patente U.S. pendente número de série 10/576.331, que reivindica prioridade para PCT/US2004/039066, depositado em 19 de novembro de 2004, que reivindica prioridade para pedido de patente U.S. 10 provisório número de série 60/523.609, depositado em 19 de novembro de 2003, agora abandonado.

Campo da Invenção

A presente invenção provê nova serina protease de Micrococcineae spp tendo substituições múltiplas. Em particular, a presente invenção provê serina proteases tendo substituições múltiplas, DNA codificando estas proteases, vetores compreendendo o DNA codificando as proteases, células hospedeiras transformadas com o DNA vetor, e enzimas produzidas pelas células hospedeiras. A presente invenção também provê composições de limpeza (por exemplo, composições detergentes), composições de ração animal, e composições de processamento de têxteis e couro compreendendo estas variantes de serina protease. Modalidades particularmente preferidas, a presente invenção provê proteases mutantes (isto é variantes) derivadas de proteases de tipo selvagem aqui descritas. Estas proteases variantes também encontram uso em numerosas aplicações.

Antecedentes da Invenção

Serina proteases são um subgrupo de uma classe diversa de enzimas tendo uma ampla faixa de especificidades e funções biológicas (vide por exemplo, Stroud, Sei. Amer., 131:74-88 [1974]). Apesar de uma 30 diversidade funcional, o maquinário catalítico de serina proteases é representado por pelo menos duas famílias geneticamente distintas de enzimas: 1) as subtilisinas; e 2) as serina proteases bacterianas, homólogas, e relacionadas com quimotripsina de mamíferos, (por exemplo, tripsinas). Estas duas famílias de serina proteases mostram mecanismos notavelmente similares de catálise (Vide por exemplo, Kraut, Ann. Rev. Biochem., 46:331- 358 [1977]). Além disso, apesar da estrutura primária não estar relacionada, 5 a estrutura terciária destas duas famílias de enzimas ocasiona em conjunto uma tríade catalítica conservada de aminoácidos consistindo em serina, histidina e aspartato.

Em contraste, as subtilisinas e serina proteases relacionadas com quimotripsina têm, ambas, uma tríade catalítica compreendendo aspartato, histidina e serina. Nas proteases relacionadas com subtilisina, a ordem relativa destes aminoácidos, lendo do término amino para carbóxi, está aspartato-histidina-serina. No entanto, nas relacionadas com quimotripsina proteases, a ordem relativa é histidina-aspartato-serina. Uma pesquisa extensa foi conduzida sobre as subtilisinas, devido em grande parte à sua utilidade na limpeza e aplicações em rações. Trabalho adicional foi focalizado nas condições ambientes adversas (por exemplo, exposição a agentes oxidativos, agentes quelantes, extremos de temperatura e/ou pH) que podem impactar de modo adverso a funcionalidade destas enzimas em várias aplicações. Mesmo assim, permanece a necessidade na técnica para sistemas de enzimas que são capazes de resistir a estas condições adversas e reter ou ter melhorada atividade sobre os atualmente conhecidos na técnica.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê novas serina proteases de 25 Micrococcineae spp tendo substituições múltiplas. Em particular, a presente invenção provê serina proteases tendo substituições múltiplas, DNA codificando estas proteases, vetores compreendendo o DNA codificando as proteases, células hospedeiras transformadas com o DNA vetor, e enzimas produzidas pelas células hospedeiras. A presente invenção também provê 30 composições de limpeza (por exemplo, composições detergentes), composições de ração animal, e composições de processamento de têxteis e couro compreendendo estas variantes de serina protease. Modalidades particularmente preferidas, a presente invenção provê proteases mutantes (isto é variantes) derivadas de proteases de tipo selvagem aqui descritas. Estas proteases variantes também encontram uso em numerosas aplicações.

5 A presente invenção provê variantes de serina protease isolada

tendo uma seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. 10 A presente invenção ainda provê composições compreendendo a(s) variante(s) de serina protease isolada tendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. 15 Em algumas modalidades preferidas, as composições compreendem pelo menos uma variante de serina protease, em que a serina protease variante tem reatividade cruzada imunológica com a serina protease especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas adicionais, a seqüência de uma variante de serina protease compreende substituições pelo menos 20 duas posições de aminoácidos selecionadas dentre posições 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18,19, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 99, 100, 101, 103, 25 104, 105, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, e 189, em que 30 as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas, a variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre G12D, R14I, R14L, R14M, R14S, R16I, R16L, R16Q, N24E, N24H, N24M, N24T, N24W, R35E, R35F, R35H, T36S, G49A, G54D, G54L, R61V, A64K, G65Q, Q71F, Y75G, S76A, S76L, S76N, S76T, S76V, R79K, R79T, Q81K, Q81P, T86K, A93G, A93H, A93S, S99A, T109M, N112E, T116E, R123F, R123L, R123Q, R123S, R127A, R127K, R127Q, R159E, R159F, R159G, R159K, R159L, R159Q, R179N, R179Q, I181K, I181Q, I181T, D184N, D184T, e S187Q, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas ainda adicionais, a variante de serina protease compreende substituições múltiplas selecionadas dentre R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R123L, R14L/R127Q/R159Q, R14L/R179Q, R123L/R127Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q, R16Q/R79T,

R35E/R123L/R127Q/R179Q, e G12D/R35E/G63R/R79K/T109M, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em ainda algumas outras 20 modalidades, a variante de serina protease compreende as seguintes substituições R123L, R127Q, e R179Q, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

Em algumas outras modalidades preferidas, a variante de serina

protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre D2G, D2Q, V3I, V3L, N7A, N7L, N7S, 111A, 111Q, R14E, N24A, N24E, N24H, N24L, N24M, N24Q, N24T, N24V, T36D, T36F, T36G, T36H, T36I, T36L, T36N, T36P, T36R, T36S, T36V, T36W, T36Y, A38D, A38F, A38H, 30 A38L, A38N, A38R, A38S, G49F, S51A, G54A, G54D, G54H, G54K, G54L, G54M, G54R, N55F, A64H, A64N, A64R, A64W, A64Y, G65L, G65P, G65Q, G65R, G65S, G65T, G65Y, G65V, V66A, V66D, V66E, V66H, V66I, V66L, Ν67Α, N67G, N67L, Ν67Κ, L69H, L69S, L69V, A70D, Α70Η, A70S, Q71A, Q71G, Q71H, Q71I, Q71K, Q71M, Q71N, N73S, Ν73Τ, N74G, Y75F, Y75G,Y75I, S76L, S76Y, S76V, S76W, G77S, G77T, G78A, G78D, G78H, G78N, G78S, G78T, R79P, V80H, V80L, Q81H, Q81K, Q81V, H85Q, H85T, 5 V90I, V90P, V90S, S92G, W103I, W103M, H104K, T109A, T109H, T109I, S114G, T116F, P118A, P118F, P118H, P118R, E119K, E119R, N145E, N145I, N145Q, V150L, R159F, N170Y, G177M, R179A, R179D, R179E, R179I, R179K, R179L, R179M, R179N, R179T, R179Y, R179V, 1181 Η, T183I, G186E, G186I, G186V, S187P, S187T, e S188M, em que as 10 substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

Em algumas modalidades adicionais, a variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1A, F1T, D2A, D2H, D2N, V3T, N7H, N7I, A8G, A8K, T10G, T10K, 111S, 111T, G12W, G13M, S15F, N24F, N24S, A30S, R35F, T36C, A38G, A38I, A38K, A38V, A38Y, T40S, T40V, A41N, N42H, F47I, F47M, G49A, G49K, G49L, S51F, S51Q, G54I, G54Q, N55K, N55Q, R61M, T62I, G63Q, G63V, G63W, A64F, A64I, A64K, A64L, A64M, A64Q, A64S, A64T, A64V,G65A, G65H, V66M, V66N, N67D, N67F, N67H, N67Q, N67R, N67S, N67T, N67V, N67Y, L68W, L69W, A70G, Q71D, Q71F, Q71L, Q71R, V72I, N73H, S76E, S76I, S76K, S76A, S76N, S76Q, S76R, S76T, G77N, G77Y, G78I, S78R, G78V, R79G, V80F, Q81D, Q81I, A83N, H85R, H85K, H85L, T86A, P89N, V90A, V90L,V90T, T107H, T107M, T107S, T107V, T109G, T109L, T109P, T109R, A110S, A110T, N112I, P118E, P118I, P118K, P118Q, R123E, R123I, I126L, R127F, I28L, T129S, E133Q, L142V, A143N, A143S, N145G, N145L, N145T, V150M, T151L, R159E, T163L, Q167N, N170A, N170D, N170L, 171S, G177S, I181G, 1181N, T182V, T183K, T183M, D184F, D184H, D184Q, D184R, S185I, S185V, S187E, e S187L, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em ainda modalidades adicionais, a variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre D2P, A8G, T10C, T10L, 111E, I11Q, I11T, I11W, G12D, G12I, G12N, G12Q, G12S, G12V, R14A, R14C, R14E, R14D, R14G, R14I, R14N, R14Q, R14S, R14T, 5 S15C, S15E, S15H, S15R, S15Y, R16C, R16D, R16E, R16T, R16V, A22C, A22S, N24E, R35A, R35C, R35D, R35E, R35H, R35M, R35N, R35P, R35Q, R35S, R35T, R35V, T36C, A38C, A38D, A41C, A41D, T44E, T46C, T46E, T46F, T46V, T46Y, F47R, A48E, G49A, G49C, G49E, G49H, G49L, G49N, G49Q, G49V, G54C, N55G, D56L, Y57G, F59W, R61E, R61M, R61T, R61V, 10 G91Q, S99A, T100A, T100R, T107R, T109E, N112P, S113C, S114C, P118K, P118R, E119G, E119R, E119T, E119V, E119Y, T121E, T121F, T121L, R123C, R123D, R123E, R123F, R123H, R123N, R123Q, R123S, R123T, R123V, R123W, R123Y, G124D, L125Q, R127D, R127E, R127K, R127Q, R127S, P134R, T151C, T151L, S155C, S155I, S155W, S155Y, 15 R159D, R159E, R159Q, R159S, R159T, R159V, T163D, F165E, F165W, Q167E, N170C, N170D, G177D, R179D, R179E, e M180L, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em ainda outras modalidades 20 adicionais, a variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1N, F1P, D2I, D2M, D2T, D2V, A8R, A8T, T10D, T10E, T10F, T10M,T10Q, T10Y, G12H, G12P, G12Y, G13D,G13E, R14H, R14L, R14M, S15F, S15G, S15N, R16I, R16Q, N24G, N24T, I28V, R35K, T36V, A41S, A41T, N42D, T44C, F47V, G49F, 25 G49K,G49S, S51A, S51C, S51L, S15M, G54E, N55A, D56F, R61K, R61Q, A64C, G65D, V66N, A70G, A70M, A70P, R79T, R79V, Q81A, Q81G, Q81P, A83E, A83D, A83H, T86E, A87C, A87E, A88F, S92T, S99G, S99H, S99K, S99Q, T100K, T100Q,W103L, T109K, N112D, N112E, S113A, S113D, S114E, T115C, T116G, T116N, P118A, P118C, P118G, P118W, E119A, 30 E119L, E119N, E119Q, E119S, T121A, T121D, R123A, R123G, R123I, R123K, R123M, A132S, L125M, R127A, R127C, T128A, S140P, L141M, T151V, S155E, S155F, S155T, S155V, N157D, R159A, R159C, R159K, R159M, R159N, T160D, T163C, F165H, N170L, Ι172Α, Q174C, Q174S, Q174T, Α175Τ, G177E, R179C, R179F, R179I, R179L, R179M, R179N, R179S, R179T, R179V, R179W, R179Y, S187E, e S188E, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma 5 protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

Em algumas outras modalidades, a presente invenção provê uma variante de serina protease, em que a seqüência de aminoácidos da protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre 10 V3R, I4D, I4G, I4P, Y9E, Y9P, T10F, T10W, T10Y, G12D, S18E, A22C, A22S, A22T, N24T, G26E, G26I, G26K, G26Q, G26V, G26W, F27V, F27W, I28P, I28T, T29E, A30M, A30N, A30P, A30Y, G31H, G31M, G31N, G31V, G31Y, C33E, C33L, C33M, C33N, A38D, A38G, T39R, T40D, T40H, T40N, T40P, T40Q, R43D, P43G, P43H, P43K, P43L, P43N, G45A, G45V, T46V, 15 T46Y, T46W, A48P, Y57M, Y57N, F59K, T62G, T62R, A70G, A70P, N73P, R79T, Q81A, Q81D, Q81F, Q81G, Q81H, Q81P, Q81S, A83H, G84C, G84P, P89W, G91L, A93S, R96C, R96E, R96F, S99A, T100A, C105E, C105G, C105K, C105M, C105N, C105P, C105S, C105W, T121E, R123F, R123N, R123W, R123Y, L125A, T128A, T128C, T128G, T128S, T128V, I28W, 20 T129W, S137R, S140P, Q146P, A147E, S155F, S155K, S155P, S155R, S155W, S155Y, G156I, G156L, G156P, C158G, C158H, C158M, R159K, T160I, G161I, G161L, G161V, T164G, T164L, F166S, Q167L, P168Y, Y176P, G186S, e S188A, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 25 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos de uma variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre A8G, T10C, T10L, G12A, G12H, S15C, S15N, S15Q, S15R, S15T, N24E, N24S, G25S, F27I, G31A, H32A, C33D, T36V, T39V, A41S, T46F, 30 G49A, S51V, F59W, Q71A, Q71Y, N74F, R79V, Q81C, Q81E, A83E, A83F, A83M, A83R, G84M, G84V,T86I, T86M, T86S, A87E, A87S, P89A, V90A, V90M, S92T, A93D, S99G, T100Q, T101S, W103N, C105A, C105L, C105T, C105Y, Τ107Α, T107F, T107L, T107Q,T107S, T110D, A110G, L111K, V115I, V115L, T116Q, Y117K, Y117Q, Y117R, Y117V, P118T, E119L, T121A, T121D, R123I, R123K, R123L, R123Q, R123T, L125M, R127F, R127K, R127Q, T129Y, V130T, A132C, P134W, L141C, A143H, G144A, 5 V150N, T151C, G153K, G153V, G154L, G154R, S155T, R159Q, R159T, R159V, T160E, T160Q, G161K, G162P, T163I, F166A, F166C, P168I, N170D, N170E, G177N, R179K, M180L, T182L, T183A, T183I, T183P, S185R, G186P, S188C, S188E, S188G, S188M, S188T, S188V, e P189S, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições 10 em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

A presente invenção ainda provê uma variante de serina protease, em que a seqüência de aminoácidos da protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1T, T10N, R14D, 15 R14G, R14I, R14L, R14N, R14Q, R14T, N24A, N24E, N24H, N24L, N24Q, N24T, N24V, R35A, R35E, R35F, R35L, R35Q, R35T, T36G, T36I, T36N, T36S, A38D, A38F, A38H, A38N, A38R, G49A, G49S, S51D, G54D, G54E, N55E, N55F, A64I, G65D, G65P, G65Q, G65S, G65T, G65V, N67D, L69S, N73T, N74G, Y75F, Y75G, S76D, S76E, S76I, S76L, S76N, S76T, S76V, 20 S76Y, G77T, G78A, G78D, R79A, R79D, R79E, R79G, R79L, R79M, R79P, R79S, R79T, R79V, Q81E, A83E, H85Q, H85T, T86D, T86E, V90I, V90P, V90S, V90T, S99N, S99V, T107E, T107H, T107S, T107V, T109E, N112D, N112E, N112L, N112Q, N112V, T116E, T116Q, T121E, R123A, R123D, R123E, R123F, R123H, R123I, R123L, R123N, R123Q, R127A, R127Q, 25 T129S, L142V, N145E, R159D, R159E, R159F, R159N, R159Q, N170D, N170Y, I172T, R179A, R179D, R179E, R179I, R179K, R179M, R179N, R179T, R179V, R179Y, 1181L, e G186N, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID 30 N0 8. Em algumas modalidades alternativas, a seqüência de aminoácidos da protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1D, V3L, N7L, A8E, A8G, T10D, T10E, G12D, G13S, R14A, R14K, R14S, R14M, S15W, I19V, Ν24Μ, R35H, R35M, R35S, R35W, R35Y, T36D, Τ36Η, A38L, A38S, Α38Τ, Α38Υ, T40V, A41D, Α41Ν, Α48Ε, G49F, G49H, S51H, S51Q, S51T, S51V, R61E, R61H, R61M, R61S, R61T, G63D, A64F, Α64Η, A64L, Α64Μ, Α64Ν, Α64Ρ, A64Q, A64S, Α64Τ, A64V, A64W, Α64Υ, G65L, 5 G65Y, Ν67Ε, N67G, Ν67Η, N67S, Ν67Τ, A70D, A70G, Α70Η, Q71D, Q71G, Q71H, Q71S, V72I, S76Q, S76W, G77S, Q81D, Q81H, Q81V, H85L, Η85Μ, V90N, S92A, S92G, A93D, Α93Ε, A93S, S99D, S99T, Tl01S1 W103M, Τ107Α, Τ107Ι, Τ107Μ, Τ107Ν, Τ109Α, T109G, Τ109Ι, A110S, Ν112Υ, S113T, S114A, V115A, T116F, T121D, Ν121Ι, R123G, R123S, R123T, 10 R123V, R123Y, R127H, R127K, R127E, R127S, R127Y, N145D, Ν145Τ, R159A, R159C, R159K, R159L,R159S, R159Y, T160E, T163D, N170L, R179L, T182V, T183E, T1831, e S185N, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID 15 N0 8. Em algumas modalidades ainda adicionais, a variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre D2Q, V3L, N7L, I11A,I11Q, R14I, R14M, R16L, R16Q, N24A, N24E, N24H, N24M, N24Q, N24T, N24V, R35F, R35L, T36D, T36G, T36H, T36I, T36L, T36N, T36P, T36S, T36W, T36Y, A38L, A38R, A38S, A48Q, G49A, G54D, 20 G54I, G54Q, G54N, R61V, A64F, A64H, A64Y, G65L, G65P, G65Q, G65S, G65T, G65Y, V66H, N67A, N67G, N67L, N67S, N67V, N67Y, L69H, L69S, Q71I, N73T, N74G, Y75F, Y75G, Y75I, S76A, S76D, S76E, S76I, S76L, S76N, S76T, S76V, S76W, S76Y, G77T, G78D, R79G, R79P, Q81P, H85F, H85K, H85L, H85Q, H85R, P89D, S92A, A93T, A93S, S99A, S99D, S99N, 25 S99T, S99W, T109E, N112E, S113A, S114G, T116F, T121D, R123F, R123I, R123L, R127A, R127F, R127G, R127H, R127K, R127L, R127Q, R127S, R127T, R127Y, A132V, P134E, A143N, N157D, R159D, R159E, R159F, R159H, R159K, R159N, R159Y, G161K, N170Y, R179V, I181Q, D184F, D184H, G186E, G186I, G186V, e S187P, em que as substituições são feitas 30 em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades adicionais, a seqüência de aminoácidos de uma variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1T, A8D, A8G, T10E, T10L, T10Q, 111L, I11S, I11T, G12D, G12Y, R14E, R14L, R14N, R14P, S15E, R16A, 5 R16G, R16I, R16N, N24L, N24S.V31F, R35A, A38D, A38F, A38N, A38V, A38Y, T40V, A41N, N42H, G49F, G49H, G49S, S51Q, S51T, G54A, G54L, G54M, N55F, R61H, R61K, R61M, R61S, R61T, A64N, A64S, A64T, A64V, A64W, G65R, G65V, V66D, N67F, N67K, N67M, N67Q, N67T, L69W, A70G, A70P, Q71D, Q71F, Q71H, Q71L, Q71T, G77N, G77S, G78A, G78N, R79D, 10 V80H, V80L, H85T, H85Y, T86N, A88F, P89N, P89V.V90I, V90P, V90T S92G, A93D, A93E, S99G, L111D, L111E, N112D, N112G, N112L, N112Q, S113G, T121E, R123E, R123K, R123Q, L125V, P134G, S140A, L142V, A143S, N145D, V150L, R159A, R159C, R159L, R159V, T160E, G161E, T163D, T1631, N170D, N170L, R179D, R179E, R179K, R179N, R179T, 15 1181 Η, T183I, D184R, D184L, D184Q, D184T, S185W, S185I, G186L, S187E, S187Q, e S188Q, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em ainda algumas outras modalidades, a seqüência de aminoácidos de uma 20 variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre A8R, A8S, A8T, A8V, R14E, R14L, R14M, R16Q, N24A, N24E, N24Q, N24T, R35F, R35L, T36D, T36G, T36l, T36N, T36P, T36S, A38D, A38F, A38L, A38R, A38S, S51A, S51D, G54D, G54I, N55E, N55F, N55S, R61M, R61T,G63V, A64H, A64N, A64S, G65Q, G65P, G65R,G65S, 25 G65T, G65Y, V66D, N67D, S76E, N67F, N67G, N67L, N67M, N67S, N67T, N67V, N67Y, L69H, L69S, L69V, L69W, N73T, N74G, Y75F, Y75G, S76C, S76D, S76I, S76L, S76N, S76W, S76Y, S76V, G77T, G78D, R79C, R79D, R79E, R79G, R79P, Q81V, A83N, T85A, H85Q, T86F, T86I, T86L, V90I, V90N, V90P, V90S, V90T, A93D, A93E, T107M, T107N, T107S, T109A, 30 T109E, T109I, N112E, T121D, T121E, R123D, R123E, R123F, R123I, I126L, R127A, R127H, R127K, R127L, R127Q, R127S, R127Y, P134A, P134E, L142V, A143N, N145E, N145S, R150Y, R159C, R159D, R159E, R159F, R159K, R159Q, G161E, T163D, Ν170Υ, I172V, G177M, R179A, R179D, R179E, R179I, R179K, R179L, R179M, R179N, R179T, R179V, R179Y, M180D, T182V, Τ183Ι, G186E, G186V, e S187P, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de 5 Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades ainda adicionais, a seqüência de aminoácidos de uma variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre V3L, I4M, A8E, A8H, A8L, A8N, A8P, 111T, R14I, R14Q, R16L, N24H, N24L, N24M, N24V, R35A, 10 R35E, T36V, T36Y, A38H, A38I, A38N, T40V, A41N, G49A, G49L, S51F, S51Q, G54A, G54E, G54M, G54Q, N55Q, N55V, R61V, T62I, G63D, G63L, G63P, G63Q, A64F, A64I, A64L, A64M, A64Q, A64R, A64T, A64V, A64W, G65A, G65D, V66E, N67A, N67C, N67Q, N67R, L69Q, A70G, A70P, A70S, Q71D, Q71M, S76A, S76Q, S76T, G77N, G77Q, R79L, Q81E, Q81H, Q81I, 15 A83D, A83I, H85L, H85R, T86E, T86M, A88F, V90L, S92C, S92G, A93Q, R96K, T101S, W103M, W103Y, T107A, T107E, T107H, T107Q, T107V, T109G, T109H, T109L, T109N, A110S, A110T, N112D, S114G, T116F, T121L, R123A, R123H, R123K, R123L, R123P, R123Q, L125V, R127F, R127T, T129G, T129S, A132V, P134D, P134G, S140A, N145G, N145P, 20 N145Q, N145T, Q146D, T151V, R159A, R159H, R159L, R159N, R159V, S161K, F166Y, N170C, N170D, P171M, A175T, A175V, Y176L, R179W, T182W, T183E, T183K, T183L, T183Q, G186I, G186L, G186P, G186T, S187E, S187T, e S188E, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 25 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades adicionais, a seqüência de aminoácidos de uma variante de serina protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre: T10A, T10G, T10L, 111A, 111S, 111T, G12I, R14G, R14M, S15E, S15F, S15G, R16K, R16N, A22V, N24A, N24E, N24L, N24Q, 30 N24T, N24V, G34A, T36G, T36I, T36N, T36S, A38F, A38T, G49A, G49F, S51A, G65V, L69H, L69S, Q71I, N73T, N74G, S76D, S76L, S76V, S76W, S76Y, G77T, V80A, V90I, V90P, S99N, S99V, T107K, T107R, N112S, S118A, E119R, R127F, P134D, Ρ134Ε, Ρ134Η, P134L, P134R, P134V, S140A, L142V, V150L, 159F, R159K, Τ163Ι, F166Y, Q167N, Ν170Υ, R179V, T182V, G186E, G186S, e G186V, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 5 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

A presente invenção também provê variantes de serina protease que tem estabilidade melhorada, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades, as 10 variantes tem melhorada termoestabilidade como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades particularmente preferidas, as variantes compreendem substituições múltiplas selecionadas dentre T121E/R123F/R159E, R79T/R127Q/R179Q, 15 R16Q/R79T/R127Q, R16Q/R79T/R123L/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R123L, R16Q/R79T, R16Q/R123L/R159Q, R14QfT121E, R14L/R79T, R123L/R159Q, R123L/R127Q/R159Q, G12D/S15E/R35D/R123F/R159E, G12D/S15E/R159E, G12D/S15E, G12D/R35H/T121E/R123Q,

G12D/R35H/R123Q, G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H,

G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E, G12D/R159E, G12D/R14Q/S15E/R35D, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14Q/R159E, G12D/R14E, G12D/R127Q/R159E, G12D/R123E/R159E, e R35E/R123L/R127Q/R175Q, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de 25 aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades alternativas, as variantes tem melhorada estabilidade LAS como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades particularmente preferidas, as variantes compreendem 30 substituições múltiplas selecionadas dentre

T121E/R123F/R159E, S15E/T121E/R123Q, S15E/R35H/R159E,

S15E/R35E/R159E, S15E/R35E/R127Q/R159E, S15E/R35E, S15E/R35D/T121E/R123Q, S15E/R35D/R123Q, S15E/R35D/R123F/R159E, S15E/R35D, S15E/R159E, S15E/R127Q, S15E/R123Q, S15E/R123E, R79T/R127Q/R179Q, R35H/R159E, R35H/R127Q/R159E, R35H/R123D/R159E, R35F/R61S/R159Q, R35F/R159Q,

R35E/T121E/R123E, R35E/R159E, R35E/R127Q, R35D/R159E, R35D/R127Q/R159E, R35D/R127Q, R35D/R123Q/R159E,

R16Q/R79T/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q,

R16Q/R79T/R123L/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R123L/R159Q, R16Q/R79T/R123L, R16Q/R79T, R16Q/R61S/R159Q/R179Q,

R16Q/R61S/R123L/R159Q, R16Q/R35F/R61S/R159Q, R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R35F/R123L/R159Q, R16Q/R35F, R16Q/R159Q/R179Q, R16Q/R159Q, R16Q/R127Q/R179Q, R16Q/R127Q/R159Q, R16Q/R123L/R159Q, R14Q/T121E, R14Q/R35EAT121E,

R14Q/R35E/R159E, R14Q/R35E, R14Q/R35D/R127Q,

R14Q/R35D/R123E/R159E, R14Q/R35D/R123D/R159E, R14Q/R35D, R14Q/R123Q, R14L/R79T/R127Q/R159Q, R14L/R79T, R14L/R61S/R79T/R123L, R14L/R61S/R123L, R14L/R35F/R79T/R123L/R159Q, R14L/R35F/R61S,

R14L/R127Q/R159Q/R179Q, R14L/R123L/R159Q,

R14I/R35E/T121E/R159E, R14I/R35E/R127Q, R14I/R35E/R123E, R14I/R35D/R159E, R14I/R35D/R127Q/R159E, R14E/S15E/R35H, R14E/R35H/R127Q, R14D/S15E/R35E/R159E, R14D/R35H/R123Q/R159E, R127Q/R159E, R127Q/R159Q, R123Q/R159E, R123Q/R127Q/R159E, R123L/R159Q, R123L/R127Q/R159Q, R123F/R159E,

R123E/R127Q/R159E, R123E/R127Q, G12D/S15E/R35H/R159E,

G12D/S15E/R35H/R123F/R127Q/R159E, G12D/S15E/R35E/R159E,

G12D/S 15E/R35D/R 127Q, G12D/S15E/R35D/R123F/R159E,

G12D/S15E/R35D/R123E, G12D/S15E/R35D, G12D/S15E/R159E, G12D/S15E, G12D/R35H/T121E/R123Q, G12D/R35H/R159E,

G12D/R35H/R123Q/R159E, G12D/R35H/R123Q,

G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H, G12D/R35E/R159E, G12D/R35E/R123Q/R159E, G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E, G12D/R35D/R159E, G12D/R35D/R127Q, G12D/R35D/R123Q/R159E, G12D/R35D, G12D/R159E, G12D/R14Q/S15E/R35D, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14Q/R35E/R127Q/R159E,

G12D/R14Q/R35D/R123H, G12D/R14Q/R159E, G12D/R14I/R35H,

G12D/R14E, G12D/R14D/R35H/R123D/R127Q, G12D/R127Q/R159E, G12D/R123E/R159E, R127A/R159K,

R14I/G65Q, R14I/G65Q/N67L/R159K,

R14I/G65Q/N67L/Y75G/R127A/R159K, R14I/G65Q/R159K, R14I/G65Q/S76V/R127A/R159K, R14I/R127A, R14I/R127A/R159K,

R14I/R159K, R14I/R35F, R14I/R35F/G65Q,

R14I/R35F/G65Q/R127A/R159K, R14I/R35F/N67L/R127A/R159K, R14I/R35F/R127A/R159K, R14I/R35F/R159K, R14I/S76V, R14I/T36S/G65Q/R127A/R159K, R35F/R127A/R159K, R35F/S76A/R127A, 024A/G049A/A093H/S099N/R127K/A143N/R159K/I181Q,

N024A/S076A/A093H/S099G/R127K/R159K, N024A/S076T/A093S/S099G/R127K/R159K, N024E/G049A/A093G/S099G/R127K/A143N/R159K/1181T1 N024E/G049A/A093H//R127K/A143N/R159K/1181Q1 N024E/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/1181ΤΛ/090Ι,

N024E/G049A/A093S/S099D/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024H/G049A/A093T/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024H/S076A/A093G/S099G/R127K/R159K, N024H/S076A/A093H/S099G/R127K/R159K, N024H/S076A/A093S/S099A/R127K/R159K/G054H/L069H,

N024H/S076A/A093T/S099G/R127K/R159K, N024H/S076N/A093Q/S099W/R127K/R159K, N024H/S076V/A093Q/S099G/R127K/R159K, N024L/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Q1 N024L/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159 K/l 181Q1 30 N024L/S076V/A093H/S099G/R127K,

N024L/S076V/A093S/S099A/R127K/R159K, N024M/G049A/A093G/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024M/G049A/A093H/S099D/R127Κ/Α143N/R159Κ/1181Q, N024M/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024M/G049A/A093S/S099W/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024Q/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T,

N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181T, N024Q/S076A/A093H/S099A/R127K/R159K/T039N, N024Q/S076A/A093H/S099W/R127K/R159K,

N024Q/S076I/A093T/S099G/R159K, N024Q/S076T/A093S/R127K/R159K, N024S/S076A/A093G/S099G/R127K/R159K/G054A, N024S/S076A/A093H/S099T/R127K/R159K, N024S/S076A/A093S/S099W/R127K/R159K, N024S/S076A/A093T/S099W/R127K,

N024S/S076T/A093Q/S099W/R127K/R159K,

N024S/S076Y/A093T/S099A/R127K/R159K,

N024T/G049A/A093G/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024T/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024T/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T, N024T/G049A/A093H/S099D/R127K/A143N/R159K/1181Q,

N024T/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181T, N024T/G049A/A093T/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T, N024T/S076N/A093Q/S099T/R127K/R159K,

N024T/S076T/A093T/S099N/R127K/R159K, N024V/S076A/R127K/R159K, N024V/S076V/A093Q/S099G/R127K/R159K,

N024W/A093G/S099W/R127K/R159K,

N024W/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024W/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181K, N024W/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024W/S076A/A093T/S099A/R127K/R159K,

N024W/S076I/A093Q/S099G/R127K/R159K, N024W/S076N/A093T/S099G/R159K, N024W/S076T/A093H/S099A/R127K/R159K, N024W/S076T/A093H/S099W/R127K/R159K, N024W/S076V/A093H/S099A/R127K/R159Κ,

N024W/S099W/R127K/R159K, N24A/G54E/S76D/A93G/R127K/R159K, N24E/A93G/R127K/R159K, N24E/G54L/S76E/A93G/R127K/R159K,

N24E/G54Q/A93S/R127K/R159K, N24E/S76D/A93T/R127K/R159K, N24H/A93H/R127K/R159Κ, N24H/G54E/A93G/R127K/R159Κ, N24H/S76D/A93H/R127K/R159Κ, N24L/A93G/R127K/R159K, N24L/G54E/A93G/R127K/R159Κ, N24L/G54L/A93G/R127K/R159Κ, N24L/G54Q/S76A/A93H/R127K/R159Κ, N24L/S76T/A93G/R127K/R159K, 10 N24L/S76T/A93H/R127K/R159K, N24M/A93G/R127K/R159K, N24M/A93H/R127K/R159Κ, N24M/A93S/R127K/R159Κ, N24M/A93T/R127K/R159K, N24M/G54E/A93H/R127K/R159K, N24M/G54E/S76N/A93S/R127K/R159Κ,

N24M/G54I/A93H/R127K/R159K/S187Ι, N24Q/A93G/R127K/R159K,

N24Q/G54D/A93H/R127K/R159K, N24Q/G54I/A93G/R127K/R159K,

N24Q/G54I/S76E/A93H/R127K/R159Κ, N24Q/G54Q/A93G/R127K/R159K, N24Q/G54Q/S76T/A93H/R127K/R159K, N24Q/S76A/A93G/R127K/R159K, N24T/G54D/S76V/A93G/R127K/R159Κ,

N24T/G54E/S76V/A93H/R127K/R159Κ, N24T/G54I/A93G/R127K/R159Κ, 20 N24T/G54N/A93H/R127K/R159K, N24T/G54Q/S76N/A93G/R127K/R159K, N24T/G54Q/S76V/R127K/R159Κ, N24T/S76I/R127K/R159Κ, N24T/S76L/A93G/R127K/R159Κ, N24W/A93G/R127K/R159Κ, N24W/G54D/A93H/R127K/R159Κ, N24W/G54I/S76A/A93H/R127K/R159Κ, N24W/S76A/A93H/R127K/R159Κ, N24W/S76E/A93G/R127K/R159Κ,

R014I/S076A/A093G/R127K/R159K/I181T,

R014I/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181K1 R014I/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181Q, R014I/S076A/A093H/R127K/R159K/I181T,

R014I/S076D/A093H/R127K/R159K/1181Q,

R014I/S076D/A093S/R127K/R159K/I181T,

R014I/S076E/A093S/R127K/R159K/1181Q, R014I/S076E/A093T/R127K/R159K/I181K, R014I/S076I/A093S/R127K/R159Κ/1181Q,

R014I/S076N/A093H/R127K/R159K/I181Q,

R014I/S076T/A093G/R127K/R159K/I181Q,

R014K/S076A/A093G/R127K/R159K/1181K1 R014K/S076E/A093H/R127K/R159K/1181K,

R014K/S076T/A093H/R127K/R159K/1181Q, R014L/S076A/A093H/R127K/R159K,

R014L/S076A/A093H/R127K/R159K/1181Q,

R014L/S076D/A093H/R127K/R159K/1181T,

R014L/S076E/A093H/R127K/R159K/I181K,

R014M/S076A/A093G/R127K/R159K/1181K,

R014M/S076A/A093G/R127K/R159K/1181T, R014M/S076A/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076A/A093S/R127K/R159K/I181K,

R014M/S076A/A093S/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076A/A093T/R127K/R159K/1181Q, R014M/S076D/A093S/R127K/R159K/I181T,

R014M/S076E/A093G/R127K/R159K/1181T1 R014M/S076E/A093H/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076E/A093S/R127K/R159K/1181T1 R014M/S076N/A093G/R127K/R159K/1181K, R014M/S076N/A093G/R127K/R159K/I181T,

R014M/S076N/A093H/R127K/R159K/1181Q,

R014M/S076N/A093H/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076N/A093S/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076N/A093T/R127K/R159K/1181T1 R014M/S076T/A093H/R127K/R159K/1181K1 R014M/S076V/A093G/R127K/R159K/1181Q1

R014M/S076V/A093H/R127K/R159K/1181Q1 G54E/R14L, G54L/R127S, N24D/G54F/R127C, N24E/R127S, N24E/R159C, N24G/G54I/R127S, N24H/R159Y/T46I, N24I/R127V/R14V, N24T/R127Q/R179F, R127A/R159V/R179F, R127C/R14W, R127S/R159N/R123L, R14A/N24F/R159L, R14A/R127L, R14A/R127Y/R159W, R14A/R159W, R14C/S114F/R159G, R14F/R127L/R159F, R14F/R127Q/R159W,

R14F/R127S/R 159V, R14F/R127V/R159F, R14G/N24L/R159G, R14G/N24S/R127C, R14G/R127C/G63E, R14G/R127G, R14G/R127P,

R14L/N24S/R159F, R14L/N24V/R127S/R159I, R14L/R123L,

R14L/R127C/R159G, R14L/R127S, R14L/R127S/R159G, R14L/R127V, R14L/R127V/R159F, R14L/R127W/R123Y, R14L/R127Y, R14L/R127Y/R159F, R14L/R159G, R14L/R159L, R14L/R159S,

R14L/R159V, R14L/R159W, R14M/N24L/R159S/R123V, R14M/R159F,

R14Q/R123F, R14S/N24E/R127W, R14S/N24L/R159G,

R14S/R127L/R159F, R14S/R127V, R14T/R14P/R159F, R14T/N24A, R14T/N24T/R127Q, R14T/N24T/R127Y/R159W, R14T/R127Y, R14V/N24A/R127I/R159A, R14V/N24D/R127C, R14V/N24G/P189S, R14V/N24S, R14V/N24Y/R127S/R159G, R14V/R127A,

R14V/R127C/R 159S, R14V/R127M/R159V, R14V/R127S/R159G,

R14V/R 127T/R159Y, R14V/R127V, R14V/R159F, R14V/R159V, R14V/R159W, R14W/N24T/R123E, R14W/R123L, R14W/R123V,

R14W/R127Q/R 159W, R14W/R159V, R159V/G49D, G012D/R035E/G065E, G012D/R035E/G065E, G012D/R035E/Q081P, G012D/R035E/R016S/A064T, G012D/R035E/R159W, G012D/R035E/R179I, G012D/R035E/S092T/I181V, R14I/N24A/A64K/R123F/R159E/D184T, R14I/A64K/R123F/R159F/D184T, R14I/A64K/R123F/R159E/D184T, R14I/N24Q/R35E/A64K/R123F/D184T,

R14I/N24Q/A64K/N67S/R123F/R159F/D184T, R14I/N24A/R35E/A64K/N67S/R123F/R159E/D184T,

R14I/N24A/R35E/A64K/N67S/G78D/R123F/D184T,

R14I/N24A/R35D/A64K/G78D/R123F/R127K/R159E/D184T,

R14I/N24A/R35D/A64K/R123F/R127K/R159F/D184T,

R14I/N24T/R35D/A64K/G78D/R123F/R127Q/R159F/D184T,

R141/A64K/R 123F/D 184T, R14I/N24A/A64K/R123F/R159N/D184T,

R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184T,

R14I/N24E/R35E/A64K/G78D/R123F/R127Q/R159F/D184T,

R14I/N24E/A64K/R123F/R127K/R159K/D184T, R14I/N24A/A64K/R123F/D184Τ, R14I/A64K/R123F/R127K/R159F/D184T, R14I/A64K/R123F/R159E/D184T, R14I/A64K/R123F/R159N/D184T,

R14I/A64K/R123F/R159K/D184T, R14I/A64K/R123F/R127Y/R159E/D184T, R14I/N24A/R35E/A64K/N67A/G78D/R123F/D184T,

R141/A64 K/R 123 F/R 127 Y/R 159 K/D 184T,

R14I/N24Q/A64K/R123F/R127Q/R159K/D184T,

R14I/A64K/R123F/R159K/D184T,

R14I/N24Q/A64K/G78D/R123F/R127Q/R159N/D184T, R14I/N24E/A64K/N67L/G78D/R123F/R159K/D184T,

R14I/N24A/R35E/A64K/G78D/R123F/R127K/R159E/D184T, R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184T, R14I/N24A/R35D/A64K/N67A/R123F/R159F/D184T,

R14I/N24E/R35E/G54D/A64K/N67L/G78D/R123F/R127K/D184T, R14I/A64K/G78D/R123F/R127Q/R159N/D184T,

R14I/N24A/R35E/A64K/G78D/R123F/R159N/D184T,

R141/A64 K/R 123F/R127K/R159E/D184T,

R14I/N24A/R35E/A64K/N67S/G78D/R123F/R127K/R159F/D184T,

R14I/A64K/G78D/R123F/R159E/D184T, R14I/N24E/R35D/A64K/N67A/G78D/R123F/R159K/D184T,

N24T/R35D/G78D/R159K, N24T/R35E/N67A/G78D/R127Q, N24Q/R35E, R127K/R159N, R35D/R159E, R35E/G54D/N67S/G78D/R159K, N24Q/G54D/G78D/R159N, R127K/R159E, R127Q/R159K, N24E/R35E/G54D/N67S/R127K/R159N, R35D/G78D/R159K, N67S/R159E, G54D/R127K/R159K, G78D/R127K/R159K, G78D/R127K/R159E,

N24E/R35D/G78D/R127K/R159N, R35D/G78D/R127K/R159N, N24A/R35E/G78D/R159N, N24Q/R35D/N67S/R127K/R159E, N24T/R35D/G78D/R159K, N67S/G78D/R127K/R159K,

N24Q/R35D/R127K/R159K, N24E/G54D/G78D/R159K, R35D/R159K, R35E/R159K, R127K/R159K, R35E/N67S/G78D/R127Q, N24E/R35D/G78D, R35D/G78D/R127K/R159E, N24E/R35E/G54D/N67S/G78D/R127K/R159K, N24T/N67S/R159E, N24D/R35D/G78D/R159F,

N24Q/R35D/N67S/G78D/R127K/R159F, R35D/G78D/R127Q/R159K, G78D/R159F, N24A/N67S/R159K, G78D/R127Q/R159K, N24T/G54D/N67S/G78D/R127Y/R159E, R14I/A63K/G78D/R123F/D184T, R14I/A63K/R123F/R159E/D184T, R14I/A63K/R123F/R159F/D184T, R14I/A63K/R123F/R159K/D184T, R14I/A63K/R123F/R159N/D184T,

R14I/A63K/R123K/D184T, R14I/A63K/R123Q/D184T,

R14I/A63K/R123Y/D184T, R14I/A64K/G78D/T86K/T116E/R123F, R14I/A64K/T86K/T116E/R123F/R159E,

R14I/A64K/T86K/T116E/R123F/R159K, R14I/A64K/T86K/T116E/R123K, R14I/A64K/T86K/T116E/R123Q, R14I/A64K/T86K/T116E/R123Y,

R14I/G54D/A63K/R123F/D184T, R14l/G54D/A64Kn_86Kn’116E/R123F, R14I/G54D/S76N/A93H/R127K/R159K/I181Q,

R14I/G54D/S76V/A93S/R127K/R159K/1181K,

R14I/N24A/A63K/R123F/D184T, R14I/N24A/A64K/T86K/T116E/R123F,

R14I/N24E/A63K/R123F/D184T, R14I/N24E/A64K/T86K/T116E/R123F,

R14I/N24Q/A63K/R123F/D184T, R14I/N24Q/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24T/A63K/R123F/D184T, R14I/N24T/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24TS76N/A93H/R127K/R159K/I181Q, R14I/N24TS76V/A93S/R127K/R159K/I181K, R14I/N67AS76N/A93H/R127K/R159K/I181Q,

R14I/N67LS76N/A93H/R127K/R159K/I181Q, R14I/N67SS76N/A93H/R127K/R159K/I181Q,

R14I/R35D/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/R35D/S76N/A93H/R127K/R159K/I181Q,

R14I/R35E/A63K/R123F/D184T, R14I/R35E/A64K/T86K/T116E/R123F,

R14I/R35E/S76N/A93H/R127K/R159K/I181Q,

R14I/R35E/S76V/A93S/R127K/R159K/1181K,

R14I/R35K/A63K/R123F/D184T, R14I/S76N/A93H/R127K/R159E/I181Q, R14I/S76N/A93H/R127K/R159F/I181Q, R14I/S76N/A93H/R127K/R159N/I181Q,

R14I/S76N/A93H/R127Q/R159K/I181Q, R14I/S76N/A93H/R127Y/R159K/I181Q,

R14I/S76N/G78D/A93H/R127K/R159K/1181Q, R141/S76V/A93S/R127K/R159F/1181K, R14I/S76V/A93S/R127K/R159N/I181K,

R141/S76V/A93S/R127Q/R159Κ/1181Κ, R14I/S76V/A93S/R127Y/R159K/I181K,

R14M/G54D/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K,

R14M/N24A/S76N/A93G/R127K/R159Κ/1181 Κ, R14M/N24E/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K, R14M/N24Q/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K, R14M/N24T/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K,

R14M/N67S/S76N/A93G/R127K/R159Κ/1181 Κ,

R14M/R35D/S76N/A93G/R127K/R159Κ/1181 Κ, R14M/R35E/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K,

R14M/S76N/A93G/R127K/R159Ε/1181 Κ, R14M/S76N/A93G/R127K/R159F/I181 Κ,

R14M/S76N/A93G/R127K/R159Ν/1181 Κ, R14M/S76N/A93G/R127Q/R159K/I181K, R14M/S76N/A93G/R127Y/R159K/I181K, e

R14M/S76N/G78D/A93G/R127K/R159K/I181K, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

A presente invenção também provê variantes de serina protease que tem atividade melhorada, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de 25 aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas, as variantes tem melhorada atividade caseinolítica, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades particularmente preferidas, as variantes 30 compreendem substituições múltiplas selecionadas dentre R14L/R79T, G12D/R35H/R159E, G12D/R35H/R123Q,

G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H, G12D/R35E/R159E, G12D/R35E/R123Q/R159E, G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E, G12D/R35D/R159E, G12D/R35D/R123Q/R159E, G12D/R35D,

G12D/R159E, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14I/R35H,

024E/G049A/A093H/R127K/A143N/R159K/1181Q,

N24M/S76V/A93H/R127K/R159K,

R14I/N24E/R35D/A64K/N67A/G78D/R123F/R159K/D184T R127A/R159K, R14I/G65Q, e R14I/G65Q/R159K R141/S76V, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos 10 especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades alternativas, as variantes tem melhorada atividade queratinolítica, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades particularmente preferidas, as variantes compreendem 15 substituições múltiplas selecionadas dentre

N024E/G049A/A093H/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024E/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/1181T/V090I, N024E/G049A/A093S/S099D/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Q,

N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T, N024Q/G049A/A093S/S099N/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024T/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T, N024W/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N24A/G54E/S76D/A93G/R127K/R159K, N24E/A93G/R127K/R159K,

N24E/G54L/S76E/A93G/R127K/R159K, N24E/G54Q/A93S/R127K/R159K, N24E/S76D/A93T/R127K/R159K, N24M/G54E/A93H/R127K/R159K, N24M/G54E/S76N/A93S/R127K/R159K, N24Q/A93G/R127K/R159K, N24Q/G54D/S76L/A93G/R127K/R159K,

N24Q/G54I/S76E/A93H/R127K/R159K,

N24T/G54D/S76V/A93G/R127K/R159K,

N24T/G54E/S76V/A93H/R127K/R159K, N24W/G54D/A93H/R127K/R159K, N24W/S76E/A93G/R127K/R159K, R014I/S076A/A093G/R127K/R159Κ/1181T, R014I/S076A/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014I/S076D/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014I/S076D/A093H/R127K/R159Κ/1181Τ,

5 R014I/S076D/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014I/S076E/A093S/R127K/R159Κ/1181Q1 R014I/S076E/A093T/R127K/R159Κ/1181K1 R0141/S0761/A093S/R127K/R159Κ/1181Q, R014I/S076N/A093H/R127K/R159K/I181Q,

R014I/S076T/A093G/R127K/R159Κ/1181Q1 R014I/S076V/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014K/S076A/A093S/R127K/R159K/I181T, R014K/S076E/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014K/S076E/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ,

R014K/S076T/A093H/R127K/R159Κ/1181Q1 R014L/S076A/A093H/R127K/R159K, R014L/S076A/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014L/S076D/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014L/S076E/A093H/R127K/R159Κ/1181K1 20 R014M/S076A/A093G/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076A/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076A/A093S/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076A/A093S/R127K/R159K/I181T, R014M/S076A/A093T/R127K/R159K/I181Q, 25 R014M/S076D/A093S/R127K/R159Κ/Ι181Τ, R014M/S076E/A093G/R127K/R159K/I181T, R014M/S076E/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076E/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076N/A093G/R127K/R159Κ/1181 Κ, 30 R014M/S076N/A093G/R127K/R159K/I181T, R014M/S076N/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076N/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076V/A093G/R127K/R159Κ/1181Q, R14I/N24Q/A64K/G78D/R123F/R159K/D184T, R14I/N24A/A64K/N67S/G78D/R123F/R159K/D184T, R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184Τ,

R14I/N24E/A64K/R123F/R127K/R159K/D184Τ,

R14I/N24Q/A64K/R123F/R127Q/R159K/D184Τ, R14I/N24Q/A64K/G78D/R123F/R127Q/R159N/D184T, R14I/N24E/A64K/N67L/G78D/R123F/R159K/D184T, R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184Τ, R127Q/R159K,

G78D/R127K/R159Κ,

N67S/G78D/R127K/R159K, R35D/R159K, G78D/R127Q/R159K, N24A/N67A/R159Κ, T36S/R127Q/R159E, S15E/T121E/R123Q, S15E/R35H/R159E, S15E/R35E, S15E/R159E, S15E/R123Q, S15E/R123E, R79T/R127Q/R179Q, R35H/R159E, R35H/R127Q/R159E,

R35F/R61S/R159Q, R35F/R159Q, R35E/R159Ε, R35E/R127Q, R35D/R159E, R35D/R127Q,

R16Q/R79T/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q, R16Q/R79T/R123L, R16Q/R79T, R16Q/R35F/R123L/R159Q, R16Q/R159Q/R179Q,

R16Q/R127Q/R159Q, R16Q/R123L/R159Q,

R14Q/T121E, R14Q/R35EAT121E, R14Q/R35E/R159E, R14Q/R35E,

R14Q/R35D/R 127Q, R14Q/R35D, R14L/R79T/R127Q/R159Q, R14L/R61S/R79T/R123L, R14L/R35F/R61S, R14L/R127Q/R159Q/R179Q, R14L/R123L/R159Q, R14I/R35E/R127Q, R14I/R35E/R123E,

R14I/R35D/R159E, R14E/R35H/R127Q, R127Q/R159E, R127Q/R159Q,

R123Q/R159E, R123Q/R127Q/R159E, R123L/R159Q,

R123L/R127Q/R159Q, R123F/R159E, R123E/R127Q/R159E, R123E/R127Q, G12D/S15E/R35H/R159E, G12D/S15E/R35D, G12D/S15E/R159E, G12D/S15E, G12D/R35H/T121E/R123Q,

G12D/R35H/R159E,G12D/R35H/R127Q/R159E, G12D/R35H/R123Q,

G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H, G12D/R35E/R159E, G12D/R35E/R123Q/R159E, G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E,

G12D/R35D/R 159E, G12D/R35D/R127Q, G12D/R35D, G12D/R159E, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14Q/R35D/R123H, G12D/R14Q/R159E, G12D/R14I/R35H, G12D/R14E, G12D/R127Q/R159E, G12D/R123E/R159E, R127A/R159K, R14I/G65Q, R14I/G65Q/R127A/R159K, R14I/G65Q/R159K, R14I/R127A, R14I/R127A/R159Κ, R14I/R159K, R14I/R35F,

R14I/R35F/G65Q, R14I/R35F/G65Q/R127A/R159K, R14I/R35F/R159K,

R14I/S76V, R14I/T36S/G65Q/R127A/R159K, e R35F/R127A/R159K, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

A presente invenção também provê variantes de serina protease

que tem melhorada atividade de desempenho de lavagem como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas, as variantes compreendem substituições múltiplas selecionadas dentre

N24F/R 159G,/N24F/R159L/R123V, N24I/R127S,/N24L/R159S,

N24S/R159A, N24V/R159L, N24Y/R159F, R14A/N24K/R127S,

R14A/R159W, R14L/N24Y, R14L/R159G, R14L/R159S, R14L/T109M, R14L/T39P, R14M/R159W, R14S/N24V, R14S/N24Y, R14T/N24A,

R14V/N24G/P189S, R14V/R159W, R127A/R159K, R14I/G65Q, R14I/S76V, R14I/G65Q/N67L/R159K, R14I/G65Q/R159K, R14I/S76V, R35F/R159Q, R16Q/R79T, R16Q/R35F, R16Q/R159Q, R14L/R79T, R123L/R159Q, G12D/S15E, G12D/R35H, G12D/R35D,

N024E/G049A/A093H//R127K/A143N/R159K/1181Q,

N024H/S076A/A093S/S099A/R127K/R159K/G054H/L069H, N024H/S076A/A093T/S099G/R127K/R159K,

N024L/S076V/A093S/S099A/R127K/R159K,

N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181'T, N024T/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181T,

N24E/G54Q/A93S/R127K/R159K,

N24H/A93H/R127K/R159K, N24H/G54L/S76V/A93H/R127K/R159K, N24L/G54Q/S76A/A93H/R127K/R159K, N24M/A93G/R127K/R159K, N24M/G54E/A93H/R127K/R159K, N24M/S76V/A93H/R127K/R159K, N24Q/G54Q/S76T/A93H/R127K/R159Κ, N24Q/S76A/A93G/R127K/R159Κ, N24T/G54Q/S76N/A93G/R127K/R159K, N24T/S76I/R127K/R159K, N24W/G54D/A93H/R127K/R159K, N24W/S76A/A93H/R127K/R159K,

N24W/S76T/A93G/R127K/R159Κ, N24W/S76V/A93G/R127K/R159K, N24W/S76Y/A93G/R127K/R159K, R014I/S076A/A093G/R127K/R159K/I181T, R014I/S076A/A093H/R127K/R159K/I181K, R014I/S076A/A093H/R127K/R159K/I181Q,

R014I/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ,

R014I/S076D/A093S/R127K/R159Κ/1181T1 R014I/S076E/A093T/R127K/R159Κ/Ι181 Κ,

R014I/S076N/A093H/R127K/R159Κ/1181Q,

R014I/S076V/A093H/R127K/R159Κ/1181Q,

R014I/S076V/A093S/R127K/R159K/I181K,

R014K/S076A/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014K/S076E/A093H/R127K/R159K/I181K, R014K/S076I/A093S/R127K/R159K/I181T,

R014K/S076T/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ,

R014K/S076T/A093H/R127K/R159Κ/1181T1 R014K/S076V/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ,

R014L/S076A/A093H/R127K/R159Κ,

R014L/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181Q, R014L/S076D/A093H/R127K/R159K/I181T,

R014L/S076E/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ,

R014M/S076A/A093G/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076A/A093G/R127K/R159K/I181T,

R014M/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181T1 R014M/S076A/A093S/R127K/R159Κ/1181 Κ,

R014M/S076A/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ,

R014M/S076A/A093T/R127K/R159Κ/1181Q1 R014M/S076I/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076I/A093S/R127K/R159K/I181T,

R014M/S076N/A093G/R127K/R159Κ/1181 Κ,

R014M/S076N/A093G/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076N/A093H/R127K/R159K/I181T,

R014M/S076N/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076T/A093H/R127K/R159K/I181K,

R014M/S076V/A093G/R127K/R159Κ/1181Q, R014M/S076W/A093H/R127K/R159K/I181K,

R014M/S076Y/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ,

R014M/S076Y/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ, G012D/R035E/D184N, G012D/R035E/N067K, R14I/A64K/R123F/R159F/D184T, R14I/A64K/R123F/R159F/D184T,

R14I/N24Q/A64K/G78D/R123F/R159K/D184Τ,

R14I/N24Q/A64K/N67S/R123F/R159F/D184Τ,

R14I/N24Q/A64K/N67A/R123F/R159K/D184T,

R14I/N24A/A64K/N67S/G78D/R123F/R159K/D184Τ, R14I/A64K/R123F/D184T, R14I/N24A/A64K/R123F/R159N/D184T, R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184Τ, R14I/N24Q/A64K/N67A/R123F/R159K/D184T,

R14I/N24E/A64K/R123F/R127K/R159K/D184Τ,

R141/Ν24Α/Α64K/R123F/D184Τ, R14I/A64K/R123F/R127K/R159F/D184T, R14I/A64K/R123F/R159N/D184T,

R14I/A64K/R123F/R159K/D184Τ, R14I/A64K/R123F/R127Y/R159K/D184T, R14I/N24Q/A64K/R123F/R127Q/R159K/D184Τ,

R14I/A64K/R123F/R159K/D184T,

R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184T,

R14I/A64K/N67S/G78D/R123F/R127K/R159K/D184Τ, R14I/N24Q/A64K/N67A/R123F/R127K/R159K/D184Τ, R127K/R159K, N24A/N67S/R159Κ, N24A/N67A/R159K, R14I/A63K/G78D/R123F/D184T, 30 R14I/A63K/N67A/R123F/D184T, R14I/A63K/N67L/R123F/D184T, R14I/A63K/N67S/R123F/D184T, R14I/A63K/R123F/R159F/D184T, R14I/A63K/R123F/R159K/D184Τ, R14I/A63K/R123F/R159N/D184Τ, R14I/A63K/R123K/D184T, R14I/A63K/R123Q/D184T, R14I/A63K/R123Y/D184T, R14I/A64K/G78D/T86K/T116E/R123F, R14I/A64K/N67A/T86K/T116E/R123F,

R14I/A64K/N67L/T86K/T116E/R123F,

R14I/A64K/T86K/T116E/R123F/R159K, R14I/A64K/T86K/T116E/R123K, R14I/G54D/A63K/R123F/D184T, R14I/G54D/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24A/A63K/R123F/D184T, R14I/N24A/A64K/T86K/T116E/R123F,

R141/N24A/S76V/A93S/R127K/R159Κ/1181 Κ,

R14I/N24E/A63K/R123F/D184T, R14I/N24E/A64K/T86K/T116E/R123F,

R14I/N24Q/A63K/R123F/D184T, R14I/N24Q/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24Q/S76V/A93S/R127K/R159K/I181K,

R14I/N24T/A63K/R123F/D184T, R14I/N24T/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24TS76V/A93S/R127K/R159K/I181K,

R14I/N67SS76N/A93H/R127K/R159K/I181Q,

R14I/R35E/A63K/R123F/D184T, R14I/R35K/A63K/R123F/D184T,

R14I/S76V/A93S/R127K/R159F/1181K,

R14I/S76V/A93S/R127K/R159N/1181K,

R14I/S76V/A93S/R127Y/R159K/1181K, R14M/N24T/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K,

R14M/N67S/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K, R14M/S76N/A93G/R127K/R159F/I181K, e

R14M/S76N/G78D/A93G/R127K/R159K/I181K, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos 25 especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades, as variantes tem melhorada atividade de desempenho de lavagem de louça, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas, as variantes compreendem substituições múltiplas 30 selecionadas dentre

R14N/R127K/R159L, R14I/A64K/T86K/N112E/R123F/D184T,

G12D/R35E/G63R/R79K/T109M, R14L, G12D/R35E, e R14M/S76D/A93H/R127K/R159K/I181K, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em ainda algumas outras modalidades, as variantes tem melhorada 5 atividade de remoção de manchas como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas, as variantes compreendem substituições múltiplas selecionadas dentre: G54E/R14L, N24D/R127Y/R159V, N24E/R127S, N24E/R159C,

N24F/R159G, N24F/R159G/G54E, N24F/R159L/R123V, N24G/R127Y, N24H/R159Y/T46I, N24I/R127S, N24I/R127V/R14/N24L/R159S, N24S/R159A, N24V/R127M/R159V, N24V/R127S/R159H, N24V/R159L, N24Y/G54A, N24Y/R127L, N24Y/R127S, N24Y/R127V, N24Y/R159F, R127A/R159F, R127H/R159Q, R127H/R159T/S185F, R127M/R159V,

R127S/R159G, R127S/R159L, R127T/R159F, R127V/R159G,

R127Y/R159L, R14A/N24K/R127S, R14A/R127Y/R159W,

R14G/N24S/R127C, R14G/R127G, R14L/N24D, R14L/N24Y, R14L/R123L, R14L/R127S, R14L/R127V, R14L/R127Y, R14L/R159G, R14L/R159S, R14L/T39P, R14M/N24L/R159S/R123V, R14M/R159F, R14M/R159W,

R14Q/R123F, R14S/N24E/R127W, R14S/N24V, R14S/N24Y,

R14T/N24T/R127Q, R14T/R127Y, R14V/N24D/R127C, R14V/N24G/P189S, R14V/N24L/R127F, R14V/R127A, R14V/R159F, R14V/R159W, R14W/N24A, R14W/R123L, R14W/R123V, R14W/R159V, R159V/G49D, R159V/R123G, N024E/G049A/A093H/R127K/A143N/R159K/I181Q,

N024E/G049A/A093S/S099D/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181T,

N24A/G54E/S76D/A93G/R127K/R159K, N24E/A93G/R127K/R159K, N24E/G54L/S76E/A93G/R127K/R159K, N24E/G54Q/A93S/R127K/R159K, N24E/S76D/A93T/R127K/R159K, N24H/G54E/A93G/R127K/R159K,

N24L/S76T/A93G/R127K/R159K, N24M/A93S/R127K/R159K, N24M/A93T/R127K/R159K, N24M/G54E/A93H/R127K/R159K, N24M/G54E/S76N/A93S/R127K/R159K, N24M/S76V/A93H/R127K/R159K, N24Q/A93G/R127K/R159Κ, N24Q/G54D/S76L/A93G/R127K/R159Κ, N24Q/G54I/S76T/A93G/R127K/R159K, N24Q/G54Q/A93G/R127K/R159K, N24Q/S76A/A93G/R127K/R159Κ, N24T/G54Q/S76N/A93G/R127K/R159K, N24T/G54Q/S76V/R127K/R159K, N24T/S76I/R127K/R159K,

N24W/A93G/R127K/R159Κ, N24W/G54D/A93H/R127K/R159Κ,

R0141/S076A/A093G/R127K/R159Κ/1181 Τ,

R014I/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181Q,

R014I/S076D/A093H/R127K/R159Κ/1181Q, R014I/S076D/A093H/R127K/R159K/I181T,

R014I/S076D/A093S/R127K/R159K/1181 Τ,

R014I/S076E/A093S/R127K/R159K/1181Q1 R014I/S076E/A093T/R127K/R159K/1181 Κ,

R014I/S076N/A093H/R127K/R159Κ/1181Q,

R014L/S076A/A093H/R127K/R159Κ,

R014 L/S076Α/Α093H/R 127K/R159K/1181Q,

R014L/S076D/A093H/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076A/A093G/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076A/A093S/R127K/R159K/1181K,

R014M/S076A/A093S/R127K/R159K/1181T1 R014M/S076A/A093T/R127K/R159K/1181Q,

R014M/S076D/A093S/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076E/A093H/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076E/A093S/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076N/A093G/R127K/R159K/1181K,

R014M/S076N/A093G/R127K/R159K/I181T,

R014M/S076N/A093H/R127K/R159K/1181T,

R014M/S076N/A093S/R127K/R159K/1181T, T36S/R127Q/R159E, S15E/R35E, S15E/R35D, S15E/R159E, S15E/R127Q, S15E/R123Q, S15E/R123E, R79T/R127Q/R179Q, R35H/R159E, R35F/R61S/R159Q,

R35F/R159Q, R35D/R127Q, R16Q/R79T/R159Q/R179Q,

R16Q/R79T/R123L, R16Q/R79T, R16Q/R35F, R16Q/R159Q/R179Q, R16Q/R159Q, R14Q/T121E, R14Q/R35E, R14Q/R35D, R14Q/R123Q, R14L/R79T, R127Q/R159E, R127Q/R159Q, R123Q/R159E, R123L/R159Q, R123F/R159E, G12D/S15E, G12D/R35H/R159E, G12D/R35H/R123Q, G12D/R35H, G12D/R35E, G12D/R35D, G12D/R159E, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14I/R35H, G65Q/R127A/R159K, R127A/R159K, R14I/G65Q,

5 R14I/G65Q/N67L/R159K, R14I/G65Q/R127A, R14I/G65Q/R127A/R159K,

R14I/G65Q/R159K, R14I/R127A, R14I/R127A/R159K, R14I/R159K, R14I/R35F, R14I/R35F/G65Q, R14I/R35F/R159K, R14I/S76V, e R35F/R127A/R159K, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 10 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. A presente invenção também provê variantes de serina protease que tem pelo menos uma propriedade de superfície alterada, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas 15 modalidades preferidas, as variantes compreendem pelo menos duas substituições em sítios selecionados dentre o grupo consistindo em 1,2, 4,

7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 24, 25, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 20 88, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 25 183, e 184, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8

Em algumas modalidades particularmente preferidas, as proteases variantes tem pelo menos uma propriedade melhorada, como comparado com a protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a pelo menos uma propriedade melhorada é selecionada dentre o grupo consistindo em estabilidade em ácido, termoestabilidade, hidrólise de caseína, hidrólise de queratina, desempenho de limpeza, e estabilidade LAS.

A presente invenção também provê vetores de expressão compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos codificando as variantes de serina protease tendo uma seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. A presente invenção também provê células hospedeiras compreendendo pelo menos um vetor de expressão. Em algumas modalidades preferidas, a célula hospedeira é uma Bacillus sp., enquanto em algumas outras modalidades, a célula hospedeira é uma Streptomyces sp., em ainda algumas outras modalidades, a célula hospedeira é uma Aspergillus sp., e em ainda algumas outras modalidades, a célula hospedeira é uma Trichoderma sp. A presente invenção também provê variantes de serina protease produzidas nas células hospedeiras.

A presente invenção também provê composições compreendendo pelo menos uma porção das variantes de serina protease tendo uma seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8, aqui apresentada. A presente invenção também ainda provê seqüências de polinucleotídeos codificando as variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. A presente invenção ainda provê vetores de expressão compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos codificando as variantes de serina protease tendo uma seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. A presente invenção também provê células hospedeiras compreendendo 5 pelo menos um vetor de expressão. Em algumas modalidades preferidas, a célula hospedeira é uma Bacillus sp., enquanto em algumas outras modalidades, a célula hospedeira é uma Streptomyces sp., em ainda algumas outras modalidades, a célula hospedeira é uma Aspergillus sp., e em ainda algumas outras modalidades, a célula hospedeira é uma 10 Trichoderma sp. A presente invenção também provê variantes de serina protease produzidas nas células hospedeiras.

A presente invenção ainda provê composições de limpeza compreendendo variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de 15 aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpeza compreendem pelo menos uma variante de serina protease, em que a serina protease tem 20 reatividade cruzada imunológica com a serina protease especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas, as substituições são feitas em posições equivalentes às posições 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 25 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 , 93, 96, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 30 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, e 189, em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8. Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpeza ainda compreendem uma ou mais enzimas adicionais ou derivados de enzimas selecionadas dentre o grupo consistindo em proteases, amilases, lipases, mannanases, pectinases, cutinases, 5 oxidorredutases, hemicelulases, e celulases.

A presente invenção também provê composições compreendendo as variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes 10 às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8, e pelo menos um agente estabilizante. Em algumas modalidades preferidas, as composições são composições de limpeza. Em algumas modalidades particularmente preferidas, o agente estabilizante é selecionado dentre bórax, glicerol, e 15 inibidores competitivos. Em algumas outras modalidades particularmente preferidas, os inibidores competitivos estabilizam as variantes de serina protease em tensoativos aniônicos. Em ainda algumas outras modalidades, a variante de serina protease é uma variante autoliticamente estável.

A presente invenção também provê composições de limpeza compreendendo pelo menos 0,0001 por cento, em peso, das variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8, e opcionalmente, um ingrediente adjunto. Em algumas modalidades preferidas, as composições compreendem de cerca de 0,001 a cerca de 0,5 por cento, em peso, de pelo menos uma variante de serina protease. Em algumas modalidades preferidas, as composições compreendem de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 por cento, em peso, da serina protease. Em algumas modalidades preferidas adicionais, as composições de limpeza compreendem um ingrediente adjunto. Em ainda algumas outras modalidades preferidas, as composições de limpeza compreendem uma quantidade suficiente de um modificador de pH para prover a composição com um pH simples de cerca de 3 a cerca de 5, em que as composições são essencialmente livres de materiais que hidrolisam em um pH de cerca de 3 a cerca de 5. Em algumas modalidades preferidas alternativas, as 5 composições de limpeza compreendem materiais que hidrolisam compreendendo um material tensoativo. Em algumas modalidades particularmente preferidas, o material tensoativo compreende um tensoativo de alquil sulfato de sódio que compreende uma porção de óxido de etileno.

A presente invenção ainda provê composições de limpeza 10 compreendendo as variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8, em que a 15 composição de limpeza é um líquido. Em algumas modalidades alternativas, a composição de limpeza é uma composição em pó, granular ou tabletes.

A presente invenção ainda provê composições de limpeza compreendendo as variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8, em que as composições de limpeza ainda compreendem uma fonte de peróxido de hidrogênio. Em algumas modalidades preferidas, a fonte de peróxido de hidrogênio compreende pelo menos um persal, em que o persal é perborato de metal alcalino, percarbonato de metal alcalino, perfosfato de metal alcalino, persulfato de metal alcalino, ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades particularmente preferidas, as composições de limpeza ainda compreendem um catalisador alvejante, ativador alvejante e/ou misturas dos mesmos.

A presente invenção também provê métodos de limpeza, compreendendo as etapas de: a) contatar uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com pelo menos uma composição de limpeza da presente invenção; e b) opcionalmente lavar e/ou enxaguar a superfície ou material.

A presente invenção também provê rações para animais 5 compreendendo variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

A presente invenção também provê composições de

processamento de têxteis e/ou couro compreendendo variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

A presente invenção também provê composições de cuidado pessoal compreendendo variantes de serina protease tendo seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as substituições são feitas em posições equivalentes 20 às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

Descrição das Figuras

Figura 1 apresenta um mapa do plasmídeo pHPLT-ASP-C1-2.

Figura 2 apresenta um mapa do plasmídeo pXX-Kpnl.

Figura 3 apresenta um mapa do plasmídeo pHPLT.

Figura 4 apresenta um mapa do plasmídeo pUC18.

Figura 5 apresenta um mapa do plasmídeo pUC18-ASP

Figura 6 apresenta uma tabela mostrando os resultados dos testes do tergotômetro realizados na ausência do tampão HEPES (a dosagem da enzima foi de 0,55 ppm).

Figura 7 apresenta uma tabela mostrando os resultados dos testes do tergotômetro realizados na presença de tampão HEPES (a dosagem da enzima foi de 0,55 ppm).

Descrição da Invenção

A presente invenção provê novas serina proteases de Micrococcineae spp tendo substituições múltiplas. Em particular, a presente invenção provê serina proteases tendo substituições múltiplas, DNA codificando estas proteases, vetores compreendendo o DNA codificando as proteases, células hospedeiras transformadas com o DNA vetor, e enzimas produzidas pelas células hospedeiras. A presente invenção também provê composições de limpeza (por exemplo, composições detergentes), composições de ração animal, e composições de processamento de têxteis e couro compreendendo estas variantes de serina protease. Em modalidades particularmente preferidas, a presente invenção provê proteases mutantes (isto é, variantes) derivadas de proteases de tipo selvagem aqui descritas. Estas proteases variantes também encontram uso em numerosas aplicações.

A presente invenção provê enzimas protease variante tendo substituições múltiplas. Importantemente, estas enzimas variantes tem boa estabilidade e atividade proteolitica. Estas enzimas variantes encontram uso em várias aplicações, incluindo mas não-limitadas a composições de 20 limpeza, ração animal, processamento de têxteis e etc. A presente invenção também provê meios para produzir estas enzimas. Em algumas modalidades preferidas, as proteases variantes da presente invenção estão em uma forma pura ou relativamente pura.

A presente invenção também provê seqüências de nucleotídeos que são apropriadas para produzir as proteases variantes da presente invenção em organismos recombinantes. Em algumas modalidades, a pro- dução recombinante provê meios para produzir as proteases variantes em quantidades que são comercialmente viáveis.

Salvo indicado em contrário, a prática da presente invenção envolve técnicas convencionais comumente usadas em biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante, que estão dentro do escopo da técnica. Estas técnicas são bem-conhecidas do versado, e são descritas em numerosos textos e livros de referência (Vide por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a. ed. (Cold Spring Harbor), [1989]); e Ausubel et al., "Current Protocols em Molecular Biology" [1987]). Todas as patentes, pedidos de patente, artigos e publicações mencionados 5 aqui, tanto supra como infra, são aqui expressamente incorporados por refe- rência.

Salvo definido de outra forma aqui, todos os termos técnicos e científicos usados aqui tem os significados como comumente entendidos por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Por exemplo, Singleton e Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a. Ed., John Wiley e Sons, NY (1994); e Hale e Marham, The Harper Collins Dietionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) fornecem aos versados dicionários gerais de muitos termos usados na invenção. Apesar de muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui encontra- rem uso na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferidos são descritos aqui. Assim, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente descritos por referência ao relatório como um todo. Também, como usado aqui, o singular de "um", "uma", "o", "a" inclui a refe- rência no plural salvo claramente especificado em contrário. As faixas numé- ricas são inclusive de números definindo a faixa. Salvo especificado em con- trário, ácidos nucleicos são escritos da esquerda à direita em orientação 5' a 3', as seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda à direita em ori- entação amino para carbóxi, respectivamente. Deve-se entender que esta invenção não é limitada à metodologia particular, protocolos e reagentes descritos, como estes podem variar dependendo do contexto em que eles são usados pelos versados na técnica.

A prática da presente invenção emprega, salvo especificado em contrário, técnicas convencionais de purificação de proteínas, biologia mole- cular, microbiologia, técnicas de DNA recombinante e sequenciamento de proteínas, todos estando de acordo com os versados na técnica.

Além disso, os cabeçalhos aqui providos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que foram tomados por refe- rência ao relatório como um todo. Assim, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório como um todo. Mesmo assim, a fim de facilitar a compreensão da invenção, vários termos são definidos abaixo. As definições adicionais são dadas no pedido 5 de patente U.S. número de série 10/576.331, que se incorpora aqui por refe- rência em sua totalidade.

1. Definições

Como usado aqui, os termos "protease," e "atividade proteolítica" referem-se a proteína ou peptídeo demonstrando a capacidade de hidrolisar peptídeos ou substratos tendo ligações peptídeo. Existem muitos procedi- mentos bem-conhecidos para medir a atividade proteolítica (Kalisz, "Microbi- al Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances em Biochemical Enqinee- rinq/Biotechnoloqy. [1988]). Por exemplo, atividade proteolítica pode ser veri- ficada por testes comparativos que analisam a capacidade da protease res- pectiva para hidrolisar um substrato comercial. Os substratos exemplares utilizáveis na análise de protease ou atividade proteolítica, incluem, mas não são limitados a di-metil caseína (Sigma C-9801), colágeno bovino (Sigma C- 9879), elastina bovina (Sigma E-1625), e queratina bovina (ICN Biomedical 902111). Testes colorimétricos usando estes substratos são bem- conhecidos na técnica (Vide por exemplo, WO 99/34011; e Patente U.S. N0 6.376.450, ambas sendo incorporadas aqui por referência). O teste pNA (Vi- de por exemplo, Del Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979]) também encontra uso na determinação da concentração de enzima ativa para fra- ções coletadas durante a eluição do gradiente. Este teste mede a taxa em que p-nitroanilina é liberada à medida que a enzima hidrolisa o substrato sintético solúvel, succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilida (sAAPF-pNA). A taxa de produção de cor amarela a partir da reação de hi- drólise é medida a 410 nm em um espectrofotômetro e é proporcional à con- centração de enzima ativa. Além disso, medidas de absorbância a 280 nm podem ser usadas para determinar a concentração de proteína total. A rela- ção de enzima ativa / proteína total dá a pureza da enzima.

Como usado aqui, os termos " ASP protease", "Asp protease," e "Asp," referem-se às serina proteases aqui descritas. Em algumas modali- dades preferidas, a Asp protease é a protease projetada aqui como protease 69B4 obtida a partir de Cellulomonas cepa 69B4. Assim, modalidades prefe- ridas, o termo "protease 69B4 " refere-se à protease madura de ocorrência 5 natural derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035) tendo seqüên- cias de aminoácidos substancialmente idênticas como providas em SEQ ID N0 8. Em modalidades alternativas, a presente invenção provê porções da ASP protease.

O termo "homólogos de protease de Cellulomonas " refere-se a 10 proteases de ocorrência natural tendo seqüências de aminoácidos substan- cialmente idênticas à protease madura derivada de Cellulomonas cepa 69B4 ou seqüências de polinucleotídeos que codificam para estas proteases de ocorrência natural, e cujas proteases retém a característica funcional de uma serina protease codificada por tais ácidos nucleicos. Em algumas modalida- 15 des, estes homólogos de protease são referidos como celulomonadinas."

Como usado aqui, os termos " variante de protease," " variante de ASP," " variante de ASP protease," e " variante de protease 69B " são usados em referência a proteases que são similares à ASP tipo selvagem, particularmente em sua função, mas tem mutações (por exemplo, substitui- 20 ções) em sua seqüência de aminoácidos que as tornam diferentes em se- qüência da protease de tipo selvagem. Alguns dos resíduos de aminoácidos identificados para substituição são resíduos conservados enquanto outros não são. Em algumas modalidades, as variantes de protease da presente invenção incluem as formas maduras de variantes de protease, enquanto em 25 outras modalidades, a presente invenção provê as pro- e prepro-formas des- tas variantes de protease.

Como usado aqui, ''Cellulomonas ssp." refere-se a todas as es- pécies dentro do gênero "Cellulomonas," que são bactérias Gram-positivas classificadas como membros da Família Cellulomonadaceae, Subordem Mi- 30 crococcineae, Ordem Actinomycetales, Classe Actinobaeteria. Reconhece- se que o gênero Cellulomonas continua a sofrer uma reorganização taxonô- mica. Assim, pretende-se que o gênero inclua espécies que foram reclassifi- cadas.

Como usado aqui, "Streptomyces ssp." refere-se a todas as es- pécies dentro do gênero "Streptomycesque são bactérias Gram-positivas classificadas como membros da Família Streptomycetaceae, Subordem S- 5 treptomycineae, Ordem Actinomycetales, Classe Actinobacteria. Reconhece- se que o gênero Streptomyces continua a sofrer uma reorganização taxo- nômica. Assim, pretende-se que o gênero inclua espécies que foram reclas- sificadas

Como usado aqui, "o gênero Bacillus'' inclui todas as espécies dentro do gênero ''Bacillus'' como conhecido do versado na técnica, incluin- do mas não-limitadas a B. subtilis, B. Iicheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halo- durans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, e B. thuringien- sis. Reconhece-se que o gênero Bacillus, continua a sofrer uma reorganiza- ção taxonômica. Assim, pretende-se que o gênero inclua espécies que foram reclassificadas, incluindo mas não-limitadas a tais organismos como B. stea- rothermophilus, que é agora chamado ''Geobacillus stearothermophilus.'' A produção de endósporos resistentes na presença de oxigênio é considerada como o aspecto definindo o gênero Bacillus, apesar desta característica também se aplicar aos recentemente nomeados Alicyclobacillus, Amphibacil- lus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Termobacillus, Ureibacillus, e Virgi- bacillus.

Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" usado de modo 25 interpermutável aqui, referem-se uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja de ribonucleotídeos ou deoxirribonucleotídeos. Estes termos incluem, mas não são limitados a, DNA de filamento único, duplo ou triplo, DNA genômico, cDNA, RNA, híbrido DNA-RNA, ou um polí- mero compreendendo bases purina e pirimidina, e outras bases de nucleotí- 30 deos naturais, quimicamente, bio-quimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas. Os seguintes são exemplos não-limitativos de polinucleotí- deos: genes, fragmentos de genes, fragmentos cromossômicos, ESTs1 é- xons, íntrons, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos re- combinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isola- do de qualquer seqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Em algumas modalidades, polinucleotídeos 5 compreendem nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos, uracila, outros açúcares e grupos de ligação co- mo fluororibose e tioato, e ramificações de nucleotídeos. Em modalidades alternativas, a seqüência de nucleotídeos é interrompida por componentes não nucleotídeos.

Como usado aqui o termo "gene" refere-se a polinucleotídeo (por

exemplo, um segmento de DNA), que codifica um polipeptídeo e inclui regi- ões precedendo e seguintes das regiões de codificação assim como se- qüências intervenientes (íntrons) entre os segmentos de codificação indivi- duais (éxons).

Como usado aqui, "genes homólogos " refere-se a um par de

genes de espécies diferentes mas geralmente relacionadas, que correspon- dem um ao outro e são idênticos ou muito parecido entre si. O termo englo- ba genes que são separados por especiação (isto é, o desenvolvimento de novas espécies) (por exemplo, genes ortólogos), assim como genes que fo- ram separados por duplicação genética (por exemplo, genes parálogos).

Como usado aqui, "homologia" refere-se a similaridade de se- qüência ou identidade, com identidade sendo preferida. Esta homologia é determinada usando técnicas-padrão conhecidas na técnica (Vide por e- xemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman e 25 Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 [1988]; programas como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, Wl); e Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]).

Como usado aqui, uma "seqüência análoga" é uma em que a função do gene é essencialmente a mesma que a do gene baseado na pro- tease de Cellulomonas cepa 69B4. Adicionalmente, genes análogos incluem pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de seqüência com a seqüência da pro- tease de Cellulomonas cepa 69B4. Alternativamente, seqüências análogas têm um alinhamento de entre 70 a 100% dos genes encontrados na protea- se de Cellulomonas cepa 69B4 região e/ou tem pelo menos entre 5-10 ge- 5 nes encontrados na região alinhada com os genes no cromossomo de Cellu- Iomonas cepa 69B4. Em modalidades adicionais mais do que uma das pro- priedades acima se aplica à seqüência. Seqüências análogas são determi- nadas por métodos conhecidos de alinhamento de seqüência. Um método de alinhamento comumente usado é BLAST, apesar de que como indicado 10 acima e abaixo, existem outros métodos que também encontram uso no ali- nhamento de seqüências.

Como usado aqui, "recombinante" inclui referência a uma célula ou vetor, que foi modificada pela introdução de uma seqüência de ácido nu- cleico heterólogo ou a célula é derivada de uma célula assim modificada. 15 Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados em forma idêntica dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressa genes nativos que são de uma outra forma anormal- mente expressados, subexpressados ou não expressados de todo como um resultado de uma intervenção humana deliberada. "Recombinação", "recom- 20 binando" e gerando um ácido nucleico "recombinado" são geralmente a montagem de dois ou mais fragmentos de ácido nucleico em que a monta- gem dá lugar a um gene quimérico.

Em uma modalidade preferida, seqüências de DNA mutante são geradas com mutagenese de saturação de sítio em pelo menos um códon. 25 Em outra modalidade preferida, a mutagenese de saturação de sítio é reali- zada para dois ou mas códons. Em ainda modalidade, seqüências de DNA mutantes tem mais do que 50%, mais do que 55%, mais do que 60%, mais do que 65%, mais do que 70%, mais do que 75%, mais do que 80%, mais do que 85%, mais do que 90%, mais do que 95%, ou mais do que 98% de ho- 30 mologia com a seqüência de tipo selvagem. Em modalidades alternativas, DNA mutante é gerado em vivo usando qualquer procedimento mutagênico conhecido, como, por exemplo, radiação, nitrosoguanidina e outros. A se- quência de DNA desejada é então isolada e usada nos métodos aqui apre- sentados.

Como usado aqui "aminoácido" refere-se a seqüências de peptí- deo ou proteína ou porções das mesmas.

5 Como usado aqui, "proteína de interesse" e "polipeptídeo de in-

teresse" referem-se a proteína/polipeptídeo que se deseja ou está sendo avaliado. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é expressada intracelularmente, enquanto em outras modalidades, é um polipeptídeo se- cretado. Em modalidades particularmente preferidas, estas enzimas incluem 10 as serina proteases da presente invenção. Em algumas modalidades, a pro- teína de interesse é um polipeptídeo secretado que é fusionado a um peptí- deo de sinal (isto é, uma extensão amino-terminal em uma proteína a ser secretada). Quase todas as proteínas secretadas usam uma extensão de proteína amino- terminal que desempenha um papel crucial na marcação 15 para e na translocação de proteínas precursoras através da membrana. Esta extensão é proteoliticamente removida por uma peptidase de sinal durante ou imediatamente após a transferência da membrana.

Como usado aqui, o termo "proteína heteróloga" refere-se a pro- teína ou polipeptídeo que não ocorre naturalmente na célula hospedeira. 20 exemplos de proteínas heterólogas incluem enzimas como hidrolases inclu- indo proteases. Em algumas modalidades, os genes codificando as proteí- nas são genes de ocorrência natural, enquanto em outras modalidades, são usados genes mutados ou sintéticos.

Como usado aqui, "proteína homóloga" refere-se a uma proteína 25 ou polipeptídeo nativo ou de ocorrência natural em uma célula. Em modali- dades preferidas, a célula é uma célula Gram-positiva, enquanto modalida- des particularmente preferidas, a célula é uma célula hospedeira de Bacillus. Em modalidades alternativas, a proteína homóloga é uma proteína nativa produzida por outros organismos, incluindo mas não-limitados a E. coli, S- 30 treptomyces, Trichoderma, e Aspergillus. A invenção engloba células hospe- deiras produzindo um proteína homóloga via tecnologia de DNA recombinan- te. Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados de modo inter- permutável aqui. O código de 3 letras para aminoácidos como definido em conformidade com a Nomenclatura da IUPAC-IUB Joint Commission on Bio- chemical Nomenclature (JCBN) é usado em toda esta descrição. Entende-se 5 também que um polipeptídeo pode ser codificado por mais do que uma se- qüência de nucleotídeos devido à degenerescência do código genético.

"Enzima de ocorrência natural" refere-se a uma enzima tendo a seqüência não modificada de aminoácidos idêntica à encontrada na nature- za. As enzimas de ocorrência natural incluem enzimas nativas, as enzimas expressadas naturalmente ou encontradas nos micro-organismos particula- res.

Os termos "derivada de" e "obtida de" referem-se a não somente as proteases produzidas ou produzíveis por uma cepa do organismo em questão, mas também uma protease codificada por uma seqüência de DNA 15 isolada desta cepa e produzida em um organismo hospedeiro contendo esta seqüência de DNA. Adicionalmente, o termo refere-se a protease que é codi- ficada por uma seqüência de DNA de origem sintética e/ou cDNA e que tem as características de identificação da protease em questão. Para exemplifi- car, "proteases derivada de Cellulomonas'' refere-se às enzimas tendo ativi- 20 dade proteolítica que são naturalmente produzidas por Cellulomonas, assim como para serina proteases como as produzidas pelas fontes de Cellulomo- nas mas que através do uso de técnicas de engenharia genética são produ- zidas por organismos não Cellulomonas transformados com um ácido nucle- ico codificando as serina proteases.

Um "derivado" dentro do escopo desta definição geralmente re-

tém a característica atividade proteolítica observada na forma de tipo selva- gem, nativa ou parental na extensão em que o derivado é utilizável para fins similares como a forma de tipo selvagem, nativa ou parental. Os derivados funcionais de serina protease englobam peptídeos de ocorrência natural, 30 sinteticamente ou recombinantemente produzidos ou fragmentos de peptí- deos que tem as características gerais da serina protease da presente in- venção. O termo "derivado funcional" refere-se a um derivado de um áci- do nucleico que tem as características funcionais de um ácido nucleico que codifica serina protease. Os derivados funcionais de um ácido nucleico que codificam serina protease da presente invenção englobam ácidos nucleicos 5 de ocorrência natural, sinteticamente ou recombinantemente produzidos ou fragmentos e codificam a característica de serina protease da presente in- venção. As serina proteases codificando ácido nucleico de acordo com a invenção incluem alelos de ocorrência natural e homólogos baseados na degenerescência do código genético conhecido na técnica.

O termo "idêntico" no contexto de duas seqüências de polipeptí-

deos ou ácidos nucleicos refere-se aos resíduos nas duas seqüências que são iguais quando alinhadas para uma correspondência máxima, como me- dido usando uma das seguintes comparações de seqüências ou algoritmos de análise.

O termo "alinhamento ótimo" refere-se ao alinhamento dando o

maior escore de identidade percentual.

"Porcentagem de identidade de seqüência," "porcentagem de identidade de seqüência de aminoácidos," "porcentagem de identidade de seqüência de genes," e/ou "porcentagem de identidade de seqüência de á- 20 cido nucleico/ polinucleotídeo," com relação a duas seqüências de aminoá- cidos, polinucleotídeos e/ou gene (como apropriado), referem-se a porcenta- gem de resíduos que são idênticos nas duas seqüências quando as seqüên- cias são otimamente alinhadas. Assim, 80% identidade de seqüência de a- minoácidos significam que 80% dos aminoácidos nas duas seqüências de 25 polipeptídeos otimamente alinhadas são idênticos.

A expressão "substancialmente idêntico" no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos assim refere-se a polinucleotídeo ou poli- peptídeo que compreendem pelo menos 70% identidade de seqüência, pre- ferivelmente pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivel- 30 mente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% e preferivelmente pelo menos 99% de identidade de seqüência, como comparado com a seqüência de referência usando os programas ou algoritmos (por exemplo, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) usando parâmetros padrões. Uma indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo cruzado 5 com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, polipeptídeos que diferem por substituições conservativas de aminoácido são imunologicamente reativo cruzados. Assim, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois peptídeos diferem somente por uma substituição conservativa. Outra indicação de que duas seqüências de ácido 10 nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam uma em cada outra sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de média a alta estringência).

A expressão "equivalente," neste contexto, refere-se a serina proteases enzimas que são codificadas por um polinucleotídeo capaz de 15 hibridizar para o polinucleotídeo tendo as seqüências como mostrado em SEQ ID N0 1, sob condições de estringência média a máxima. Por exemplo, sendo equivalente significa que uma serina protease madura equivalente compreende pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 20 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e/ou pelo menos 99% de identidade de seqüência da serina protease madura de Cellulomonas tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0 8.

O termo "isolado" ou "purificado" refere-se a material que é re- 25 movido de seu meio original (por exemplo, o meio natural, se ele for de ocor- rência natural). Por exemplo, o material é dito como sendo "purificado" quando ele está presente em uma composição particular em uma concentra- ção maior do que ele existe em um organismo de ocorrência natural ou tipo selvagem, ou em combinação com componentes não normalmente presen- 30 tes quando da expressão de um organismo de ocorrência natural ou de tipo selvagem. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleo- tídeo ou polipeptídeo, separado de alguns ou de todos os materiais co- existentes no sistema natural, é isolado. Estes polinucleotídeos podem ser parte de um vetor, e/ou estes polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser uma parte de uma composição, e ainda serem isolados em que tal vetor ou 5 composição não faz parte de seu meio natural. Em modalidades preferidas, um ácido nucleico ou proteína é dito como sendo purificado, por exemplo, se ele der lugar a essencialmente uma banda em um gel eletroforético ou blot.

O termo "isolado", quando usado em referência a uma seqüên- cia de DNA, refere-se à seqüência de DNA que foi removida de seu meio genético natural ou é assim isenta de outras seqüências de codificação es- tranhas ou não desejadas, e está em uma forma apropriada para uso dentro dos sistemas de produção de proteína geneticamente engenheirada. Estas moléculas isoladas são as que são separadas de seu meio natural e incluem clones genômicos e cDNA. As moléculas de DNA isoladas da presente in- venção são isentas de outros genes com os quais elas são comumente as- sociadas, mas podem incluir regiões não traduzidas 5' e 3' de ocorrência natural como promotores e terminadores. A identificação de regiões associ- adas será evidente para um versado na técnica (Vide por exemplo, Dynan e Tijan, Nature 316:774-78 [1985]). O termo "uma seqüência de DNA isolada" é alternativamente referido como "uma seqüência de DNA clonada".

O termo "isolado," quando usados em referência a uma proteína, refere-se a proteína que é encontrada em uma condição deferente de seu meio nativo. Em uma forma preferida, a proteína isolada é substancialmente isenta de outras proteínas, particularmente outras proteínas homólogas. 25 Uma proteína isolada é mais do que 10% pura, preferivelmente mais do que 20% pura, e ainda mais preferivelmente mais do que 30% pura, como de- terminado por SDS-PAGE. Outros aspectos da invenção englobam a proteí- na em uma forma altamente purificada (isto é, mais do que 40% pura, mais do que 60% pura, mais do que 80% pura, mais do que 90% pura, mais do 30 que 95% pura, mais do que 97% pura, e ainda mais do que 99% pura), como determinado por SDS-PAGE.

Como usado aqui, o termo "mutagenese combinatorial" refere-se a métodos em que bibliotecas de variantes de uma seqüência de partida são gerados. Nestas bibliotecas, as variantes contêm uma ou várias mutações (por exemplo, substituições) selecionadas dentre um conjunto predefinido de mutações. Além disso, os métodos provêem meios para introduzir muta- 5 ções aleatórias que não são membros do conjunto predefinido de mutações (por exemplo, substituições). Em algumas modalidades, os métodos incluem os especificados no pedido patente U.S. número de série 09/699.250, depo- sitado em 26 de outubro de 2000, aqui incorporado por referência. Em mo- dalidades alternativas, métodos de mutagenese combinatorial englobam kits 10 comercialmente disponíveis (por exemplo, QuikChange® Multisite, Stratage- ne, San Diego, CA).

Como usado aqui, o termo "biblioteca de mutantes" refere-se a uma população de células que são idênticas na maior parte de seu genoma mas incluem homólogos diferentes de um ou mais genes. Estas bibliotecas podem ser usadas, por exemplo, para identificar genes ou óperons com tra- ços melhorados.

Como usado aqui, o termo "gene de partida" refere-se a um ge- ne de interesse que codifica a proteína de interesse que deve ser melhorada e/ou mudada usando a presente invenção.

Como usado aqui, o termo "alinhamento de seqüência múltiplo"

("MSA") refere-se às seqüências de homólogos múltiplos de um gene de partida que são alinhados usando um algoritmo (por exemplo, Clustal W).

Como usado aqui, os termos "seqüência de consenso " e "se- qüência canônica" referem-se a uma seqüência de aminoácidos arquetípica 25 contra a qual todos os variantes de uma proteína ou seqüência de interesse particular são comparados. Os termos também referem-se a seqüência que especifica os nucleotídeos que estão presentes com maior frequência em uma seqüência de DNA de interesse. Para cada posição de um gene, a se- qüência de consenso dá o aminoácido que é o mais abundante nesta posi- 30 ção no MSA.

Como usado aqui, o termo "mutação de consenso" refere-se uma diferença na seqüência de um gene de partida e seqüência de consen- so. As mutações de consenso são identificadas por comparação das se- qüências do gene de partida e a seqüência de consenso resultante de um MSA. Em algumas modalidades, mutações de consenso são introduzidas no gene de partida de modo que ele se torna mais similar à seqüência de con- 5 senso. As mutações de consenso também incluem mudanças de aminoácido que mudam um aminoácido em um gene de partida em um aminoácido que é encontrado com maior frequência em um MSA nesta posição relativa à frequência do aminoácido no gene de partida. Assim, o termo mutação de consenso compreende todas as mudanças de aminoácido que substituem 10 um aminoácido do gene de partida com um aminoácido que é mais abun- dante do que o aminoácido no MSA.

Como usado aqui, o termo "acerto inicial" refere-se uma variante que foi identificada por triagem de uma biblioteca de mutagenese de con- senso combinatorial. Em modalidades preferidas, os acertos iniciais têm ca- racterísticas de desempenho melhoradas, como comparado com o gene de partida.

Como usado aqui, o termo "acerto melhorado " refere-se uma variante que foi identificada por triagem de uma biblioteca de mutagenese de consenso combinatorial melhorada.

Como usado aqui, os termos "melhorando a mutação" e "muta-

ção melhorando o desempenho" ("melhorando uma substituição" e "substitu- ição melhorando o desempenho") referem-se a mutação (por exemplo, subs- tituição) que leva a um desempenho melhorado quando ela é introduzida no gene de partida. Em algumas modalidades preferidas, estas mutações (por 25 exemplo, substituições) são identificadas por acertos de sequenciamento que foram identificados durante a etapa de triagem do método. Na maior parte das modalidades, mutações (por exemplo, substituições) que são en- contradas com maior frequência nos acertos estão provavelmente melho- rando as mutações (por exemplo, substituições) como comparado com uma 30 biblioteca de mutagenese de consenso combinatorial não triada.

Como usado aqui, o termo "biblioteca de mutagenese de con- senso combinatorial melhorada" refere-se a uma biblioteca CCM que é pro- jetada e construída com base nos resultados de triagem e/ou sequenciamen- to de um ciclo anterior de mutagenese CCM e triagem. Em algumas modali- dades, a biblioteca CCM melhorada é baseada na seqüência de um acerto inicial resultante de um ciclo anterior de CCM. Em modalidades adicionais, a 5 CCM melhorada é projetada de modo que as mutações que foram observa- das com frequência em acertos iniciais de ciclos anteriores de mutagenese e triagem são favorecidas. Em algumas modalidades preferidas, isto é obtido por omissão dos iniciadores que codificam as mutações reduzindo o desem- penho ou por aumento da concentração de iniciadores que codificam as mu- 10 tações melhorando o desempenho com relação a outros iniciadores que fo- ram usados em bibliotecas CCM anteriores.

Como usado aqui, o termo "mutações reduzindo o desempenho" referem-se a mutações na biblioteca de mutagenese de consenso combina- torial que são encontradas com menor frequência em acertos resultantes da 15 triagem, como comparado com uma biblioteca de mutagenese de consenso combinatorial não triada. Em modalidades preferidas, o processo de triagem remove e/ou reduz a abundância de variantes que contém as "mutações re- duzindo o desempenho".

Como usado aqui, o termo "teste funcional" refere-se a um teste 20 que provê uma indicação de uma atividade da proteína. Em modalidades particularmente preferidas, o termo refere-se a sistemas de teste em que a proteína é analisada por sua capacidade de funcionar em sua capacidade comum. Por exemplo, no caso de enzimas, um teste funcional envolve de- terminar a eficácia da enzima na catálise de uma reação.

Como usado aqui, o termo "propriedade de marcação" refere-se

à propriedade de um gene de partida que deve ser alterada. Não se preten- de que a presente invenção seja limitada a qualquer propriedade de marca- ção particular. No entanto, em algumas modalidades preferidas, a proprie- dade de marcação é a estabilidade de um produto de gene (por exemplo, 30 resistência a desnaturação, proteólise, ou outros fatores degradativos), en- quanto em outras modalidades, o nível de produção de um hospedeiro de produção é alterado. De fato, contempla-se que qualquer propriedade de um gene de partida irá encontrar uso na presente invenção.

O termo "propriedade" ou seus equivalentes gramaticais no con- texto de um ácido nucleico, como usados aqui, referem-se a qualquer carac- terística ou atributo de um ácido nucleico que pode ser selecionado ou de- 5 tectado. Estas propriedades incluem, mas não são limitadas a propriedade de afetar a ligação a um polipeptídeo, uma propriedade conferida em uma célula compreendendo um ácido nucleico particular, uma propriedade de afetar a transcrição de gene (por exemplo, resistência do promotor, reconhe- cimento do promotor, regulação do promotor, função de melhorador), uma 10 propriedade de afetar o processamento de RNA (por exemplo, emenda de RNA, estabilidade de RNA, conformação de RNA, e modificação pós- transcricional), uma propriedade de afetar a translação (por exemplo, nível, regulação, ligação de mRNA a proteínas ribossômicas, modificação pós- translacional). Por exemplo, um sítio de ligação para um fator de transcrição, 15 polimerase, fator regulatório, etc, de um ácido nucleico pode ser alterado para produzir as características desejadas ou para identificar características indesejáveis.

O termo "propriedade " ou seus equivalentes gramaticais no con- texto de um polipeptídeo, como usados aqui, refere-se a qualquer caracterís- tica ou atributo de um polipeptídeo que pode ser selecionada ou detectada. Estas propriedades incluem, mas não são limitadas a estabilidade oxidativa, especificidade do substrato, atividade catalítica, estabilidade térmica, estabi- lidade alcalina, perfil de atividade de pH, resistência à degradação proteolíti- ca, relação KM, kcat, IWkM, duplicação de proteína, indução de uma resposta imune, capacidade para ligar-se a um ligante, capacidade para ligar-se a um receptor, capacidade para ser secretado, capacidade para ser exibido sobre a superfície de uma célula, capacidade para oligomerizar, capacidade para sinalizar, capacidade para estimular a proliferação de células, capacidade para inibir a proliferação de células, capacidade para induzir apoptose, ca- pacidade para ser modificado por fosforilação ou glicosilação, capacidade para tratar doenças.

Como usado aqui, o termo "triagem " tem seu significado comum na técnica e é, em geral um processo em múltiplas etapas. Na primeira eta- pa, um ácido nucleico mutante ou polipeptídeo variante do mesmo é provido. Na segunda etapa, a propriedade do ácido nucleico mutante ou polipeptídeo variante é determinada. Na terceira etapa, a propriedade determinada é 5 comparada com uma propriedade do ácido nucleico precursor corresponden- te, à propriedade do polipeptídeo de ocorrência natural correspondendo ou a propriedade do material de partida (por exemplo, a seqüência inicial) para a geração do ácido nucleico mutante.

Será evidente para uma pessoa versada que o procedimento de triagem para obter um ácido nucleico ou proteína com uma propriedade alte- rada depende da propriedade do material de partida do qual a modificação da geração do ácido nucleico mutante se destina a facilitar. O versado irá assim notar que a invenção não é limitada a qualquer propriedade específica a ser triada e que a seguinte descrição de propriedades relaciona apenas exemplos ilustrativos. Os métodos para a triagem de qualquer propriedade particular são geralmente descritos na técnica. Por exemplo, pode-se medir a ligação, pH, especificidade, etc. antes e após a mutação, em que uma mu- dança indica uma alteração. Preferivelmente, as triagens são realizadas em um modo de alta produção, incluindo amostras múltiplas sendo triadas simul- taneamente, incluindo mas não-limitadas a testes usando chips, mostra de fagos, e substratos múltiplos e/ou indicadores.

Como usado aqui, em algumas modalidades, triagens englobam etapas de seleção em que variantes de interesse são enriquecidos a partir de uma população de variantes, exemplos destas modalidades incluem a 25 seleção de variantes que conferem uma vantagem no crescimento do orga- nismo hospedeiro, assim como mostra de fagos ou qualquer outro método de exibição, onde variantes podem ser capturadas de uma população de variantes com base em sua ligação ou propriedades catalíticas. Em uma modalidade preferida, a biblioteca de variantes é exposta a estresse (por 30 exemplo, calor, protease, desnaturação, etc.) e subsequentemente variantes que ainda estão intactas são identificadas em uma triagem ou enriquecidas por seleção. Pretende-se que o termo englobe quaisquer meios apropriados para seleção. De fato não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer método de triagem particular.

Como usado aqui, o termo "randomização-direcionada" refere-se a um processo que produz uma pluralidade de seqüências onde uma ou vá- rias posições foram randomizadas. Em algumas modalidades, randomização está completa (isto é, todos os quatro nucleotídeos, A, T, G, e C podem o- correr em uma posição randomizada). Em modalidades alternativas, rando- mização de um nucleotídeo é limitada a um subconjunto dos quatro nucleo- tídeos. A randomização direcionada pode ser aplicada a um ou vários có- dons de uma seqüência, codificando para uma ou várias proteínas de inte- resse. Quando expressas, as bibliotecas resultantes produzem populações de proteínas em que uma ou mais posições de aminoácidos podem conter uma mistura de todos os 20 aminoácidos ou um subconjunto de aminoáci- dos, como determinado pelo esquema de randomização do códon randomi- zado. Em algumas modalidades, os membros individuais de uma população resultando da randomização direcionada diferem no número de aminoáci- dos, devido a uma inserção marcada ou randômica ou deleção de códons. Em outras modalidades, aminoácidos sintéticos são incluídos nas popula- ções de proteínas produzidas. Em algumas modalidades preferidas, a maior parte dos membros de uma população resultantes de uma randomização direcionada mostra uma maior homologia de seqüência para a seqüência de consenso do que o gene de partida. Em algumas modalidades, a seqüência codifica uma ou mais proteínas de interesse. Em modalidades alternativas, as proteínas têm diferentes funções biológicas. Em algumas modalidades preferidas, a seqüência que entra compreende pelo menos um marcador selecionável.

Os termos "seqüência modificada" e "genes modificados" são usados de modo interpermutável aqui para se referirem a uma seqüência que inclui uma deleção, inserção ou interrupção de uma seqüência de ácido 30 nucleico de ocorrência natural. Em algumas modalidades preferidas, o pro- duto de expressão da seqüência modificada é uma proteína truncada (por exemplo, se a modificação for uma deleção ou interrupção da seqüência ). Em algumas modalidades particularmente preferidas, a proteína truncada retém atividade biológica. Em modalidades alternativas, o produto de ex- pressão da seqüência modificada é uma proteína alongada (por exemplo, modificações compreendendo uma inserção na seqüência de ácido nuclei- 5 co). Em algumas modalidades, uma inserção leva a uma proteína truncada (por exemplo, quando a inserção resulta na formação de um códon de para- da). Assim, uma inserção pode resultar em ou uma proteína truncada ou uma proteína alongada como um produto de expressão.

Como usado aqui, o termo "substituição" engloba a substituição de um aminoácido em uma seqüência de aminoácidos com outro aminoáci- do nesta posição na seqüência de aminoácidos. Assim, o termo engloba si- tuações em que inserção e/ou deleção de outro aminoácido em uma se- qüência de aminoácidos muda as posições relativas dos aminoácidos na seqüência. Assim, enquanto um aminoácido pode não ser especificamente marcado para substituição (por exemplo, usando os métodos aqui descritos), este aminoácido pode ser "substituído" por outro aminoácido na seqüência devido a uma mudança em uma posição relativa na seqüência. Por exemplo, por inserção de um aminoácido entre os aminoácidos em posições 1 e 2 de SEQ ID N0 8, a seqüência resultante será trocada por um aminoácido (isto é, o aminoácido originalmente em posição 2 está agora em posição 3, etc.). Pretende-se que o termo englobe mudanças múltiplas, assim como únicas na seqüência de aminoácidos (isto é, substituições únicas ou múltiplas). Também deve ser notado que, como usado aqui, substituições de aminoáci- do são indicadas pelo aminoácido de ocorrência natural, seguido pela posi- ção, seguido pelo aminoácido substituído. Assim, N024E (também indicado como N24E) indica que a asparagina na posição 24 de SEQ ID N0 8 foi substituída com ácido glutâmico. Como indicado aqui, substituições múltiplas são indicadas por ou "/" ou Assim, "R127A-G65Q" e "R127A/G65Q" indi- cam, ambos, que os aminoácidos em posições 127 e 65 foram substituídos (isto é, a arginina na posição 127 foi substituída com uma alanina e a glicina na posição 65 foi substituída com uma glutamina).

Como usado aqui, os termos " seqüência mutante " e " gene mu- tante " são usados de modo interpermutável e referem-se à seqüência que tem uma alteração em pelo menos um códon ocorrendo em uma seqüência de tipo selvagem da célula hospedeira. O produto de expressão da seqüên- cia mutante é uma proteína com uma seqüência alterada de aminoácidos 5 com relação ao tipo selvagem. O produto expressão pode ter uma capacida- de funcional alterada (por exemplo, atividade enzimática melhorada).

Como usado aqui, o termo "mutação positiva" refere-se a muta- ções para as quais os valores ΔΔ G para uma propriedade são melhores do que os da proteína parental (valores ΔΔ G, <0).

Como usado aqui, o termo "mutação negativa" refere-se a muta-

ções para as quais os valores ΔΔ G para uma propriedade são piores do que os da proteína parental (valores ΔΔ G, >0).

Como usado aqui, o termo "sítio produtivo" refere-se às posições que têm pelo menos uma mutação positiva para uma dada propriedade.

Como usado aqui, o termo "sítio improdutivo" refere-se às posi-

ções que não têm mutações positivas para uma da propriedade.

Os termos "iniciador mutagênico" ou "oligonucleotídeo mutagê- nico" (usados de modo interpermutável aqui) são destinados a fazer referên- cia a composições de oligonucleotídeo que correspondem a uma porção da 20 seqüência de gabarito, e que são capazes de hibridizar com o mesmo. Com relação a iniciadores mutagênicos, o iniciador não precisará se alinhar ao ácido nucleico do gabarito, o desalinhamento ou desalinhamentos no inicia- dor sendo usados para introduzir a mutação desejada na biblioteca de ácido nucleico. Como usado aqui, "iniciador não-mutagênico" ou " oligonucleotídeo 25 não-mutagênico" referem-se a composições de oligonucleotídeo que irão se alinhar precisamente no ácido nucleico do gabarito. Em uma modalidade da invenção, somente são usados iniciadores mutagênicos. Em outra modali- dade preferida da invenção, os iniciadores são projetados de modo que em pelo menos uma região em que o iniciador mutagênico foi incluído, também 30 se tem um iniciador não-mutagênico incluído na mistura de oligonucleotí- deos. Por adição de uma mistura de iniciadores mutagênicos e iniciadores não-mutagênicos correspondendo a pelo menos um dos iniciadores mutagê- nicos, é possível produzir uma biblioteca de ácido nucleico resultante em que uma variedade de padrões mutacionais combinatoriais está presente. Por exemplo, se for desejado que alguns dos membros da biblioteca de áci- do nucleico mutante retenham sua seqüência de precursor em algumas po- 5 sições enquanto outros membros sejam mutantes em tais sítios, os iniciado- res não-mutagênicos fornecem a capacidade para obter um nível específico de membros não mutantes dentro da biblioteca de ácido nucleico para um dado resíduo. Os métodos da invenção empregam oligonucleotídeo mutagê- nicos e não-mutagênicos que tem geralmente entre 10-50 bases de compri- 10 mento, mais preferivelmente cerca de 15-45 bases de comprimento. No en- tanto, pode ser necessário usar iniciadores que são ou mais curtos do que 10 bases ou mais longos do que 50 bases para obter o resultado de muta- genese desejado. Com relação a iniciadores mutagênicos e não-mutagênico correspondentes, não é necessário que os oligonucleotídeos corresponden- 15 tes sejam de comprimento idêntico, mas somente que se tenha uma sobre- posição na região correspondendo à mutação a ser adicionada.

Iniciadores podem ser adicionados em uma relação pré-definida de acordo com a presente invenção. Por exemplo, se for desejado que a biblioteca resultante tenha um nível significante de uma determinada muta- 20 ção específica e uma quantidade menor de uma diferente mutação no mes- mo ou diferente sítio, por ajuste da quantidade de iniciador adicionada, é possível produzir a biblioteca desviada desejada. Alternativamente, por adi- ção de quantidades menores ou maiores de iniciadores não-mutagênicos, é possível ajustar a frequência com que a(s) mutação(s) correspondentes são 25 produzidas na biblioteca de ácido nucleico mutante.

Como usado aqui, a expressão " mutações contíguas" referem- se a mutações que são apresentadas dentro do mesmo iniciador de oligonu- cleotídeo. Por exemplo, mutações contíguas podem estar adjacentes ou próximas umas das outras, no entanto, ela serão introduzidas nos ácidos nucleicos gabaritos mutantes pelo mesmo iniciador.

Como usado aqui, a expressão "mutações descontíguas" refere- se a mutações que são apresentadas em iniciadores de oligonucleotídeo separados. Por exemplo, mutações descontíguas serão introduzidas nos ácidos nucleicos gabaritos mutantes resultantes por iniciadores de oligonu- cleotídeo preparados em separado.

Os termos "seqüência de tipo selvagem", ou "gene de tipo sel- 5 vagem" são usados de modo interpermutável aqui, para fazer referência a uma seqüência que é nativa ou de ocorrência natural em uma célula hospe- deira. Em algumas modalidades, a seqüência de tipo selvagem refere-se a uma seqüência de interesse que é o ponto de partida de um projeto de en- genharia de proteína. A seqüência de tipo selvagem pode codificar ou uma 10 proteína homóloga ou uma heteróloga. A proteína homóloga é uma que a célula hospedeira irá produzir sem intervenção. A proteína heteróloga é uma que a célula hospedeira não irá produzir, mas somente com intervenção.

Como usado aqui, o termo "anticorpos" refere-se a imunoglobu- linas. Anticorpos incluem mas não são limitados a imunoglobulinas obtidas diretamente de qualquer espécies da qual é desejável produzir os anticor- pos. Além disso, a presente invenção engloba anticorpos modificados. O termo também refere-se a fragmentos de anticorpo que retém a capacidade para ligar ao epítopo ao qual o anticorpo intacto se liga e incluem anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos anti- idiotipos (anti-ID). Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limita- dos a regiões de determinação de complementaridade (CDRs), regiões vari- áveis de fragmento de cadeia única (scFv), região variável de cadeia pesada (VH), região variável de cadeia leve (VL). Os anticorpos policlonais e mono- clonais são também englobados pela presente invenção. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos monoclonais.

O termo "estável em oxidação " refere-se a proteases da presen- te invenção que retém uma quantidade especificada de atividade enzimática sobre um dado período de tempo sob condições prevalecentes durante o processo proteolítico, de hidrólise, ou de limpeza ou outros da invenção, por 30 exemplo enquanto expostos a ou contatados a agentes alvejantes ou agen- tes oxidantes. Em algumas modalidades, as proteases retém pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de atividade proteolítica após contato com um agente alvejante ou oxidante durante um dado período de tempo, por exemplo, pelo menos 1 minuto, 3 minutos, 5 minutos, 8 minutos, 12 minutos, 16 minutos, 20 minutos, etc. Em algumas modalidades, a estabilidade é medida como descrito nos exemplos.

5 O termo "estável em quelador" refere-se a proteases da presen-

te invenção que retém uma quantidade especificada de atividade enzimátíca sobre um dado período de tempo sob condições prevalecentes durante o processo proteolítico, de hidrólise, ou de limpeza ou outros da invenção, por exemplo quando expostas ou contatadas com agentes quelantes. Em algu- 10 mas modalidades, as proteases retém pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da atividade proteolíti- ca após contato com um agente quelante durante um período dado de tem- po, por exemplo, pelo menos 10 minutos, 20 minutos, 40 minutos, 60 minu- tos, 100 minutos, etc. Em algumas modalidades, a estabilidade em quelador 15 é medida como descrito nos exemplos.

Os termos "termicamente estável" e "termoestável" referem-se a proteases da presente invenção que retém uma quantidade especificada de atividade enzimática após exposição a temperaturas identificadas durante um dado período de tempo sob condições prevalecentes durante o processo 20 proteolítico, de hidrólise, ou de limpeza ou outros da invenção, por exemplo, quando expostos a temperaturas alteradas. As temperaturas alteradas inclu- em temperaturas aumentadas ou diminuídas. Em algumas modalidades, as proteases retêm pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da atividade proteolítica após exposição a 25 temperaturas alteradas durante um dado período de tempo, por exemplo, pelo menos 60 minutos, 120 minutos, 180 minutos, 240 minutos, 300 minu- tos, etc. Em algumas modalidades, a termoestabilidade é determinada como descrito nos exemplos.

O termo "estabilidade melhorada" no contexto de uma protease estável à oxidação, quelador, térmico e/ou pH refere-se a uma maior ativida- de proteolítica retida com o passar do tempo, como comparado com outras serina proteases (por exemplo, subtilisina proteases) e/ou enzimas tipo sei- vagem.

O termo "estabilidade diminuída " no contexto de uma protease estável à oxidação, quelador, térmico e/ou pH refere-se a uma menor ativi- dade proteolítica retida com o passar do tempo, como comparado com ou- 5 tras serina proteases (por exemplo, subtilisina proteases) e/ou enzimas tipo selvagem.

O termo "atividade de limpeza" refere-se ao desempenho de limpeza obtido pela protease sob condições prevalentes durante o processo proteolítico, de hidrólise, limpeza ou outros da invenção. Em algumas moda- 10 lidades, desempenho de limpeza é determinado pela aplicação de vários testes de limpeza com relação às manchas sensíveis à enzima, por exem- plo, grama, sangue, leite, proteína de ovo, como determinado por várias me- todologias de cromatografia, espectrofotometria, ou outras quantitativas após submeter as manchas a condições de lavagem-padrão. Os testes de exem- 15 pio incluem, mas não são limitados aos descritos em WO 99/34011, e Paten- te U.S. 6.605.458 (ambos sendo aqui incorporador por referência), assim como os métodos incluídos nos exemplos.

O termo "quantidade efetiva de limpeza" de uma protease refere- se à quantidade de protease aqui descrita acima que alcança um nível dese- 20 jado de atividade enzimática em uma composição de limpeza específica. Estas quantidades efetivas são prontamente verificadas pelos versados e são baseadas em muitos fatores, como a protease particular usada, a apli- cação de limpeza, a composição específica de uma composição de limpeza, e se uma composição líquida ou em pó (por exemplo, granular, barra) for 25 requerida, etc.

O termo "materiais adjuntos de limpeza" como usados aqui, sig- nifica qualquer material líquido, sólido ou gasoso selecionado para o tipo particular de composição de limpeza desejado e a forma do produto (por e- xemplo, líquido, grânulo, pó, barra, pasta, pulverização, tablete, gel; ou com- 30 posição de espuma), cujos materiais são também preferivelmente compatí- veis com a enzima protease usada na composição. Em algumas modalida- des, composições granulares estão em forma "compacta", enquanto em ou- tras modalidades, as composições líquidas estão em uma forma "concentra- da".

O termo "desempenho melhorado" no contexto de atividade de limpeza refere-se a uma atividade de limpeza maior de algumas manchas 5 sensíveis a enzimas, como ovo, leite, grama, ou sangue, como determinado por avaliação comum após um ciclo de lavagem-padrão e/ou ciclos de lava- gem múltiplos.

O termo "desempenho diminuído" no contexto de atividade de limpeza refere-se a uma atividade de limpeza diminuída ou menor de algu- mas manchas sensíveis a enzimas, como ovo, leite, grama, ou sangue, co- mo determinado por avaliação comum após um ciclo de lavagem-padrão.

O termo "desempenho comparativo " no contexto de atividade de limpeza refere-se a pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% pelo menos 90% pelo menos 95% da atividade de limpeza de uma protease 15 de subtilisina comparativa (por exemplo, proteases comercialmente disponí- veis), incluindo mas não-limitadas a protease OPTIMASE® (Genencor), pro- dutos de protease PURAFECT® (Genencor), protease SAVINASE® (No- vozymes), ΒΡΝ’-variantes (Vide por exemplo, Patente U.S. n° Re 34,606), proteases RELASE®, DURAZYME®, EVERLASE®, KANNASE® (Novozy- 20 mes), proteases MAXACAL®, MAXAPEM®, PROPERASE® (Genencor; Vide também, Patente U.S. n0 Re 34.606, e Pat. U.S. Nss 5.700.676; 5.955.340; 6.312.936; e 6.482.628), e produtos de protease variante B. Ientus (por e- xemplo, como descrito em WO 92/21760, WO 95/23221 e/ou WO 97/07770). As variantes de protease de subtilisina exemplares incluem, mas não são 25 limitadas às substituições ou deleções nas posições de resíduo equivalentes às posições 76, 101, 103, 104, 120, 159, 167, 170, 194, 195, 217, 232, 235, 236, 245, 248, e/ou 252 de BPN'. Desempenho de limpeza pode ser deter- minado por comparação das proteases da presente invenção com as prote- ases de subtilisina em vários testes de limpeza com relação às manchas 30 sensíveis a enzima como grama, sangue ou leite, como determinado por metodologias comuns de espectrofotometria ou analíticas após condições de ciclo de lavagem padrões. Como usado aqui, um sistema de "concentração baixa de deter- gente" inclui detergentes onde menos do que cerca de 800 ppm de compo- nentes detergente estão presentes na água de lavar. Os detergentes no Ja- pão são tipicamente considerados sistemas de concentração baixa de deter- 5 gente, como eles têm geralmente aproximadamente 667 ppm de componen- tes detergentes presentes na água de lavar.

Como usado aqui, os sistemas de "concentração média de de- tergente " incluem detergentes em que entre cerca de 800 ppm e cerca de 2000 ppm dos componentes detergentes estão presentes na água de lavar. 10 Os detergentes dos Estados Unidos são geralmente considerados como sendo sistemas de concentração média de detergentes, como eles têm ge- ralmente aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavar. Os detergentes do Brasil tipicamente têm aproximadamen- te 1500 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavar.

Como usado aqui, sistemas de "concentração alta de detergen-

te" incluem detergentes em que mais do que cerca de 2000 ppm de compo- nentes detergentes estão presentes na água de lavar. Os detergentes da Europa são geralmente considerados como sendo sistemas de concentração alta de detergentes, como eles têm aproximadamente 3000-8000 ppm de componentes detergentes na água de lavar.

Como usado aqui, "composições de limpeza de tecido" incluem composições detergentes para lavagem de roupas manual ou em máquina incluindo composições aditivas para lavagem e composições apropriadas para uso no molho e/ou pretratamento de tecidos manchados (por exemplo, roupas, roupas de cama e mesa e outros materiais têxteis).

Como usado aqui, "composições de limpeza para não-tecidos" incluem composições de limpeza de superfícies não têxteis (isto é tecido), incluindo mas não-limitadas a composições detergentes de lavagem de lou- ça, composições orais de limpeza, composições de limpeza de dentaduras, e composições de limpeza pessoal.

A forma "compacta" das composições de limpeza aqui é melhor refletida pela densidade e, em termos de composição, pela quantidade de sal de carga inorgânico. Os sais de carga inorgânicos são ingredientes con- vencionais de composições detergentes em forma em pó. Em composições detergentes convencionais, os sais de carga estão presentes em quantida- des substanciais, tipicamente 17-35% em peso da composição total. Em 5 contraste, em composições compactas, o sal de carga está presente em quantidades não excedendo 15% da composição total Em algumas modali- dades, o sal de carga está presente em quantidades que não excedem 10%, ou mais preferivelmente, 5%, em peso da composição. Em algumas modali- dades, os sais de carga inorgânicos são selecionados dentre os sais de me- 10 tal alcalino e metal alcalino-terroso de sulfatos e cloretos. Um sal de carga preferido é sulfato de sódio.

II. Enzimas Serina Protease da Presente Invenção e Seqüências para as mesmas

A presente invenção provê polinucleotídeos isolados codificando 15 seqüências de aminoácidos que codificam proteases variantes. O pedido de patente U.S., número de série 10/576.331, incorporado por referência em sua totalidade provê várias proteases, incluindo a serina protease de tipo selvagem de Cellulomonas , assim como numerosas proteases variantes, seqüências de codificação de peptídeo de sinal, e seqüências de aminoáci- 20 dos. Em algumas modalidades preferidas da presente invenção, Cellulomo- nas spp. é Cellulomonas cepa 69B4 (DSM16035), como descrito no pedido de patente U.S. número de série 10/576.331.

A. Serina proteases

Apesar de poderem existir variações em seqüência de enzima 25 de ocorrência natural enzima dentro de uma dada espécie de organismo, enzimas de tipo específico produzidas pelos organismos das mesmas espé- cies geralmente são substancialmente idênticas com relação à especificida- de do substrato e/ou níveis de atividade proteolítica sob dadas condições (por exemplo, temperatura, pH, dureza da água, condições oxidativas, con- 30 dições quelantes e concentração), etc. Assim, para os fins da presente in- venção, contempla-se que as outras cepas e espécies de Cellulomonas também produzem a protease de Cellulomonas da presente invenção e as- sim fornecem fontes utilizáveis para as proteases da presente invenção. De fato, como aqui apresentado, contempla-se que outros membros de Micro- coccineae irão encontrar uso na presente invenção.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos proteolíticos desta invenção são caracterizados fisicoquimicamente, enquanto em outras moda- lidades, eles são caracterizados com base em sua funcionalidade, enquanto em ainda modalidades, eles são caracterizados usando ambos os conjuntos de propriedades. A caracterização físico-química alcança vantagem de téc- nicas bem-conhecidas como eletroforese de SDS, filtração de gel, composi- ção de aminoácido, espectrometia de massa (por exemplo, MALDI-TOF-MS, LC-ES-MS/MS, etc.), e sedimentação para determinar o peso molecular de proteínas, focalização elétrica para determinar o pl de proteínas, sequenci- amento de aminoácidos para determinar as seqüências de aminoácidos de proteína, estudos de cristalografia para determinar as estruturas terciárias de proteínas, e ligação de anticorpos para determinar epítopos antigênicos pre- sentes em proteínas.

Em algumas modalidades, características funcionais são deter- minadas por técnicas bem-conhecidas do versado no campo de protease e incluem, mas não são limitadas a, hidrólise de vários substratos comerciais, 20 como dimetil caseína ("DMC") e/ou AAPF-pNA. Esta técnica preferida para a caracterização funcional é descrita em maiores detalhes nos exemplos aqui apresentados.

A protease madura também demonstra atividade proteolítica (por exemplo, atividade hidrolítica sobre um substrato tendo ligações de peptí- 25 deo) como DMC. Em outras modalidades, proteases da presente invenção fornecem um melhorado desempenho de lavagem sob condições identifica- das. Apesar da presente invenção englobar a protease 69B como aqui des- crito, em algumas modalidades, as proteases da presente invenção demons- tram pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 30 97%, 98% ou 99% de atividade proteolítica, como comparado com a ativida- de proteolítica de 69B4. Em algumas modalidades, as proteases exibem pe- lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de atividade proteolítica, como comparado com a atividade pro- teolítica de proteases vendidas sob nomes registrados SAVINASE® (Novzymes) ou PURAFECT® (Genencor) sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, as proteases da presente invenção exibem desem- 5 penho comparativo ou melhorado de lavagem sob condições identificadas como comparado com 69B4 sob as mesmas condições. Em algumas moda- lidades preferidas, as proteases da presente invenção exibem desempenho comparativo ou melhorado de lavagem sob condições identificadas, como comparado com proteases vendidas sob os nomes registrados SAVINASE® 10 (Novozymes) ou PURAFECT® (Genencor) sob as mesmas condições.

Em ainda outras modalidades, as proteases e/ou polinucleotí- deos codificando as proteases da presente invenção são providos em forma purificado (isto é, presentes em uma composição particular em uma concen- tração maior ou menor do que existe em um organismo de ocorrência natural 15 ou tipo selvagem), ou em combinação com componentes não normalmente presentes quando da expressão de um organismo de ocorrência natural ou tipo selvagem. No entanto, não se pretende que presente invenção seja limi- tada a proteases de qualquer nível de pureza específica, como faixas de pu- reza de protease encontram uso em várias aplicações em que as proteases 20 da presente invenção são apropriadas.

B. Seqüências de ácido nucleico e aminoácidos de Serina proteases

A seqüência de DNA do gene asp (SEQ ID N0 1) derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035) é provida abaixo. O polinucleotídeo de iniciação codificando o peptídeo de sinal da protease de Cellulomonas cepa 69B4 está em negrito (ATG). Esta seqüência também inclui o peptídeo de sinal e serina protease precursora.

A seguinte seqüência de DNA (SEQ ID N0 2) codifica o peptídeo de sinal (SEQ ID N0 9) que é ligado operativamente à protease precursora (SEQ ID N0 7) derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035). O polinu- 30 cleotídeo de iniciação codificando o peptídeo de sinal da protease de Cellu- lomonas cepa 69B4 está em negrito (ATG). O códon de terminação (TGA) começa com resíduo 1486. Resíduos 85, 595, e 1162, referem-se aos resí- duos iniciais da pró-sequência N terminal, seqüência madura e pró- sequência terminal carboxila, respectivamente, estão em negrito e sublinha- dos

ATOACACCAC GCACAGTCAC GCGGGCCCTG GCCGTGGCCA CCGCAGCCGC CACACTCCTG 60

GCAGGCGGCA TGGCCGCCCA GGCCAACGAG CCCGCACCAC CCGGGAGCGC GAGCGCACCG 120

CCACGCCTGG CCGAGAAGCT CGACCCCGAC CTCCTCGAGG CCATGGAGCG CGACCTGGGC 180

CTCGACGCGG AGGAAGCCGC CGCCACCCTG GCGTTCCAGC ACGACGCAGC CGAGACCGGC 240

GAGGCCCTCG CCGAAGAGCT CGACGAGGAC TTCGCCGGCA CCTGGGTCGA GGACGACGTC 300

CTGTACGTCG CChCCACCGA CGAGGACGCC GTCGAGGAGG TCGAGGGCGA AGGCGCCACG 360

GCCGTCACCG TCGAGCACTC CCTGGCCGAC CTCGAGGCCT GGAAGACCGT CCTCGACGCC 420

GCCCTCGAGG GCCACGACGA CGTGCCCACC TGGTACGTCG ACGTCCCGAC CAACAGCGTC «80

GTCGTCGCCG TCAAGGCCGG AGCCCAGGAC GTCGCCGCCG GCCTCGTCGA AGGTGCCGAC 540

GTCCCGTCCG ACGCCGTGAC CTTCGTCGAG ACCGACGAGA CCCCGCGGAC CATGTTCGAC 600

GTGATCGGCG GCAACGCCTA CACCATCGGG GGGCGCAGCC GCTGCTCGAT CGGGTTCGCG 660

GTCAACGGCG GGTTCATCAC CGCCGGCCAC TGCGGCCGCA CCGGCGCCAC CACCGCCAAC 720

CCCACCGGGA CCTTCGCCGG GTCCAGCTTC CCGGGCAACG ACTACGCGTT CGTCCGTACC 780

GGGGCCGGCG TGAACCTGCT GGCCCAGGTC AACAACTACT CCGQTGGCCG CGTCCAGGTC 840

GCCGGGCACA CCGCGGCCCC CGTCGGCTCG GCCGTSTGCC GGTCCGGGTC GACCACCGGG 900

TGGCACTGCG GCACCATCAC TGCGCTCAAC TCCTCGGTCA CCTACCCCGA GGGCACCGTC 960

CGCGGCCTGA TCCGCACCAC CGTCTGCGCC GAGCCCGGCG ACTCCGGTGO CTCGCTGCTC 1020

GCCGGCAACC AGGCCCAGGG CGTCACGTCC GGCGGCTCCG GCAACTGCCG CACCGGTGGC 1080

ACCACGTTCT TCCAGCCGGT CAACCCCATC CTCCAGGCGT ACGGCCTGAG GATGATCACC 114 0

ACGGACTCGG GCAGCAGCCC GGCCCCTGCA CCGACCTCCT GCACCGGCTA CGCCCGCACC 1200

TTCACCGGGA CCCTCGCGGC CGGCCGGGCC GCCGCCCAGC CCAACGGGTC CTACGTGCAG 126 0

GTCAACCGGT CCGGGACCCA CAGCGTGTGC CTCAACGGGC CCTCCGGTGC GGACTTCGAC 1320

CTCTACOTGC AGCGCTGGAA CGGCAGCTCC TGGGTGACCG TCGCCCAGAG CACCTCCCCC 1380

GGCTCCAACG AGACCATCAC CTACCGCGGC AACGCCGGCT ACTACCCCTA CGTGGTCAAC 144 0

GCCGCGTCCG GCTCCGGTGC CTACACCATG GGGCTCACCC TCCCCTGA 14 88 {SEQ 10 NO:2)

A seguinte seqüência de DNA (SEQ ID N0 3) codifica a protease precursora derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035). I AACGAGCCCG CACCACCCGG GAGCGCGAGC GCACCGCCAC GCCTGGCCGA GAAGCTCGAC TTGCTCGGGC GTGGTGGGCC CTCGCGCTCG CGTGGCGGTG CCÜACCGGCT CTTCGAGCTG 61 CCCGACCTCC TCGAGGCCAT GGAGCGCGAC CTGGGCCTCG ACGCGGAGGA AQCCGCCGCC GGGCTGGAGG AGCTCCGGTA CCTCGCGCTG GACCCGGAGC TGCGCCTCCT TCGGCGGCGG 121 ACCCTGGCGT TCCAGCACGA CGCAGCCGAG ACCGGCGAGG CCCTCGCCGA AGAGCTCGAC TGGGACCGCA AGGTCGTGCT GCGTCGGCTC TGGCCGCTCC GGGAGCGGCT TCTCGAGCTG 181 GAGGACTTCG CCGGCACCTG GGTCGAGGAC GACGTCCTGT ACGTCGCCAC CACCGACGAG CTCCTGAAGC GGCCGTGGAC CCAGCTCCTG CTGCAGGACA TGCAGCGGTG GTGGCTGCTC 241 GACGCCGTCG AGGAGGTCGA GGGCGAAGGC GCCACGGCCG TCACCGTCGA GCACTCCCTG CTGCGGCAGC TCCTCCAGCT CCCGCTTCCG CGGTGCCGGC AGTGGCAGCT CGTGAGGGAC 301 GCCGACCTCG AGGCCTGGAA GACCGTCCTC GACGCCGCCC TCGAGGGCCA CGACGACGTG CGGCTGGAGC TCCGGACCTT CTGGCAGGAG CTGCGGCGGG AGCTCCCGGT GCTGCTGCAC 361 CCCACCTGGT ACGTCGACGT CCCGACCAAC AGCGTCGTCG TCGCCGTCAA GGCCGGAGCC GGGTGGACCA TGCAGCTGCA GGGCTGGTTG TCGCAGCAGC AGCGGCAGTT CCGGCCTCGG 421 CAGGACGTCG CCGCCGGCCT CGTCGAAGGT GCCGACGTCC CGTCCGACGC CGTGACCTTC GTCCTGCAGC GGCGGCCGGA GCAGCTTCCA CGGCTGCAGG GCAGGCTGCG GCACTGGAAG 481 GTCGAGACCG ACGAGACCCC GCGGACCATG TTCGACGTGA TCGGCGGCAA CGCCTACACC CAGCTCTGGC TGCTCTGGiGG CGCCTGGTAC AAGCTGCACT AGCCGCCGTT GCGGATGTGG 541 ATCGGGGGGC GCAGeCGCTG CTCGATCGGG TTCGCGGTCA ACGGCGGGTT CATCACCGCC TAGCCCCCCG CGTCGGCGAC GAGCTAGCCC AAGCGCCAGT TGCCGCCCAA GTAGTGGCGG 601 GGCCACTGCG GCCGCACCGG CGCCACCACC GCCAACCCCA CCGGGACCTT CGCCGGGTCC CCGGTGACGC CGGCGTGGCC GCGGTGGTGG CGGTTGGGGT GGCCCTGGAA GCGGCCCAGG 661 AGCTTCCCGG GCAACGACTA CGCGTTCGTC CGTACCGGGG CCGGCGTGAA CCTGCTGGCC TCGAAGGGCC CGTTGCTGAT GCGCAAGCAG GCATGGCCCC GGCCGCACTT GGACGACCGG 721 CAGGTCAACA ACTACTCCGG TGGCCGCGTC CAGGTCGCCG GGCACACCGC GGCCCCCGTC GTCCAGTTGT TGATGAGGCC ACCGGCGCAG GTCCAGCGGC CCGTGTGGCG CCGGGGGCAG 781 GGCTCGGCCG TGTGCCGGTC CGGGTCGACC ACCGGGTGGC ACTGCGGCAC CATCACTGCG CCGAGCCGGC ACACGGCCAG GCCCAGCTGG TGGCCCACCG TGACGCCGTG GTAGTGACGC 841 CTCAACfCCT CGGTCACCTA CCCCGAGGGC ACCGTCCGCG GCCTGATCCG CACCACCGTC GAGTTGAGGA GCCAGTGGAT GGGGCTCCCG TGGCAGGCGC CGGACTAGGC GTGGTGGCAG 901 TGCGCCGAGC CCGGCGACTC CGGTGGCTCG CTGCTCGCCG GCAACCAGGC CCAGGGCGTC ACGCGGCTCG GGCCGCTGAG GCCACCGAGC GACGAGCGGC CGTTGGTCCG GGTCCCGCAG 961 ACGTCCGGCG GCTCCGGCAA CTGCCGCACC GGTGGCACCA CGTTCTTCCA GCCGGTCAAC TGCAGGCCGC CGAGGCCGTT GACGGCGTGG CCACCGTGGT GCAAGAAGGT CGGCCAGTTC 1021 CCCATCCTCC AGGCGTACGG CCTGAGGATG ATCACCACGG ACTCGGGCAG CAGCCCGGCC GGGTAGGAGG TCCGCATGCC GGACTCCTAC TAGTGGTGCC TGAGCCCGTC GTCGGGCCGG 1081 CCTGCACCGA CCTCCTGCAC CGGCTACGCC CGCACCTTCA CCGGGACCCT CGCGGCCGGC GGACGTGGCT GGAGGACGTG GCCGATGCGG GCGTGGAAGT GGCCCTGGGA GCGCCGGCCG 1141 CGGGCCGCCG CCCAGCCCAA CGGGTCCTAC GTGCAGGTCA ACCGGTCCGG QACCCACAGC GCCCGGCGGC GGGTCGGGTT GCCCAGGATG CACGTCCAGT TGGCCAGGCC CTGGGTGTCG 1201 GTGTGCCTCA ACGGGCCCTC CGGTGCGGAC TTCGACCTCT ACGTGCAGCG CTGGAACGGC CACACGGAGT TGCCCGGGAG GCCACOCCTG AAGCTGGAGA TGCACGTCGC GACCTTGCCG 1261 AGCTCCTGGG TGACCGTCGC CCAGAGCACC TCCCCCGGCT CCAACGAGAC CATCACCTAC TCGAGGACCC ACTGGCAGCG GGTCTCGTGG AGGGGGCCGA GGTTGCTCTG GTAGTGGATG

13 21 CGCGGCAACG CCGGCTACTA CCGCTACGTG GTCAACGCCG CGTCCGGCTC CGGTGC CTAC GCGCCGTTGC GGCCGATGAT GGCGATGCAC CAGTTGCGGC GCAGGCCGAG GCCACGGATG 13 81 ACCATGGGGC TCACCCTCCC CTCA (SEQ ID 80:3)

TGGTACCCCG AGTGGGAGGG GACT

A seguinte seqüência de DNA (SEQ ID N0 4) codifica a protease

madura derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035). I TTCGACGTGA TCGGCGGCAA CGCCTACACC ATCGGGGGGC GCAGCCGCTG CTCGATCGGG

AAGCTGCACT AGCCGCCGTT GCGGATGTGG TAGCCCCCCG CGTCGGCGAC GAGCTAGCCC 61 TTCGCGGTCA ACGGCGGGTT CATCACCGCC GGCCACTGCG GCCGCACCGG CGCCACCACC AAGCGCCAGT TGCCGCCCAA GTAGTGGCGG CCGGTGACGC CGGCGTGGCC GCGGTGGTGG 121 GCCAACCCCA CCGGGACCTT CGCCGGGTCC AGCTTCCCGG GCAACGACTA CGCGTTCGTC CGGTTGGGGT GGCCCTGGAA GCGGCCCAGG TCGAAGGGCC CGTTGCTGAT GCGCAAGCAG 181 CGTACCGGGG CCGGCGTGAA CCTGCTGGCC CAGGTCAACA ACTACTCCGG TGGCCGCG TC GCATGGCCCC GGCCGCACTT GGACGACCGG GTCCAGTTGT TGATGAGGCC ACCGGCGCAG 241 CAGGTCGCCG GGCACACCGC GGCCCCCGTC GGCTCGGCCG TGTGCCGGTC CGGGTCGftCC GTCCAGCGGC CCGTGTGGCG CCGGGGGCAG CCGAGCCGGC ACAOSGCCAG GCCCAGCTGG 301 ACCGGGTGGC ACTGCGGCAC CATCACTGCG CTCAACTCCT CGGTCACCTA CCCCGAGGGC TGGCCCACCG TGACGCCGTG GTAGTGACGC GAGTTGAGGA GCCAGTGGAT GGGGCTCCCG 361 ACCGTCCGCG GCdGATCCG CACCACCGTC TGCGCCGAGC CCGGCGACTC CGGTGGCTCG TGGCAGGCGC CGGACTAGGC GTGGTGGCAG ACGCGGCTCG GGCCGCTGAG GCCACCGAGC 4 21 CTGCTCGCCG GCAACCAGGC CCAGGGCGTC ACGTCCGGCG GCTCCGGCAA CTGCCGCACC GACGAGCGGC CGTTGGTCCG GGTCCCGCAG TGCAGGCCGC CGAGGCCGTT GACGGCGTGG 481 GGTGGCACCA CGTTCTTCCA GCCGGTCAAC CCCATCCTCC AGGCGTACGG CCTGAGGATG CCACCGTGGT GCAAGAAGGT CGGCCAGTTO GGGTAGGAGG TCCGCATGCC GGACTCCTAC SSl ATCACCACGG ACTCGGGCAG CAGCCCG {SEQ ID NO: 4)

TAGTGGTGCC TGAGCCCGTC GTCGGGC

A seguinte seqüência de DNA (SEQ ID N0 5) codifica o peptídeo de sinal derivado de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035)

1 ATGACACCAC CACAGTCAC GCGGGCCCTQ GCCSTGGCCA CCGCAGCCGC CACACTCCTO TACTGTGGTG CGTGTCAGTG CGCCCGGGAC CGGCACCGGT GGCGTCGGCG GTGTOAGGAC 61 GCAGGCGGCA TGGCCGCCCA GGCC (SEQ ID MO: 5)

CGTCCGCCGT ACCGGCGGGT CCGG

A seguinte seqüência é a seqüência de aminoácidos (SEQ ID N0 5 6) da seqüência de sinal e protease precursora derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035), incluindo a seqüência de sinal [segmentos 1a-c] (resíduos 1-28 [-198 a -171]), uma pró-sequência N-terminal [segmentos 2a- r] (resíduos 29-198 [-170 a -1]), uma protease madura [segmentos 3a-t] (resíduos 199-387 [1-189]), e uma pró-sequência C-terminal [segmentos 4a- 10 I] (resíduos 388-495 [190-398]) codificada pelas seqüências de DNA especificadas em SEQ ID NOS:1, 2, 3 e 4. A seqüência N-terminal da

seqüência de protease madura seqüência de aminoácidos está em negrito.

1 MTPRTVTRAL AVATAAATLL AGGMAAQA NE PAPPGSASAF ’ PRLAEKLDPD la Ib Ic 2a 2b 2c 51 LLEAMERDLG LDAE EAAATL AFQHDAAETG EALAEELDED FAGTWVEDDV 2d 2e 21 2g 2h 101 IiWATTDEDA VEEVEGEOAT AVTVEHSLAD LEAWKTVLDA ALEGHDDVPT 2i 2j 2k 21 2m 151 WYVOVPTNS V WAVKAGAQD VAAGLVEGAD VPSDAVTFVE TDETPRTM FD 201 2n 2o 2 p 2q 2r 3a VIGGNAYTIG GRSRCSIGFA VNGGFITAGH CGRTGATTAjN PTGT FAGS S F 3b 3c 3d 3e 3 f 251 PGNDYAFVRT GAGVNLLAQV NNYSGGRVQV AGirTAAPVGS AVCRSGSTTG 3g 3h 3i 3j 3k 301 WHCGTITALN SSVTYPEGTV RGLIRTTVCA EPGDSGGSLL AGNQAQGVTS 31 3m 3n 30 3p 351 GGSGNCRTGG TTFFQPVNPI LQAYGLRMIT TDSGSSP APA PTSCTGYART 3q 3r 39 3t 4a 4b 401 FTGTLAAGRA AAQPNGSYVQ VNRSGTHSVC LNG PSGADFD LYVQRWNGSS 4C 4d 4e 4f 4g 451 WVTVAQSTS P GSNETITYRG NAGYYR YWN AASGSGAYTM GLTLP (SEQ I >:6) 4h . 4 i 4k 41 A seguinte seqüência (SEQ ID N0 7) é um seqüência de aminoácidos de da protease precursora derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035) ( SEQ ID N0 7).

I NEPAPPGSAS APPRLAEKtD PDLLEAMERD.LGLDAEE A A A.TLAFQHDA AE

51 TGEALAEELD EDFAGTWVED DVLYVATTDE DAVEEVEGEG ATAVTVEHSL

101 ADLEAWKTVL DAALEGHDDV PTWYVDVPTN SVVVAVKAGA QDVAAGLVEG

151 ADVPSDAVTF VETDETPRTM FDVIGGNAYT IGGRSRCSiG FAVNGGF1TA

201 GHCGRTGATT ANPTGTFAGS SFPGNDYAFV RTGAGVNLLA QVNNYSGGRV

251 QVAGHTAAPV GSAVCRSGST TGWHCGTITA LNSSVTYPEG TVRGLlRTTV

30! CAEPGDSGGS LLAGNQAQGV TSGGSGNCRT GGTTFFQPVN PiLQAYGLRM

351 ITTDSGSSPA PA PTSCTGYA RTFTGTLAAG RAAAQPNGSY VQVNRSGTHS

401 VCLNGPSGAD FDLYVQRWNG SSWVTVAQST SPGSNETITY RGNAGYYRYV

<151 VNAASGSGAY TMGLTLP {SEQ ID NO:7)

A seguinte seqüência (SEQ ID N0 8) é uma seqüência de aminoácidos da protease madura derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035). Os resíduos da tríade catalítica H32, D56 e S132 estão em negrito e sublinhados.

1 FDVIGGNAYT IGGRSRCSIG FAVNGGFITA GHCGRTGATT ANPTGTFAGS

51 SFPGNDYAFV RTGAGVNLLA QVNNYSGGRV QVAGHTAAPV GSAVCRSGST

101 TGWHCGTITA LNSSVTYPEG TVRGLIRTTV CAEPGDSGGS LLAGNQAQGV

151 TSGGSGNCRT GGTTFFQPVN PILQAYGLRM ITTDSGSSP (SEQ ID NO:8)

A seguinte seqüência (SEQ ID N0 9) é uma seqüência de aminoácidos de peptídeo sinal da protease derivada de Cellulomonas cepa 69B4 (DSM 16035).

1 MTPRTVTRAL AVATAAATLL AGGMAAQA (SEQ ID NO: 9)

Em algumas modalidades, a presente invenção engloba varian- tes que compreendem pelo menos uma porção de aproximadamente 1621 pares de base em comprimento polinucleotídeo especificada em SEQ. ID N0 1. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a presente invenção 15 provê variantes que tem mutações múltiplas, como comparado com a serina protease de tipo selvagem (por exemplo, "parental"). Em algumas destas modalidades particularmente preferidas adicionais, estas variantes mudadas em múltiplas vezes demonstram um desempenho melhorado, como compa- rado com a serina protease de tipo selvagem (por exemplo, "parental").

Como será entendido por uma pessoa versada, devido à dege- nerescência do código genético, várias polinucleotídeos podem codificar o peptídeo de sinal, protease precursora e/ou protease madura aqui apresen- tada e/ou no pedido de patente U.S. número de série 10/576.331, incorpora- do por referência em sua totalidade (por exemplo, SEQ ID NOS:6, 7, e/ou 8 de pedido de patente U.S. número de série 10/576.331) ou uma protease tendo a % de identidade de seqüência descrita acima. Outra modalidade da presente invenção engloba um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência, pelo menos 75% identidade de seqüência, pelo menos 80% identidade de se- qüência, pelo menos 85% identidade de seqüência, pelo menos 90% identi- dade de seqüência, pelo menos 92% identidade de seqüência, pelo menos 95% identidade de seqüência, pelo menos 97% identidade de seqüência, pelo menos 98% identidade de seqüência e pelo menos 99% identidade de seqüência para a seqüência de polinucleotídeos de SEQ ID NOS:2, 3, e/ou 4, respectivamente, codificando o peptídeo de sinal e protease precursora, a protease precursora e/ou a protease madura, respectivamente.

Em modalidades adicionais, a presente invenção provê fragmen- tos ou porções de DNA que codificam proteases, desde que o fragmento codificado retenha a atividade proteolítica. Outra modalidade da presente invenção engloba polinucleotídeos tendo pelo menos 20% do comprimento 25 da seqüência, pelo menos 30% do comprimento da seqüência, pelo menos 40% do comprimento da seqüência, pelo menos 50% do comprimento da seqüência, pelo menos 60% do comprimento da seqüência, 70% do com- primento da seqüência, pelo menos 75% do comprimento da seqüência, pelo menos 80% do comprimento da seqüência, pelo menos 85% do comprimen- 30 to da seqüência, pelo menos 90% do comprimento da seqüência, pelo me- nos 92% do comprimento da seqüência, pelo menos 95% do comprimento da seqüência, pelo menos 97% do comprimento da seqüência, pelo menos 98% do comprimento da seqüência e pelo menos 99% da seqüência da se- qüência de polinucleotídeos de SEQ ID N0 1, codificando a protease precur- sora. Em modalidades alternativas, estes fragmentos ou porções do com- primento da seqüência são porções contíguas do comprimento da sequên- 5 cia, utilizável para o embaralhamento da seqüência de DNA em seqüências de DNA recombinantes (Vide por exemplo, Patente U.S. n° 6.132.970)

Outra modalidade da invenção inclui fragmentos do DNA aqui descritos que encontram uso de acordo com técnicas reconhecidas para a obtenção de um fragmentos de DNA de comprimento parcial capazes de 10 serem usados para isolar ou identificar polinucleotídeos codificando enzima de protease madura aqui descrita a partir de Cellulomonas 69B4, ou um segmento da mesma, tendo atividade proteolítica. Além disso, o DNA provi- do em SEQ ID N0 1 encontra uso na identificação de fragmentos homólogo de DNA de outras espécies, particularmente de Cellulomonas spp. que codi- 15 ficam a protease ou uma porção da mesma tendo atividade proteolítica.

Além disso, a presente invenção engloba o uso de seqüências de iniciador ou sonda construída a partir de SEQ ID N0 1, ou uma porção apropriada ou fragmento da mesma (por exemplo, pelo menos cerca de 5-20 ou 10-15 nucleotídeos contíguos) como uma sonda ou iniciador para triagem 20 de ácido nucleico de origem genômica ou cDNA. Em algumas modalidades, a presente invenção provê sondas de DNA do comprimento desejado (isto é, geralmente entre 100 e 1000 bases em comprimento), com base nas se- qüências em SEQ ID N0 1.

Em algumas modalidades, os fragmentos de DNA são eletrofore- 25 ticamente isolados, cortados do gel, e recuperados da matriz de ágar do gel. Em modalidades preferidas, este fragmento purificado de DNA é então rotu- lado (usando por exemplo, o sistema de rotulação Megaprime de acordo com as instruções do fabricante) para incorporar P32 em DNA. A sonda rotu- lada é desnaturada por aquecimento a 95°C durante um dado período de 30 tempo (por exemplo, 5 minutos), e imediatamente adicionado à membrana e solução de pré-hibridização. A reação de hibridização prossegue durante um tempo apropriado e sob condições apropriadas (por exemplo, 18 horas a 37°C), com agitação suave ou rotação. A membrana é enxaguada (por e- xemplo, duas vezes em SSC/0,3% SDS) e então lavada em uma solução de lavagem apropriada com suave agitação. A estringência desejada é um re- flexo das condições sob as quais a membrana (filtro) é lavada. Em algumas 5 modalidades aqui, condições de "baixa estringência" envolvem lavar com uma solução de 0,2 X SSC/0,1% SDS a 20°C durante 15 minutos, enquanto em outras modalidades, condições de "estringência média", envolvem ainda a etapa de lavar compreendendo lavar com uma solução de 0,2 X SSC/0,1% SDS a 37°C durante 30 minutos, enquanto em outras modalidades, condi- 10 ções de " estringência alta" envolvem uma outra etapa de lavagem compre- endendo lavar com uma solução de 0,2 X SSC/0,1% SDS a 37°C durante 45 minutos, e em ainda modalidades, "estringência máxima" condições envolve outra etapa de lavar compreendendo lavar com uma solução de 0,2 X SSC/0,1% SDS a 37°C durante 60 minutos. Assim, várias modalidades da 15 presente invenção fornecem polinucleotídeos capazes de hibridizar em um derivado sondado da seqüência de nucleotídeos provida em SEQ ID NOS:1 ou 2, sob condições de estringência média, alta e/ou máxima.

Após lavar, a membrana é secada e a sonda ligada detectada. Se P32 ou outro radioisótopo for usado como o agente de rotulação, a sonda ligada é detectada por autorradiografia. Outras técnicas para a visualização de outras sondas são bem-conhecidas do versado. A detecção de uma son- da ligada indica uma seqüência de ácido nucleico tem a desejada homologi-

a, e assim identidade, para qualquer seqüência de interesse aqui apresenta- da é englobada pela presente invenção. Assim, a presente invenção provê 25 métodos para a detecção de ácido nucleico codificando a protease engloba- da pela presente invenção que compreende hibridizar parte ou toda a se- qüência de ácido nucleico de SEQ ID N0 1 com outro ácido nucleico de ori- gem genômica ou cDNA.

Como indicado acima, em outras modalidades, condições de hibridização são baseadas na temperatura de fusão (Tm) do complexo de ligação do ácido nucleico, para conferir a "estringência" definida, como expli- cado abaixo. A "estringência máxima" tipicamente ocorre em cerca de Tm- 5°C (5°C abaixo do Tm da sonda); " estringência alta " em cerca de 5°C a 10°C abaixo deTm; " estringência intermediária" em cerca de 10°C a 20°C abaixo de Tm; e " estringência baixa" em cerca de 20° C a 25°C abaixo do Tm. Como conhecido do versado na técnica, a hibridização de estringência 5 média, alta 6 máxima, é selecionada de modo que condições são otimizadas para identificar ou detectar os homólogos de seqüência de polinucleotídeos ou seqüências de polinucleotídeos equivalentes.

Em ainda modalidades adicionais, a presente invenção provê construções de ácido nucleico (isto é, vetores de expressão) compreenden- do os polinucleotídeos codificando as proteases da presente invenção. Em outras modalidades, a presente invenção provê células hospedeiras trans- formadas com pelo menos um destes vetores.

Em outras modalidades, a presente invenção provê seqüências de polinucleotídeos ainda codificando a seqüência de sinal, como descrito 15 no pedido de patente U.S. número de série 10/576,331, incorporado por re- ferência em sua totalidade. Em algumas destas modalidades, a presente invenção provê uma seqüência com uma seqüência de sinal putativo, e poli- nucleotídeos sendo capazes de hibridizar em uma sonda derivada da se- qüência de nucleotídeos descrita em SEQ ID N0 1 sob condições de estrin- 20 gência média, alta e/ou máxima, em que as seqüências de sinal tem subs- tancialmente a mesma atividade de sinal que a seqüência de sinal codificada pelo polinucleotídeo da presente invenção.

Em algumas modalidades, a atividade de sinal é indicada por substancialmente o mesmo nível de secreção da protease no meio de fer- 25 mentação, como o material de partida, como descrito no pedido de patente U.S. número de série 10/576,331. Meios adicionais para determinar os níveis de secreção de proteína heteróloga ou homóloga em uma célula hospedeira Gram-positiva e detectar as proteínas secretadas incluem usar anticorpos ou policlonais ou monoclonais específicos para a proteína, exemplos incluem 30 teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoteste (RIA) e clas- sificação de células ativadas fluorescentes (FACS), com bem-conhecido do versado na técnica. Outros aspectos da presente invenção englobam polipeptídeos tendo atividade proteolítica compreendendo 65% identidade de seqüência de aminoácidos, pelo menos 70% de identidade de seqüência, pelo menos 75% de identidade de seqüência de aminoácidos, pelo menos 80% de identidade 5 de seqüência de aminoácidos, pelo menos 85% de identidade de seqüência de aminoácidos, pelo menos 90% de identidade de seqüência de aminoáci- dos, pelo menos 92% de identidade de seqüência de aminoácidos, pelo me- nos 95% de identidade de seqüência de aminoácidos, pelo menos 97% de identidade de seqüência de aminoácidos, pelo menos 98% de identidade de 10 seqüência de aminoácidos e pelo menos 99% de identidade de seqüência de aminoácidos para uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS:7 ou 8, e como aqui descrito e no pedido de patente U.S. número de série 10/576,331. A atividade proteolítica destes polipeptídeos é determinada u- sando métodos conhecidas na técnica e incluem tais métodos como os usa- 15 dos para avaliar a função de detergente. Em outras modalidades, os polipep- tídeos são isolados.

III. Obtenção de polinucleotídeos codificando Micrococcineae (por e- xemplo, Cellulomonas)

Proteases da Presente invenção

Em algumas modalidades, ácido nucleico codificando uma pro-

tease da presente invenção é obtido por procedimentos padrões conhecidos na técnica a partir de, por exemplo, DNA clonado (por exemplo, uma "biblio- teca" de DNA), síntese química, clonagem de cDNA, PCR, clonagem de DNA genômico ou fragmentos dos mesmos, ou purificado a partir de uma 25 célula desejada, como espécies bacterianas ou fúngicas (Vide, por exemplo, Sambrook et ai, supra [1989]; e Glover e Hames (eds.), DNA Cloninq: A Practical Approach, Vols. 1 e 2, 2a. ed.). A síntese de seqüências de polinu- cleotídeos é bem-conhecida na técnica (Vide por exemplo, Beaucage e Ca- ruthers, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 [1981]), incluindo o uso de sinteti- 30 zadores automatizados (Vide por exemplo, Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res., 12:6159-6168 [1984]). As seqüências de DNA também po- dem ser feitas sob encomenda e solicitadas a partir de várias fontes comer- ciais. Como descrito em maiores detalhes aqui, em algumas modalidades, seqüências de ácido nucleico derivadas de DNA genômico contém regiões regulatórias além das regiões de codificação.

Em algumas modalidades envolvendo a clonagem molecular do 5 gene a partir do DNA genômico, os fragmentos de DNA são gerados, alguns dos quais compreendem pelo menos uma porção do gene desejado. Em algumas modalidades, o DNA é clivado em sítios específicos usando várias enzimas de restrição. Em algumas modalidades alternativas, DNAse é usada na presença de manganês para fragmentar DNA, ou o DNA é fisicamente 10 cisalhado (por exemplo, por sonicação). Os fragmentos de DNA linear cria- dos são então separados de acordo com o tamanho e amplificados por téc- nicas-padrão, incluindo mas não-limitadas a eletroforese de agarose e gel de poliacrilamida, PCR e cromatografia de coluna.

Uma vez que os fragmentos de ácido nucleico são gerados, a 15 identificação do fragmento de DNA específico codificando uma protease po- de ser obtida em vários modos. Por exemplo, em algumas modalidades, uma enzima de hidrólise proteolítica codificando o gene asp ou seu RNA específico, ou um fragmento do mesmo, como uma sonda ou iniciador, é isolada, rotulada e então usada em testes de hibridização bem-conhecidos 20 do versado para detectar um gene gerado (Vide por exemplo, Benton e Da- vis, Science 196:180 [1977]; e Grunstein e Hogness, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:3961 [1975]). Em modalidades preferidas, fragmentos de DNA com- partilhando uma similaridade de seqüência substancial para a sonda hibridi- zar sob uma estringência média a alta.

Em algumas modalidades preferidas, amplificação é obtida u-

sando PCR, como conhecido na técnica. Em algumas modalidades preferi- das, uma seqüência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 4 nucleotí- deos e tanto quanto cerca de 60 nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1-5, (isto é, fragmentos), preferivelmente cerca de 12 a 30 nucleotídeos, e mais preferi- 30 velmente cerca de 25 nucleotídeos é usada em quaisquer combinações a apropriadas como o iniciador de PCR. Estes mesmos fragmentos também encontram uso como sondas em hibridização e métodos de detecção de produtos.

Em algumas modalidades, isolamento de construções de ácido nucleico da invenção a partir de uma biblioteca genômica ou cDNA utiliza PCR com uso de iniciadores de oligonucleotídeos degenerados preparados 5 com base em uma seqüência de aminoácidos da proteína. Os iniciadores podem ser de qualquer comprimento de segmento, por exemplo pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 8, pelo menos 15, pelo menos 20, nucleotídeos em comprimento.

Em vista do acima, será notado que as seqüências de polinucle- 10 otídeos aqui apresentadas e baseadas nas seqüências de polinucleotídeos providos em SEQ ID NOS: 1-5 são utilizáveis para obter fragmentos idênticos ou homólogos de polinucleotídeos de outras espécies, e particularmente de bactérias que codificam enzimas tendo a atividade de serina protease ex- pressada por protease 69B4. Seqüências adicionais são providas no pedido 15 de patente U.S. número de série 10/576,331.

IV. Variantes de mutação de serina proteases da presente invenção

Como indicado aqui, modalidades particularmente preferidas, a presente invenção provê variantes de mutação múltiplos de serina protease. Em algumas da maior parte das modalidades particularmente preferidas, 20 estas variantes demonstram desempenho melhorado como comparado com a protease parental (por exemplo, tipo selvagem ). Em algumas destas den- tre a maior parte das modalidades particularmente preferidas, as variantes tem melhorado desempenho de lavagem, estabilidade LAS, e/ou atividade proteolítica. Assim, estas variantes encontram uso em numerosas aplica- 25 ções, incluindo mas não-limitadas a detergentes para lavagem de louça, de- tergentes para lavagem de roupas, e detergentes para limpeza de superfí- cies.

V. Expressão e recuperação de serina proteases da Presente invenção

Qualquer meio apropriado para expressão e recuperação das serina proteases da presente invenção encontram uso aqui. De fato, os ver- sados na técnica conhecem muitos métodos apropriados para a clonagem de um polipeptídeo derivado de Cellulomonas tendo atividade proteolítica, assim como uma enzima adicional (por exemplo, um segundo peptídeo ten- do atividade proteolítica, como uma protease, celulase, mannanase, ou ami- lase, etc.). Numerosos métodos são também conhecidos na técnica para introdução de pelo menos uma cópia (por exemplo múltipla) de polinucleotí- 5 deo(s) codificando a(s) enzima(s) da presente invenção em conjunto com qualquer uma das seqüências adicionais desejadas, nos genes ou genoma de células hospedeiras.

Em geral, os procedimentos padrão para clonagem de genes e introdução de regiões codificando proteases exógenas (incluindo cópias múl- 10 tiplas das regiões de codificação exógenas) nos referidos genes encontram uso em obtenção de um derivado de protease de Cellulomonas 69B4 ou homólogo do mesmo. De fato, o presente relatório, incluindo os exemplos, provê tal ensinamento. No entanto, métodos adicionais conhecidos na técni- ca são também apropriados (Vide por exemplo, Sambrook et al. supra 15 (1989); Ausubel et al., supra [1995]; e Harwood e Cutting, (eds.) Molecular Bioloqical Methods for Bacillus," John Wiley e Sons, [1990]; e WO 96/34946).

Em algumas modalidades preferidas, as seqüências de polinu- cleotídeos da presente invenção são expressadas por ligação operativa das 20 mesmas para uma seqüência de controle de expressão em um vetor de ex- pressão apropriado e empregadas pelo vetor de expressão para transformar um hospedeiro apropriado de acordo com técnicas bem-estabelecidas na técnica.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos produzidos em ex- pressão das seqüências de DNA desta invenção são isolados da fermenta- ção de culturas de células e purificados em várias modos de acordo com técnicas bem-estabelecidas na técnica. Os versados na técnica são capazes de selecionar as técnicas de isolamento e purificação mais apropriadas.

Mais particularmente, a presente invenção provê construções, vetores compreendendo polinucleotídeos aqui descritos, células hospedeiras transformadas com tais vetores, proteases expressadas por tais células hos- pedeiras, métodos de expressão e sistemas para a produção de enzimas de serina protease derivadas de micro-organismos, em particular, membros de Micrococcineae, incluindo mas não-limitadas a espécies de Cellulomonas. Em algumas modalidades, o(s) polinucleotídeo(s) codificando serina protea- se(s) são usados para produzir células hospedeiras recombinantes apropria- 5 das para a expressão da(s) serina protease(s). Em algumas modalidades preferidas, os hospedeiros de expressão são capazes de produzir a(a) pro- tease(s) em quantidades comercialmente viáveis. Os detalhes adicionais são providos no pedido de patente U.S., número de série 10/576.231.

VI. Vetores Recombinantes e Células hospedeiras

Como indicado acima, em algumas modalidades, a presente in-

venção provê vetores compreendendo os polinucleotídeos acima menciona- dos. Em algumas modalidades, os vetores (isto é, construções) da invenção codificando a protease são de origem genômica (por exemplo, preparados através do uso de biblioteca genômica e triagem para as seqüências de DNA 15 codificando para toda ou parte da protease por hibridização usando sondas de oligonucleotídeo sintéticas de acordo com técnicas-padrão). Estes veto- res são descritos em maiores detalhes no pedido de patente U.S. número de série 10/576.331.

Como indicado acima, em algumas modalidades, a presente in- venção também provê células hospedeiras transformadas com os vetores descritos acima. As células hospedeiras adicionais são descritas em maiores detalhes no pedido de patente U.S. número de série 10/576.331.

VII. Aplicações para Enzimas Serina Protease

Como descrito em maiores detalhes aqui, as proteases da pre- 25 sente invenção tem importantes características que as tornam muito apropri- adas para algumas aplicações. Por exemplo, as proteases da presente in- venção tem uma melhorada estabilidade térmica. Em algumas modalidades, as enzimas também demonstram melhorada estabilidade oxidativa, e melho- rada estabilidade do quelador, como comparado com algumas proteases 30 atualmente usadas. Assim, estas proteases encontram uso em composições de limpeza. De fato, sob algumas condições de lavagem, as presentes pro- teases demonstram um desempenho de lavagem comparativo ou melhora- do, como comparado com proteases de subtilisina atualmente usadas. As- sim, contempla-se que composições de lavagem e/ou de enzimas da pre- sente invenção serão providas em várias composições de limpeza. Em al- gumas modalidades, as proteases da presente invenção são usadas do 5 mesmo modo que as proteases de subtilisina (isto é, proteases atualmente em uso). Assim, as presentes proteases encontram uso em várias composi- ções de limpeza, assim como aplicações em ração animal, processamento de couro (por exemplo, em banhos de macerar), hidrólise de proteína, e em usos têxteis. As proteases identificadas também encontram uso em aplica- 10 ções de cuidado pessoal.

Assim, as proteases da presente invenção encontram uso em várias aplicações industriais, em particular nas indústrias de limpeza, desin- fecção, ração animal, e têxtil/couro. Em algumas modalidades, a(s) protea- se(s) da presente invenção são combinadas com detergentes, builders, a- 15 gentes alvejantes e outros ingredientes convencionais para produzir as vá- rias novas composições de limpeza utilizáveis na lavagem de outras e outras técnicas de limpeza como, por exemplo, detergentes para lavagem de rou- pas (tanto em pó como líquido), molhos de pré-lavagem, alvejantes para to- dos tecidos, detergentes para lava-louças (tanto líquidos como em pó), Iim- 20 padores domésticos, particularmente aplicações de sabão em barra e líqui- dos e desentupidores. Além disso, as proteases encontram uso na limpeza de lentes de contato, assim como outros itens, por contato destes materiais com uma solução aquosa da composição de limpeza. Além disso, estas pro- teases de ocorrência natural podem ser usadas, por exemplo em hidrólise de 25 peptídeos, tratamento de esgoto, aplicações têxteis, limpeza de dispositivos médicos, remoção de biofilme, como enzimas de fusão-clivagem em produ- ção de proteínas, etc. A composição destes produtos não é crítica para a presente invenção, desde que a(s) protease(s) mantenha sua função no con- junto usado. Em algumas modalidades, as composições são prontamente 30 preparadas por combinação de uma quantidade efetiva de limpeza da prote- ase ou uma composição de enzima compreendendo a preparação de enzi- ma protease com os componentes convencionais destas composições em suas quantidades reconhecidas na técnica.

As proteases da presente invenção encontram uso particular na indústria de limpeza, incluindo, mas não-limitadas detergentes para lavagem de roupas e louças. Estas aplicações colocam as enzimas sob vários estres- 5 ses ambientais. As proteases da presente invenção provêem vantagens so- bre muitas enzimas atualmente usadas enzimas, devido à sua estabilidade sob várias condições.

De fato, existem várias condições de lavagem incluindo formula- ções detergentes variadas, volumes de água de lavagem, temperaturas da 10 água de lavagem, e extensões do tempo de lavagem, às quais as proteases envolvidas na lavagem estão expostas. Além disso, as formulações deter- gentes usadas em diferentes áreas geográficas têm diferentes concentra- ções de seus componentes relevantes presentes na água de lavagem. Por exemplo, um detergente da Europa tipicamente tem cerca de 4500-5000 15 ppm de componentes detergentes na água de lavar, enquanto um detergen- te japonês tipicamente tem aproximadamente 667 ppm de componentes de- tergentes na água de lavar. Na América do Norte, particularmente nos Esta- dos Unidos, detergentes tipicamente tem cerca de 975 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavar.

Um sistema de concentração baixa de detergente inclui deter-

gentes onde menos do que cerca de 800 ppm de componentes detergentes estão presentes na água de lavar. Os detergentes japoneses são tipicamen- te considerados um sistema de baixa concentração de detergente, como eles têm aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavar.

Uma concentração média de detergentes inclui detergentes on- de entre cerca de 800 ppm e cerca de 2000 ppm de componentes detergen- tes estão presentes na água de lavar. Os detergentes da América do Norte são geralmente considerados como sendo sistemas de concentração média 30 de detergente como eles têm aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavar. O Brasil tipicamente tem aproxima- damente 1500 ppm de componentes detergentes presentes na água de Ia- var.

Um sistema de concentração alta de detergente inclui detergen- tes onde mais do que cerca de 2000 ppm de componentes detergentes es- tão presentes na água de lavar. Os detergentes da Europa são geralmente 5 considerados como sendo sistemas de concentração alta de detergente co- mo eles têm aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes na água de lavar.

Os detergentes da América Latina são geralmente detergentes builder de fosfato, com elevado teor de espuma, e a faixa de detergentes 10 usados na América Latina pode cair tanto em concentrações de detergente média quanto alta, como estão na faixa de 1500 ppm a 6000 ppm de com- ponentes detergentes na água de lavar. Como acima mencionado, o Brasil tipicamente tem aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes na água de lavar. No entanto, outros lugares geográficos com de- 15 tergentes builder de fosfato, com elevado teor de espuma, não-limitados a outros países da América Latina podem ter sistemas de concentração de detergentes elevadas, com até cerca de 6000 ppm de componentes deter- gentes presentes na água de lavar.

À Iuz do acima exposto, é evidente que concentrações de com- 20 posições detergentes em soluções de lavagem típicas em todo o mundo va- riam de menos do que cerca de 800 ppm de composição detergente ("geo- grafias de concentração baixa de detergente "), por exemplo cerca de 667 ppm no Japão, a entre cerca de 800 ppm a cerca de 2000 ppm ("geografias de concentração média de detergente "), por exemplo cerca de 975 ppm em 25 U.S. e cerca de 1500 ppm em Brasil, a acima do que cerca de 2000 ppm ("geografias de concentração alta de detergente"), por exemplo cerca de 4500 ppm a cerca de 5000 ppm em Europa e cerca de 6000 ppm em geo- grafias com reforçadores de fosfato de alto teor de espuma.

As concentrações das soluções de lavagem típicas são determi- nadas empiricamente. Por exemplo, nos Estados Unidos, uma máquina de lavar típica mantém um volume de cerca de 64,4 L de solução de lavagem. Assim, a fim de obter uma concentração de cerca de 975 ppm de detergente dentro da solução de lavagem, cerca de 62,79 g de composição detergente devem ser adicionados a 64,4 L de solução de lavagem. Esta quantidade é a quantidade típica medida na água de lavagem pelo consumidor usando o copo de medida fornecido junto com o detergente.

5 Como outro exemplo, diferentes locais geográficos usando dife-

rentes temperaturas de lavagem. A temperatura da água de lavagem no Ja- pão é tipicamente menor do que a usada na Europa. Por exemplo, a tempe- ratura da água de lavagem na América do Norte e Japão pode estar entre 10 e 30°C (por exemplo, cerca de 20°C), enquanto a temperatura da água de 10 lavagem na Europa está tipicamente entre 30 e 60°C (por exemplo, cerca de 40°C).

Como um outro exemplo, diferentes locais geográficos tipica- mente têm diferentes durezas de água. A dureza da água é geralmente des- crita em termos de Ca2+/Mg2+ mistos em 0,01714 grama por litro. A dureza é 15 uma medida da quantidade de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) na água. A maior parte da água nos Estados Unidos é dura, mas o grau de dureza varia. Água moderadamente dura (60- 120 ppm), a dura (121 - 181 ppm) tem 60 a 181 partes por milhão (partes por milhão convertidas em grãos por galão (GPG) é n° de ppm dividido por 17,1 igual a grãos por galão de minerais de 20 dureza (vide tabela 13-1).

A dureza de água na Europa é tipicamente maior do que 179,5 ppm (10,5 GPG) (por exemplo, 179,5 a 3095,1 ppm (10,5 a 20 GPG)) de Ca2+/Mg2+ mistos (por exemplo, cerca de 256,5 ppm (20 GPG) de Ca2VMg2+ mistos). A dureza da água na América do Norte é tipicamente maior do que 25 a dureza da água no Japão, mas menor do que a dureza da água na Euro- pa. Por exemplo, dureza da água na América do Norte pode estar entre 51,3 a 171 ppm (3 a 10 GPG), 51,3 a 136,8 ppm (3 a 8 GPG) ou cerca de 102,6 ppm (6 GPG). A dureza da água no Japão é tipicamente menor do que a dureza da água na América do Norte, geralmente menor do que 68,4 PPM (4 30 GPG), por exemplo 51,3 PPM (3 GPG) 0,0514 grama por litro de Ca2+/Mg2+ mistos.

Assim, em algumas modalidades, a presente invenção provê proteases que mostram um desempenho de lavagem surpreendente em pelo menos um conjunto de condições de lavagem (por exemplo, temperatura da água, dureza da água, e/ou concentração do detergente). Em algumas mo- dalidades, as proteases da presente invenção são comparáveis em desem- 5 penho de lavagem a proteases de subtilisina. Em algumas modalidades, as proteases da presente invenção demonstram desempenho de lavagem me- lhorado, como comparado com proteases de subtilisina. Assim, em algumas modalidades preferidas da presente invenção, as proteases aqui apresenta- das demonstram melhorada estabilidade oxidativa, melhorada estabilidade 10 térmica, e/ou melhorada estabilidade do quelador.

Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção provê a ASP protease, assim como homólogos e variantes da protease. Em moda- lidades particularmente preferidas, as variantes ASP compreendem substitu- ições múltiplas na seqüência de protease ASP de tipo selvagem. Estas pro- 15 teases encontram uso em quaisquer aplicações em que se deseja limpar manchas à base de proteínas dos têxteis ou tecidos.

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da pre- sente invenção são formuladas como composições detergentes para lava- gem manual ou em máquina, incluindo composições aditivas para lavagem 20 de roupas, e composições apropriadas para uso no pré-tratamento de teci- dos manchados, composições amaciantes de tecidos adicionadas no enxá- güe, e composições para uso em operações de limpeza de superfícies duras em ambientes domésticos em geral, assim como em operações de lavagem de louça. Os versados na técnica conhecem as diferentes formulações que 25 podem ser usadas como composições de limpeza. Em modalidades preferi- das, as proteases da presente invenção compreendem desempenho compa- rativo ou melhorado em composições detergentes (isto é, como comparado com outras proteases). Em algumas modalidades, desempenho de limpeza é avaliado por comparação das proteases da presente invenção com protea- 30 ses de subtilisina em vários testes de limpeza que usam manchas sensíveis a enzima como ovo, grama, sangue, leite, etc, em método-padrão. De fato, os versados conhecem as metodologias espectrofotométricas e outras analí- ticas usadas para avaliar o desempenho do detergente sob condições pa- drões do ciclo de lavagem.

Os ensaios que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitados aos descritos em WO 99/34011, e Patente U.S. n° 5 6.605.458 (Vide por exemplo, exemplo 3). Na Patente U.S. n° 6.605.458, no exemplo 3, uma dose de detergente de 3,0 g/l a pH10,5, tempo de lavagem de 15 minutos, a 15 C, dureza da água de 6°dH, 10nM concentração enzima em béqueres de vidro de 150 ml com barra de agitação, 5 pedaços de têxtil (phi 2,5 cm) em 50 ml, ,material de teste EMPA 117 do CenterforTest Mate- 10 riais Holland são usados. A medida de refletância "R" no material de teste foi feita a 460 nm usando um fotômetro Macbeth CoIorEye 7000. Os métodos adicionais são providos nos exemplos aqui. Assim, estes métodos também encontram uso na presente invenção.

A adição de proteases da invenção a composições de limpeza 15 convencionais não cria qualquer limitação de uso especial. Em outras pala- vras, qualquer temperatura e pH apropriados para o detergente é também apropriada para as presentes composições, desde que o pH esteja dentro da faixa aqui especificada, e a temperatura esteja abaixo da temperatura de desnaturação da protease descrita. Além disso, proteases da presente in- 20 venção encontram uso em composições de limpeza que não incluem deter- gentes, novamente ou sozinhas ou em combinação com encorpadores e estabilizadores.

Quando usadas em composições de limpeza ou detergentes, estabilidade oxidativa ainda é levada em consideração. Assim, em algumas 25 aplicações, a estabilidade é melhorada, diminuída ou comparável à de pro- teases de subtilisina como desejado para vários usos. Em algumas modali- dades preferidas, estabilidade oxidativa melhorada é desejada. Algumas das proteases da presente invenção encontram uso particular em tais aplica- ções.

Quando usadas em composições de limpeza ou detergentes,

estabilidade térmica ainda é levada em consideração. Assim, em algumas aplicações, a estabilidade é melhorada, diminuída ou comparável à de pro- teases de subtilisina como desejado para vários usos. Em algumas modali- dades preferidas, termoestabilidade melhorada é desejada. Algumas das proteases da presente invenção encontram uso particular em tais aplica- ções.

5 Quando usadas em composições de limpeza ou detergentes,

estabilidade de quelador ainda é levada em consideração. Assim, em algu- mas aplicações, a estabilidade é melhorada, diminuída ou comparável à de proteases de subtilisina como desejado para vários usos. Em algumas mo- dalidades preferidas, estabilidade de quelador melhorada é desejada. Algu- 10 mas das proteases da presente invenção encontram uso particular em tais aplicações.

Em algumas modalidades da presente invenção, proteases de ocorrência natural são providas as quais demonstram uma atividade enzimá- tica modificada em diferentes pHs quando comparadas com as proteases de subtilisina. Um perfil de atividade de pH é um gráfico de pH contra atividade da enzima e pode ser construído como descrito nos exemplos e/ou por mé- todos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, é desejado obter proteases de ocorrência natural com perfis mais amplos (isto é, os tendo maior atividade em faixa de pHs do que uma protease de subtilisina). Em outras formas realização, as enzimas não têm uma atividade significante- mente maior em qualquer pH, ou homólogos de ocorrência natural com per- fis mais agudos (isto é, os tendo atividade melhorada quando comparados com proteases de subtilisina em um dado pH, e menor atividade em outros pontos). Assim, em várias modalidades, as proteases da presente invenção têm diferentes ótimos de pH e/ou faixas. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer faixa de pH ou pH específico.

Em algumas modalidades da presente invenção, as composi- ções de limpeza compreendem, proteases da presente invenção em um ní- vel de 0,00001 % a 10% de 69B4 e/ou outras proteases da presente inven- 30 ção em peso da composição e o resto (por exemplo, 99,999% a 90,0%) compreendendo materiais adjuntos de limpeza em peso da composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da pre- sente invenção compreendem, a 69B4 e/ou outra proteases em um nível de 0,0001 % a 10%, 0,001% a 5%, 0,001% a 2%, 0,005% a 0,5% 69B4 ou outra protease da presente invenção em peso da composição e o resto da compo- sição de limpeza (por exemplo, 99,9999% a 90,0%, 99,999 % a 98%, 5 99,995% a 99,5% em peso) compreendendo materiais adjuntos de limpeza.

Em algumas modalidades, composições de limpeza preferidas, além da preparação de proteases da invenção, compreendem uma ou mais enzimas adicionais ou derivados de enzimas que provêem desempenho de limpeza e/ou benefícios de cuidados do tecido. Estas enzimas incluem, mas 10 não são limitadas a outras proteases, lipases, cutinases, amilases, celula- ses, peroxidases, oxidases (por exemplo laccases), e/ou mannanases.

Qualquer outra protease apropriada para uso em soluções alca- linas encontra uso nas composições da presente invenção. As proteases apropriadas incluem as de origem animal, vegetal ou microbiana. Em moda- 15 Iidades particularmente preferidas, proteases microbianas são usadas. Em algumas modalidades, mutantes quimicamente ou geneticamente modifica- dos são incluídos. Em algumas modalidades, a protease é uma serina prote- ase, preferivelmente uma protease microbiana alcalina ou uma protease de tipo tripsina. exemplos de proteases alcalinas incluem subtilisinas, especial- 20 mente as derivadas de Bacillus (por exemplo, subtilisina, lentus, amylolique- faciens, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168). Os exemplos adicionais incluem as proteases mutantes descritas em Pat. U.S. N2i RE 34.606, 5.955.340, 5.700.676, 6.312.936, e 6.482.628, sendo todas incorporadas aqui por referência. Os exemplos adicionais de 25 protease incluem, mas não são limitados a tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina), e as proteases descritas em WO 89/06270. As enzimas proteases preferidas comercialmente disponíveis incluem as vendidas sob os nomes comerciais MAXATASE®, MAXACAL®, MAXAPEM®, OPTICLE- AN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT® e PURAFECT® OXP 30 (Genencor), as vendidas sob os nomes comerciais ALCALASE®, SAVINA- SE®, PRIMASE®, DURAZYM®, RELASE® e ESPERASE® (Novozymes); e as vendidas sob os nomes comerciais BLAP® (Henkel Kommanditgesells- chaft auf Aktien, Duesseldorf, Alemanha. Várias proteases são descritas em W095/23221, WO 92/21760, e Pat. U.S. N25 5.801.039, 5.340.735, 5.500.364, 5.855.625. Uma variante BPN' adicional ("BPN’-var 1" e "BPN- variante 1"; como referido aqui) é descrita em U.S. RE 34,606. Uma variante 5 GG36 adicional ("GG36-var.1" e "GG36-variante 1"; como referido aqui) é descrita em U.S. 5,955,340 e 5,700,676. Uma outra variante GG36- é descri- ta em Patentes U.S. 6.312.936 e 6.482.628. Em um aspecto da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção compreendem enzimas protease adicionais em um nível de 0,00001 % a 10% de protease 10 adicional em peso da composição e 99,999% a 90,0% de materiais adjuntos de limpeza em peso da composição. Em outras modalidades da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também com- preendem, proteases em um nível de 0,0001 % a 10%, 0,001% a 5%, 0,001% a 2%, 0,005% a 0,5% 69B4 protease (ou seus homólogos ou varian- 15 tes) em peso da composição e o resto da composição de limpeza (por e- xemplo, 99,9999% a 90,0%, 99,999 % a 98%, 99,995% a 99,5% em peso) compreendendo materiais adjuntos de limpeza.

Além disso, qualquer Iipase apropriada para uso em soluções alcalinas encontra uso na presente invenção. As Iipases apropriadas inclu- em, mas não são limitadas às de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente ou geneticamente modificados são englobados pela presente invenção, exemplos de Iipases utilizáveis incluem Iipase de Humicola Ianugi- nosa (Vide por exemplo, EP 258 068, e EP 305 216), Iipase de Rhizomucor miehei (Vide por exemplo, EP 238 023), Iipase de Candida, como Iipase de C. antarctica (por exemplo, a Iipase de C. antarctica A ou B; Vide por exem- plo, EP 214 761), a Iipase de Pseudomonas como Iipase de P. alcaligenes e P. pseudoalcaligenes (Vide por exemplo, EP 218 272), Iipase de P. cepacia (Vide por exemplo, EP 331 376), Iipase de P. stutzeri (Vide por exemplo, GB 1,372,034), Iipase de P. fluorescens, Iipase de Bacillus (por exemplo, Iipase de B. subtilis [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); Iipase de B. stearotermophilus [Vide por exemplo, JP 64/744992]; e Iipase de

B. pumilus [Vide por exemplo, WO 91/16422]). Além disso, várias Iipases clonadas encontram uso em algumas modalidades da presente invenção, incluindo mas não-limitadas a Iipase de Penicillium camembrotii (Vide, Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991]), Iipase de Geotricum candidum (Vide, Schimada et al., J. Biochem., 106:383- 5 388 [1989]), e várias Iipases de Rhizopus como Iipase de R. delemar (Vide, Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]), a Iipase de R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) e Iipase de R. oryzae.

Outros tipos de enzimas lipolíticas como cutinases também en- contram uso em algumas modalidades da presente invenção, incluindo mas não-limitadas à cutinase derivada de Pseudomonas mendocina (Vide, WO 88/09367), ou cutinase derivada de Fusarium solani pisi (Vide, WO 90/09446).

As Iipases adicionais apropriadas incluem Iipases comercialmen- te disponíveis como M1 LIPASE®, LUMA FAST®, e LIPOMAX® (Genencor); LIPOLASE® e LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); e LIPASE P® "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japão).

Em algumas modalidades da presente invenção, as composi- ções de limpeza da presente invenção ainda compreendem Iipases em um nível de 0,00001 % a 10% de Iipase adicionais em peso da composição e o 20 resto de materiais adjuntos de limpeza em peso da composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem, Iipases em um nível de 0,0001 % a 10%, 0,001% a 5%, 0,001% a 2%, 0,005% a 0,5% Iipase em peso da composição.

Qualquer amilase (alfa e/ou beta) apropriadas para uso em solu- 25 ções alcalinas também encontram uso em algumas modalidades da presen- te invenção. As amilases apropriadas incluem, mas não são limitadas de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente ou geneticamente modificados são incluídos em algumas modalidades. Amilases que encon- tram uso na presente invenção, incluem, mas não são limitadas a a-amilases 30 obtidas de B. Iieheniformis (Vide por exemplo, GB 1,296,839). As amilases comercialmente disponíveis que encontram uso na presente invenção inclu- em, mas não são limitadas a DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, e BAN® (Novozymes) e RAPIDASE®, e MAXAMYL® P (Ge- nencor International). Em algumas modalidades da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção ainda compreendem amila- ses em um nível de 0,00001 % a 10% de amilase adicional em peso da 5 composição e o resto de materiais adjuntos de limpeza em peso de compo- sição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpe- za da presente invenção também compreendem, amilases em um nível de 0,0001 % a 10%, 0,001% a 5%, 0,001% a 2%, 0,005% a 0,5% amilase em peso da composição.

Qualquer celulase apropriada para uso em soluções alcalinas

encontram uso modalidades da presente invenção. As celulases apropriadas incluem, mas não são limitadas às de origem bacteriana ou fúngica. Os mu- tantes quimicamente ou geneticamente modificados são incluídos em algu- mas modalidades. As celulases apropriadas incluem, mas não são limitadas 15 a celulases de Humicola insolens (Vide por exemplo, Patente U.S. n° 4,435,307). As celulases especialmente apropriadas são as celulases tendo benefício para o cuidado da cor (Vide por exemplo, EP 0 495 257).

As celulases comercialmente disponíveis que encontram uso no presente incluem, mas não são limitadas a CELLUZYME® (Novozymes), e 20 KAC-500(B) ® (Kao Corporation). Em algumas modalidades, celulases são incorporadas as porções ou fragmentos de celulases de tipo selvagem ma- duras, ou variantes, em que uma porção do N- término é deletada (Vide por exemplo, Patente U.S. n° 5.874.276).

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da pre- 25 sente invenção ainda podem compreender celulases em um nível de 0,00001 % a 10% de celulase adicional em peso da composição e o resto de materiais adjuntos de limpeza em peso da composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem celulases em um nível de 0,0001 % a 10%, 0,001% a 30 5%, 0,001% a 2%, 0,005% a 0,5% celulase em peso da composição.

Quaisquer mannanases apropriadas para uso em composições detergentes e ou soluções alcalinas encontram uso na presente invenção. As mannanases apropriadas incluem, mas não são limitados às de origem bacteriana ou fúngica. Os mutantes quimicamente ou geneticamente modifi- cados são incluídos em algumas modalidades. Várias mannanases são co- nhecidas que encontram uso na presente invenção (Vide por exemplo, Pa- 5 tente U.S. n° 6.566.114, Patente U.S. n° 6.602.842, e Patente U.S. n°

6.440.991, todas sendo incorporadas aqui por referência).

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da pre- sente invenção ainda podem compreender mannanases em um nível de 0,00001 % a 10% de mannanase adicional em peso da composição e o res- 10 to de materiais adjuntos de limpeza em peso de composição. Em outros as- pectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente in- venção também compreendem, mannanases em um nível de 0,0001 % a 10%, 0,001% a 5%, 0,001% a 2%, 0,005% a 0,5% mannanases em peso da composição.

Em algumas modalidades, peroxidases são usadas em combi-

nação com peróxido de hidrogênio ou uma fonte do mesmo (por exemplo, um percarbonato, perborato ou persulfato). Em modalidades alternativas, oxidases são usadas em combinação com oxigênio. Ambos os tipos de en- zimas são usados para " alvejante de solução" (isto é, para evitar a transfe- 20 rência de um corante de têxtil para um tecido tingido ou outro tecido quando os tecidos são lavados juntos em um líquido de lavagem), preferivelmente juntos com um agente melhorador (Vide por exemplo, WO 94/12621 e WO 95/01426). As oxidases/oxidases apropriadas incluem, mas não são limita- das às de origem em plantas, bactérias ou fungos. Os mutantes quimica- 25 mente ou geneticamente modificados são incluídos em algumas modalida- des

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da pre- sente invenção ainda podem compreender enzimas peroxidase e/ou oxidase em um nível de 0,00001 % a 10% de peroxidase e/ou oxidase adicional em 30 peso da composição e o resto de materiais adjuntos de limpeza em peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem enzimas peroxidase e/ou oxidase em um nível de 0,0001 % a 10%, 0,001% a 5%, 0,001% a 2%, 0,005% a 0,5% enzimas peroxidase e/ou oxidase em peso da composição.

Misturas das enzimas acima mencionadas são englobadas aqui, em particular a mistura de uma enzima 69B4, uma ou mais proteases adi- 5 cionais, pelo menos uma amilase, pelo menos uma lipase, pelo menos uma mannanase, e/ou pelo menos uma celulase. De fato, contempla-se que vá- rias misturas destas enzimas irão encontrar uso na presente invenção.

Contempla-se que os níveis variados da protease e uma ou mais enzimas adicionais podem estar ambos independentemente em uma faixa 10 de 10%, o resto da composição de limpeza sendo de materiais adjuntos de limpeza. A seleção específica dos materiais adjuntos de limpeza é pronta- mente feita por consideração da superfície, item, ou tecido a ser limpo, e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante uso (por exemplo, através do uso do detergente de lavagem).

Exemplos de materiais adjuntos de limpeza apropriados incluem,

mas não são limitados a tensoativos, reforçadores, alvejantes, ativadores alvejantes, catalisadores alvejantes, outras enzimas, sistemas de estabiliza- ção de enzimas, quelantes, abrilhantadores ópticos, polímeros de liberação de sujeira, agentes de transferência de corantes, dispersantes, supressores 20 de espuma, corantes, perfumes, colorantes, cais de carga, hidrótopos, foto- ativadores, fluorescedores, condicionadores de tecido, tensoativos hidrolisá- veis, conservantes, antioxidante, agentes antirrugas, agentes antipregas, germicidas, fungicidas, salpicos de cor, cuidado de prata, agentes antiemba- çamento e/ou anticorrosão, fontes de alcalinidade, agentes solubilizantes, 25 veículos, auxiliares de processamento, pigmentos, e agentes de controle de pH (Vide por exemplo, Pat. U.S. N— 6.610.642, 6.605.458, 5.705.464, 5.710.115, 5.698.504, 5.695.679, 5.686.014 e 5.646.101, todas sendo incor- poradas aqui por referência). As modalidades de materiais de composição de limpeza específicos são exemplificadas em detalhes abaixo.

Se os materiais adjuntos de limpeza não forem compatíveis com

as proteases da presente invenção nas composições de limpeza, então são usados métodos apropriados de manter os materiais adjuntos de limpeza e as protease(s) separados (isto é, não em contato um com o outro) até a combinação dos dois componentes ser apropriada. Estes métodos de sepa- ração incluem qualquer método apropriado conhecido na técnica (por exem- plo, gel em cápsulas, encapulação, comprimidos, separação física, etc.).

Preferivelmente uma quantidade efetiva de uma ou mais protea- se(s) aqui apresentada(s) é incluída em composições utilizável para limpeza de várias superfícies em necessário de remoção de manchas proteináceas. Estas composições de limpeza incluem composições de limpeza para estas aplicações como limpeza de superfícies duras, tecidos e louça. De fato, em algumas modalidades, a presente invenção provê composições de limpeza de tecidos, enquanto em outras modalidades, a presente invenção provê composições de limpeza não-tecidos. Notavelmente, a presente invenção também provê composições de limpeza apropriadas para cuidado pessoal, incluindo cuidado oral (incluindo dentifrícios, pastas de dentes, colutórios, etc., assim como composições de limpeza de dentaduras), composições de limpeza da pele e cabelo. Pretende-se que a presente invenção englobe composições detergentes em qualquer forma (isto é, líquida, granular, barra, semissólida, géis, emulsões, comprimidos, cápsulas, etc.).

A título de exemplo, várias composições de limpeza em que a protease da presente invenção encontra uso são descritas em maiores deta- lhes abaixo. Em modalidades em que as composições de limpeza da pre- sente invenção são formuladas como composições apropriadas para uso em método(s) de lavagem em máquina, as composições da presente invenção preferivelmente contém pelo menos um tensoativo e pelo menos um com- posto encorpador, assim como um ou mais materiais adjuntos de limpeza preferivelmente selecionados dentre compostos poliméricos orgânicos, a- gentes alvejantes, enzimas adicionais, supressores de espuma, dispersan- tes, dispersantes de sabão de limão, agentes de suspensão de sujeira e an- tirredeposição e inibidores de corrosão. Em algumas modalidades, composi- ções de lavagem de roupas também contém agentes amaciantes (isto é, como materiais adjuntos de limpeza adicionais).

As composições da presente invenção também encontram uso em produtos aditivos detergentes em forma sólida ou líquida. Estes produtos aditivos são destinados a suplementar e/ou reforçar o desempenho de com- posições detergentes convencionais e podem ser adicionados em qualquer estágio do processo de limpeza.

Em modalidades formuladas como composições para uso em métodos de lavagem manual de louça, as composições da invenção preferi- velmente contém pelo menos um tensoativo e preferivelmente pelo menos um material adjunto de limpeza adicional selecionado dentre compostos po- liméricos orgânicos, agentes de melhora de espuma, íons de metal do grupo II, solventes, hidrótropos e enzimas adicionais.

Em algumas modalidades, a densidade das composições deter- gentes para lavagem de roupas aqui está na faixa de 400 a 1200 g/litro, en- quanto em outras modalidades, está na faixa de 500 a 950 g/litro da compo- sição medida a 20°C.

Em algumas modalidades, várias composições de limpeza como as providas em Patente U.S. N0 6.605.458 encontram uso com as proteases da presente invenção. Assim, em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma protease da presente invenção é uma composições granular compacta para limpeza de tecidos, enquanto em ou- tras modalidades, a composição é uma composição granular de limpeza de tecidos utilizável na lavagem de tecidos coloridos, em ainda modalidades, a composição é uma composição granular de limpeza de tecidos que provê amaciamento através da capacidade de lavagem, modalidades adicionais, a composição é uma composição líquida de limpeza de tecidos de carga pe- sada.

Em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma protease da presente invenção são composições de limpeza de tecidos como as descritas em Patente U.S. N0 6,610,642 e Patente U.S. N0 6.376.450. Além disso, as proteases da presente invenção encontram uso em composições detergentes granulares para lavagem de roupas de utilida- de particular sob condições de lavagem na Europa e Japão (Vide por exem- plo, Patente U.S. 6.610.642). Em modalidades alternativas, a presente invenção provê com- posições de limpeza de superfícies duras, compreendendo pelo menos uma protease aqui apresentada. Assim, em algumas modalidades, as composi- ções compreendendo pelo menos uma protease da presente invenção é uma composição granular para superfícies duras, como descrito em Pat. U.S. N— 6. 610.642, Patente U.S. N0 6.376.450, e Patente U.S. N0 6.376.450.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê com- posições para lavagem de louça compreendendo pelo menos uma protease aqui apresentada. Assim, em algumas modalidades, as composições com- preendendo pelo menos uma protease da presente invenção é uma compo- sições granular de superfícies duras como as em Patente U.S. N0 6.610.642, e Patente U.S. N0 6.376.450.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê com- posições para lavagem de louças compreendendo pelo menos uma protease aqui apresentada. Assim, em algumas modalidades, as composições com- preendendo pelo menos uma protease da presente invenção compreendem composições para o cuidado oral como as em Patente U.S. N0 6.376.450, e Patente U.S. N0 6.376.450.

As formulações e descrições dos compostos e materiais adjun- tos de limpeza contidos nas Patentes U.S. N- 6.376.450; 6,605,458; 6,605,458; e 6,610,642 acima mencionadas, são expressamente incorpora- dos por referência aqui. Ainda outros exemplos são especificados nos e- xemplos abaixo.

Ainda mais, a presente invenção provê composições e métodos para a produção de uma ração ou ração animal, caracterizados em que a protease de acordo com a invenção é misturada com ração ou ração animal. Em algumas modalidades, a protease é adicionada como um produto seco antes do processamento, enquanto em outras modalidades ela é adicionada como um líquido antes ou após o processamento. Em algumas modalidades, em que é usado um pó seco, a enzima é diluída como líquido sobre um veí- culo seco como um grão moído. As proteases da presente invenção encon- tram uso como componentes de rações para animais e/ou aditivos como descritos em Patente U.S. N0 5,612,055, Patente U.S. N0 5.314.692, e Pat U.S. N0 5.147.642, todas sendo aqui incorporadas por referência.

O aditivo de enzima para ração de acordo com a presente in- venção é apropriado para preparação em vários métodos. Por exemplo, em algumas modalidades, ele é preparado simplesmente por misturação de en- zimas diferentes tendo as atividades apropriadas para produzir uma mistura de enzimas. Em algumas modalidades, esta mistura de enzima é misturada diretamente com a ração, enquanto em outras modalidades, ela é impregna- da sobre o material veículo à base de cereal, como farinha de soja, trigo mo- ldo e milho. A presente invenção também engloba estes veículos impregna- dos, como eles encontram uso como aditivos de enzimas para ração.

Em algumas modalidades alternativas, um veículo à base de cereais (por exemplo, trigo moído ou milho) é impregnado ou simultanea- mente ou seqüencialmente com enzimas tendo as atividades apropriadas. Por exemplo, em algumas modalidades, um veículo de trigo moído é primei- ro pulverizado com uma xilanase, segundo com uma protease, e opcional- mente com uma β-glucanase. A presente invenção também engloba estes veículos impregnados, como eles encontram uso como aditivos de enzima para ração. Em modalidades preferidas, estes veículos impregnados com- preendem pelo menos uma protease da presente invenção.

Em algumas modalidades, aditivos de ração da presente inven- ção são diretamente misturados com a ração animal, enquanto modalidades alternativas, eles são misturados com um ou mais de outros aditivos de ra- ção como um aditivo de ração de vitamina, aditivo de ração de mineral, e/ou um aditivo de ração de aminoácido. O aditivo de ração resultante incluindo vários tipos diferentes de componentes é então misturado em uma quantida- de apropriada com a ração.

Em algumas modalidades preferidas, aditivos de ração da pre- sente invenção, incluindo veículos a base de cereais são normalmente mis- turados em quantidades de 0,01-50 g por kg de ração, mais preferivelmente 0,1-10 g/kg, e o mais preferivelmente cerca de 1 g/kg. Em modalidades alternativas, o aditivo de enzima para ração da presente invenção envolve a construção de micro-organismos recombinan- tes que produz a(s) desejada (s) enzima(s) em nas quantidades relativas desejadas. Em algumas modalidades, isto é obtido por aumento do número de cópias do gene codificando pelo menos uma protease da presente inven- ção, e/ou por uso de um promotor apropriadamente forte, ligado operativa- mente ao polinucleotídeo codificando a (s) protease(s). Em outras modalida- des, o cepa do micro-organismo recombinante tem algumas atividades da enzima deletadas (por exemplo, celulases, endoglucanases, etc.), como de- sejado.

Em modalidades adicionais, os aditivos de enzima para ração providos pela presente invenção também incluem outras enzimas, incluindo mas não-limitadas a pelo menos uma xilanase, α-amilase, glucoamilase, pectinase, mannanase, α-galactosidase, fitase, e/ou lipase. Em algumas modalidades, as enzimas tendo as atividades desejadas são misturadas com a xilanase e protease ou antes da impregnação das mesmas em um veículo à base de cereais ou alternativamente estas enzimas são impregnadas si- multaneamente ou seqüencialmente em tal veículo à base de cereal. O veí- culo é então por sua vez misturado com uma ração à base de cereais para preparar a ração final. Em modalidades alternativas, o aditivo de enzima pa- ra ração é formulado como uma solução das atividades de enzima individu- ais e então misturado com um material de ração pré-formado como grânulos ou uma massa.

Em ainda outras modalidades, o aditivo de enzima para ração é incluído em dietas de animais por sua incorporação em uma segunda ração (isto é, diferente) ou na água de beber do animal. Assim, não é essencial que a mistura de enzimas provida pela presente invenção seja incorporada na própria ração à base de cereais, apesar desta incorporação formar uma modalidade particularmente preferida da presente invenção. A relação das unidades de atividade de xilanase por g de aditivos de ração para as unida- des de atividade de protease por g de aditivos de ração é preferivelmente 1:0,001-1,000, mais preferivelmente 1:0,01-100, e o mais preferivelmente 1:0,1-10. Como indicado acima, a mistura de enzima provida pela presente invenção preferivelmente encontra uso como um aditivo de ração em prepa- ração de uma ração à base de cereal.

Em algumas modalidades, ração à base de cereal compreende pelo menos 25% em peso, ou mais preferivelmente pelo menos 35% em pe- so, de trigo ou milho ou uma combinação de ambos estes cereais. A ração ainda compreende uma protease (isto é, pelo menos uma protease da pre- sente invenção) em tal quantidade que a ração inclui uma protease nestas quantidades em que a ração inclui 100-100.000 unidade de atividade de pro- tease por kg.

As rações à base de cereal providas pela presente invenção de acordo com a presente invenção encontram uso como ração para vários a- nimais não-humanos, incluindo (aves (por exemplo peru, ganso, pato, gali- nha, etc), animais de criação (por exemplo porcos, ovelha, gado, cabras, etc), e animais de companhia (por exemplo, cavalos, cachorros, gatos, coe- lhos, camundongos, etc). As rações são particularmente apropriadas para aves e suínos e particularmente frangos para assar.

A presente invenção também provê composições para o trata- mento de têxteis que incluem pelo menos uma das proteases da presente invenção. Em algumas modalidades, pelo menos uma protease da presente invenção é um componente de composições apropriadas para o tratamento de seda ou lã (Vide por exemplo, U.S. RE Pat. N0 216,034, EP 134.267, Pa- tente U.S. N0 4.533.359, e EP 344.259).

Além disso, as proteases da presente invenção encontram uso em várias aplicações em que é desejável separar fósforo de fitato. Assim, a presente invenção também provê métodos produzindo lã ou material de pêlo de animais com propriedades melhoradas. Em algumas modalidades prefe- ridas, estes métodos compreendem as etapas de pré- tratamento da lã, fi- bras de lã ou material de pêlo de animais em um processo selecionado den- tre o grupo consistindo em processos de tratamento com plasma e o pro- cesso Delhey; e submeter a lã ou materiais de pêlo de animal pré-tratado a um tratamento com uma enzima proteolítica (por exemplo, pelo menos uma protease da presente invenção) em uma quantidade efetiva para melhorar as propriedades. Em algumas modalidades, o tratamento com enzima proteolí- tica ocorre antes do tratamento com plasma, enquanto em outras modalida- des, ele ocorre após o tratamento com plasma. Em algumas outras modali- dades, ele é conduzido como uma etapa separada, enquanto em outras mo- dalidades, ele é conduzido em combinação com o a esfregação ou tingimen- to da lã ou material do pêlo do animal. Em modalidades adicionais, pelo me- nos um tensoativo e/ou pelo menos um amaciante está presente durante a etapa de tratamento com enzima, enquanto em outras modalidades, o(s) tensoativo(s) e/ou amaciante(s) são incorporados em uma etapa separada em que a lã ou material de pêlo do animal é submetido a um tratamento a- maciante.

Em algumas modalidades, as composições da presente inven- ção encontram uso em métodos para fibras de lã à prova de encolhimento (Vide por exemplo, JP 4-327274). Em algumas modalidades, as composi- ções são usados em métodos tratamento à prova de encolhimento de fibras de lã ao submeter as fibras a um tratamento com plasma em baixa tempera- tura, seguido por tratamento com uma resina à prova de encolhimento como resina bloco-uretano, resina poliamida epiclorohidrina, resina glioxálica, resi- na etileno- uréia, ou resina acrilato, e então tratamento com uma enzima pro- teolítica redutora de peso para obter um efeito amaciante). Em algumas mo- dalidades, a etapa de tratamento com plasma é um tratamento em baixa temperatura, preferivelmente tratamento de descarga corona ou um trata- mento de descarga de incandescente.

Em algumas modalidades, o tratamento com plasma em baixa temperatura é realizado usando um gás, preferivelmente um gás seleciona- do dentre o grupo consistindo em ar, oxigênio, nitrogênio, amônia, hélio ou argônio. Convencionalmente, ar é usado mas pode ser vantajoso usar qual- quer outro dos gases indicados.

Preferivelmente, o tratamento com plasma em baixa temperatura é realizado em uma pressão entre cerca de 13,3 e 666,6 Pa (0,1 e 5 torr) durante cerca de 2 segundos a cerca de 300 segundos, preferivelmente du- rante cerca de 5 segundos a cerca de 100 segundos, mais preferivelmente de cerca de 5 segundos a cerca de 30 segundos.

Como indicado acima, a presente invenção encontra uso em conjunto com métodos como o processo Delhey (Vide por exemplo, DE-A-43 32 692). Neste processo, a lã é tratada em uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio, na presença de um wolframato solúvel, opcionalmente segui- do por tratamento em uma solução ou dispersão de polímeros sintéticos, para melhorar as propriedades antiformação de feltro da lã. Neste método, a lã é tratada em uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio, (0,1 a 35% (w/w), preferivelmente 2 a 10% (w/w)), na presença de 2 a 60% (w/w), prefe- rivelmente 8 a 20% (w/w) de um catalisador (preferivelmente Na2 WO4), e na presença de um agente umectante não-iônico . Preferivelmente, o tratamen- to é realizado a um pH 8-11, e temperatura ambiente. O tempo de tratamen- to depende das concentrações de peróxido de hidrogênio e catalisador, mas é preferivelmente 2 minutos ou menor. Após o tratamento oxidativo, a lã é enxaguada com água. Para remoção o peróxido de hidrogênio residual, e opcionalmente para alvejamento adicional, a lã é ainda tratada em soluções ácidas de agentes redutores (por exemplo, sulfitos, fosfitos, etc.).

Em algumas modalidades, a etapa de tratamento com enzima é realizada durante cerca de 1 minuto e cerca de 120 minutos. Esta etapa é preferivelmente realizada a uma temperatura de entre cerca de 20°C, e cer- ca de 60°C, mais preferivelmente entre cerca de 30°C e cerca de 50°C. Al- ternativamente, a lã é embebida em ou almofadada com uma solução de enzima aquosa e então submetida a tratamento com vapor em uma tempe- ratura convencional e pressão, tipicamente durante cerca de 30 segundos a cerca de 3 minutos. Em algumas modalidades preferidas, o tratamento com enzima proteolítica é realizado em um meio ácido ou neutro ou alcalino que pode incluir um tampão.

Em modalidades alternativas, a etapa de tratamento com enzima é conduzida na presença de um ou mais tensoativos convencionais aniôni- cos, não-iônicos (por exemplo, Dobanol; Henkel AG) ou catiônicos. Um e- xemplo de um tensoativo não-iônico utilizável é Dobanol (de Henkel AG). Em outras modalidades, o materiais de lã ou pêlo animal é submetido a um tratamento com ultrassom, seja antes ou simultaneamente com o tratamento com a enzima proteolítica. Em algumas modalidades preferidas, o tratamen- to com ultrassom é realizado a uma temperatura de cerca de 50°C durante cerca de 5 minutos. Em algumas modalidades preferidas, a quantidade de enzima proteolítica usada na etapa de tratamento com enzima está entre cerca de 0,2 p/p % e cerca de 10 p/p %, com base no peso do material de lã ou pêlo do animal. Em algumas modalidades, a fim de numerar as etapas de tratamento, o tratamento com enzima é realizado durante o tingimento e/ou lavagem a fundo do material de lã ou pêlo do animal, simplesmente por adi- ção da protease ao banho de tingimento, enxague e/ou limpeza a fundo. Em algumas modalidades, tratamento com enzima é realizado após o tratamento com plasma, mas em outras modalidades, as duas etapas de tratamento são realizadas na ordem oposta. Amaciantes convencionalmente usados em lã são geralmente

amaciantes catiônicos, ou os amaciantes catiônicos orgânicos ou produtos à base de silicone mas amaciantes aniônicos ou não-iônicos são também utili- záveis. exemplos de amaciantes utilizáveis incluem, mas não são limitados a amaciantes de polietileno e amaciantes de silicone (isto é, dimetil polissilo- xanos (óleos de silicone)), H-polissiloxanos, elastômeros de silicone, dimetil polissiloxanos aminofuncionais, elastômeros de silicone aminofuncionais, e dimetil polissiloxanos epoxifuncionais, e amaciantes catiônicos orgânicos (por exemplo derivados de alquil amônio quaternário).

Em modalidades adicionais, a presente invenção provê compo- sições para o tratamento de couro cru de animal que inclui pelo menos uma protease da presente invenção. Em algumas modalidades, as proteases da presente invenção encontram uso em composições para tratamento de cou- ro cru de animal, como descrito em WO 03/00865 (lnsect Biotech Co., Tae- jeon-Si, Korea). Em modalidades adicionais, a presente invenção provê mé- todos para o processamento de couros crus e/ou peles em couro compreen- dendo tratamento enzimático do couro cru ou pele com a protease da pre- sente invenção (Vide por exemplo, WO 96/11285). Em modalidades adicio- nais, a presente invenção provê composições para o tratamento de uma pele ou couro cru de animal em couro que inclui pelo menos uma protease da presente invenção.

Couros crus e peles são geralmente recebidos nos curtumes na forma de couros crus ou peles salgados ou secados sem tratamento. O pro- cessamento de couros crus ou peles em couro compreende várias diferentes etapas de processo, incluindo as etapas de embeber, depilar e macerar. Es- tas etapas constituem o processamento a úmido e são realizadas no curtu- me. O tratamento enzimático utilizando as proteases da presente invenção é aplicável em qualquer momento durante o processo envolvendo o proces- samento de couro. No entanto, proteases são geralmente empregadas du- rante o processamento a úmido (isto é, durante o embebimento, depilação e/ou maceração). Assim, em algumas modalidades preferidas, o tratamento enzimático com pelo menos uma das proteases da presente invenção ocorre durante o estágio de processamento a úmido.

Em algumas modalidades, os processos de embebimento da presente invenção são realizados sob condições de embebimento conven- cionais, (por exemplo, em um pH na faixa de pH 6,0 a 11). Em algumas mo- dalidades preferidas, a faixa é pH 7,0 a 10,0. Em modalidades alternativas, a temperatura está na faixa de 20 a 30 0C1 enquanto em outras modalidades preferivelmente na faixa de 24 a 28 0C. Em ainda outras modalidades, o tempo de reação está na faixa de 2 a 24 horas, enquanto a faixa preferida é 4 a 16 horas. Em modalidades adicionais, tensídeos e/ou conservantes são providos como desejado. A segunda fase da etapa de maceração geralmente começa

com a adição do próprio agente de maceração. Em algumas modalidades, o tratamento enzimático ocorre durante a maceração. Em algumas modalida- des preferidas, o tratamento enzimático ocorre durante a maceração, após a fase de remoção do cal. Em algumas modalidades, o processo de macera- ção da presente invenção é realizado usando condições convencionais (por exemplo, em um pH na faixa de pH 6,0 a 9,0). Em algumas modalidades preferidas, a faixa do pH é 6,0 a 8,5. Em outras modalidades, a temperatura está na faixa de 20 a 30° C, enquanto modalidades preferidas, a temperatura está na faixa de 25 a 28°C. Em algumas modalidades, o tempo de reação está na faixa de 20 a 90 minutos, enquanto em outras modalidades, na faixa de 40 a 80 minutos. Processos para a fabricação de couro são bem- conhecidos dos versados na técnica (Vide por exemplo, WO 94/069429 WO 90/1121189, Pat. U.S. N0 3.840.433, EP 505920, GB 2233665, e Patente U.S. N0 3.986.926, todas sendo aqui incorporadas por referência).

Em outras modalidades, a presente invenção provê macerações compreendendo pelo menos uma protease da presente invenção. Um agen- te de maceração é um agente ou uma preparação contendo enzima, com- preendendo os ingredientes quimicamente ativos para uso em processos de curtumes, em particular na etapa de maceração de um processo para a fa- bricação de couro. Em algumas modalidades, a presente invenção provê agentes de maceração compreendendo protease e excipientes apropriados. Em algumas modalidades, agentes incluindo, mas não-limitadas a produtos químicos conhecidos e usados na técnica, por exemplo diluentes, emulgado- res, removedores de cal e veículos. Em algumas modalidades, o agente de maceração compreendendo pelo menos uma protease da presente invenção é formulado como conhecido na técnica {Vide por exemplo, GB-A2250289, WO 96/11285, e EP 0784703).

Em algumas modalidades, o agente de maceração da presente invenção contém de 0,00005 a 0,01 g de protease ativa por g de agente, enquanto em outras modalidades, o agente de maceração contém de 0,0002 a 0,004 g de protease ativa por g de agente. Assim, as proteases da presente invenção encontram uso em

numerosas aplicações e ambientes. Experimental

A presente invenção é descrita em mais detalhes nos seguintes exemplos que não são de nenhum modo destinados a limitar o escopo da invenção como reivindicada. As figuras anexas devem ser consideradas co- mo partes integrantes do relatório e descrição da invenção. Todas as refe- rências citadas aqui são especificamente incorporadas por referência com relação a tudo o que foi descrito aqui. Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar a invenção reivindicada.

Na descrição experimental que segue, as seguintes abreviaturas se aplicam: Pl (inibidor de proteinase), ppm (partes por milhão); M (molar);

mM (milimolar); μΜ (micromolar); nM (nanomolar); mol (mois); mmol (milimols); μιηοΙ (micromols); nmol (nanomols); g (gramas); mg (miligramas); pg (microgramas); pg (picogramas); L (litros); ml e mL (mililitros); μΙ e μΙ_ (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μιτι (micrômetros); nm (nanômetros); U (unidades); V (volts); MW (peso molecular); s (segundos); min(s) (minuto/minutos); h(s) e hr(s) (hora /horas); °C. (graus Centígrados); QS (quantidade suficiente); ND (não-realizado); NA (não-aplicável); rpm (revoluções por minuto); H2O (água); dH20 (água desionizada); (HCI (ácido clorídrico); aa (aminoácido); bp (par de bases); kb (par de quilobases); kD (quilodaltons); cDNA (cópia ou DNA complementar); DNA (ácido desoxirribonucleico); ssDNA (DNA de filamento único); dsDNA (DNA de filamento cuplo); dNTP (trifosfato de desoxirribonucleotídeo); RNA (ácido ribonucleico); MgCI2 (cloreto de magnésio); NaCI (cloreto de sódio); w/v (peso para volume); v/v (volume para volume); g (densidade); OD (densidade ótica); solução tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS); SOC (2% Bacto-Triptona, 0,5% extrato de levedura Bacto, 10 mM NaCI1 2,5 mM KCI); caldo Terrific (TB; 12 g/l Bacto Triptona, 24 g/l glicerol, 2,31 g/l KH2PO4, e 12,54 g/l K2HPO4); OD280 (densidade ótica a 280 nm); ODeoo (densidade óptica a 600 nm); A405 (absorbância a 405 nm); Vmax (a velocidade inicial máxima de uma reação catalisada por enzima); PAGE (eletroforese de poliacrilamida gel); PBS (solução salina tamponada com fosfato [150 mM NaCI, 10 mM tampão de fosfato de sódio, pH 7,2]); PBST (PBS+0,2 5% TWEEN® 20); PEG (polietileno glicol); PCR (reação de cadeia polimerase); RT-PCR (transcrição reversa PCR); SDS (dodecil sulfato de sódio); Tris (tris(hidroximetil)aminometano); HEPES

(N-[2-Hidroxietil]piperazina-N-[ácido 2-etano sulfônico]); HBS (HEPES solução salina tamponada); Tris-HCI (cloridrato de tris[Hidroximetil]aminometano); Tricine (N-[tris-(hidroximetil)-metil]-glicina); CHES (ácido 2-(N-ciclo-hexilamino) etano- sulfônico); TAPS (ácido 3-{[tris- (hidroximetil)-metil]-amino}-propanossulfônico); CAPS (ácido 3-(ciclo- hexilamino)-propano- sulfônico; DMSO (dimetil sulfóxido); DTT (1,4-ditio-DL- treitol); SA (ácido sinapinico (ácido s,5-dimetóxi-4-hidróxi cinâmico); TCA (ácido tricloroacético ); Glut e GSH (glutationa reduzida); GSSG (glutationa oxidada); TCEP (Tris[2-carboxietil] fosfina); Ci (Curies); mCi (miliCuries); pCi (microCuries); HPLC (cromatografia de líquido de alta pressão); RP-HPLC (cromatografia de líquido de alta pressão de fase reversa); TLC (cromatografia de camada fina); MALDI-TOF ( dessorção / ionização a laser auxiliada por matriz - tempo de vôo); Ts (tosil); Bn (benzil); Ph (fenil); Ms (mesil); Et (etil), Me (metil); Taq (DNA polimerase de Thermus aquaticus)\ Klenow (fragmento grande de DNA polimerase I (KIenow)); EGTA (ácido N, N, N', Ν'-tetra-acético de etileno glicol-bis(B-aminoetil éter)); EDTA (ácido etilenodiaminotetracético); bla (β-lactamase ou gene de resistência a ampicilina); HDL (líquido de alta densidade); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, Holanda); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); TermoFinnigan (TermoFinnigan, San Jose1 CA); Argo (Argo BioAnaIytica, Morris Plains, NJ); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemanha); Pall (Pall Corp., East Hills, NY); EMPA Testmaterialien AG (EMPA Testmaterialien AG, St. Gallen-Winkeln, Suiça); Warwick Equest (Warwick Equest Limited, Durham, UK); Minolta (Konica Minolta, Inc., Japão); United States Testing (United States Testing Co, lnc, Hoboken, NJ); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canadá); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (CenterforTest Materials, Vlaardingen, Holanda); Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Irlanda) Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia); Kelco (CP Kelco, Wilmington1 DE); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Noruega); Dynal (Dynal, Oslo, Noruega); Bio- Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island1 NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech1 Piscataway1 NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems1 Foster City1 CA); BD Biosciences e/ou Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto1 CA); Óperon Technologies (Óperon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prússia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL ou Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Milipore (Milipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japão); Roche (Hoffmann-La Roche1 Basel, Suíça); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville1 NC); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale1 CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla1 CA); Marsh (Marsh Biosciences1 Rochester, NY); Geneart (Geneart GmbH1 Regensburg1 Alemanha); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski1 VT); (Biacore (Biacore1 Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech1 Rocky Hill1 NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters1 Inc., Milford, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Alemanha); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Enichem (Enichem Ibérica, Barcelona, Espanha); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buehs, Suiça); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, Holanda); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, Ml); e Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA).

A serina protease de tipo selvagem usada nos seguintes exemplos é descrita em detalhes em US04/39006 e US04/39066, ambos sendo aqui incorporados por referência em sua totalidade. Além disso, exemplo 2 de pedido de patente U.S. número de série 10/576.331 provê detalhes para a produção de protease 69B4 a partir da bactéria alcalifílica Gram-positiva 69B4. Como indicado em todo o presente pedido. Este pedido de prioridade é incorporado por referência aqui em sua totalidade. Exemplo 1 Testes

Nos seguintes exemplos, vários testes foram usados, tais como determinações de proteína, testes baseados em aplicação, e testes basea- dos em estabilidade. Para facilitar na leitura, os seguintes testes são publi- cados abaixo e referidos a nos respectivos exemplos. Quaisquer desvios dos protocolos providos abaixo em quaisquer dos experimentos realizados du- rante o desenvolvimento da presente invenção são indicados nos exemplos.

Alguns dos detergentes usados nos seguintes exemplos tiveram as seguintes composições. Em composições I e II, o equilíbrio (a 100%) é perfume/corante e/ou água. O pH destas composições foi de cerca de 5 a cerca de 7 para Composição I, e cerca de 7,5 a cerca de 8,5 Composição II. Na Composição III, o equilíbrio (a 100%) compreendeu água e/ou quantida- des menores de perfume, corante, alvejante /SRPI/carboximetilcelulose de sódio/fotoalvejante/ MgSo4/PVPVI/supressor de espumação/PEG molecular elevado/argila. Composições Detergentes Composição I Composição Il LAS 24,0 8,0 C 12-C15 AEi eS - 11,0 C8-C10 propil dimetil amina 2,0 2,0 C12-C14 alquil óxido de dimetil a- mina - - C12-C15 AS - 7,0 CFAA - 4,0 C12-C14 Etoxilato de álcool graxo 12,0 1,0 C12-C18 Ácido graxo 3,0 4,0 Ácido cítrico (anídrico) 6,0 3,0 DETPMP - 1,0 Monoetanolamina 5,0 5,0 Hidróxido de sódio - 1,0 1 N Solução aquosa de HCI n°1 - Propanodiol 12,7 10, Etanol 1,8 5,4 DTPA 0,5 0,4 Pectina Liase - 0,005 Lipase 0,1 - Amilase 0,001 - Celulase - 0,0002 Protease A - - Aldose Oxidase - - DETBCHD - 0,01 SRP1 0,5 0,3 Ácido bórico 2,4 2,8 xileno sulfonato de sódio - - DC 3225C 1,0 1,0 2-butil-octanol 0,03 0,03 Alvejante 1 0,12 0,08 Composições Deteraentes C14-C15AS ou alquil sulfato de sebo de sódio 3,0 LAS 8,0 C12-C15AE3S 1,0 C12-Ci5E5 ou E3 5,0 QAS Zeólito A 11,0 SKS-6 (adicionar a seco) 9,0 MA/AA 2,0 AA Citrato 3Na 2H20 . Ácido cítrico (Anídrico) 1,5 DTPA . EDDS 0,5 HEDP 0,2 PB1 _ Percarbonato 3,8 NOBS _ NACA OBS 2,0 TAED 2,0 BB1 0,34 BB2 Carbonato de Na Anídrico 8,0 Sulfato 2,0 Silicato _ Protease B Protease C Lipase Amilase Celulase _ Composições Detergentes Pectina Liase 0,001 Aldose Oxidase 0,05 PAAC A, Teste TCA oara Determinação de Teor de Proteína em placas de microti-

tulação de 96 cavidades

Este teste foi iniciado usando sobrenadante de cultura filtrado de placas de microtitulação cultivadas 4 dias a 33 °C, com agitação a 230 RPM e aeração umidificada. Uma placa de fundo plano de 96 cavidades fresca foi usada para o teste. Primeiro, 100 pL/cavidade de 0,25 N de HCI foram colo- cados nos cavidades. Então, 50 μι. de caldo de cultura filtrado foram adicio- nados aos cavidades. A dispersão/absorvância de luz a 405 nm (usar 5 s modo de mistura no leitor de placa) foi então determinada, a fim de prover a leitura "em branco".

Para o teste, 100 pL/cavidade de 15% (em peso) de TCA foram colocados nas placas e incubados entre 5 e 30 min em temperatura ambien- te. A dispersão/absorvância de luz a 405 nm (usar 5 s modo de mistura no leitor de placa) foi então determinada.

Os cálculos foram realizados subtraindo o branco (isto é, sem TCA) da leitura de teste com TCA. Se desejado, uma curva padrão pode ser criada calibrando as leituras de TCA com testes AAPF de clones com fatores de conversão conhecidos. No entanto, os resultados de TCA são lineares com respeito à concentração de proteína de 50 a 500 ppm e podem deste modo ser diretamente traçados em gráfico contra desempenho de enzima para o propósito de escolher variantes de bom desempenho. B. Teste suc-AAPF-pNA de Proteases em placas de microtitulação de 96 cavidades

Neste sistema de teste, as soluções reagentes usadas foram:

1. 100 mM de Tris/HCI, pH 8.6, contendo 0,005% de TWEEN®-80 (Tam- pão de Tris)

2. 100 mM de Tampão de Tris, pH 8,6, contendo 10 mM de CaCI2 e 0,005% de TWEEN®-80 (Tampão de Tris) 3. 160 mM de suc-AAPF-pNA em DMSO (solução de carga suc-AAPF- pNA) (Sigma: S-7388)

Para preparar a solução de trabalho suc-AAPF-pNA, 1 ml de carga de AAPF foi adicionado a 100 ml de tampão de Tris e bem misturado por pelo menos 10 segundos.

O teste foi realizado adicionando 10 μΙ de solução de protease diluída para cada cavidade, seguido pela adição (rapidamente) de 190 μΙ de 1 mg/ml de solução de operação AAPF. As soluções foram misturadas por 5 s, e a troca de absorvância foi lida a 410 nm em um leitor MTP1 a 25°C. A atividade de protease foi expressada como AU (atividade = AOD min1 .ml"1). C. Teste de Hidrólise de Queratina

Neste sistema de teste, as soluções químicas e reagentes usa- das foram:

Queratina ICN 902111

Detergente 1,6 g. detergente foi dissolvido em 1000 ml de água (pH = 8,2) 0,6 ml de CaCI2/MgCI2 de 171,42 gramas/litro (10,000 gpg) foi também adicionado, bem como 1190 mg de HEPES, resultan- do uma dureza e resistência de tampão de 0,1026 grama/litro e mM respectivamente. O pH foi ajustado a 8,2 com NaOH. Ácido Picrilsulfônico (TNBS)

Sigma P-2297 (5% de solução em água) ReagenteA 45,4 g de Na2B4O7-IO H20 (Merck 6308) e 15 ml de 4N de NaOH foram dissolvidos juntos para um volume final de 1000 ml (aquecendo se necessário) ReagenteB 35,2 g de NaH2PO4 IH2O (Merck 6346) e 0,6 g de Na2SO3 (Merck 6657) foram dissolvidos juntos para um volume final de 1000 ml.

Método :

Anterior às incubações, queratina foi peneirada em uma peneira de 100 μιη em porções pequenas em um período. Então, 10 g da queratina de < 100 μιτι foram agitados na solução detergente por pelo menos 20 minu- tos a temperatura ambiente com ajustamento regular do pH para 8,2. Final- mente, a suspensão foi centrifugada por 20 minutos a temperatura ambiente (Sorvall, rotor GSA1 13.000 rpm). Este procedimento foi então repetido. Fi- nalmente, o sedimento úmido foi colocado em suspensão em detergente para um volume total de 200 ml, e a suspensão foi mantida agitada durante pipetagem. Anterior a incubação, placas de microtitulação (MTPs) foram cheias com 200 μΙ de substrato por cavidade com uma pipeta multicanal de Biohit e 1200 μΙ de ponta (6 dispensas de 200 μΙ e distribuídas tão rápido quanto possível para evitar depósito de queratina nas pontas). Então, 10μΙ da cultura filtrada foi adicionada ao substrato contendo MTPs. As placas fo- ram cobertas com fita, colocadas em uma incubadora e incubadas a 20 °C. por 3 horas a 350 rpm (Innova 4330 [New Brunswick]). Seguindo incubação, as placas foram centrifugadas por 3 minutos a 3000 rpm (centrífuga Sigma 6K 15). Cerca de 15 minutos antes de remoção da 1a placa do incubador, o reagente TNBS foi preparado misturando 1 ml de solução de TNBS por 50 ml de reagente A.

MTPs foram carregados com 60 μΙ de reagente A de TNBS por cavidade. A partir das placas incubadas, 10 μΙ foram transferidos para os MTPs com reagente A de TNBS. As placas foram cobertas com fita e agita- das por 20 minutos em um agitador de marca (BMG Thermostar) a tempera- tura ambiente e 500 rpm. Finalmente, 200 μΙ de reagente B foi adicionado aos cavidades, misturado por 1 minuto em um agitador, e a absorvância a 405 nm foi medida com o leitor de MTP. Cálculo da Atividade Hidrolisante de queratina:

O valor de absorvância obtido foi corrigido para o valor em bran- co (substrato sem enzima). A absorvância resultante provê uma medida para a atividade hidrolítica. Para cada amostra (variante) o índice de desempenho foi calculado. O índice de desempenho compara o desempenho da variante (valor real) e a enzima padrão (valor teórico) na mesma concentração de proteína. Em adição, os valores teóricos podem ser calculados, usando os parâmetros da equação de Langmuir da enzima padrão. Um índice de de- sempenho (PI) que é maior que 1 (Pl>1) identifica uma variante melhor (con- forme comparado ao padrão [por exemplo, tipo selvagem]), enquanto um Pl de 1 (Pl=1) identifica uma variante que realizada o mesmo que o padrão, e um Pl que é menor que 1 (Pl<1) identifica uma variante que tem um desem- penho pior que o padrão.

Deste modo, o Pl identifica vencedores, bem como variantes que são menos desejáveis para uso sob certas circunstâncias. D. Teste de Microamostra para testar desempenho de protease

Todos dos detergentes usados nestes testes não continham en- zimas.

Preparações de Detergente:

1. Detergente líquido em água gelada (Condições dos Estados Unidos):

Água Milli-Q foi ajustada a 0,1026 grama/litro (6 gpg) de dureza de água (Ca/Mg=3/1), 1,60 g/l detergente foi adicionado, e a solução deter- gente foi agitada vigorosamente por pelo menos 15 minutos. Então, 5mM de tampão de Hepes foi adicionado e o pH ajustado a 8,2. O detergente foi fil- trado antes de uso no teste através de um filtro de 0,22pm (por exemplo Fil- tro de garrafa de topo de Nalgene ).

2. Detergente Líquido de pH baixo (Condições U.S.):

Água Milli-Q foi ajustada a 0,1026 grama/litro (6 gpg) de dureza de água (Ca/Mg=3/1), 1,60 g/l de detergente TIDE®-LVJ-1 ou TIDE® 2005) ou 1,50 g/l de detergente (TIDE®-SNOW) foi adicionado, e a solução deter- gente agitada vigorosamente por pelo menos 15 minutos. O pH foi ajustado a 6,0 usando 1N de solução de NaOH. O detergente foi filtrado antes de uso no teste através de um filtro de 0,22pm (por exemplo filtro de garra de topo de Nalgene).

Microamostras de tecido:

Microamostras circulares de 0,63 cm (1/4") de diâmetro foram encomendadas e distribuídas por CFT Vlaardingen. As microamostras foram pré-tratadas usando o método de fixação descrito abaixo. Microamostras simples foram colocadas em cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades verticalmente para expor a área de superfície completa (isto é, não-planas no fundo do cavidade). Fixação de Amostra "3K": Esta fixação de amostra particular foi feita a temperatura ambi- ente. No entanto a quantidade de 30% de H2O2 adicionado é 10X maior do que na método de fixação de amostra superfixado isto é, conduzido a 60°C, usado com condições européias). Formação de bolhas (espumação) será visível e portanto é necessário usar um copo maior para calcular isto. Primei- ro, 8 litros de água destilada foram colocados em um copo de 10 L1 e 80 ml de 30% de peróxido de hidrogênio adicionado. A água e peróxido foram bem misturados com uma pá. Então, 40 pedaços de EMPA, 116 amostras de te- cidos foram espalhados em um ventilador antes de adicionar na solução pa- ra assegurar fixação uniforme. As amostras de tecido foram submetidas a redemoinho na solução (usando a pá) por 30 minutos, continuamente para os primeiros cinco minutos e ocasionalmente para os 25 minutos restantes. A solução foi descartada e as amostras foram enxaguadas 6 vezes com a- proximadamente 6 litros de água destilada cada vez. As amostras foram co- locadas no topo de toalhas de papel para secar. As amostras secas a ar fo- ram perfuradas usando uma cunha circular de 0,63 cm (1/4") em uma pren- sa de expulsão. Uma microamostra simples foi colocada verticalmente em cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades para expor a área de superfície completa (isto é, não planas no fundo do cavidade). Amostras de enzima.

As amostras de enzima foram testadas em concentrações apro- priadas para a respectiva área geográfica, e diluída em 10 mM de NaCI, 0,005% de solução TWEEN®-80. Método de teste.

A incubadora foi configurada na temperatura desejada: 20°C para condições de líquido de água gelada ou 30°C. para condições de líqui- do de pH baixo. As amostras pré-tratadas e pré-cortadas foram colocadas nos cavidades de um MTP de 96 cavidades, como descrito acima. As amos- tras de enzima foram diluídas, se necessário, em 10 mM de NaCI, 0,005% de TWEEN®-80 para 20x a concentração desejada. As soluções detergen- tes desejadas foram preparadas como descrito acima. Então, 190 μΙ de so- lução detergente foram adicionados a cada cavidade do MTP. Para esta mis- tura, 10 μΙ de solução de enzima foram adicionados a cada cavidade (para prover um volume total para 200 μΙ/cavidade). O MTP foi selado com um se- Iador de placa e colocado em uma incubadora por 60 minutos, com agitação a 350 rpm. Seguindo incubação sob as condições apropriadas, 100 μΙ de solução de cada cavidade foram removidas e colocadas em um MTP fresco. O MTP novo contendo 100 μΙ de solução/cavidade foi lido a 405 nm em um leitor de MTP. Controles em branco, bem como um controle contendo uma microamostra e detergente mas nenhuma enzima também foram incluídos. A solução de carga foi usada em uma concentração de 257,14 gramas/litro (15,000 gpg) (Ca/Mg 3:1 (1,92 M de Ca2+ = 282,3 g/L de CaCI2.2H20; 0,64 M de Mg2+ = 30,1 g/L de MgCI2.6H20).

Tabela 1-1

Composição detergente e Condições de incubação no teste de microamostra de tecidos. _

Detergente Enzi- ma de refe- rência Detergente Dureza água Dosa- gem de enzima [ppm] Tem- pera- tura (0C) Amostra tecido Líquido de água gelada ASP 1,5 ou 1,6 g/l Detergente 0,1026 grama/litro - Ca/Mg :3/1 0,3-4 20° 3K Detergente líquido de pH baixo ASP 1,6 g/l De- tergente 0,1026 grama/litro - Ca/Mg:3/1 0,5-4 30° 3K

Cálculo do desempenho de BMI:

O valor de absorvância obtido foi corrigido para o valor em bran- co (obtido após incubação de microamostras na ausência de enzima).A ab- sorvância resultante foi uma medida para a atividade hidrolítica. Para cada amostra (variante), o índice de desempenho foi calculado. O índice de de- sempenho compara o desempenho da variante (valor real) e a enzima pa- drão (valor teórico) na mesma concentração de proteína. Em adição, os va- lores teóricos podem ser calculados, usando os parâmetros da equação de Langmuir da enzima padrão. Um índice de desempenho (PI) que é maior que 1 (Pl>1) identifica uma variante melhor (conforme comparado ao padrão [por exemplo, tipo selvagem]), enquanto um Pl de 1 (Pl=1) identifica uma 10

15

20

25

30

Dimetilcaseína (DMC): TWEEN®-80:

Tampão de PIPES (ácido livre):

variante que tem o mesmo desempenho que o padrão, e uma Pl que é me- nor que 1 (Pl<1) identifica uma variante que tem um desempenho pior que o padrão.

Deste modo, o Pl identifica vencedores, bem como variantes que são menos desejáveis para uso sob certas circunstâncias. D. Teste de Hidrólise de Dimetilcaseína (96 cavidades)

Neste sistema de teste, as soluções químicas e reagentes usa- das foram:

Sigma C-9801 Sigma P-8074

Sigma P-1851; 15,1 g é dissolvido em cerca de 960 ml de água; pH é ajustado : para 7,0 com 4N de NaOH, 1 ml de 5% de TWEEN®- 80 é adicionado e o volume le- vado a 1000 ml. A concentração final de PIPES e TWEEN®-80 é 50 mM e 0,005% respectivamente.

Sigma P-2297 (5% de solução em água) 45,4 g de Na2B4O7-IO H20 (Merck 6308) e 15 ml de 4N de NaOH são dissolvidos juntos para um volume final de 1000 ml (aquecendo se necessário) 35,2 g de NaH2PO4 IH2O (Merck 6346) e 0,6 g de Na2SO3 (Merck 6657) são dissol- vidos juntos para um volume final de 1000 ml.

Método:

Para preparar o substrato, 4 g de DMC foram dissolvidas em 400 ml de tampão de PIPES. O sobrenadante de cultura filtrados foram diluídos com tampão de PIPES; a concentração final dos controles na placa cultivada foi 20 ppm. Então, 10 μΙ de cada sobrenadante diluído foram adicionados a 200 μΙ de substrato nos cavidades de um MTP. A placa de MTP foi coberta

Ácido Picrilsulfônico (TNBS): Reagente A:

Reagente B: com fita, agitada por alguns segundos e colocada em um forno a 37°C por 2 horas sem agitação.

Cerca de 15 minutos antes de remoção da 1a placa do forno, o reagente TNBS foi preparado misturando 1 ml de solução de TNBS por 50 ml de reagente A. MTPs foram cheios com 60 μΙ de reagente A de TNBS por cavidade. As placas incubadas foram agitadas por alguns segundos, após que 10 μΙ foram transferidos para os MTPs com reagente A de TNBS. As placas foram cobertas com fita e agitadas por 20 minutos em um agitador de marca (BMG Thermostar) a temperatura ambiente e 500 rpm. Finalmente, 200 μΙ de reagente B foram adicionados aos cavidades, misturados por 1 minuto em um agitador, e a absorvância a 405 nm foi determinada usando um leitor de MTP.

Cálculo de Atividade hidrolisante de dimetilcaseína:

O valor de absorvância obtido foi corrigido para o valor em bran- co (substrato sem enzima). A absorvância resultante é uma medida para a atividade hidrolítica. A atividade específica (arbitrária) de uma amostra foi calculada dividindo a absorvância e a concentração de proteína determina- da.

E. Teste de Termoestabilidade Este teste é baseado na hidrólise de dimetilcaseína, antes e de-

pois de aquecimento do sobrenadante de cultura tamponado. As mesmas soluções químicas e reagentes foram usadas como descrito no teste de hi- drólise de dimetilcaseína. Método:

Os sobrenadantes de cultura filtrados foram diluídas a 20 ppm

em tampão de PIPES (baseado na concentração dos controles na placa cul- tivadas). Primeiro, 10 μΙ de cada amostra de enzima diluída foram tomados para determinar a atividade inicial no teste de dimetilcaseína e tratados co- mo descrito abaixo. Então, 50 μΙ de cada sobrenadante diluído foram colo- cados nas cavidades vazias de um MTP. A placa de MTP foi incubada em uma incubadora/agitador HT iEMS (Thermo Labsystems) por 90 minutos a 60°C e 400 rpm. As placas foram resfriadas em gelo por 5 minutos. Então, μΙ da solução foram adicionados ao MTP fresco contendo 200 μΙ de subs- trato de dimetilcaseína/cavidade para determinar a atividade final após incu- bação. Este MTP foi revestido com fita, agitado por alguns segundos e colo- cado em um forno a 37 0C por 2 horas sem agitação. O mesmo método de detecção como usado pelo teste de hidrólise de DMC foi usado. Cálculo de Termoestabilidade:

A atividade residual de uma amostra foi expressada como a re- lação da absorvância fina e a absorvância inicial, ambas corrigidas para em branco.

F. Teste de estabilidade de LAS

Estabilidade de LAS foi medida após incubação da protease de teste na presença de 0,06% de LAS (dodecilbenzeno sulfonato de sódio), e a atividade residual foi determinada usando o teste AAPF. Reagentes:

Dodecilbenzenossulfonato, sal de sódio (=LAS): Sigma D-2525

TWEEN®-80: Sigma P-8074

Tampão de TRIS (ácido livre): Sigma T-1378); 6,35 g são dissol- vidos em cerca de 960 ml de água; pH é ajustado a 8,2 com 4N de HCI. Concentração final de TRIS é 52,5 mM. Solução de carga de LAS: Preparar uma solução de LAS de 10,5

% em água MQ (=10,5 g por 100 ml de MQ)

Tampão de TRIS -100 mM / pH 8,6 (100mM de Tris/0,005% de

Tween80)

Tampão de TRIS-Ca, pH 8,6 (100mM de Tris/10mM de Ca- CI2/0,005% de Tween80)

Aparelhagem:

MTPs de fundo plano: Costar (n° 9017) Biomek FX Multipipetador ASYS Leitor de MTP Spectramax

Incubadora/agitador iEMS Incubadora/agitador Innova 4330 Pipeta multicanal de Biohit Agitador BMG Thermostar

Método:

Uma solução de LAS a 0,063% foi preparada em 52,5 mM de

tampão de Tris pH 8,2. A solução de operação AAPF foi preparada adicio- nando 1 ml de 100 mg/ml de solução de carga AAPF (em DMSO) a 100 ml (100 mM) de tampão de TRIS, pH 8,6. Para diluir os sobrenadantes, placas de fundo plano foram cheias com tampão de diluição e uma alíquota do so- brenadante foi adicionado e bem misturada. A relação de diluição dependeu da concentração dos controles ASP na placas cultivadas (atividade de A- APF). A concentração de proteína desejada foi 80 ppm.

Dez μΙ do sobrenadante diluído foram adicionados a 190 μΙ de 0,063% de tampão de LAS /cavidade. O MTP foi revestido com fita, agitado por alguns segundos e colocado em uma incubadora (Innova 4230) a 25° ou 35°C., por 60 minutos a 200 rpm de agitação. A atividade inicial (t=10 minu- tos) foi determinada após 10 minutos de incubação transferindo 10 μΙ da mistura em cada cavidade para um MTP fresco contendo 190μΙ de solução de trabalho AAPF. Essas soluções foram bem misturadas e a atividade de AAPF foi medida usando um leitor de MTP (20 leituras em 5 minutos e 25°C).

A atividade final (t=60 minutos) foi determinada removendo ou- tros 10 μΙ de solução da placa de incubação após 60 minutos de incubação. A atividade de AAPF foi então determinada como descrito acima. Os cálcu- Ios foram realizados como a seguir:

A % de atividade residual foi [t-60 valor]°100 / [t-10 valor].

Exemplo 2

Produção de ASP protease em B. subtilis

Neste exemplo, experimentos conduzidos para produzir protease 69B4 (também referida aqui como "ASP," "Asp," e "ASP protease," e "Asp protease") em B. subtilis estão descritos. Neste exemplo, a transformação de plasmídeo pHPLT-ASP-C1-2 (Vide, figura 1) em B. subtilis está descrita. Transformação foi realizada como conhecido na técnica (Vide por exemplo, WO 02/14490, incorporada aqui por referência). Para otimizar expressão de ASP em B. subtilis, uma seqüência de DNA sintético foi produzida por DNA 2,0, e utilizada nestes experimentos de expressão. A seqüência de DNA (seqüência de DNA de ASP sintética) provida abaixo, com uso de códon a- daptado para espécie de Bacillus, codifica a proteína de precursor de ASP de tipo selvagem:

ATG ACACC ACGAACTGTCACAAGAGCTCTGGCTGTGGCAACAGCAGCTGCTACA CTCTTG

GCTGGGGGTATGGCAGCACAAGCTA ACGAACCGGCTCCTCCAGGA TCTGC ATCAGCCCC

tccacgattagctgaaaaacttgaccctgacttacitgaagçaatggaaçgçgatçtggg

gttagatgcagaggaagcagctgcaacgttagcttttcagcatgacgcagctgaaacgg

gtgctgtatgttgcaaccactgatgaagatgctgttgaagaagtcgaaggcgaagga^c AACTGCTCrrG ACTGTTG AGCATTCTtnTGCTGATTT AGAGGCGTGGAAGACGGITTTOGA

TGCTGCGCTGGAGGGTCATGATGATGTGCCTACGTGGTACGTCXjACGTGCCT ACG AATTC

ggtagtcgttgctgtaaaggcaggagcgcaggatgtagctgcaggacttgtggaaggcg

Cro ATCíTGCCAICAÜ AfGCXiGlCACrnTGTACA A ACGG ACG AAACGCCT AG AACGATG

ttcgacgtaattcgaggcaacgcatatactattggcgcccggtctagatgttctat

cggattcgcagtaaacggtggcttcattactgccggtcactgcggaagaacaggag

ccactactgccaatccgactggcacatttgcaggtagctcgtttccgggaaatgat

tatgcattcgtccgaacaggggcaggagtaaatttgcttgcccaagtcaataacta

ctcgggcggcagagtccaagtagcaggacatacggccgcaccagttggatctgctg

tatgccgctcaggtagcactacaggttggcattgcggaactatcacggcgctgaat

tcgtctgtcacgtatccagagggaacagtccgaggacttatccgcacgacggtitg

tgccgaaccaggtgatagcggaggtagccttttagcgggaaatcaagcccaaggtg

tcacgtcaggtggttctggaaattgtcggacggggggaacaacattctttcaacca

gtcaacccgattttgcaggcttacggcctgagaatgattacgactgactctggaag

'itc.ccctgctccagcacctacatcatgtacaggctacgcaagaacgttcacaggaaccc

r.gtacacattccgtctgtctcaatggacctagcgcngcggacrngatrtgtatgtgcag

cgatggaatggcagtagctgggtaaccgtcgctcaatcgacatcgccgggaagcaatga aaccattacgtaccgcggaaatgctggatattatcgctacgtggttaacgctgçgtçagq

atcaogagcitacacaatgogactcaccctcccctga íseq id no: 10)

Na seqüência acima, negrito indica o DNA que codifica a protea- se madura, fonte padrão indica a seqüência líder, e o sublinhado indica as pró-sequências de N-término e C-término. Expressão do Gene de ASP sintético

Cassetes de expressão de Asp foram construídos no vetor pXX- Kpnl (vide, figura 2) e subseqüentemente clonados no vetor pHPLT (Vide, figura 3) para expressão de ASP em B. subtilis. pXX-Kpnl é um vetor à base de pUC com o promotor de aprE (B. subtilis) conduzindo expressão, um ge- ne cat, e um promotor de aprE duplicado para amplificação do número de cópia em B. subtilis. O gene bla permite crescimento seletivo em E. coli. O Kpnl1 introduzido no sítio de ligação ribossomal, a jusante da região de pro- motor de aprE, junto com o sítio HindUl possibilita clonagem de cassetes de expressão de Asp em pXX-Kpnl.

pHPLT-EBS2c2, um derivado de pHPLT (Solingen et al., Extre- mophiles 5:333-341 [2001]), contém a promotor de Amilase LAT termoestá- vel (Plat) de Bacillus licheniformis, seguido por sítios de restrição de Xba\ e Hpa\ para clonar construções de expressão de ASP.

O cassete de expressão de Asp foi clonado no vetor pXX-Kpnl contendo DNA codificando um peptídeo de sinal híbrido construído de 5 a- minoácidos de peptídeo de sinal de N-término de AprE de subtilisina fundido aos 25 aminoácidos de peptídeo de sinal de C-término de Asp (MRSK- KRTVTRALAVATAAATLLAGGMAAQA; SEQ ID N0 11). O cassete de ex- pressão de Asp clonado no vetor pXX-Kpnl foi transformado em E. coli (Elec- tromax DH10B, Invitrogen, Cat. N0 12033-015). Os iniciadores e estratégia de clonagem usados são apresentados na Tabela 2-1. Subseqüentemente, os cassetes de expressão foram clonados destes vetores e introduzidos no vetor de expressão de pHPLT para transformação em uma cepa B. subtilis (AaprE, AnprE, oppA, AspolIE, degUHy32, AamyE:: (xylR,pxylA-comK). Os iniciadores e estratégia de clonagem para clonagem de cassetes de expres- são de Asp em pHPLT são apresentados na Tabela 2-2. Transformação em B. subtilis foi realizada como descrito em WO 02/14490, incorporada aqui por referência. Tabela 2-1. ASP em pXX-Kpnl e p2JM103-DNNDPI Sítios ASP de Cons- trução de Ve- tor Peptí- deo de Sinal Pró- se- quência C- Termi- nal Iniciadores Modelo de DNA Vetor Hos- pedei- ro Res- trição usa- dos para clo- nage MRSK ASP-PreCross-l-FW Se- pXX- tCpn\ e pXX- ASP-4 KRTVT RALA VATA AATLL AGGM AAQA (SEQ ID NOIl) Não incorpo- rado TCATGCAGGGTACCATG AGAAGCAAGAAGCGAA CTGTCAC A AG AGCTCTG GCT (SEQ ID NO: 12) ASP-syntc-mature-RV GTGTGCAAGCTTTCAAG GGGAACTTCCAGAGTCA GTC (SEQ ID NO: 13) qüência de DNA sintético de ASP Kpnl HindWl

Tabela 2-2. Cassetes de expressão de Asp em pHPLT Constru- ção de Vetor Iniciadores Mode- lo de DNA Vetor Hospedei- ro Sítios de Restri- ção usa- dos para clona- gem pHPLT- ASP -CI-2 AS P-C ruzamento-1 &2-FW TGAGCTGCTAGCAAAAGGAGAGGG TAAAGAATGAGAAGCAAGAAG (SEQ ID NO: 14) DHPLT-ASPmat-RV CATGC ATCCCGGGTT AAGGGG A AC TTCCAGAGTCAGTC (SEQ ID NO: 15) pXX- ASP-4 PHPLT- EBS2c2 (Xba\ χ Hpa\) Nhe I χ Smal

Iniciadores foram obtidos de MWG e Invitrogen. Invitrogen Plati- num Taq DNA polymerase High Fidelity (Cat. N0 11304-029) foi usado para amplificação de PCR (0,2 μΜ de iniciadores, 25 até 30 ciclos) de acordo com o protocolo de Invitrogen. Reações de Iigase de cassetes de expressão de Asp e vetores hospedeiros foram completados usando Ligase de DNA de Invitrogen T4 (Cat. N0 15224-025), utilizando protocolo de Invitrogen confor- me recomendado para clonagem geral de extremidades coesivas).

Expressão do gene asp foi investigada em uma cepa B. subtilis (AaprE, AnprE, oppA, AspollE, degUHy32, AamyE:.(xylR,pxylA-comK.) O plasmídeo pHPLT-ASP-CI-2 (Vide, Tabela 2-2, e figura 1), foi transformado em B. subtilis (AaprE, AnprE, oppA, Aspol IE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK). transformação foi realizada como conhecido na técnica (Vide por exemplo, WO 02/14490, incorporada aqui por referência).

Crescimento seletivo de transformantes de B. subtilis (AaprE, AnprE, oppA, AspollE, degUHy32, AamyE:\(xylR,pxylA-comK) abrigando o vetor pHPLT-ASP-C1-2 foi realizado em frascos de agitação contendo 25 ml de Meio de Maxatase Sintético (SMM), com 0,97 g/l de CaCI2.6H20 ao invés de 0,5 g/l de CaCI2 (Vide, Pat. U.S N0 5.324.653, aqui incorporada por refe- rência) com 20 mg/L de neomicina. Este crescimento resultou na produção de protease de ASP secretada com atividade proteolítica. Análise de gel foi realizada usando géis NuPage Novex 10% Bis-Tris (Invitrogen, Cat. N0 NP0301BOX). Para preparar amostras para análise, 2 volumes de sobrena- dante foram misturados com 1 volume de 1M de HCI, 1 volume de 4xLDS de tampão de amostra (Invitrogen, Cat. N0 NP0007) e 1% de PMSF (20 mg/ml) e subseqüentemente aquecidos por 10 minutos a 70°C. Então, 25 μΙ_ de ca- da amostra foi carregada no gel, junto com 10 μΙ_ de SeeBIue mais 2 pa- drões de proteína pré-colorida (Invitrogen, Cat. N°LC5925). Os resultados claramente demonstraram que a estratégia de clonagem asp descrita neste exemplo deu Asp ativo produzido por B. subtilis.

Em adição, amostras dos mesmos caldos de fermentação foram testadas como a seguir: 10μΙ do sobrenadante diluído foram tomados e adi- cionados a 190 μΙ de solução de substrato de AAPF (conc. 1 mg/ml, em 0,1 M de Tris/0,005% TWEEN®, pH 8,6). A taxa de aumento em absorvância a 410 nm devido a liberação de p-nitroanilina foi monitorada (25°C), conforme provê uma medida da concentração de ASP produzida. Estes resultados indicaram que os transformantes pHPLT-ASP-C1-2 de B.subtilis resultaram na produção de protease de ASP mensurável. Exemplo 3 Construção de Mutantes Combinatórios

Neste exemplo, a construção de uma biblioteca de mutação múl- tipla de uma variante de ASP é descrita. A variante de ASP que serviu como a estrutura dorsal para a biblioteca de mutação múltipla contém as substitui- ções R014I-A064K-T086K-T116E-R123F. Esta variante foi clonada no vetor pHPLT. O kit de mutagênese sítio-dirigida de multi QuikChange® (QCMS) (Stratagene) foi usado para construir a biblioteca. Os iniciadores fosforilados de 5' usados para criar a biblioteca são mostrados na Tabela 3-1. Notou-se que HPLC1 PAGE ou qualquer outro tipo de iniciadores purificados deram resultados muito melhores em termos de incorporação de iniciadores de comprimento completo bem como redução significante em erros contendo

iniciador. No entanto, nestes experimentos, iniciadores purificados não foram usados.

Tabela 3-1. Iniciadores e Seqüências Nome de Iniciador Seqüências de Iniciador ASP-N24E-FW TATCGGATTCGCAGTAGAGCGTGGCTTCATTACTGCCGG (SEQ ID NO: 16) ASP-N24A-FW TATCGGATTCGCAGTAGCCGGTGGCTTCATTACTGCCGG (SEQ ID NO: 17) ASP N24T FW TATCGGATTCGCAGTAACAGGTGGCTTCATTACTGCCGG (SEQ ID NOrI8) ASP-N24Q-FW TATCCGA rrCGCAGTACAAGGTGGCTTCATTACTGCCGG (SEQ ID NO: 19) ASP-R35E-FW CGGTCACTGCGGAGAGACAGGAGCCACrACTGCC (SEQ ID NO:20) ASP-R3SD-FW CGGTCACTGCGGAGACACAGGAGCCACTACTGCC (SEQ ID NO:2l) ASP-G54D-FW AGGT AGCTGG TTTCCGGACAATG ATT ATGCATTCGTCCG (SEQ ID NO:21) ASP-A64K-N67L-FW CCGAACAGGGAAAGGAGTACTGTTGCTTGCCCAAGTCAATAAC (SF.Q IDNO:22) ASP-A64K-N67S-FW CCGAACAGGGAAAGGAGTATCTTTGCTTGCCCAAGTCAATAAC (SEQ ID NO:23) ASP-A64K-N67A-FW CCGAACAGGGAAAOGAGTAGCrrrGCTTGCCCAAGTCAATAAC (SEQ ID NO:24) ASP-G78D-T86K-FW TAACTACTCGGGCGACAGAGTCCAAGTAGCAGGACATAAAGCC(SEQ ID NO:25) ASP-R123 F-R127Q-FW GTCTTTGGACTTATCCAAACGACGGTTTGTGCCGAACC (SEQ ID NO:26) ASP-FU 23F-R127K-FW GTCTTTGGACTTATCAAAACGACGGTTTGTGCCGA ACCAG (SEQ ID NO:27) ASP-R123 F-R i 27Y-FW GTCCGAGGACTTATCTACACGACGGTTTGTGCCGAACC(SEQ ID NO:28) K159F-FW GGTGGTTCTGGAAATTGTTTCACGGGGGGAACAACATTC (SEQ ID NO:29) KI59E-FW GGTGGTTCTGGAAATTGTGAGACGGGGGGAACAACATTC(SEQ ID NO: 30) KI59N-FW GGTGGTTCTGGAAATTGTAACACGGGGGGAACAACATTC (SEQ ID NO:3?) RI59K-FW GGTGGTTCTGGAAATTGTAAGACGGGGGGAACAACATTC(SEQ ID NO:32)

Preparação de pUC18-ASP

A variante de ASP contendo as substituições R014I-A064K- T086K-T116E-R123F foi clonada a partir do vetor pHPLT no vetor pUC18 (Invitrogen, cat. n° 15363013; Vide, figura 1), usando os sítios de restrição Pst\ e Hind\\\. Subseqüentemente, o plasmídeo de pUC18-ASP (Vide, figura 2) foi eletroporado em células de E.coli eletrocompetentes (Invitrogen, cat. no C4040-52, um Shot® TOPIO Electrocomp® E. coli, dam+) e crescimento seletivo em placas de agar contendo 100 mg/L de ampicilina, resultou em plasmídeo de pUC18-ASP abrigando células E.coli. Este método foi usado para assegurar DNA de ASP metilado em sítios GATC1 necessários para realizar o protocolo de QCMS, porque o plasmídeo pHPLT-ASP-C1-2 não cresceu em E. coli.

Miniprep DNA foi preparado a partir de células de E.coli abrigan- do o plasmídeo de pUC18-ASP. Especificamente, a cepa foi cultivada duran- te a noite em 10mL de meio de 2xTY com 100 ppm de ampicilina, após que as células foram giradas. O kit de spin miniprep DNA de Qiagen (cat. N0 27106) foi usado para preparar o DNA de plasmídeo pelas etapas descritas no manual de kit miniprep Qiagen. Miniprep DNA foi eluído com 50pL de tampão EB de Qiagen provido no kit. Construção de Biblioteca de mutação múltipla

Os sítios a serem usados para construção de biblioteca de mu- tação múltipla foram escolhidos como a seguir. Para cada propriedade re- querida na molécula final, mutações foram avaliadas como "positivas" ou "negativas", com sítios definidos como produtivos. Em um mínimo, sítios a serem combinados deveriam ser produtivos para cada propriedade deseja- da, e em um mínimo, para a propriedade mais importante. Para assegurar que as bibliotecas tiveram a maior probabilidade para melhorar ou manter todas propriedades importantes, os seguintes critérios foram usados.

Para cada propriedade, um valor de corte para ΔΔ G foi estabe- lecido. Por exemplo, para um processo ocorrendo a 25° C. Valores de ΔΔ G < 0,06 Kcal representam aquelas mutações não piores que 90% da atividade de proteínas parentais, enquanto valores de ΔΔ G > 1,13 Kcal representam aquelas mutações que são 125% da atividade de proteínas parentais.

A biblioteca de mutação múltipla foi construída como descrito no kit QCMS de Stratagene, com a exceção da concentração de iniciador usada nas reações. Especificamente, 1 pL plasmídeo de pUC18-ASP purificado metilado (cerca de 70 ng) foi misturado com 15pL de água destilada estéril, 1,5pL de dNTP, 2,5pL de 10x tampão, 1pL da mistura de enzima e 1,0μί mistura de iniciador mutante (para um total de 100 pmols de iniciadores). A mistura de iniciador foi preparada usando 10μΙ_ de cada um dos dezoito ini- ciadores mutantes (100 ρηιοΙ/μ[_); adicionando 50ng de cada iniciador para a biblioteca de acordo com as instruções do fabricante de Stratagene, resultou em menos mutações em uma ciclo anterior de mutagênese. Deste modo, o protocolo foi modificado na presente ciclo de mutagênese para incluir um total de 100 pmol de iniciadores em cada reação. As condições cíclicas fo- ram 95°C. por 1 min, seguido por 30 ciclos de 95°C. por 1 min, 55°C. por 1 min, e 65°C. por 12 min, em um termociclizador MJ Research PTC-200 u- sando tubos de PCR de 0,2mL de paredes finas. O produto de reação foi digerido com 1pL de Dpn\ do kit QCMS incubando a 37°C. durante a noite. Um adicional de 0,5μΙ_ de Dpn\ foi adicionado, e a reação foi incubada du- rante 1 hora.

Subseqüentemente, o DNA de biblioteca (produto de pUC18- ASP de filamento simples mutagenizado) foi eletroporado em células de E.coli eletrocompetentes (Invitrogen, cat. no C4040-52, um Shot® TOPIO Electrocomp® E. coli, dam+) e crescimento seletivo em placas de agar con- tendo 100 mg/L de ampicilina resultou na biblioteca de mutação múltipla de ASP em células E.coli. Colônias (dezenas de milhares) foram coletadas e o kit miniprep DNA Qiagen (cat. N0 27106) foi usado para preparar o DNA de plasmídeo pelas etapas descritas no manual de kit miniprep Qiagen. O mini- prep DNA foi eluído com 50uL de tampão EB de Qiagen provido no kit.

Miniprep DNA foi digerido usando as enzimas de restrição de DNA Pstl e Hindlll. A mistura de fragmento de biblioteca de ASP (Pstl χ Hin- dlll) foi purificada por gel e clonada no fragmento de vetor pHPLT de Hindlll χ Pstl base par 4154 por uma reação de Iigase usando Ligase de DNA de Invitrogen T4 (Cat. N0 15224-025), utilizando protocolo de Invitrogen confor- me recomendado para clonagem geral de extremidades coesivas). Em outra abordagem, fragmentos de biblioteca de ASP sintéticos foram produzidos por GeneArt. Estes fragmentos de biblioteca de ASP foram também digeri- dos com Psfl e HindWl, purificados e clonados no fragmento de vetor pHPLT de Hindlll χ Pstl base par 4154 por uma reação de ligase.

Para transformar a mistura de reação de ligação diretamente em células Bacillus, o DNA de biblioteca (mistura de fragmento de biblioteca de ASP clonada em pHPLT) foi amplificado usando o kit TempIiPhi (Amersham cat. n°25-6400). Para este fim, 1μΙ_ da mistura de reação de ligação foi mis- turado com 5μΙ_ de tampão de amostra do kit TempIiPhi e aquecido durante 3 minutos a 95°C. para desnaturar o DNA. A reação foi colocada em gelo para resfriar por 2 minutos e então girada para baixo levemente. Em segui- da, 5μΙ_ de tampão de reação e 0,2pL de polimerase phi29 do kit TempIiPhi foram adicionados, e as reações foram incubadas a 30°C em uma máquina de PCR MJ Research por 4 horas. A enzima phi29 enzima foi inativada por calor nas reações por incubação a 65°C. por 10 min na máquina de PCR.

Para transformação das bibliotecas em Bacillus, 0,1 μΙ_ do pro- duto de reação de amplificação TempIiPhi foi misturado com 500 μΙ_ de célu- las de B. subtilis competentes (AaprE, AnprE, oppA, AspolIE1 degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK) seguido por agitamento vigoroso a 37°C. por 1 hora e 100 e 500 pL foi colocado em placas de agar-HI contendo 20 ppm de sulfato de neomicina (Sigma, Cat. N0 N-1876; contém 732 μg de neomicina por mg) e 0,5% leite desnatado. Noventa e cinco clones da biblioteca foram coletados para sequenciamento.

A mutagênese funcionou bem, em que apenas 14% dos clones foram iguais à seqüência de estrutura dorsal (ASP com R014I-A064K- T086K-T116E-R123F), cerca de 3% de clones tiveram mutações extras. O restante dos clones sequenciados (72%) foram todos mutantes e, destes, cerca de 94% foram mutantes únicos. Os resultados de sequenciamento

Tabela 3-3. Variantes de ASP com R014I-A064K-T086K-T116E-R123F G54D N 24 A N24Q N24T N67S R127K R159F Tabela 3-3. Variantes de ASP com R014I-A064K-T086K-T1 IfiF-R 1?3F R159K R159K R159N R159N G78D R159F N24Q R35E N67S R159E R127K R159E R127K R159K R127K R159N R127Q R159K R35D R159E R35D R159K R35E R159K G54D R127K R159K G78D R127K R159K G78D R127K R159E G78D R127Q R159K N24A N67A R159K N24A N67S R159K N24E R35D G78D N24T N67S R159E N67L G78D R159K R35D G78D R159K N24A R35E G78D R159N N24D R35D G78D R159F N24E G54D G78D R159K N24E R35D G78D R127K R159N N24Q G54D G78D R159N N24Q N67L G78D R159E N24Q R35D R127K R159K N24T R35D G78D R159K Tabela 3 -3. Variantes de ASP com R014I-A064K-T086K-T116E-R123F N24T R35D G78D R159K N67S G78D R127K R159K R35D G78D R127K R159E R35D G78D R127K R159N R35D G78D R127Q R159K R35E G54D N67A R159F R35E N67S G78D R127Q N 24 A G54D N67S G78D R159F N 24 A R35D N67A G78D R159F N24Q R35D N67L G78D R159K N24Q R35D N67L G78D R159N N24Q R35D N67S R127K R159E N24Q R35E N67A R127K R159E N24Q R35E N67A G78D R159E N24T N67A G78D R127Q R159N N24T R35E N67A G78D R127Q R35E G54D N67S G78D R159K N24A G54D N67S G78D R127K R159K N24A R35E N67S G78D R127K R159K N24E R35E G54D N67S R127K R159N N24Q R35D N67S G78D R127K R159F N24T G54D N67S G78D R127Y R159E N24E R35E G54D N67S G78D R127K R159K

Exemplo 4

Preparação de Amostras de enzima cruas de variante de ASP

As proteínas de variante de Asp foram produzidas cultivando os

transformantes de B. subtilis (descritos acima e no pedido de patente U.S. número de série 10/576,331) em MTP de 96 cavidades a 37°C por 68 horas em meio de MDB (um meio definido à base de MOPS). Meio de MDB foi feito essencialmente como conhecido na técnica (Vide, Neidhardt et al., J. Bacte- riol., 119: 736-747 [1974]), exceto que NH4CI2, FeSO4, e CaCI2 foram deixa- dos de lado do meio de base, 3 mM de K2HPO4 foram usados, e o meio de base foi suplementado com 60 mM de uréia, 75 g/L de glucose, e 1 % de soytone. Também, os micronutrientes foram constituídos como uma carga de 100 X contendo em um litro, 400 mg de FeSO4 .7H20, 100 mg de MnSO4 .H2O, 100 mg de ZnS04.7H20, 50 mg de CuCI2.2H20, 100 mg CoCI2.6H20, 100 mg de NaMo04.2H20, 100 mg de Na2B4O7-IOH2O1 10 ml de 1M de Ca- Cl2, e 10 ml de 0,5 M de citratode sódio.

Nos seguintes exemplos, testes conduzidos em vários mutantes de ASP são descritos. Os métodos descritos acima no exemplo 1 foram usa- dos. Nas seguintes Tabelas, "Código de Variante" provê o aminoácido de tipo selvagem, a posição na seqüência de aminoácido, e o aminoácido de substituição (isto é, "F001A" indica que a fenilalanina em posição 1 na se- qüência de aminoácido foi substituída por alanina nesta variante particular).

Exemplo 5

Atividade de hidrólise de caseína de variantes substituídas de modo múltiplo

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar a ati- vidade caseinolítica de várias variantes de ASP substituídas de modo múlti- plo são descritos. Nestes experimentos, o protocolo usado é descrito no e- xemplo 1, acima. A tabela seguinte apresenta as variantes, incluindo as mu- tações em cada variante, bem como a atividade de caseína para aquelas com atividade maior que aquela de ASP de tipo selvagem mais 1 desvio pa- drão (>1,13 de unidade de atividade).

Tabela 5-1. Atividade caseinolítica Variantes Atividade de case- ína R14L-R79T 1,61 G12D-R35H-R159E 1,27 G12D-R35H-R123Q 1,30 G12D-R35H-R123F- R159E 1,45

Tabela 5-1. Atividade caseinolítica Variantes Atividade de caseína G12D-R35D-R123Q- R159E 1,27 G12D-R35D 1,64 G12D-R159E 1,49 G12D-R14Q-R35H 1,39 G12D-R14I-R35H 1,41

N024E-G049A- 1,15

A093H-R127K-

A143N-R159K-I181Q

N24M-S76V-A93H- 1,13 R127K-R159K

R14I-N24E-R35D- 1,13

A64K-N67A-G78D-

R123F-R159K-

D184T

A tabela seguinte provê as variantes, incluindo as mutações em

cada variante, bem como a atividade de caseína para aqueles com atividade maior que aquela de ASP de tipo selvagem mais 1 desvio padrão (>0,85 uni- dade de atividade)._

Tabela 5-2. Atividade caseinolítica Variante Atividade de caseína R127A-R159K 0,86 R14I-G65Q 1,04 R14I-G65Q-R159K 0,99 R14I-S76V 1,43

Como indicado por estes resultados, numerosas variantes substituí-

das de modo múltiplo tiveram um melhor desempenho do que ASP de tipo selvagem neste sistema de teste. exemplo 6

Atividade de hidrólise de queratina de variantes substituídas de modo múltiplo

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar a ati- vidade queratinolítica de várias variantes de ASP substituídas de modo múl- tiplo são descritos. Nestes experimentos, o protocolo usado é descrito no exemplo 1, acima. A tabela seguinte apresenta as variantes, incluindo as mutações em cada variante, bem como a atividade de hidrólise de queratina

G12D-R35H 1,69 G12D-R35E-R159E 1,22 G12D-R35E-R123Q- R159E 1,16 G12D-R35E-R123Q 1,14 G12D-R35E 1,43 G12D-R35D-R159E 1,18 para aquelas com atividade maior que aquela de ASP de tipo selvagem mais 1 desvio padrão (>1,1 índice de desempenho). _

Tabela 6-1. Resultados de teste da atividade de hidrólis* ri* qi i^tina Variantes Hidrólise de Querati- na[índice de desempenho] N024E-G049A-A093H-R127K-A143N-R159K- 1181Q 1,32 N024E-G049A-A093H-S099A-R127K-A143N- R159K-1181T-V090I 1,37 N024E-G049A-A093S-S099D-R127K-A143N- R159K-I181Q 1,28 N024Q-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 1,17 N024Q-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T 1,19 N024Q-G049A-A093S-S099N-R127K-A143N- R159K-I181Q 1,13 N024T-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T 1,12 N024W-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 1,13 N24A-G54E-S76D-A93G-R127K-R159K 1,53 N24E-A93G-R127K-R159K 1,33 N24E-G54L-S76E-A93G-R127K-R159K 1,21 N24E-G54Q-A93S-R127K-R159K 1,37 N24E-S76D-A93T-R127K-R159K 1,64 N24M-G54E-A93H-R127K-R159K 1,24 N24M-G54E-S76N-A93S-R127K-R159K 1,24 N24Q-A93G-R127K-R159K 1,17 N24Q-G54D-S76L-A93G-R127K-R159K 1,15 N24Q-G54I-S76E-A93H-R127K-R159K 1,12 N24T-G54D-S76V-A93G-R127K-R159K 1,11 Tabela 6-1. Resultados de teste da atividade de hidrólise de queratina Variantes Hidrólise de Querati- na[índice de desempenho] N24T-G54E-S76V-A93H-R127K-R159K 1,28 N24W-G54D-A93H-R127K-R159K 1,20 N24W-S76E-A93G-R127K-R159K 1,13 R014I-S076A-A093G-R127K-R159K-1181T 1,27 R014I-S076A-A093H-R127K-R159K-I181Q 1,22 R014I-S076D-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,40 R014I-S076D-A093H-R127K-R159K-I181T 1,46 R014I-S076D-A093S-R127K-R159K-1181T 1,49 R014I-S076E-A093S-R127K-R159K-1181Q 1,54 R014I-S076E-A093T-R127K-R159K-1181K 1,34 R014I-S076I-A093S-R127K-R159K-1181Q 1,27 R014I-S076N-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,18 R014I-S076T-A093G-R127K-R159K-I181Q 1,22 R014I-S076V-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,23 R014K-S076A-A093S-R127K-R159K-I181T 1,15 R014K-S076E-A093H-R127K-R159K-I181T 1,14 R014K-S076E-A093S-R127K-R159K-I181T 1,19 R014K-S076T-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,11 R014L-S076A-A093H-R127K-R159K 1,36 R014L-S076A-A093H-R127K-R159K-I181Q 1,24 R014L-S076D-A093H-R127K-R159K-1181T 1,32 R014L-S076E-A093H-R127K-R159K-1181K 1,30 R014M-S076A-A093G-R127K-R159K-1181T 1,26 R014M-S076A-A093H-R127K-R159K-1181T 1,15 R014M-S076A-A093S-R127K-R159K-1181K 1,22 R014M-S076A-A093S-R127K-R159K-1181T 1,24 R014M-S076A-A093T-R127K-R159K-I181Q 1,13 R014M-S076D-A093S-R127K-R159K-I181T 1,36 Tabela 6-1. Resultados de teste da atividade de hidrólise de queratina Variantes Hidrólise de Querati- ria[índice de desempenho] R014M-S076E-A093G-R127K-R159K-1181T 1,25 R014M-S076E-A093H-R127K-R159K-I181T 1,42 R014M-S076E-A093S-R127K-R159K-1181T 1,46 R014M-S076N-A093G-R127K-R159K-1181K 1,11 R014M-S076N-A093G-R127K-R159K-1181T 1,21 R014M-S076N-A093H-R127K-R159K-1181T 1,23 R014M-S076N-A093S-R127K-R159K-1181T 1,25 R014M-S076V-A093G-R127K-R159K-I181Q 1,21 R14I-N24Q-A64K-G78D-R123F-R159K-D184T 1,11 R14I-N24A-A64K-N67S-G78D-R123F-R159K- D184T 1,34 R14I-N24Q-R35D-A64K-N67S-R123F-R159K- D184T 1,21 R14I-N24E-A64K-R123F-R127K-R159K-D184T 1,31 R14I-N24Q-A64K-R123F-R127Q-R159K- D184T 1,28 R14I-N24Q-A64K-G78D-R123F-R127Q- R159N-D184T 1,21 R14I-N24E-A64K-N67L-G78D-R123F-R159K- D184T 1,49 R14I-N24Q-R35D-A64K-N67S-R123F-R159K- D184T 1,26 R127Q-R159K 1,14 G78D-R127K-R159K 1,24 N67S-G78D-R127K-R159K 1,39 R35D-R159K 1,17 G78D-R127Q-R159K 1,26 N24A-N67A-R159K 1,17 T36S-R127Q-R159E 1,77 Tabela 6-1. Resultados de teste da atividade de hidrólise de aueratina Variantes Hidrólise de Querati- nafíndice de desempenho] S15E-T121E-R123Q 1,32 S15E-R35H-R159E 1,23 S15E-R35E 1,33 S15E-R159E 1,12 S15E-R123Q 1,54 S15E-R123E 1,92 R79T R127Q R179Q 1,55 R35H-R159E 1,12 R35H-R127Q-R159E 1,23 R35F R61S R159Q 1,24 R35F R159Q 1,39 R35E-R159E 1,52 R35E-R127Q 1,21 R35D-R159E 1,52 R35D-R127Q 1,29 R16Q R79TR159Q R179Q 1,36 R16Q R79T R127Q 1,68 R16Q R79T R123L 1,35 R16Q R79T 1,24 R16Q R35F R123L R159Q 1,20 R16Q R159Q R179Q 1,14 R16Q R127Q R159Q 1,35 R16Q R123L R159Q 1,32 R14Q-T121E 1,44 R14Q-R35E-T121E 1,11 R14Q-R35E-R159E 1,20 R14Q-R35E 1,49 R14Q-R35D-R127Q 1,39 Tabela 6-1. Resultados de teste da atividade de hidrólise de queratina Variantes Hidrólise de Querati- na[índice de desempenho] R14Q-R35D 1,46 R14L R79T R127Q R159Q 1,30 R14L R61S R79TR123L 1,30 R14L R35F R61S 1,27 R14L R127Q R159Q R179Q 1,47 R14L R123L R159Q 1,34 R14I-R35E-R127Q 1,74 R14I-R35E-R123E 1,19 R14I-R35D-R159E 1,20 R14E-R35H-R127Q 1,60 R127Q-R159E 2,44 R127Q R159Q 1,37 R123Q-R159E 1,64 R123Q-R127Q-R159E 1,34 R123L R159Q 1,51 R123L R127Q R159Q 1,11 R123F-R159E 1,64 R123E-R127Q-R159E 1,15 R123E-R127Q 1,65 G12D-S15E-R35H-R159E 1,40 G12D-S15E-R35D 1,59 G12D-S15E-R159E 1,34 G12D-S15E 1,81 G12D-R35H-T121E-R123Q 1,96 G12D-R35H-R159E 1,98 G12D-R35H-R127Q-R159E 1,73 G12D-R35H-R123Q 2,43 G12D-R35H-R123F-R159E 1,44 Tabela 6-1. Resultados de teste da atividade de hidrólise de aueratina Variantes Hidrólise de Querati- na[índice de desempenho] G12D-R35H 2,02 G12D-R35E-R159E 1,47 G12D-R35E-R123Q-R159E 1,29 G12D-R35E-R123Q 2,28 G12D-R35E 1,98 G12D-R35D-R159E 1,23 G12D-R35D-R127Q 1,59 G12D-R35D 2,23 G12D-R159E 2,46 G12D-R14Q-R35H 2,20 G12D-R14Q-R35D-R123H 1,20 G12D-R14Q-R159E 1,55 G12D-R14I-R35H 2,82 G12D-R14E 2,00 G12D-R127Q-R159E 1,83 G12D-R123E-R159E 1,26

A tabela seguinte provê as variantes, incluindo as mutações em

cada variante, bem como a atividade queratinolítica para aquelas com ativi- dade maior que aquela de ASP de tipo selvagem mais 1 desvio padrão (>1,2 índice de desempenho)._

Tabela 6-2. Resultados de teste de nidrólise de queratina Variante Hidrólise de Queratina [índice de De- sempenho] R127A-R159K 1,84 R14I-G65Q 1,96 R14I-G65Q-R127A-R159K 1,42 R14I-G65Q-R159K 1,78 R14I-R127A 1,23 Tabela 6-2. Resultados de teste de hidrólise de queratina Variante Hidrólise de Queratina [índice de De- sempenho! R14I-R127A-R159K -————C_J___ 1,45 R14I-R159K 2,69 R14I-R35F 1,32 R14I-R35F-G65Q 1,50 R14I-R35F-G65Q-R127A-R159K 1,66 R14I-R35F-R159K 1,71 R14I-S76V 2,39 R14I-T36S-G65Q-R127A-R159K 1,90 R35F-R127A-R159K 1,75

Como indicado por estes resultados, numerosas variantes substituí- das de modo múltiplo tiveram um desempenho melhor do que a ASP de tipo selvagem neste sistema de teste. Exemplo 7

Termoestabilidade de variantes substituídas de modo múltiplo

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar a termoestabilidade de várias variantes de ASP substituídas de modo múltiplo são descritos. Nestes experimentos, o protocolo usado é descrito no exem- plo 1, acima. A tabela seguinte provê as variantes, incluindo as mutações em cada variante, bem como a residual atividade de caseína para aquelas com atividade maior que aquela de ASP de tipo selvagem mais 1 desvio pa-

drão (>48% atividade residual).

Tabela 7-1. Resultados d e teste de termoestabilidade Variantes Termoestabilidade [% de atividade re- sidual] T121E-R123F-R159E 61 R79T-R127Q-R179Q 55 R16Q-R79T-R127Q 55 R16Q-R79T-R123L-R159Q-R179Q 61 Tabela 7-1. Resultados de teste de termoestabilidade Variantes Termoestabilidade [% de atividade re- sidual] R16Q-R79T-R123L 65 R16Q-R79T 64 R16Q-R123L-R159Q 49 R14Q-T121E 59 R14L-R79T 71 R123L-R159Q 54 R123L-R127Q-R159Q 69 G12D-S15E-R35D-R123F-R159E 59 G12D-S15E-R159E 54 G12D-S15E 64 G12D-R35H-T121E-R123Q 57 G12D-R35H-R123Q 59 G12D-R35H-R123F-R159E 60 G12D-R35H 57 G12D-R35E-R123Q 51 G12D-R35E 52 G12D-R159E 53 G12D-R14Q-S15E-R35D 52 G12D-R14Q-R35H 51 G12D-R14Q-R159E 49 G12D-R14E 84 G12D-R127Q-R159E 63 G12D-R123E-R159E 58

Como indicado por estes resultados, numerosas variantes subs-

tituídas de modo múltiplo tiveram um desempenho melhor do que a ASP de tipo selvagem neste sistema de teste. Exemplo 8

Estabilidade de LAS de Variantes substituídas de modo múltiplo

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar a es- tabilidade de LAS de várias variantes de ASP substituídas de modo múltiplo são descritos. Nestes experimentos, o protocolo usado é descrito no exem- plo 1, acima, com uma temperatura de 25°C usada. A tabela seguinte provê as variantes, incluindo as mutações em cada variante, bem como a atividade de AAPF residual para aquelas com atividade residual maior que aquela de

Tabela 8-1. Resultados de teste de estabilidade de LAS Variantes Estabilidade de LAS \%] T121E-R123F-R159E 73 S15E-T121E-R123Q 87 S15E-R35H-R159E 88 S15E-R35E-R159E 93 S15E-R35E-R127Q-R159E 102 S15E-R35E 82 S15E-R35D-T121E-R123Q 100 S15E-R35D-R123Q 90 S15E-R35D-R123F-R159E 97 S15E-R35D 81 S15E-R159E 62 S15E-R127Q 67 S15E-R123Q 66 S15E-R123E 81 R79TR127Q R179Q 53 R35H-R159E 82 R35H-R127Q-R159E 89 R35H-R123D-R159E 82 R35F R61S R159Q 78 R35F R159Q 44 R35E-T121E-R123E 92 R35E-R159E 93 Tabela 8-1. Resultados de teste de estabilidade de LAS Variantes Estabilidade de LAS [%] R35E-R127Q 84 R35D-R159E 88 R35D-R127Q-R159E 95 R35D-R127Q 89 R35D-R123Q-R159E 94 R16Q R79T R159Q R179Q 93 R16Q R79TR127Q 92 R16Q R79T R123L R159Q R179Q 96 R16Q R79TR123L R159Q 89 R16Q R79TR123L 74 R16Q R79T 38 R16Q R61S R159Q R179Q 95 R16Q R61S R123L R159Q 96 R16Q R35F R61S R159Q 97 R16Q R35F R159Q 82 R16Q R35F R123L R159Q 91 R16Q R35F 54 R16Q R159Q R179Q 83 R16Q R159Q 69 R16Q R127Q R179Q 88 R16Q R127Q R159Q 76 R16Q R123L R159Q 85 R14Q-T121E 88 R14Q-R35E-T121E 96 R14Q-R35E-R159E 91 R14Q-R35E 94 R14Q-R35D-R127Q 88 R14Q-R35D-R123E-R159E 93 Tabela 8-1. Resultados de teste de estabilidade de LAS Variantes Estabilidade de LAS [%] R14Q-R35D-R123D-R159E 99 R14Q-R35D 85 R14Q-R123Q 87 R14L R79T R127Q R159Q 90 R14L R79T 32 R14L R61S R79TR123L 97 R14L R61S R123L 85 R14L R35F R79T R123L R159Q 90 R14L R35F R61S 80 R14L R127Q R159Q R179Q 86 R14L R123L R159Q 91 R14I-R35E-T121E-R159E 100 R14I-R35E-R127Q 97 R14I-R35E-R123E 95 R14I-R35D-R159E 98 R14I-R35D-R127Q-R159E 99 R14E-S15E-R35H 92 R14E-R35H-R127Q 91 R14D-S15E-R35E-R159E 98 R14D-R35H-R123Q-R159E 98 R127Q-R159E 40 R127Q R159Q 39 R123Q-R159E 42 R123Q-R127Q-R159E 51 R123L R159Q 36 R123L R127Q R159Q 56 R123F-R159E 67 R123E-R127Q-R159E 65 Tabela 8-1. Resultados de teste de estabilidade de LAS Variantes Estabilidade de LAS [%] R123E-R127Q 49 G12D-S15E-R35H-R159E 100 G12D-S15E-R35H-R123F-R127Q-R159E 100 G12D-S15E-R35E-R159E 103 G12D-S15E-R35D-R127Q 99 G12D-S15E-R35D-R123F-R159E 101 G12D-S15E-R35D-R123E 100 G12D-S15E-R35D 97 G12D-S15E-R159E 96 G12D-S15E 76 G12D-R35H-T121E-R123Q 98 G12D-R35H-R159E 96 G12D-R35H-R123Q-R159E 97 G12D-R35H-R123Q 89 G12D-R35H-R123F-R159E 98 G12D-R35H 79 G12D-R35E-R159E 101 G12D-R35E-R123Q-R159E 96 G12D-R35E-R123Q 92 G12D-R35E 97 G12D-R35D-R159E 95 G12D-R35D-R127Q 98 G12D-R35D-R123Q-R159E 103 G12D-R35D 94 G12D-R159E 97 G12D-R14Q-S15E-R35D 101 G12D-R14Q-R35H 88 G12D-R14Q-R35E-R127Q-R159E 100 Tabela 8-1. Resultados de teste de estabilidade de LAS Variantes Estabilidade de LAS [%] G12D-R14Q-R35D-R123H 100 G12D-R14Q-R159E 96 G12D-R14I-R35H 94 G12D-R14E 85 G12D-R14D-R35H-R123D-R127Q 100 G12D-R127Q-R159E 93 G12D-R123E-R159E 99 R127A-R159K 24 R14I-G65Q 13 R14I-G65Q-N67L-R159K 11 R14I-G65Q-N67L-Y75G-R127A-R159K 11 R14I-G65Q-R159K 33 R14I-G65Q-S76V-R127A-R159K 11 R14I-R127A 71 R14I-R127A-R159K 77 R14I-R159K 58 R14I-R35F 64 R14I-R35F-G65Q 47 R14I-R35F-G65Q-R127A-R159K 76 R14I-R35F-N67L-R127A-R159K 61 R14I-R35F-R127A-R159K 81 R14I-R35F-R159K 70 R14I-S76V 14 R14I-T36S-G65Q-R127A-R159K 32 R35F-R127A-R159K 57 R35F-S76A-R127A 58

Em experimentos adicionais, a estabilidade de LAS de variantes tendo múltiplas substituições foi testada. No primeiro conjunto de experimen- tos, as condições de teste descritas no exemplo 1 foram usadas a uma tem- peratura de 25°C. Na Tabela seguinte, as variantes com atividade maior que tipo selvagem, mais um desvio padrão (> 20% atividade residual) estão pre- sentes.

Tabela 8-2. Resultados de Teste de estabilidade de LAS a 25°C. Variante Estabilidade de LAS a 25°C [%] N024A-G049A-A093H-S099N-R127K-A143N- R159K-I181Q 25 N024A-S076A-A093H-S099G-R127K-R159K 47 N024A-S076T-A093S-S099G-R127K-R159K 41 N024E-G049A-A093G-S099G-R127K-A143N- R159K-I181T 31 N024E-G049A-A093H-R127K-A143N-R159K-1181Q 53 N024E-G049A-A093H-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T-V090I 75 N024E-G049A-A093S-S099D-R127K-A143N- R159K-I181Q 27 N024H-G049A-A093T-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 41 N024H-S076A-A093G-S099G-R127K-R159K 53 N024H-S076A-A093H-S099G-R127K-R159K 78 N024H-S076A-A093S-S099A-R127K-R159K- G054H-L069H 26 N024H-S076A-A093T-S099G-R127K-R159K 46 N024H-S076N-A093Q-S099W-R127K-R159K 33 N024H-S076V-A093Q-S099G-R127K-R159K 29 N024L-G049A-A093H-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 31 N024L-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N-R159K- 1181Q 23 N024L-S076V-A093H-S099G-R127K 30 Tabela 8-2. Resultados de Teste de estabilidade de LAS a 25°C. Variante Estabilidade de LAS a 25°C [%] N024L-S076V-A093S-S099A-R127K-R159K 29 N024M-G049A-A093G-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 39 N024M-G049A-A093H-S099D-R127K-A143N- R159K-I181Q 26 N024M-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 35 N024M-G049A-A093S-S099W-R127K-A143N- R159K-I181Q 23 N024Q-G049A-A093H-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T 40 N024Q-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 50 N024Q-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T 28 N024Q-S076A-A093H-S099A-R127K-R159K-T039N 58 N024Q-S076A-A093H-S099W-R127K-R159K 38 N024Q-S076I-A093T-S099G-R159K 25 N024Q-S076T-A093S-R127K-R159K 48 N024S-S076A-A093G-S099G-R127K-R159K-G054A 46 N024S-S076A-A093H-S099T-R127K-R159K 41 N024S-S076A-A093S-S099W-R127K-R159K 47 N024S-S076A-A093T-S099W-R127K 21 N024S-S076T-A093Q-S099W-R127K-R159K 37 N024S-S076Y-A093T-S099A-R127K-R159K 50 N024T-G049A-A093G-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 48 N024T-G049A-A093H-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 60 Tabela 8-2. Resultados de Teste de estabilidade de LAS a 25°C. Variante Estabilidade de LAS a 25°C [%l N024T-G049A-A093H-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T 58 N024T-G049A-A093H-S099D-R127K-A143N- R159K-I181Q 21 N024T-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T 41 N024T-G049A-A093T-S099A-R127K-A143N-R159K- I181T 27 N024T-S076N-A093Q-S099T-R127K-R159K 26 N024T-S076T-A093T-S099N-R127K-R159K 37 N024V-S076A-R127K-R159K 60 N024V-S076V-A093Q-S099G-R127K-R159K 33 N024W-A093G-S099W-R127K-R159K 33 N024W-G049A-A093H-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 35 N024W-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181K 22 N024W-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181Q 25 N024W-S076A-A093T-S099A-R127K-R159K 60 N024W-S076I-A093Q-S099G-R127K-R159K 26 N024W-S076N-A093T-S099G-R159K 30 N024W-S076T-A093H-S099A-R127K-R159K 44 N024W-S076T-A093H-S099W-R127K-R159K 34 N024W-S076V-A093H-S099A-R127K-R159K 26 N024W-S099W-R127K-R159K 32 N24A-G54E-S76D-A93G-R127K-R159K 50 N24E-A93G-R127K-R159K 53 N24E-G54L-S76E-A93G-R127K-R159K 22 Tabela 8-2. Resultados de Teste de estabilidade de LAS a ?5°C Variante Estabilidade de LAS a 25°C [%] N24E-G54Q-A93S-R127K-R159K 50 N24E-S76D-A93T-R127K-R159K 40 N24H-A93H-R127K-R159K 41 N24H-G54E-A93G-R127K-R159K 46 N24H-S76D-A93H-R127K-R159K 35 N24L-A93G-R127K-R159K 32 N24L-G54E-A93G-R127K-R159K 46 N24L-G54L-A93G-R127K-R159K 21 N24L-G54Q-S76A-A93H-R127K-R159K 37 N24L-S76T-A93G-R127K-R159K 24 N24L-S76T-A93H-R127K-R159K 30 N24M-A93G-R127K-R159K 33 N24M-A93H-R127K-R159K 41 N24M-A93S-R127K-R159K 36 N24M-A93T-R127K-R159K 29 N24M-G54E-A93H-R127K-R159K 54 N24M-G54E-S76N-A93S-R127K-R159K 46 N24M-G54I-A93H-R127K-R159K-S187I 31 N24Q-A93G-R127K-R159K 37 N24Q-G54D-A93H-R127K-R159K 43 N24Q-G54I-A93G-R127K-R159K 25 N24Q-G54I-S76E-A93H-R127K-R159K 22 N24Q-G54Q-A93G-R127K-R159K 32 N24Q-G54Q-S76T-A93H-R127K-R159K 30 N24Q-S76A-A93G-R127K-R159K 37 N24T-G54D-S76V-A93G-R127K-R159K 26 N24T-G54E-S76V-A93H-R127K-R159K 38 N24T-G54I-A93G-R127K-R159K 38 Tabela 8-2. Resultados de Teste de estabilidade de LAS a 25°C. Variante Estabilidade de LAS a 25°C [%] N24T-G54N-A93H-R127K-R159K 27 N24T-G54Q-S76N-A93G-R127K-R159K 40 N24T-G54Q-S76V-R127K-R159K 26 N24T-S76I-R127K-R159K 25 N24T-S76L-A93G-R127K-R159K 20 N24W-A93G-R127K-R159K 35 N24W-G54D-A93H-R127K-R159K 35 N24W-G54I-S76A-A93H-R127K-R159K 26 N24W-S76A-A93H-R127K-R159K 36 N24W-S76E-A93G-R127K-R159K 21 R014I-S076A-A093G-R127K-R159K-I181T 44 R014I-S076A-A093H-R127K-R159K-1181K 54 R014I-S076A-A093H-R127K-R159K-1181Q 71 R014I-S076A-A093H-R127K-R159K-1181T 38 R014I-S076D-A093H-R127K-R159K-I181Q 75 R014I-S076D-A093S-R127K-R159K-I181T 41 R014I-S076E-A093S-R127K-R159K-I181Q 64 R014I-S076E-A093T-R127K-R159K-1181K 30 R014I-S076I-A093S-R127K-R159K-I181Q 23 R014I-S076N-A093H-R127K-R159K-I181Q 68 R014I-S076T-A093G-R127K-R159K-1181Q 57 R014K-S076A-A093G-R127K-R159K-I181K 20 R014K-S076E-A093H-R127K-R159K-1181K 20 R014K-S076T-A093H-R127K-R159K-1181Q 24 R014L-S076A-A093H-R127K-R159K 69 R014L-S076A-A093H-R127K-R159K-I181Q 66 R014L-S076D-A093H-R127K-R159K-1181T 39 R014L-S076E-A093H-R127K-R159K-1181K 36 Tabela 8-2. Resultados de Teste de estabilidade de LAS a 25°C. Variante Estabilidade de LAS a 25°C [%] R014M-S076A-A093G-R127K-R159K-I181K 45 R014M-S076A-A093G-R127K-R159K-I181T 37 R014M-S076A-A093H-R127K-R159K-I181T 36 R014M-S076A-A093S-R127K-R159K-1181K 49 R014M-S076A-A093S-R127K-R159K-I181T 40 R014M-S076A-A093T-R127K-R159K-I181Q 57 R014M-S076D-A093S-R127K-R159K-1181T 35 R014M-S076E-A093G-R127K-R159K-I181T 32 R014M-S076E-A093H-R127K-R159K-I181T 32 R014M-S076E-A093S-R127K-R159K-I181T 39 R014M-S076N-A093G-R127K-R159K-I181K 42 R014M-S076N-A093G-R127K-R159K-I181T 36 R014M-S076N-A093H-R127K-R159K-1181Q 75 R014M-S076N-A093H-R127K-R159K-I181T 42 R014M-S076N-A093S-R127K-R159K-I181T 37 R014M-S076N-A093T-R127K-R159K-1181T 33 R014M-S076T-A093H-R127K-R159K-1181K 37 R014M-S076V-A093G-R127K-R159K-I181Q 25 R014M-S076V-A093H-R127K-R159K-1181Q 22

Em outros experimentos, ainda outras condições de teste foram usadas. Em um conjunto de experimentos, a estabilidade de LAS foi testada em uma maior temperatura (35°C.), usando o protocolo descrito no exemplo 1. Na tabela seguinte, a porcentagem de atividade residual para variantes que exibiram atividade maior que tipo selvagem mais um desvio padrão

Tabela 8-3. Resultados de teste de estabilidade de LAS a 35°C Variante Estabilidade de LAS (35°C) [%] G54E-R14L 32 Tabela 8-3. Resultados de teste de estabilidade de LAS a 35°C Variante Estabilidade de LAS (35°C) [%] G54L-R127S 6 N24D-G54F-R127C 6 N24E-R127S 7 N24E-R159C 7 N24G-G54I-R127S 10 N24H-R159Y-T46I 52 N24I-R127V-R14V 18 N24T-R127Q-R179F 11 R127A-R159V-R179F 12 R127C-R14W 7 R127S-R159N-R123L 50 R14A-N24F-R159L 25 R14A-R127L 28 R14A-R127Y-R159W 28 R14A-R159W 9 R14C-S114F-R159G 25 R14F-R127L-R159F 19 R14F-R127Q-R159W 37 R14F-R127S-R159V 32 R14F-R127V-R159F 16 R14G-N24L-R159G 13 R14G-N24S-R127C 47 R14G-R127C-G63E 58 R14G-R127G 19 R14G-R127P 9 R14L-N24S-R159F 20 R14L-N24V-R127S-R159I 31 R14L-R123L 25 R14L-R127C-R159G 32 Tabela 8-3. Resultados de teste de estabilidade de LAS a 35°C Variante Estabilidade de LAS (35°C) [%] R14L-R127S 22 R14L-R127S-R159G 31 R14L-R127V 17 R14L-R127V-R159F 27 R14L-R127W-R123Y 47 R14L-R127Y 10 R14L-R127Y-R159F 30 R14L-R159G 23 R14L-R159L 30 R14L-R159S 43 R14L-R159V 40 R14L-R159W 5 R14M-N24L-R159S-R123V 39 R14M-R159F 17 R14Q-R123F 56 R14S-N24E-R127W 13 R14S-N24L-R159G 17 R14S-R127L-R159F 41 R14S-R127V 33 R14T-R14P-R159F 33 R14T-N24A 6 R14T-N24T-R127Q 69 R14T-N24T-R127Y-R159W 42 R14T-R127Y 29 R14V-N24A-R127I-R159A 26 R14V-N24D-R127C 69 R14V-N24G-P189S 7 R14V-N24S 9 R14V-N24Y-R127S-R159G 37 Tabela 8-3. Resultados de teste de estabilidade de LAS a 35°C Variante Estabilidade de LAS (35°C) [%] R14V-R127A 48 R14V-R127C-R159S 62 R14V-R127M-R159V 63 R14V-R127S-R159G 47 R14V-R127T-R159Y 49 R14V-R127V 27 R14V-R159F 33 R14V-R159V 53 R14V-R159W 12 R14W-N24T-R123E 48 R14W-R123L 6 R14W-R123V 19 R14W-R127Q-R159W 13 R14W-R159V 13 R159V-G49D 6

Em experimentos adicionais, variantes foram testadas a 35°C,

usando o protocolo descrito no exemplo 1. Na tabela seguinte, resultados para variantes com G12D e R35E, e >70% de atividade residual estão pre- sentes. _________

Tabela 8-4. Resultados de Teste de estabilidade de LAS a 35°C Variante LAS-35°C G12D-R35E Estabilidade [%] G012D-R035E-G065E 73 G012D-R035E-G065E 73 G012D-R035E-Q081P 79 G012D-R035E-R016S-A064T 77 G012D-R035E-R159W 74 G012D-R035E-R179I 82 Tabela 8-4. Resultados de Teste de estabilidade de I AS a if>°c. Variante LAS-35°C G12D-R35E Estabilidade [%] G012D-R035E-S092T-I181V 71

Em experimentos adicionais, ainda outras condições foram usa- das. Em um conjunto de experimentos, os índices de desempenho para nu- merosas variantes substituídas de modo múltiplo foram determinados usan- do o protocolo no exemplo 1 e testados a 25°C. Na tabela seguinte, os re-

sultados de índice de desempenho (PI) para variantes com atividade residual maior que tipo selvagem mais 1 desvio padrão (>1,1 índice de desempenho) estão presentes._

Tabela 8-5. Resultado de estabilidade de teste de LAS Variante LAS (25°C) [índice de De- sempenho] R14I-N24A-A64K-R123F-R159E-D184T 2,97 R14I-A64K-R123F-R159F-D184T 3,99 R14I-A64K-R123F-R159E-D184T 3,82 R14I-N24Q-R35E-A64K-R123F-D184T 3,89 R14I-N24Q-A64K-N67S-R123F-R159F-D184T 1,24 R14I-N24A-R35E-A64K-N67S-R123F-R159E-D184T 1,20 R14I-N24A-R35E-A64K-N67S-G78D-R123F-D184T 1,20 R14I-N24A-R35D-A64K-G78D-R123F-R127K-R159E- D184T 1,72 R14I-N24A-R35D-A64K-R123F-R127K-R159F-D184T 2,88 R14I-N24T-R35D-A64K-G78D-R123F-R127Q-R159F- D184T 3,75 R14I-A64K-R123F-D184T 3,99 R14I-N24A-A64K-R123F-R159N-D184T 2,94 R14I-N24Q-R35D-A64K-N67S-R123F-R159K-D184T 1,31 R14I-N24E-R35E-A64K-G78D-R123F-R127Q-R159F- 9,51 Tabela 8-5. Resultado de estabilidade de teste de LAS D184T R14I-N24E-A64K-R123F-R127K-R159K-D184T 6,64 R14I-N24A-A64K-R123F-D184T 2,80 R14I-A64K-R123F-R127K-R159F-D184T 4,25 R14I-A64K-R123F-R159E-D184T 4,22 R14I-A64K-R123F-R159N-D184T 3,93 R14I-A64K-R123F-R159K-D184T 3,83 R14I-A64K-R123F-R127Y-R159E-D184T 4,32 R14I-N24A-R35E-A64K-N67A-G78D-R123F-D184T 2,40 R14I-A64K-R123F-R127Y-R159K-D184T 4,08 R14I-N24Q-A64K-R123F-R127Q-R159K-D184T 3,92 R14I-A64K-R123F-R159K-D184T 4,29 R14I-N24Q-A64K-G78D-R123F-R127Q-R159N-D184T 1,87 R14I-N24E-A64K-N67L-G78D-R123F-R159K-D184T 1,33 R14I-N24A-R35E-A64K-G78D-R123F-R127K-R159E- D184T 1,91 R14I-N24Q-R35D-A64K-N67S-R123F-R159K-D184T 1,33 R14I-N24A-R35D-A64K-N67A-R123F-R159F-D184T 1,22 R14I-N24E-R35E-G54D-A64K-N67L-G78D-R123F-R127K- D184T 2,64 R14I-A64K-G78D-R123F-R127Q-R159N-D184T 1,60 R14I-N24A-R35E-A64K-G78D-R123F-R159N-D184T 1,74 R14I-A64K-R123F-R127K-R159E-D184T 4,27 R14I-N24A-R35E-A64K-N67S-G78D-R123F-R127K- R159F-D184T 1,20 R14I-A64K-G78D-R123F-R159E-D184T 1,71 R14I-N24E-R35D-A64K-N67A-G78D-R123F-R159K-D184T 4,23 N24T-R35D-G78D-R159K 6,53 N24T-R35E-N67A-G78D-R127Q 1,36 N24Q-R35E 6,60 Tabela 8-5. Resultado de estabilidade de teste de LAS R127K-R159N 6,02 R35D-R159E 7,25 R35E-G54D-N67S-G78D-R159K 1,58 N24Q-G54D-G78D-R159N 2,84 R127K-R159E 6,58 R127Q-R159K 5,76 N24E-R35E-G54D-N67S-R127K-R159N 9,73 R35D-G78D-R159K 5,17 N67S-R159E 2,05 G54D-R127K-R159K 6,11 G78D-R127K-R159K 2,76 G78D-R127K-R159E 2,63 N24E-R35D-G78D-R127K-R159N 11,02 R35D-G78D-R127K-R159N 5,38 N24A-R35E-G78D-R159N 4,03 N24Q-R35D-N67S-R127K-R159E 2,13 N24T-R35D-G78D-R159K 6,73 N67S-G78D-R127K-R159K 1,12 N24Q-R35D-R127K-R159K 7,33 N24E-G54D-G78D-R159K 8,72 R35D-R159K 6,89 R35E-R159K 7,66 R127K-R159K 5,82 R35E-N67S-G78D-R127Q 2,67 N24E-R35D-G78D 11,21 R35D-G78D-R127K-R159E 5,44 N24E-R35E-G54D-N67S-G78D-R127K-R159K 7,87 N24T-N67S-R159E 3,10 N24D-R35D-G78D-R159F 9,11 N24Q-R35D-N67S-G78D-R127K-R159F 1,50 Tabela 8-5. Resultado de estabilidade de teste de I AS R35D-G78D-R127Q-R159K 4,41 G78D-R159F 2,48 N24A-N67S-R159K 1,14 G78D-R127Q-R159K 2,63 N24T-G54D-N67S-G78D-R127Y-R159E 2,42

Em experimentos adicionais, a estabilidade de LAS de numero-

sas variantes foi testada a 25°C, usando o protocolo especificado no exem- plo 1. Como acima, o critério de seleção foi atividade residual maior que WT +1 desvio padrão (> 1,1 índice de desempenho). _

Tabela 8-6. Resultados de teste de estabilidade de LAS Variante Estabilidade de LAS a 25° [índice de De- sempenho] R14I-A63K-G78D-R123F-D184T 2,66 R14I-A63K-R123F-R159E-D184T 3,53 R14I-A63K-R123F-R159F-D184T 3,48 R14I-A63K-R123F-R159K-D184T 3,33 R14I-A63K-R123F-R159N-D184T 3,83 R14I-A63K-R123K-D184T 3,38 R14I-A63K-R123Q-D184T 3,58 R14I-A63K-R123Y-D184T 3,62 R14I-A64K-G78D-T86K-T116E-R123F 1,47 R14I-A64K-T86K-T116E-R123F-R159E 5,21 R141-A64 K-T86 K-T116E-R123F-R159K 5,11 R141-A64 K-T86 K-T116E-R123K 4,21 R14I-A64K-T86K-T116E-R123Q 4,74 R14I-A64K-T86K-T116E-R123Y 4,34 R14I-G54D-A63K-R123F-D184T 2,74 R14I-G54D-A64K-T86K-T116E-R123F 4,12 R14I-G54D-S76N-A93H-R127K-R159K-I181Q 8,53 Tabela 8-6. Resultados de teste de estabilidade de LAS Variante Estabilidade de LAS a 25° [índice de De- sempenho] R14I-G54D-S76V-A93S-R127K-R159K-1181K 3,53 R14I-N24A-A63K-R123F-D184T 2,59 R14I-N24A-A64K-T86K-T116E-R123F 3,11 R14I-N24E-A63K-R123F-D184T 7,31 R14I-N24E-A64K-T86K-T116E-R123F 9,39 R14I-N24Q-A63K-R123F-D184T 4,13 R14I-N24Q-A64K-T86K-T116E-R123F 4,51 R14I-N24T-A63K-R123F-D184T 4,35 R14I-N24T-A64K-T86K-T116E-R123F 6,54 R14I-N24TS76N-A93H-R127K-R159K-1181Q 7,43 R14I-N24TS76V-A93S-R127K-R159K-I181K 1,78 R14I-N67AS76N-A93H-R127K-R159K-I181Q 4,59 R14I-N67LS76N-A93H-R127K-R159K-I181Q 2,71 R14I-N67SS76N-A93H-R127K-R159K-I181Q 4,32 R14I-R35D-A64K-T86K-T116E-R123F 5,72 R14I-R35D-S76N-A93H-R127K-R159K-1181Q 9,45 R14I-R35E-A63K-R123F-D184T 3,50 R14I-R35E-A64K-T86K-T116E-R123F 6,08 R14I-R35E-S76N-A93H-R127K-R159K-1181Q 9,00 R14I-R35E-S76V-A93S-R127K-R159K-1181K 5,22 R14I-R35K-A63K-R123F-D184T 3,10 R14I-S76N-A93H-R127K-R159E-I181Q 8,54 R14I-S76N-A93H-R127K-R159F-I181Q 7,56 R14I-S76N-A93H-R127K-R159N-1181Q 9,01 R14I-S76N-A93H-R127Q-R159K-1181Q 9,11 R14I-S76N-A93H-R127Y-R159K-I181Q 6,88 R14I-S76N-G78D-A93H-R127K-R159K-I181Q 5,55 Tabela 8-6. Resultados de teste de estabilidade de LAS Variante Estabilidade de LAS a 25° [índice de De- sempenho] R14I-S76V-A93S-R127K-R159F-1181K 1,82 R14I-S76V-A93S-R127K-R159N-1181K 2,00 R14I-S76V-A93S-R127Q-R159K-I181K 2,59 R14I-S76V-A93S-R127Y-R159K-I181K 1,63 R14M-G54D-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 7,52 R14M-N24A-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 1,38 R14M-N24E-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 7,17 R14M-N24Q-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 3,58 R14M-N24T-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 5,57 R14M-N67S-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 1,53 R14M-R35D-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 8,65 R14M-R35E-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 9,25 R14M-S76N-A93G-R127K-R159E-I181K 6,89 R14M-S76N-A93G-R127K-R159F-1181K 5,14 R14M-S76N-A93G-R127K-R159N-I181K 6,71 R14M-S76N-A93G-R127Q-R159K-I181K 5,85 R14M-S76N-A93G-R127Y-R159K-I181K 4,75 R14M-S76N-G78D-A93G-R127K-R159K-1181K 2,13

Como indicado por estes resultados, numerosas variantes subs-

tituídas de modo múltiplo tiveram um desempenho melhor do que a ASP de tipo selvagem neste sistema de teste. Exemplo 9

Desempenho de remoção de manchas de mutantes substituídos de modo múltiplo

Nestes experimentos, o protocolo usado é descrito no exemplo 1, acima. A tabela seguinte apresenta as variantes, incluindo as mutações em cada variante para aquelas com atividade maior que tipo selvagem mais um desvio padrão (> 1,1 índice de desempenho [PI]). Como indicado por estes resultados, numerosas variantes substituídas de modo múltiplo tiveram um desempenho melhor do que a ASP de tipo selvagem neste sistema de teste.

Tabela 9-1. Resultados de desempenho de lavagem Variante Detergente BMI LVJ1 [índice de Desempe- nho] N24F-R159G 1,24 N24F-R159L-R123V 1,22 N24I-R127S 1,15 N24L-R159S 1,14 N24S-R159A 1,41 N24V-R159L 1,34 N24Y-R159F 1,14 R14A-N24K-R127S 1,32 R14A-R159W 1,12 R14L-N24Y 1,32 R14L-R159G 1,22 R14L-R159S 1,11 R14L-T109M 1,14 R14L-T39P 1,26 R14M-R159W 1,18 R14S-N24V 1,34 R14S-N24Y 1,32 R14T-N24A 1,16 R14V-N24G-P189S 1,23 R14V-R159W 1,17 R127A-R159K 1,23 R14I-G65Q 1,32 R14I-S76V 1,27 Tabela 9-1. Resultados de desempenho de lavagem Variante Detergente BMI LVJ1 [índice de Desempe- nho] R14I-G65Q-N67L-R159K 1,11 R14I-G65Q-R159K 1,32 R14I-S76V 1,48

Em experimentos adicionais usando detergente líquido, os se-

guintes resultados foram obtidos. As variantes indicadas nas seguintes tabe- la exibiram atividade maior que o tipo selvagem mais um desvio padrão (>1,1 índice de desempenho), como mostrado nas tabelas seguintes._

Tabela 9-2. Resultados de desempenho de Iavaaem para LVJ-1 Variantes Detergente BMI LVJ-1 [índice de De- sempenho] R35F R159Q 1,13 R16Q R79T 1,31 R16Q R35F 1,10 R16Q R159Q 1,17 R14L R79T 1,45 R123L R159Q 1,16 G12D-S15E 1,23 G12D-R35H 1,46 G12D-R35D 1,13

Tabela 9-3. Resultados de desempenho de lavagem para TIDE®2005 Variante Detergente BMI Tide2005 [índice de Desempenho] N024E-G049A-A093H--R127K-A143N-R159K- I181Q 1,23 N024H-S076A-A093S-S099A-R127K-R159K- G054H-L069H 1,11 Tabela 9-3. Resultados de desempenho de lavagem para TIDE®2005 Variante Detergente BMI Tide2005 [índice de Desempenho] N024H-S076A-A093T-S099G-R127K-R159K 1,16 N024L-S076V-A093S-S099A-R127K-R159K 1,11 N024Q-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T 1,13 N024T-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N- R159K-I181T 1,13 N24E-G54Q-A93S-R127K-R159K 1,17 N24H-A93H-R127K-R159K 1,14 N24H-G54L-S76V-A93H-R127K-R159K 1,28 N24L-G54Q-S76A-A93H-R127K-R159K 1,13 N24M-A93G-R127K-R159K 1,10 N24M-G54E-A93H-R127K-R159K 1,15 N24M-S76V-A93H-R127K-R159K 1,29 N24Q-G54Q-S76T-A93H-R127K-R159K 1,11 N24Q-S76A-A93G-R127K-R159K 1,13 N24T-G54Q-S76N-A93G-R127K-R159K 1,14 N24T-S76I-R127K-R159K 1,12 N24W-G54D-A93H-R127K-R159K 1,20 N24W-S76A-A93H-R127K-R159K 1,14 N24W-S76T-A93G-R127K-R159K 1,12 N24W-S76V-A93G-R127K-R159K 1,12 N24W-S76Y-A93G-R127K-R159K 1,22 R014I-S076A-A093G-R127K-R159K-I181T 1,22 R014I-S076A-A093H-R127K-R159K-I181K 1,23 R014I-S076A-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,14 R014I-S076A-A093H-R127K-R159K-I181T 1,15 R014I-S076D-A093S-R127K-R159K-1181T 1,10 R014I-S076E-A093T-R127K-R159K-I181K 1,28 Tabela 9-3. Resultados de desempenho de Iavaaem oara TIDE®2005 Variante Detergente BMI Tide2005 [índice de Desempenho] R014I-S076N-A093H-R127K-R159K-I181Q 1,26 R014I-S076V-A093H-R127K-R159K-I181Q 1,22 R014I-S076V-A093S-R127K-R159K-I181K 1,27 R014K-S076A-A093S-R127K-R159K-I181T 1,21 R014K-S076E-A093H-R127K-R159K-I181K 1,19 R014K-S076I-A093S-R127K-R159K-I181T 1,14 R014K-S076T-A093H-R127K-R159K-I181K 1,11 R014K-S076T-A093H-R127K-R159K-I181T 1,23 R014K-S076V-A093H-R127K-R159K-I181K 1,11 R014L-S076A-A093H-R127K-R159K 1,34 R014L-S076A-A093H-R127K-R159K-I181Q 1,13 R014L-S076D-A093H-R127K-R159K-I181T 1,17 R014L-S076E-A093H-R127K-R159K-I181K 1,23 R014M-S076A-A093G-R127K-R159K-I181K 1,25 R014M-S076A-A093G-R127K-R159K-1181T 1,12 R014M-S076A-A093H-R127K-R159K-1181T 1,18 R014M-S076A-A093S-R127K-R159K-I181K 1,46 R014M-S076A-A093S-R127K-R159K-1181T 1,17 R014M-S076A-A093T-R127K-R159K-I181Q 1,11 R014M-S076I-A093H-R127K-R159K-I181T 1,30 R014M-S076I-A093S-R127K-R159K-I181T 1,23 R014M-S076N-A093G-R127K-R159K-1181K 1,23 R014M-S076N-A093G-R127K-R159K-I181T 1,24 R014M-S076N-A093H-R127K-R159K-I181T 1,39 R014M-S076N-A093S-R127K-R159K-I181T 1,28 R014M-S076T-A093H-R127K-R159K-1181K 1,28 R014M-S076V-A093G-R127K-R159K-I181Q 1,17 R014M-S076W-A093H-R127K-R159K-I181K 1,14 Tabela 9-3. Resultados de desempenho de lavagem para TIDE®2005 Variante Detergente BMI Tide2005 [índice de Desempenho] R014M-S076Y-A093H-R127K-R159K-I181K 1,29 R014M-S076Y-A093H-R127K-R159K-1181T 1,14 G012D-R035E-D184N 1,13 G012D-R035E-N067K 1,24

Em outros experimentos, os seguintes resultados foram obtidos. Nestes experimentos, as variantes foram comparadas a 0,5 ppm de ASP de tipo selvagem como uma referência. Os resultados na tabela seguinte são apresentados para variantes que tiveram atividades maiores que tipo selva-

Tabela 9-4. Resultados de desempenho de lavagem para detergente Tl- DE(E)SNOWA Variante Detergente BMI TIDE- SNOWA [índice de De- sempenho] R14I-A64K-R123F-R159F-D184T 1,27 R14I-A64K-R123F-R159F-D184T 1,45 R14I-N24Q-A64K-G78D-R123F-R159K-D184T 1,38 R14I-N24Q-A64K-N67S-R123F-R159F-D184T 1,34 R14I-N24Q-A64K-N67A-R123F-R159K-D184T 1,40 R14I-N24A-A64K-N67S-G78D-R123F-R159K- D184T 1,31 R14I-A64K-R123F-D184T 1,45 R14I-N24A-A64K-R123F-R159N-D184T 1,47 R14I-N24Q-R35D-A64K-N67S-R123F-R159K- D184T 1,23 R14I-N24Q-A64K-N67A-R123F-R159K-D184T 1,45 R14I-N24E-A64K-R123F-R127K-R159K-D184T 1,23 R14I-N24A-A64K-R123F-D184T 1,65 Tabela 9-4. Resultados de desempenho de lavagem para detergente Tl- DE® SNOW A Variante Detergente BMI TIDE- SNOWA [índice de De- sempenhol R14I-A64K-R123F-R127K-R159F-D184T 1,48 R14I-A64K-R123F-R159N-D184T 1,38 R14I-A64K-R123F-R159K-D184T 1,66 R14I-A64K-R123F-R127Y-R159K-D184T 1,11 R14I-N24Q-A64K-R123F-R127Q-R159K-D184T 1,25 R14I-A64K-R123F-R159K-D184T 1,55 R14I-N24Q-R35D-A64K-N67S-R123F-R159K- D184T 1,22 R14I-A64K-N67S-G78D-R123F-R127K-R159K- D184T 1,48 R14I-N24Q-A64K-N67A-R123F-R127K-R159K- D184T 1,67 R127K-R159K 1,53 N24A-N67S-R159K 1,55 N24A-N67A-R159K 1,58

Em experimentos adicionais, os seguintes resultados foram obti- dos. As variantes indicadas na tabela seguinte exibiram atividade maior que tipo selvagem mais um desvio padrão (>1,1 índice de desempenho)._

Tabela 9-5. Resultados de desempenho de lavagem para TIDE®-SNOW Variante Detergente BMI TIDE- SNOW [índice de De- sempenhol R14I-A63K-G78D-R123F-D184T 1,39 R14I-A63K-N67A-R123F-D184T 1,50 R14I-A63K-N67L-R123F-D184T 1,23 R14I-A63K-N67S-R123F-D184T 1,48 Tabela 9-5. Resultados de desempenho de lavagem para TIDE®-SNOW Variante Detergente BMI TIDE- SNOW [índice de De- sempenhol R14I-A63K-R123F-R159F-D184T 1.75 R14I-A63K-R123F-R159K-D184T 1,70 R14I-A63K-R123F-R159N-D184T 1,67 R14I-A63K-R123K-D184T 1,40 R14I-A63K-R123Q-D184T 1,44 R14I-A63K-R123Y-D184T 1.25 R14I-A64K-G78D-T86K-T116E-R123F 1,26 R14I-A64K-N67A-T86K-T116E-R123F 1,66 R14I-A64K-N67L-T86K-T116E-R123F 1,19 R14I-A64K-T86K-T116E-R123F-R159K 1,54 R14I-A64K-T86K-T116E-R123K 1,70 R14I-G54D-A63K-R123F-D184T 1,13 R14I-G54D-A64K-T86K-T116E-R123F 1,11 R14I-N24A-A63K-R123F-D184T 1,47 R141 - N 24 A-A64 K-T86 K-T116E-R123F 1,56 R14I-N24A-S76V-A93S-R127K-R159K-I181K 1,15 R14I-N24E-A63K-R123F-D184T 1,36 R14I-N24E-A64K-T86K-T116E-R123F 1,26 R14I-N24Q-A63K-R123F-D184T 1,47 R14I-N24Q-A64K-T86K-T116E-R123F 1,57 R14I-N24Q-S76V-A93S-R127K-R159K-I181K 1.43 R14I-N24T-A63K-R123F-D184T 1,57 R14I-N24T-A64K-T86K-T116E-R123F 1,38 R14I-N24TS76V-A93S-R127K-R159K-I181K 1,13 R14I-N67SS76N-A93H-R127K-R159K-I181Q 1,17 R14I-R35E-A63K-R123F-D184T 1,55 R14I-R35K-A63K-R123F-D184T 1,20 Tabela 9-5. Resultados de desempenho de lavagem para TIDE®-SNOW Variante Detergente BMI TIDE- SNOW [índice de De- sempenho] R14I-S76V-A93S-R127K-R159F-I181K 1,12 R14I-S76V-A93S-R127K-R159N-I181K 1,31 R14I-S76V-A93S-R127Y-R159K-1181K 1,30 R14M-N24T-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 1,11 R14M-N67S-S76N-A93G-R127K-R159K-I181K 1,22 R14M-S76N-A93G-R127K-R159F-I181K 1,41 R14M-S76N-G78D-A93G-R127K-R159K-I181K 1,20

Exemplo 10

Desempenho de remoção de manchas de mutantes substituídos de modo múltiplo

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar a ca- pacidade de remoção de manchas de várias variantes de ASP substituídas de modo múltiplo são descritos. Nestes experimentos, os seguintes protoco- los e materiais foram usados.

Primeiro, 105 ppm de água (~ 6 GPG) foram preparados primei- ro preparando uma solução de carga de 10.000 ppm (3/1 Ca+2/Mg+2) dissol- vendo 11.020 g/L de cloreto de cálcio desidratado (CaCI2.2H20) Peso mole- cular 147,01 g/mol e 5,08 g/L cloreto de magnésio hexa-hidratado (Mg- CI2.6H20) peso molecular 203.3 g/mol em 1000 ml de água desionizada. A solução de 105 ppm foi preparada diluindo 10,50 ml do carga de 10.000 ppm com 989,50 ml de água desionizada. Uma solução detergente TIDE® 2005 ( 1,6 gm/L) foi preparada

na água de 105 ppm dissolvendo 11,2 g de TIDE®-2005 em 7 litros de água de 105 ppm.

Sangue-Leite-Tinta (BMI) mancharam amostras EMPA 116 (11 χ 8 cm), EMPA117 (11x8 cm) ambas de EMPA Testmaterialien AG e grama manchou amostras EMPA164 (10 χ 7,5 cm) de EMPA Testmaterialien AG e meio de grama Equest manchou (10 χ 7,5 cm) de Warwick Equest Limited usado nestes experimentos foram numerados usando uma caneta imperme- ável (nos lados manchados). Os lados manchados das amostras foram me- didos usando Medidor Tristimulus Minolta CR-300 (Minolta), e analisados usando a equação L (L°a°b), D65 Std. Illuminate, em um fundo branco. Três leituras foram feitas por amostra. Como manchas de grama são muitos sen- síveis à luz, amostras manchadas de grama foram cobertas e armazenadas no escuro até serem usadas. Cada teste de desempenho de lavagem foi conduzido em duplicata.

Durante o teste, lastro extra (mais ação mecânica) foi usado. Este lastro compreendeu 2 pedaços de EMPA 221 de 10 χ 10 cm (algodão sem sujeira, EMPA Testmaterialien AG colocados em um copo grande. Es- tas amostras EMPA 221 não foram numeradas ou medidas.

O teste de desempenho de lavagem de roupas automática foi conduzido usando um Tergotômetro de modelo de marca, com seis vasos (TOM) Modelo 7243S (United States Testing). A temperatura foi ajustada 15°C ou 60°F. Metade do interior do TOM foi cheia com gelo. O tempo de lavagem foi configurado para 12 minutos. Copos grandes de teste foram cheios com 1 litro da solução detergente (feita em água de 105 ppm, como descrito acima). Uma vez que as soluções alcançaram 15°C ou 60°F, o TOM foi iniciado com uma agitação de 100 rpm. As amostras de variante foram então adicionadas à mistura conforme indicado abaixo. Como um controle, a solução detergente TIDE® 2005 (Procter & Gamble) sem qualquer amostra de enzima adicionada foi usada. As variantes foram testadas em duas con- centrações diferentes (isto é, a 0,55 ppm e a 2,75 ppm). Seis amostras de tecido (com as mesmas manchas) foram adi-

cionadas a cada copo grande uma de cada vez. Em adição, 2 amostras EM- PA 221 foram adicionadas. Por exemplo: para amostras sujas com BMI 3 EMPA 116 e 3 EMPA117 + 2 EMPA 221 (peso total é aproximadamente 13,25 gramas), ou, amostras sujas com grama 3 EMPA 164 e 3 meios de grama Equest sujos + 2 EMPA 221 (peso total é aproximadamente 13,22 gramas). O tempo de lavagem foi então reinicializado em 12 minutos, após 12 minutos de lavagem, todas as amostras EMPA 116 e EMPA 117 foram enxaguadas em um balde e todas as amostras de tecido com grama foram enxaguadas em balde separado durante 3 minutos sob água de torneira cor- rente fria. As amostras de tecido EMPA 221 foram então descartadas. As amostras foram colocadas em uma secadora giratória durante 2 minutos (as amostras de tecidos EMPA 116 e EMPA 117 foram secadas separadamente das amostras sujas com grama). Subseqüentemente, as amostras sujas com grama foram secadas no ar, sem luz ou passadas a ferro, enquanto que as amostras de tecidos EMPA 116 e EMPA 117 foram secadas passando a fer- ro.

Após secagem, os lados cujos das amostras foram avaliados

usando o Medidor Tristimulus Minolta CR-300 com equação L (L0a°b), D65 Std. Illuminate, em um fundo branco, 3 leituras por amostra. O percentual de remoção de sujeira foi calculado usando a equação:

% de Remoção de sujeira =(valor de L após lavagem - valor de L antes de lavagem)/(l_o algodão branco- valor de L antes de lavagem) χ 100%

A fim de obter uma medida para a remoção de sujeiras de cada variante individual, a porcentagem delta de remoção de sujeiras foi então calculada subtraindo a porcentagem de remoção de sujeira obtida pela solu- ção detergente TIDE® 2005 sem qualquer variante da porcentagem de re- moção de sujeira na presença de cada variante (SR % delta). Os resultados são mostrados na Tabela 10.1

Em experimentos adicionais, as capacidades de remoção de manchas de várias variantes de ASP substituídas de modo múltiplo foram testadas. As condições de teste como descrito acima foram usadas com as seguintes modificações. Nestes testes uma solução detergente TIDE®2005 SNOW (1,5 gm/L) foi preparada na água de 105 ppm, dissolvendo 37,5 g de TIDE®2005 SNOW em 25 litros de água de 105 ppm. Ademais, as amostras de tecido sujas BMI EMPA 116 foram cortadas em pedaços de 10 χ 7,5 cm. As amostras de tecidos EMPA 117 foram substituídas por amostras fixadas EMPA 116 (CFT) e também cortadas em pedaços de 10 χ 7,5 cm. Nenhuma das amostras EMPA 164 foi usada nestes experimentos. As variantes foram testadas a uma concentração de 0,55 ppm. Seis amostras (isto é 6 EMPA 116 , ou 6 EMPA 116 fixadas ou 6 Equest) foram adicionadas a cada copo grande uma de cada vez. Em adição, 2 amostras de tecido EMPA 221 foram adicionadas. Como um controle, solução detergente TIDE® 2005 SNOW (Procter & Gamble), sem qualquer amostra de enzima adicionada foi usada.

Cada teste de desempenho de lavagem foi conduzido em quadruplicata. Os resultados (SR de % delta média, desvio padrão (STD) e número de réplicas (n)) são mostrados na figura 6._

Tabela 10.1 Variantes / Dosa- gem EMPA 116 S.R de % Δ (n=6) EMPA 117 S.R de % Δ (n=6) Grama E- quest S.R de % Δ (n=6) EMPA 164 S.R de % Δ (n=6) ASP / 0,55 ppm 5,2 ±1,2 4,9 ±2,4 -4,3 ±4,3 1,5 ± 1,1 ASP/2,75 ppm 9,7 ±1,4 10,7 ±2,8 -1,8 ±5,4 3,1 ±1,6 R123L-R127Q- R179Q /0,55 ppm 6,0 ± 1,5 8,5 ±2,1 1,7 ±3,7 2,1 ±1,2 R123L-R127Q- R179Q / 2,75 ppm 11,3 ± 1,5 14,0 ±2,7 1,1 ±5,0 5,4 ± 1,4 G12D-R35H / 0,55 ppm 7,0 ± 1,1 7,9 ± 1,9 -2,2 ±5,0 2,5 ±1,3 G12D-R35H / 2,75 ppm 10,1 ± 1,7 14,4 ± 1,9 3,2 ±3,8 4,5 ± 1,0 G12D-R35E / 0,55 ppm 8,2 ± 1,2 10,0 ±2,1 1,3 ±5,4 2,9 ± 1,4 G12D-R35E / 2,75 ppm 10,6 ± 1,4 16,6 ±2,1 4,3 ±4,2 5,4 ± 1,4 R35E-R123L- R127Q-R179Q / 0,55 ppm 6,1 ±1,2 6,8 ±2,1 0,4 ±4,1 1,0 ± 1,4 R35E-R123L- R127Q-R179Q / 2,75 ppm 8,8 ±2,1 12,7 ± 1,8 4,7 ±4,3 1,7 ±1,4

Em outro conjunto de experimentos, a capacidade de remoção de manchas de numerosas variantes de ASP substituídas de modo múltiplo, foi testada. As condições de teste como descrito acima foram usadas com as seguintes modificações. Nestes testes, uma solução detergente TIDE®2005 SNOW (1,5 gm/L) contendo tampão de HEPES foi preparada na água de 105 ppm dissolvendo 37,5 g de TIDE® 2005 SNOW em 25 litros de água de 105 ppm. Então, 30 g de Hepes (=5mM; C8Hi8N2O4S), foi adicionado, a so- lução foi agitada, e o pH ajustado a 7,8 com ± 19 ml de NaOH a 4N. Notou- se que esta solução pode ser armazenada por 36 horas a temperatura am- biente. Nestes testes, apenas amostras de tecido sujas de BMI EMPA 116 de 10 χ 7,5 cm e amostras sujas com meio de grama Equest de 10 χ 7,5 cm foram usadas. As variantes foram testadas a uma concentração de 0,55 ppm. Seis amostras de tecido (quer 6 EMPA 116 , ou 6 sujas com meio de grama Equest) foram adicionadas a cada copo grande de uma vez. Em adi- ção, 2 amostras de tecido EMPA 221 foram adicionadas. Como um controle, solução detergente TIDE® 2005 SNOW (Procter & Gamble) com tampão HEPES, sem qualquer amostra de enzima adicionada foi usada. Cada teste de desempenho de lavagem foi conduzido em quadruplicata. Os resultados (média de D% SR, Desvio padrão (STD) e número de réplicas (n)) são mos- trados na figura 7.

Como indicado por estes resultados, numerosas variantes subs- tituídas de modo múltiplo tiveram um desempenho melhor do que a ASP de tipo selvagem neste sistema de teste. Exemplo 11

Desempenho de remoção de manchas de mutantes substituídos de modo múltiplo testados em baixo pH

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar o de- sempenho de remoção de manchas de várias variantes de ASP substituídas de modo múltiplo são descritos. Nestes experimentos, o protocolo usado é descrito no exemplo 1, acima. Atabela seguinte provê as variantes, incluin- do as mutações em cada variante para aquelas com atividade maior que aquela de ASP de tipo selvagem mais 1 desvio padrão (1,1 índice de de- sempenho). Tabela 11-1. Desempenho de remoção de manchas em haixn nH Variante Baixo pH de BMI [índice de Desem- penho] G54E-R14L 1,40 N24D-R127Y-R159V 1,61 N24E-R127S 1,43 N24E-R159C 1,14 N24F-R159G 1,42 N24F-R159G-G54E 1,98 N24F-R159L-R123V 1,61 N24G-R127Y 1,34 N24H-R159Y-T46I 1,34 N24I-R127S 1,21 N24I-R127V-R14V 1,12 N24L-R159S 1,37 N24S-R159A 2,48 N24 V-R127M-R159V 1,33 N24V-R127S-R159H 1,60 N24V-R159L 1,41 N24Y-G54A 1,11 N24Y-R127L 1,37 N24Y-R127S 1,14 N24Y-R127V 1,22 N24Y-R159F 1,29 R127A-R159F 1,12 R127H-R159Q 1,78 R127H-R159T-S185F ,66 R127M-R159V ,70 R127S-R159G ,21 Tabela 11-1. Desempenho de remoção de manchas em baixo pH

Variante

Baixo pH de BM [índice de Desem penho]_

R127S-R159L

1,27

R127T-R159F

1,28

R127V-R159G

1,36

R127Y-R159L

2,14

R14A-N24K-R127S

1,41

IR14A-R127Y-R159W

1,17

[R14G-N24S-R127C

1,10

R14G-R127G

1,17

R14L-N24D

1,73

R14L-N24Y

1,19

R14L-R123L

2,11

R14L-R127S R14L-R127V

1,47

,18

R14L-R127Y

,78

R14L-R159G

,51

R14L-R159S

,52

R14L-T39P

,50

1R14M-N24L-R159S-R123V

15

R14M-R159F

,18

R14M-R159W

,36

R14Q-R123F

,58

R14S-N24E-R127W

,31

R14S-N24V

11

R14S-N24Y

,12

[R14T-N24T-R127Q

38

R14T-R127Y

98

R14V-N24D-R127C

28 Tabela 11-1. Desempenho de remoção de manchas em baixo dH Variante Baixo pH de BMI [índice de Desem- penho] R14V-N24G-P189S 1,14 R14V-N24L-R127F 1,14 R14V-R127A 1,55 R14V-R159F 1,43 R14V-R159W 1,24 R14W-N24A 1,10 R14W-R123L 1,19 R14W-R123V 1,40 R14W-R159V 1,15 R159V-G49D 1,67 R159V-R123G 1,20 N024E-G049A-A093H-R127K-A143N-R159K-1181Q 1,29 N024E-G049A-A093S-S099D-R127K-A143N-R159K- 1181Q 1,11 N024Q-G049A-A093S-S099A-R127K-A143N-R159K- I181T 1,12 N24A-G54E-S76D-A93G-R127K-R159K 1,41 N24E-A93G-R127K-R159K 1,32 N24E-G54L-S76E-A93G-R127K-R159K 1,15 N24E-G54Q-A93S-R127K-R159K 1,46 N24E-S76D-A93T-R127K-R159K 1,35 N24H-G54E-A93G-R127K-R159K 1,10 N24L-S76T-A93G-R127K-R159K 1,24 N24M-A93S-R127K-R159K 1,23 N24M-A93T-R127K-R159K 1,18 N24M-G54E-A93H-R127K-R159K 1,35 N24M-G54E-S76N-A93S-R127K-R159K 1,36 Tabela 11-1. Desempenho de remoção de manchas em baixo pH Variante Baixo pH de BMI [índice de Desem- penho] N24M-S76V-A93H-R127K-R159K 1,16 N24Q-A93G-R127K-R159K 1,10 N24Q-G54D-S76L-A93G-R127K-R159K 1,11 N24Q-G54I-S76T-A93G-R127K-R159K 1,10 N24Q-G54Q-A93G-R127K-R159K 1,10 N24Q-S76A-A93G-R127K-R159K 1,12 N24T-G54Q-S76N-A93G-R127K-R159K 1,19 N24T-G54Q-S76V-R127K-R159K 1,20 N24T-S76I-R127K-R159K 1,14 N24W-A93G-R127K-R159K 1,20 N24W-G54D-A93H-R127K-R159K 1,21 R014I-S076A-A093G-R127K-R159K-I181T 1,21 R014I-S076A-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,16 R014I-S076D-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,10 R014I-S076D-A093H-R127K-R159K-I181T 1,27 R014I-S076D-A093S-R127K-R159K-I181T 1,31 R014I-S076E-A093S-R127K-R159K-1181Q 1,46 R014I-S076E-A093T-R127K-R159K-I181K 1,20 R014I-S076N-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,13 R014L-S076A-A093H-R127K-R159K 1,21 R014L-S076A-A093H-R127K-R159K-1181Q 1,15 R014L-S076D-A093H-R127K-R159K-1181T 1,16 R014M-S076A-A093G-R127K-R159K-I181T 1,30 R014M-S076A-A093S-R127K-R159K-I181K 1,35 R014M-S076A-A093S-R127K-R159K-I181T 1,15 R014M-S076A-A093T-R127K-R159K-1181Q 1,28 R014M-S076D-A093S-R127K-R159K-1181T 1,31 Tabela 11-1. Desempenho de remoção de manchas em baixo nH Variante Baixo pH de BMI [índice de Desem- penho] R014M-S076E-A093H-R127K-R159K-1181T 1,12 R014M-S076E-A093S-R127K-R159K-I181T 1,16 R014M-S076N-A093G-R127K-R159K-I181K 1,12 R014M-S076N-A093G-R127K-R159K-I181T 1,19 R014M-S076N-A093H-R127K-R159K-I181T 1,15 R014M-S076N-A093S-R127K-R159K-I181T 1,32

Em experimentos adicionais usando detergente líquido, os se-

guintes resultados foram obtidos. As variantes indicadas na tabela seguinte exibiram atividade maior que tipo selvagem mais um desvio padrão (>1,1 índice de desempenho)._____

Tabela 11-2. Desempenho de lavagem em pH baixo Variante Detergente de baixo pH de BMI [índice de Desempe- nho] T36S-R127Q-R159E 1,24 S15E-R35E 1,15 S15E-R35D 1,20 S15E-R159E 1,24 S15E-R127Q 1,39 S15E-R123Q 1,22 S15E-R123E 1,38 R79TR127Q R179Q 1,23 R35H-R159E 1,37 R35F R61S R159Q 1,39 R35F R159Q 1,49 R35D-R127Q 1,56 R16Q R79TR159Q R179Q 1,42 Tabela 11-2. Desempenho de Iavaqem em pH baixo Variante Detergente de baixo pH de BMI [índice de Desempe- nho] R16Q R79TR123L 1,62 R16Q R79T 1,59 R16Q R35F 1,29 R16Q R159Q R179Q 1,31 R16Q R159Q 1,26 R14Q-T121E 1,37 R14Q-R35E 1,36 R14Q-R35D 1,27 R14Q-R123Q 1,33 R14L R79T 1,59 R127Q-R159E 1,34 R127Q R159Q 1,45 R123Q-R159E 1,51 R123L R159Q 1,58 R123F-R159E 1,77 G12D-S15E 1,71 G12D-R35H-R159E 1,74 G12D-R35H-R123Q 1,89 G12D-R35H 2,38 G12D-R35E 1,85 G12D-R35D 1,68 G12D-R159E 1,32 G12D-R14Q-R35H 1,44 G12D-R14I-R35H 1,54 G65Q-R127A-R159K 1,10 R127A-R159K 1,35 R14I-G65Q 1,38 Tabela 11-2. Desempenho de Iavaqem em pH baixo Variante Detergente de baixo pH de BMI [índice de Desempe- nho] R14I-G65Q-N67L-R159K 1,14 R14I-G65Q-R127A- 1,43 R14I-G65Q-R127A-R159K 1,27 R14I-G65Q-R159K 1,38 R14I-R127A 1,33 R14I-R127A-R159K 1,44 R14I-R159K 1,32 R14I-R35F 1,13 R14I-R35F-G65Q 1,16 R14I-R35F-R159K 1,28 R14I-S76V 1,40 R35F-R127A-R159K 1,17

Como indicado por estes resultados, numerosas variantes subs-

tituídas de modo múltiplo tiveram um desempenho melhor do que a ASP de tipo selvagem neste sistema de teste. Exemplo 12

Desempenho de Limpeza de variantes de ASP em lavagem de louça automática

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar o de- sempenho de limpeza de variantes de ASP em detergente TABLET ACTION PACK® de lavagem de louça automática (ADW) em comparação com uma protease de serina de marca de referência ("Protease B") em manchas sen- síveis à protease são descritos. Como mostrado na Tabela abaixo, variantes de ASP removem manchas muito melhor que protease B.

Um teste de microlavagem com placas de 24 cavidades foi reali- zado. Discos de aço inoxidável foram perfurados usando um martelo e perfu- rador. Os discos foram limpos e pesados, a fim de obter pesos iniciais. Man- chas de ovo foram preparadas como descrito abaixo ("Preparação de ovo mexido" e "Preparação de gema de ovo"). Então, 50uL de ovo preparado foram distribuídos em cada disco. As preparações foram deixadas secar em temperatura ambiente por 30 minutos, então foram assadas em um forno a 80°C por 2 horas. Os discos foram resfriados para temperatura ambiente. Após manchar, os discos foram pesados a fim de obter os pesos sujos dos discos. Os discos sujos foram inseridos em placa de poliestireno de 24 cavi- dades NUNCLON®. Solução de produto de lavagem de louça automática foi preparada misturando completamente a quantidade apropriada de ADW sem produto de enzima (por exemplo, pó 4500 ppm) em 1L de água a 0,1885 grama/litro a 40°C. Solução de dureza foi preparada misturando 188,57g de CaCI2-2H20 e 86,92g de MgCI2-6H20 em 1L de água Dl. No teste, 2 m!_ de solução de ADW pré-aquecida foram adicionados a 55°C para cada cavida- de. A quantidade apropriada de enzima foi então para cada cavidade. Em algumas modalidades, os testes foram realizados usando seis cruzamentos, com quatro duplicatas, enquanto em outras modalidades, o teste foi realiza- do com quatro cruzamentos com seis duplicatas. As placas foram então se- ladas com filme. As placas foram colocados em um agitador/incubadora pré- aquecido e protegidas com braçadeira de frasco. Placas foram lavadas por 30 minutos em uma temperatura apropriada (por exemplo, 55°C para Condi- ções de lavagem européias), a 180 RPM. Após lavagem, as placas foram cuidadosamente enxaguadas imergindo-as em um banho de água aquecida três vezes. Os discos foram removidos das placas e secados em um forno por 1 hora a 80°C. Uma vez secos, os discos foram pesados, a fim de obter os pesos de discos lavados. A avaliação de gravimetria resultando em per- centual aproximado de remoção foi calculada como a seguir: % de Remoção = (peso sujo - peso lavado)/(peso sujo - peso limpo) χ 100 índice de remoção = % de remoção/ % de remoção por Protease de marca de referência (Protease B) Preparação de ovo mexido

Ovos para uso no teste das composições de protease e/ou de- tergente compreendendo enzima(s) de teste foram preparados como a se- guir. Primeiro, 100 ml de 10% de leito gorduroso foram misturados com 3 ovos inteiros. Esta mistura foi cozida com agitamento contínuo até que a mistura foi levemente corrente. Então, mais 40 ml de leite foram adicionados e a mistura foi misturada com uma misturador manual ou misturador em ve- locidade alta até não aparecerem mais grumos. A mistura de ovo foi deixada resfriar a temperatura ambiente antes de ser usada para sujar. Preparação de gema de ovo

Um banho de água foi aquecido configurando a sonda de tempe- ratura na placa quente para 60°C. Um coador de polpa foi colocado sob um copo grande. Para preparar as gemas de ovo, 6-9 gemas foram quebradas e as gemas foram separadas das claras. Os sacos de geme não foram que- brados, embora qualquer resíduo presente nas gemas foi removido. As ge- mas foram gentilmente enxaguadas em água gelada. As gemas foram gen- tilmente quebradas sob o coador e copo grande. Uma vez que todas as ge- mas foram coadas, o copo grande contendo as gemas coadas foi colocado no banho de água. As gemas foram agitadas por 30 minutos, a 60°C. As gemas foram removidas do banho de água e colocadas em um banho de água gelada por 30 minutos. Qualquer pele que se formou na superfície foi gentilmente removida.

Preparação de manchas de ovo usando lâminas de aço inoxidável (2,54 χ 7,62cm)

Cada lâmina de metal foi mergulhada na preparação de ovo me- xido ou gema de ovo (preparada como descrito acima) e batida uma vez, assegurando que havia aproximadamente a mesma quantidade de ovo em cada lado. As costas das lâminas foram esfregadas em um tecido limpo para limpá-las. As lâminas foram então colocadas em duas prateleiras de forno em ordem numérica. As lâminas foram deixadas secar por 30 minutos a temperatura ambiente. As lâminas foram então cozidas por 2 horas a 80°C (+/- 1°C), com colocação na prateleira superior e inferior sendo trocada e girada em 180° (+/- 1°C) após 1 hora. As placas manchadas resfriadas fo- ram pesados em ordem 1-96.

Para lavagem, oito lâminas manchadas foram colocados ambas na prateleira de topo e prateleira de fundo da máquina de lavagem. Pré- Iavagem e lavagem principal foram baseadas em capacidade de copo de Whirlpool 840 de 40 ml para pré-lavagem e 60 ml para lavagem principal. Tipicamente em um teste, quatro produtos foram realizados usando quatro máquinas GE 500. Para o ciclo de teste, lâminas manchadas foram carrega- das nas máquinas e produto de teste colocado em copos de pré-lavagem e lavagem principal. A temperatura da água foi configurada para 48,89°C (120°F) e as máquinas ligadas em um ciclo de lavagem normal. As lâminas foram removidas das máquinas para pesagem no final do ciclo de enxague final. As lâminas não passaram pelo ciclo seco. Pelo final da quarta repeti- ção, cada produto foi ciclado uma vez em cada máquina. Todas as quatro repetições foram realizada em um dia. No próximo dia, o mesmo procedi- mento foi repetido usando novos substratos sujos, para prover um total de 8 repetições por produto, que foram então calculadas as médias para os resul- tados finais. A avaliação gravimétrica resultando em percentual de remoção aproximado foi calculada como a seguir:

% de remoção= (peso sujo-peso lavado)/(peso sujo-peso limpo) χ 100 índice de remoção = % de remoção/ % de remoção por Protease de marca de referência (Protease B) Os resultados destes testes de desempenho são apresentados abaixo na Tabela 12-1:__

Tabela 12-1. índice de remoção de mancha versus Protease B em triagem em 24 cavidades Enzima Em ovo mexido Em gema ovo WTASP 101 100 R14N-R127K-R159L 134 120 R141 - A64 K-T86 K- N112E-R123F-D184T 126 124 G12D-R35E-G63R- R79K-T109M 124 113 R14L 128 123 G12D-R35E 120 138 R14M-S76D-A93H- R127K-R159K-I181K 123 103

10

15

Exemplo 13

Desempenho de limpeza de variantes de ASP em detergente em pó pa- ra lavagem de roupas

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar o de- sempenho de limpeza de variantes de ASP em detergente em pó ARIEL® para lavagem de roupas são descritos. Nestes experimentos, o desempenho das variantes foi comparado com uma protease de serina de marca de refe- rência (por exemplo, "Protease C") em limpeza de item real (RIC).

Os testes foram conduzidos usando máquinas de lavagem Meile usando as seguintes condições: temperatura 40°C, dureza 0,3617 gra- ma/litro, detergente 7300 ppm, protease 0,88 ppm, Rl 0,75 kg, lastro total e Rl 2,5 kg, água 13 L, tempo de lavagem de 20 minutos, tempo de enxague de 3 χ 5 minutos.

Nestes experimentos, lençóis de tamanho tipo king e queen, e meias limpas (J&R Coordinating Service) são guardadas para lastro limpo. Em adição, itens reais de consumo (RI) são testados, incluindo meias, cami- setas, fronhas, toalhas, e toalhas de chá. Sujeiras compreendendo levedura e AS1 (sujeira artificial 1; Equest) são usadas nestes experimentos. A com-

Tabela 13-1. Composição de AS1 Componente % Sebo artificial 14,5 Chá (PG Tips) 6,5 Café (Nescafé) 4,0 Suco de laranja 12,0 Molho de tomate (Heinz) 13,0 Grama 4,5 Chocolate (Heinz Baby) 7,5 Manteiga queimada 2,5 Óleo de cozinha 14,0 Argila ETC 5,0 Argila NTC 5,0 Poeira de Hoover 4,0 Maquiagem 7,5

Os artigos de vestuário são cortados, de modo a assegurar a igualdade de tamanho do artigo de vestuário a testar, com artigos de vestuá- rio selecionados para nível de sujeira uniforme. As duas metades são codifi- cadas em ordem de par de painel (por exemplo, esquerda/direita de artigo

Vestuá- rio 1 Vestuá- rio 2 Vestuá- rio 3 Vestuá- rio 4 Vestuá- rio 5 Vestuá- rio 6 Vestuá- rio 7 Vestuá- rio 8 A B BA BA AB BA A B A B BA

Artigos de vestuário rotulados "A" são lavados com variante de ASP, enquanto artigos de vestuário rotulados "B" são lavados com Protease C. Os testes foram conduzidos 4x4x2 (cada tratamento é repetido em qua- tro máquinas com duas réplicas internas de RI). Procedimento de Teste

Lastro de lençóis de leito guardados limpos e Rl são combinados para fazer um peso total de 2,5kg e aprontados para serem carregados em uma máquina de lavagem Meile manual, com o bico de "359,1 ppm (21GPG)" na frente do painel ligado. A lavadora é então ligada. A temperatu- ra é configurada para 40°C e para o ciclo de lavagem curto. Em seguida, o lastro e Rl são adicionados à máquina de lavagem. Em adição, 20 g AS1 e meias limpas manchadas com 17g de fermento de pão são adicionadas à cada réplica. Então, detergente (95 g) é adicionado para bandeja de deter- gente na máquina e o ciclo iniciado. Uma vez que o detergente é lavado da bandeja, quaisquer líquidos a ser adicionados são adicionados. A máquina então passa através de seus ciclos. Quando o ciclo de lavagem está comple- to, os conteúdos são transferidos para uma secadora e secados por 30 mi- nutos. Os itens são então visualmente classificados para dar resultados de PSU e números de preferência no programa de LSG. Teste de graduação Os testes completos são graduados em uma sessão simples dentro de 72 h de lavagem e secagem dos itens de teste. Os artigos de ves- tuário de item divididos são definidos no painel e classificados por pelo me- nos 3 juizes usando a escala de Scheffé. Adicionalmente, as manchas A versus B são classificadas por pelo menos 2 juizes. Manipulação de resultados

As graduações são introduzidas em uma configuração de Psion manual com o software de teste de lavagem. Quando a graduação de todos os itens divididos foi completada, os dados são transferidos em um compu- IO tador pessoal onde o grau de PSU médio, % de preferência entre tratamen- tos A e B, e LSD para cada artigo de vestuário são calculados. Diferenças

significantes entre produtos são calculadas para um limite de confiança de 90%.

Os sistemas de graduação de PSU são usados para comparar dois produtos (fórmulas). As duas fórmulas são testadas em desempenho (por exemplo, resíduos de mancha após a lavagem). Nestes experimentos vários tecidos, lavados com ambos produtos (por exemplo, produto A e pro- duto B), são comparados. Dois ou mais juizes realizam a graduação, em que a seguinte escala de Schelle é usada: 0: nenhuma preferência

1: eu acho este produto um pouco melhor (inseguro) 2: eu sei que este produto é um pouco melhor 3: este produto é melhor 4: este produto é muito melhor Exemplo 14

Estabilidade em armazenagem de Variantes de ASP

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar a es- tabilidade de armazenagem de várias variantes de ASP testadas em deter- gente TIDE® líquido em comparação com WT ASP são descritos. A atividade de protease das variantes e WT ASP foi testada usando um Analisador au- tomático Hitachi 911. Nestes testes, succinil - L-Ala-L-Pro-L-Phe-p- nitroanilida (pNA) foi usada para como o substrato para avaliar a atividade de protease. Neste teste, a ligação de carboxil amida terminal é clivada por p-nitroanilina produzindo protease ativa. A intensidade da cor amarela resul- tante, lida a 415 nm / 450 nm, é proporcional à atividade da protease na a- mostra que é calibrada com protease SAVINASE® padrão.

Como indicado na tabela seguinte, notam-se melhoras signifi-

cantes em estabilidade ao armazenamento das variantes engenheiradas como comparadas a ASP WT. Nesta Tabela , a "% de atividade retida" foi determinada usando a seguinte fórmula: % de atividade retida = atividade / atividade inicial χ 100%

Tabela 14-1. Atividade retida em 28 dias de armazenamento em TIDE® lí- quido a 32,22°C (90°F) Inicial 1 Dia 4 Dias 7 Dias 14 Dias 21 Dias 28 Dias WT ASP 100% 91% 32% 0 0 0 0 R18 100% 99% 41% 0 0 0 0 G12D- R35H 100% 100% 100% 100% 97% 92% 87% G12D- R35E 100% 100% 100% 100% 100% 97% 94% R35E 100% 100% 100% 96% 87% 79% 72% R35E- R18 100% 100% 100% 94% 82% 70% 61% R35D 100% 100% 100% 86% 71% 56% 45%

Exemplo 15

Determinação de atividade de limpeza de ASP

Neste exemplo, experimentos conduzidos para determinar a ati- vidade de limpeza de ASP sob várias condições, bem como as propriedades de várias condições de lavagem são descritos.

Nota-se uma vasta variedade de condições de lavagem incluindo

variar formulações de detergente, volume de água de lavagem, temperatura de água de lavagem, e duração de tempo de lavagem. Deste modo, compo- nentes de detergente tais como proteases devem estar aptos a tolerar e fun- cionar sob condições adversas de meio. Por exemplo, formulações de deter- gente usadas em diferentes áreas têm diferentes concentrações de seus componentes relevantes presentes na água de lavagem. Por exemplo, um detergente europeu tipicamente tem cerca de 3000-8000 ppm de componen- tes de detergente na água de lavagem, enquanto um detergente japonês tipicamente tem menos do que 800 (por exemplo, 667 ppm) de componentes de detergente na água de lavagem. Na América do Norte, particularmente Estados Unidos, detergente tipicamente tem cerca de 800 a 2000 (por e- xemplo, 975 ppm) de componentes de detergente presentes na água de Ia- vagem.

Detergentes latino-americanos são geralmente detergentes buil- der de fosfato de elevada espumação, e a faixa de detergentes usados na América Latina pode cair em ambas concentrações de detergente média e elevada, conforme elas variam de 1500 ppm a 6000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem. Detergentes brasileiros tipicamente tem aproximadamente 1500 ppm de componentes de detergentes presentes na água de lavagem. No entanto, outras áreas geográficas usando detergente builder de fosfato de elevada espumação, não-limitados a outros países Iati- no-americanos, podem ter sistemas de concentração elevada de detergente até cerca de 6000 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem.

Em face do exposto, é evidente que concentrações de composi- ções de detergente em soluções de lavagem típicas em todo o mundo vari- am de menos de cerca de 800 ppm de composição detergente ("áreas geo- gráficas de concentração de detergente baixa"), por exemplo cerca de 667 ppm no Japão, para entre cerca de 800 ppm a cerca de 2000 ppm ("áreas geográficas de concentração de detergente média"), por exemplo cerca de 975 ppm nos Estados Unidos e cerca de 1500 ppm no Brasil, para maior que cerca de 2000 ppm ("áreas geográficas de concentração de detergente ele- vada"), por exemplo cerca de 3000 ppm a cerca de 8000 ppm na Europa e cerca de 6000 ppm em áreas geográficas com detergentes builder de fosfato de elevada espumação. 10

15

20

As concentrações das soluções de lavagem típicas são determi- nadas empiricamente. Por exemplo, nos Estados Unidos, uma máquina de lavagem típica possui um volume de cerca de 64,4 L de solução de lavagem. Consequentemente, a fim de obter uma concentração de cerca de 975 ppm de detergente dentro da solução de lavagem, cerca de 62,79 g de composi- ção detergente devem ser adicionados à 64,4 L de solução de lavagem. Esta quantidade é uma quantidade típica medida na água de lavagem pelo con- sumidor usando o copo de medição provido com o detergente.

Como um outro exemplo, áreas geográficas diferentes usam temperaturas de lavagem diferentes. A temperatura da água de lavagem no Japão é tipicamente menor que usada na Europa. Por exemplo, a tempera- tura da água de lavagem na América do Norte e Japão pode ser entre 10 e 30°C (por exemplo, cerca de 20°C), considerando que a temperatura de á- gua de lavagem na Europa é tipicamente entre 30 e 50°C (por exemplo, cer- ca de 40°C).

Como um outro exemplo, áreas geográficas diferentes pode ter dureza de água diferente. Dureza de água é tipicamente descrita como gra- ma por litro de Ca2VMg2+ mistos. Dureza é uma medida de uma quantidade de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) na água. A maior parte de água nos Es- tados Unidos é dura, mas o grau de dureza varia de área para área. Água moderadamente dura (60-120 ppm) para dura (121-181 ppm) tem 60 a 181 partes por milhão (isto é, partes por milhão convertida a grama por litro de Estados Unidos é ppm n° dividido por 17,1 é igual a 0,01714 grama por litro)

Tabela 15-1. Faixas de dureza de áaua Água Grama/litro (grama/galão) Partes por milhão Macia menos que 0,01714 g/L (menos que 1,0) menos que 17 Levemente dura 0,01714 g/L a 0,06 g/L (1,0 a 3,5) 17 a 60 Moderadamente dura 0,06g/L a 0,12g/L (3,5 a 7,0) 60 a 120 Tabela 15-1. Faixas de dureza de áqua Água Grama/litro (grama/galão) Partes por milhão Dura 0,12g/L a 0,18g/L (7,0 a 10,5) 120 a 180 Muito dura mais que 0,18g/L (mais que 10,5) mais que 180

Dureza de água européia é tipicamente maior que 0,18 grama (10,5 gramas por galão) (por exemplo, 0,18-0,3428 (10,5 - 20,0)) por litro misturado Ca2+/Mg2+ (por exemplo, cerca de 0,2571 grama por litro (15 gra- mas por galão) misturado Ca2VMg2+ ). Dureza de água norte americana é tipicamente maior que dureza de água japonesa, mas menor do que dureza de água européia. Por exemplo, dureza de água norte americana pode estar entre 0,0514 a 0,1714 grama por litro (3 a 10 gramas por galão), 0,0514- 0,1370 grama por litro (3-8 gramas por galão) ou cerca de 0,1026 grama por litro (6 gramas por galão). Dureza de água japonesa é tipicamente menor que dureza de água norte americana, tipicamente menos que 0,0685 grama por litro (4 gramas por galão), por exemplo 0,0513 grama por litro (3 gramas por galão) misturado Ca2+/Mg2+

A presente invenção provê variantes de protease que proveem desempenho de lavagem em pelo menos um conjunto de condições de Ia- vagem e tipicamente em condições de lavagem múltiplas.

Como descrito aqui, as variantes de protease são testadas para desempenho em tipos diferentes de detergente e condições de lavagem u- sando um teste de microamostra (Vide acima, e pedido de patente U.S. nú- mero de série 09/554,992; e WO 99/34011, ambos sendo incorporados aqui por referência). Variantes de protease são testadas para outros substratos de mancha também de forma semelhante. Exemplo 16

Composições de limpeza de tecidos líquidas

Este exemplo provê composições de limpeza de tecido líquidas que encontram uso em conjunto com a presente invenção. Estas composi- ções são contempladas para encontrar utilidade particular sob condições de lavagem em máquinas japonesas, bem como para aplicações envolvendo limpeza de tecido finos e/ou delicados. A tabela 13-1 prove uma composi- ção apropriada. No entanto, não é pretendido que a presente invenção seja limitada a esta formulação específica, como muitas outras formulações en- contram uso com a presente invenção.____

_Tabela 16-1. Composição

Componente_

AE2.5S

íquida de limpeza de tecido

Quantidade (%)

2,16

AS

N-Cocoil N-metil glucamina

Tensoativo não-iônico

3,30

1,10

10,00

Acido cítrico

0,40

Ácido graxo

0,70

Base

Monoetanolamina 1,2-Propanodiol

EtOH_

HXS

0,85

1,01

1,92

0,24

2,09

Protease.sup.1 Amilase

Outros/inertes a 100%

0,01

0,06

Tabela 16-2. Composições detergentes líquidas para lavagem de roupas Componente Composições detergentes I Il Ill IV V LAS 18,0 _ 6,0 - - C 12-C15 AEi eS _ 2,0 8,0 11,0 5,0 C8-C10 dimetil propil amina 2,0 2,0 2,0 2,0 1,0 C12-C14 óxido de dimetil al- quil amina - - - - 2,0 C12-C15 AS - 17,0 - 7,0 8,0 Tabela 16-2. Composições deterqentes líquidas para Iavaaem de roupas Componente Composições detergentes I Il Ill IV V CFAA _ 5,0 4,0 4,0 3,0 Ci2-C14 Etoxilato de álcool graxo 12,0 6,0 1,0 1,0 1,0 C12-C18 Ácido graxo 11,0 11,0 4,0 4,0 3,0 Ácido cítrico (anidro) 5,0 1,0 3,0 3,0 2,0 DETPMP 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 Monoetanolamina 11,0 8,0 5,0 5,0 2,0 Hidróxido de sódio 1,0 1,0 2,5 1,0 1,5 Percarbonato _ 3,5 _ 2,5 _ Propanodiol 12,7 14,5 13,1 10, 8,0 Etanol 1,8 1,8 4,7 5,4 1,0 Pectina Liase _ _ _ 0,005 _ Amilase _ 0,002 _ _ _ Celulase - - 0,0002 - 0,000 1 Lipase 0,1 _ 0,1 _ 0,1 Protease A 0,05 0,3 0,055 0,5 0,2 DETBCHD _ _ 0,02 0,01 _ SRP1 0,5 0,5 _ 0,3 0,3 Ácido bórico 2,4 2,4 2,8 2,8 2,4 Sulfonato de xileno de sódio _ _ 3,0 _ _ DC 3225C 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2-butil-octanol 0,03 0,04 0,04 0,03 0,03 DTPA 0,5 0,4 0,35 0,28 0,4 Alvejante 1 0,18 0,10 0,11 _ _ Variante de ASP 0,05 0,3 0,08 0,5 0,2 Equilíbrio a 100% de perfume / corante e/ou água Tabela 16-3. Composições detergentes líquidas para Iavaqem de roupas Componente Composição detergente I I Il Ill IV V LAS 11,5 11,5 9,0 _ 4,0 _ C12-C15AE2.85S . _ 3,0 18,0 _ 16,0 C14-C15E 2.5 s 11,5 11,5 3,0 16,0 C 12-C13E9 _ _ 3,0 2,0 2,0 1,0 N. 3,2 3,2 _ _ _ _ LD CO d I CNJ O CFAA _ _ 5,0 _ 3,0 TPKFA 2,0 2,0 _ 2,0 0,5 2,0 Ácido cítrico (A- 3,2 3,2 0,5 1,2 2,0 1,2 nidrico) Formato de Ca 0,1 0,1 0,06 0,1 _ _ Formato de Na 0,5 0,5 0,06 0,1 0,05 0,05 Sulfonato de Na 4,0 4,0 1,0 3,0 1,2 - Culmeno Borato 0,6 0,6 _ 3,0 2,0 3,0 Hidróxido de Na 6,0 6,0 2,0 3,5 4,0 3,0 Etanol 2,0 2,0 1,0 4,0 4,0 3,0 1,2 Propanodiol 3,0 3,0 2,0 8,0 8,0 5,0 Monoetanol 3,0 3,0 1,5 1,0 2,5 1,0 amina TEPAE 2,0 2,0 _ 1,0 1,0 1,0 PB1 4.5 _ 2.8 _ Protease A 0,03 0,03 0,01 0,03 0,02 0,02 Lipase _ _ _ 0,002 _ _ Amilase _ _ _ _ 0,002 _ Celulase _ _ _ _ _ 0,0001 Pectina Liase 0,005 0,005 _ _ - Variante de ASP 0,03 0,05 0,01 0,03 0,08 0,02 SRP 1 0,2 0,2 - 0,1 - - Tabela 16-3. Composições detergentes líquidas para lavagem de roupas Componente Composição detergente I I Il Ill IV V DTPA _ 0,3 _ PVNO _ _ 0,3 _ 0,2 Alvejante 1 0,2 0,2 0,07 0,1 _ _ Silicone anties- 0,04 0,04 0,02 0,1 0,1 0,1 pumante Equilíbrio a 100% perfume / corante, e/ou água Tabela 16-4. Composições detergentes líquidas para lavagem de roupas Componente Composição I Il Ill IV V LAS 24,0 32,0 6,0 8,0 6,0 C 12-Ci5 AE1 sS _ _ 8,0 11,0 5,0 C8-C10 dimetil propil amina 2,0 2,0 2,0 2,0 1,0 Ci2-C14 óxido de dimetil alquil - - - - 2,0 amina C12-C15 AS _ 17,0 7,0 8,0 CFAA _ 5,0 4,0 4,0 3,0 C12-C14 Etoxilato de álcool graxo 12,0 6,0 1,0 1,0 1,0 Ci2-C18 Ácido graxo 3,0 _ 4,0 4,0 3,0 Ácido cítrico (anidro) 6,0 5,0 3,0 3,0 2,0 DETPMP _ _ 1,0 1,0 0,5 Monoetanolamina 5,0 5,0 5,0 5,0 2,0 Hidróxido de sódio _ _ 2,5 1,0 1,5 1 N de solução aquosa de HCI n°1 n°1 _ _ _ Propanodiol 12,7 14,5 13,1 10, 8,0 Etanol 1,8 2,4 4,7 5,4 1,0 DTPA 0,5 0,4 0,3 0,4 0,5 Pectina Liase - - - 0,005 - Tabela 16-4. Composições detergentes líquidas para lavagem de roupas Componente Composição I Il Ill IV V Amilase 0,001 0,00 - - - 2 Celulase - - 0,000 - 0,000 2 1 Lipase 0,1 _ 0,1 _ 0,1 Variante de ASP 0,05 0,3 0,08 0,5 0,2 Protease A _ _ _ _ 0,1 SRP1 0,5 0,5 _ 0,3 0,3 Ácido bórico 2,4 2,4 2,8 2,8 2,4 Sulfonato de xileno de sódio _ 3,0 _ DC 3225C 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2-butil-octanol 0,03 0,04 0,04 0,03 0,03 Alvejante 1 0,12 0,10 0,18 0,08 0,10 Equilíbrio a 100% de perfume / corante e/ou água O pH de composições (I)-(II) de exemplos 16-4 é cerca de 5 a cerca de 7, e de I(III)-(V) é cerca de 7,5 a cerca de 8,5. n°1: adicionar 1N solução aquosa de HCI para ajustar o pH livre da fórmula na faixa de cerca de 3 a cerca de 5.

Exemplo 17

Composições líquidas de lavagem de louça

Este exemplo provê composições líquidas de lavagem de louça que encontram uso em conjunto com a presente invenção. Estas composi- ções são contempladas para encontrar utilidade particular sob condições 10 japonesas de lavagem de louça. No entanto, não pretende-se que a presen- te invenção seja limitada a esta formulação específica, como muitas outras formulações encontram uso com a presente invenção.

As seguintes composições de detergente de lavagem de louça de densidade elevada compactas são providas pela presente invenção. Tabela 17-1. Composições detergentes para lavagem de louças de densida¬ de elevada compactas Componente Composições I Il Ill IV V Vl STPP _ 45,0 45,0 _ _ 40,0 3Citrato de Na 2H20 17,0 _ _ 50,0 40,2 _ Carbonato de Na 17,5 14,0 20,0 8,0 33,6 Biearbonato _ _ 26,0 _ Silicato 15,0 15,0 8,0 _ 25,0 3,6 Metassilicato 2,5 4,5 4,5 _ _ _ PB1 _ _ 4,5 _ _ _ PB4 _ _ 5,0 _ _ Percarbonato _ _ _ _ _ 4,8 PAAC 0,02 0,05 0,03 0,04 0,03 0,05 BB1 _ 0,1 0,1 _ 0,5 _ BB2 0,2 0,05 _ 0,1 _ 0,6 Não-iônico 2,0 1,5 1,5 3,0 1,9 5,9 HEDP 1,0 _ _ _ _ DETPMP 0,6 _ _ _ Parafina 0,5 0,4 0,4 0,6 _ Protease B 0,072 0,053 0,053 0,026 0,059 0,01 Amilase 0,012 _ 0,012 _ 0,021 0,006 Lipase _ 0,001 _ 0,005 _ _ Pectina Liase 0,001 0,001 0,001 _ _ _ Variante de ASP 0,072 0,053 0,053 0,026 0,059 0,01 BTA 0,3 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 Policarboxilato 6,0 _ _ _ 4,0 0,9 Perfume 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 Equilíbrio a 100% de Umidade e/ou Menores0 0AIvejante / Corante / SRP1 / Carboximetilcelulose de Na / Fotoalvejante / MgSO4 / PVPVI/ Supressor de espumação/PEG molecular elevado/Argila. O pH de composições (I) até (VI) de exemplos 17-1 é de cerca de 9,6 a cer- ca de 11,3.

As seguintes composições detergentes líquidas para lavagem manual de louça são providos pela presente invenção.___

Tabela 17-2. Composições detergentes líquidas para lavagem manual de louça Componente Composições de detergente I Il Ill IV V Vl C 12-C15 AE-I eS 30,0 28,0 25,0 _ 15,0 10,0 LAS _ _ 5,0 15,0 12,0 Sulfonato de Parafina _ _ 20,0 _ _ Cio-C18 Óxido de dimetil 5,0 3,0 7,0 - - - alquil amina Betaína 3,0 1,0 3,0 1,0 Ci2 ácido graxo poli-OH - - - 3,0 - 1,0 amida C14 ácido graxo poli-OH - 1,5 - - - - amida I 2,0 _ 4,0 _ _ 20,0 p m to DTPA _ _ _ 0,2 _ citrato de tri-sódio dihi- 0,25 - - 0,7 - - drato Diamina 1,0 5,0 7,0 1,0 5,0 7,0 MgCI2 0,25 _ 1,0 _ Protease A 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 0,05 Amilase 0,001 - - 0,00 - 0,001 2 cumeno sulfonato de só¬ - - - 2,0 1,5 3,0 dio DETBCHD _ 0,01 0,02 0,01 PB1 1,5 2,8 1,2 - - - Tabela 17-2. Composições detergentes líquidas para lavagem manual de louça Componente Composições de detergente I Il Ill IV V Vl Variante de ASP 0,02 0,01 0,03 0,01 0,02 0,05 Equilíbrio a 100% perfume / corante e/ou água As seguintes composições detergentes líquidas para lavagem de louça automática são providas pela presente invenção._

Tabela 17-3. Composições detergentes líquidas para lavagem de louça au¬ tomática Componente Composições I Il Ill IV V STPP 16 16 18 16 16 Sulfato de - 10 8 - 10 potássio 1,2 propa- 6,0 0,5 2,0 6,0 0,5 nodiol Ácido bórico 4,0 3,0 3,0 4,0 3,0 CaCI2 di- 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 hid ratado Não-iônico 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Protease B 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 Amilase 0,02 _ 0,02 0,02 _ Variante de 0,1 0,03 0,05 0,03 0,06 ASP Equilíbrio a 100% perfume / corante e/ou água As seguintes composições de detergente em tablete são provi-

das pela presente invenção. Essas composições são preparadas pela com- pressão de uma composição detergente de lavagem de louça granular em uma prensagem de 13KN/cm2, usando um prensa rotatória de calibre 12 pa- drão. Tabela 17-4. Composições detergentes em tabletes Componente Composições I Il Ill IV V Vl Vll Vlll STPP _ 48,8 44,7 38,2 _ 42,4 46,1 36,0 3Citrato de Na 20,0 - - - 35,9 - - - 2H20 Carbonato de Na 20,0 5,0 14,0 15,4 8,0 23,0 20,0 28,0 Silicato 15,0 14,8 15,0 12,6 23,4 2,9 4,3 4,2 Lipase 0,001 _ 0,01 _ 0,02 _ _ Protease B 0,042 0,072 0,042 0,031 _ _ _ Protease C - - - - 0,052 0,023 0,02 0,029 3 Variante de ASP 0,01 0,08 0,05 0,04 0,052 0,023 0,02 0,029 3 Amilase 0,012 0,012 0,012 - 0,015 - 0,01 0,002 7 Pectina Liase 0,005 _ _ 0,002 _ _ _ _ PB1 _ _ 3,8 _ 7,8 _ 8,5 Percarbonato 6,0 _ _ 6,0 _ 5,0 _ _ PAAC 0,02 0,03 0,05 0,04 0,03 0,02 0,04 0,05 BB1 0,2 _ 0,5 _ 0,3 0,2 _ _ BB2 0,2 _ 0,5 _ _ 0,1 0,2 Não-iônico 1,5 2,0 2,0 2,2 1,0 4,2 4,0 6,5 TAED _ _ _ _ _ 2,1 _ 1,6 HEDP 1,0 _ _ 0,9 _ 0,4 0,2 _ DETPMP 0,7 _ _ _ _ _ _ Parafina 0,4 0,5 0,5 0,5 _ _ 0,5 _ BTA 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 _ Policarboxilato 4,0 . _ 4,9 0,6 0,8 _ PEG 400-30,000 - _ - _ . 2,0 . 2,0 Tabela 17-4. Composições detergentes em tabletes Componente Composições I Il Ill IV V Vl Vll Vlll Glicerol _ _ 0,4 _ 0,5 Perfume _ . 0,05 0,2 0,2 0,2 0,2 Equilíbrio a 100% Umidade e/ou Menores0 0AIvejante / Corante / SRP1 / Carboximetilcelulose de Na / Fotoalvejante / MgSO4 / PVPVI/ Supressor de espumação/ PEG Molecular elevado/Argila.

O pH de exemplos 17-4.(I) até (VIII) é de cerca de 10 a cerca de 11,5.

O peso do tablete de exemplos 17-4.(I) até 7(VIII) é de cerca de 20 gramas a cerca de 30 gramas.

A seguinte composição de lavagem de louça encontram uso par-

ticular sob condições japonesas de lavagem.

Tabela 17-5. Composições de lavagem de louça líquidas Componente A B AE1.4S 24,69 24,69 N-cocoil N-metil gluca- 3,09 3,09 mina Óxido de Amina 2,06 2,06 Betaína 2,06 2,06 tensoativo não-iônico 4,11 4,11 Hidrótropo 4,47 4,47 Magnésio 0,49 0,49 Etanol 7,2 7,2 LemonEase 0,45 0,45 Geraniol/BHT ___ 0,60/0,02 Amilase 0,03 0,005 Protease 0,01 0,43 Equilíbrio a 100% Exemplo 18

Composições líquidas de limpeza de tecido

As proteases da presente invenção encontram uso particular em composições de limpeza. Por exemplo, é contemplado que a composição líquida de limpeza de tecido de particular utilidade sob condições japonesas de lavagem de máquina seja preparada de acordo com a invenção. Em al- gumas modalidades preferidas, essas composições compreendem os com- ponentes mostrados na Tabela 18-1.

Tabela 18-1. Composição líquida de limpeza de tecido Componente Quantidade (%) AE2.5S 15,00 AS 5,50 N-cocoil N-metil glucamina 5,50 Tensoativo não-iônico 4,50 Ácido cítrico 3,00 Ácido graxo 5,00 Base 0,97 Monoetanolamina 5,10 1,2-Propanodiol 7,44 EtOH 5,50 HXS 1,90 Ácido bórico 3,50 Tetraetilenopentaimina etoxilada 3,00 SRP 0,30 Protease 0,069 Amilase 0,06 Celulase 0,08 Lipase 0,18 Alvejante 0,10 Menores/inertes a 100% Exemplo 19

Composições granulares de limpeza de tecido

Neste exemplo, várias composições granulares de limpeza de tecido que encontram uso com a presente invenção são providas. As seguin- tes tabelas apresentam composições apropriadas. No entanto, não preten- de-se que a presente invenção seja limitada por estas formulações específi- cas, conforme muitas outras formulações encontram uso com a presente invenção.__

Tabela 19-1. Composições granulares de limpeza de tecido Componente Formulações A B C D Proteasel 0,10 0,20 0,03 0,05 Protease2 0,2 0,15 C13 sulfonato de alquil benzeno linear 22,00 22,00 22,00 22,00 Fosfato (como tripolifosfato de sódio) 23,00 23,00 23,00 23,00 Carbonato de sódio 23,00 23,00 23,00 23,00 Silicato de sódio 14,00 14,00 14,00 14,00 Zeólito 8,20 8,20 8,20 8,20 Chelan (ácido petaacético de dietilaenotri- 0,40 0,40 0,40 0,40 amina) Sulfato de sódio 5,50 5,50 5,50 5,50 Água Equilíbrio a 100% Tabela 19-2. Composições granulares de limpeza de tecido Componente Formulações A B C D Proteasel 0,10 0,20 0,30 0,05 Protease2 0,2 0,1 C12 sulfonato de alquil benzeno 12,00 12,00 12,00 12,00 Zeólito A (1 a 10 micrômetro) 26,00 26,00 26,00 26,00 C12-C14 secundário (2,3) sulfato de alqui- 5,00 5,00 5,00 5,00 la, sal de Na Citrato de sódio 5,00 5,00 5,00 5,00 Alvejante óptico 0,10 0,10 0,10 0,10 Sulfato de sódio 17,00 17,00 17,00 17,00 Cargas, água, outros Equilíbrio a 100% 5

As seguintes composições para lavagem de roupas são providas pela presente invenção. Estas composições são apropriadas para uso como grânulos ou tabletes. _

Tabela 19-3. Composições detergentes para lavagem de roupas em grâ¬ nulos e tabletes Componente Composição I Il Ill IV V Produto base C14-C15AS ou TAS 8,0 5,0 3,0 3,0 3,0 LAS 8,0 _ 8,0 7,0 C12-C15AE3S 0,5 2,0 1,0 _ C12-C15E5 OU E3 2,0 5,0 2,0 2,0 QAS _ 1,0 1,0 Zeólito A 20,0 18,0 11,0 10,0 SKS-6 (adicionar seco) _ 9,0 _ _ MA/AA 2,0 2,0 2,0 ... _ AA _ _ _ 4,0 3 Citrato de Na 2H2O _ 2,0 _ _ _ Ácido cítrico (Anidro) 2,0 _ 1,5 2,0 _ DTPA 0,2 0,2 _ _ EDDS _ 0,5 0,1 HEDP _ _ 0,2 0,1 PB1 3,0 4,8 _ _ 4,0 Percarbonato - _ 3,8 5,2 _ NOBS 1,9 _ NACA OBS _ 2,0 _ TAED 0,5 2,0 2,0 5,0 1,00 BB1 0,06 _ 0,34 0,14 BB2 0,14 _ 0,20 - Carbonato de Na Anidro 15,0 18,0 8,0 15,0 15,0 Sulfato 5,0 12,0 2,0 17,0 3,0 Silicato - 1,0 - - 8,0 Tabela 19-3. Composições detergentes para lavagem de roupas em grâ¬ nulos e tabletes Componente Composição I Il Ill IV V Produto base Protease B 0,033 0,033 _ _ _ Protease C _ _ 0,033 0,046 0,033 Lipase 0,008 _ _ Amilase 0,001 _ _ - 0,001 Celulase _ 0,0014 _ _ _ Pectina Liase 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 Variante de ASP 0,03 0,05 1,0 0,06 0,1 Equilíbrio a 100% Umidade e/ou Menores0 0Perfume / Corante, Alvejante / SRP1 / Carboximetilcelulose de

Na / Fotoalvejante / MgSO4 / PVPVI/ Supressor de espumação/ PEG Mole- cular elevado/Argila.

As seguintes composições detergentes para lavagem de roupas são contempladas para proporcionar um uso particular sob condições euro- péias de lavagem em máquina._

Tabela 19-3. Composições granulares de limpeza de tecido Componente Formulações A B C LAS 7,0 5,61 4,76 TAS 1,57 C45AS 6,0 2,24 3.89 C25E25 1,0 0,76 1.18 C45E7 2.0 C25E3 4,0 5,5 QAS 0,8 2,0 2.0 STPP Zeólito 25,0 19,5 19.5 Tabela 19-3. Composições granulares de limpeza de tecido Componente Formulações A B C Ácido cítrico 2,0 2,0 2.0 NaSKS-6 8,0 10,6 10.6 Carbonato I 8,0 10,0 8.6 MA/AA 1,0 2,6 1.6 CMC 0,5 0,4 0.4 PB4 12,7 Percarbonato 19.7 TAED 3,1 5.0 Citrato 7,0 DTPMP 0,25 0,2 0.3 HEDP 0,3 0,3 0.3 QEA 1 0,9 1,2 1.0 Protease 1 0,02 0,05 0.035 Lipase 0,15 0,25 0.15 Celulase 0,28 0,28 0,28 Amilase 0,4 0,7 0,3 PVPI/PVNO 0,4 0,1 Alvejante Fotoativado (ppm) 15 ppm 27 ppm 27 ppm Alvejante 1 0,08 0,19 0,19 Alvejante 2 0,04 0,04 Perfume 0,3 0,3 0,3 Grânulos efervescente(ácido málico 15 15 5 a 40%, bicarbonato de sódio a 40%, carbonato de sódio a 20%) Silicone antiespumante 0,5 2,4 2,4 Outros/inertes a 100% Equilíbrio a 100% Exemplo 20.

Composições detergentes de limpeza de superfície dura

A presente invenção também provê composições apropriadas para limpeza de superfícies duras.

Tabela 20. Composições detergentes líquidas de limpeza de superfície dura Componente Composição I Il Ill IV V Vl Vll C9-C11E5 2,4 1,9 2,5 2,5 2,5 2,4 2,5 p 3,6 2,9 2,5 2,5 2,5 3,6 2,5 N) I P m Oi C7-C9E6 _ _ _ _ 8,0 _ _ CM 1,0 0,8 4,0 2,0 2,0 1,0 2,0 LJJ d I CN d LAS _ _ _ 0,8 0,8 _ 0,8 Sulfonato de culme- 1,5 2,6 - 1,5 1,5 1,5 1,5 no de sódio Isachem ® AS 0,6 0,6 _ _ _ 0,6 _ Na2C03 0,6 0,13 0,6 0,1 0,2 0,6 0,2 3Citrato de Na 2H20 0,5 0,56 0,5 0,6 0,75 0,5 0,75 NaOH 0,3 0,33 0,3 0,3 0,5 0,3 0,5 Ácido graxo 0,6 0,13 0,6 0,1 0,4 0,6 0,4 2-butil octanol 0,3 0,3 _ 0,3 0,3 0,3 0,3 PEG DME-2000® 0,4 _ 0,3 0,35 0,5 _ _ PVP 0,3 0,4 0,6 0,3 0,5 _ _ MME PEG (2000) ® _ _ _ _ 0,5 0,5 Jeffamine® ED- - 0,4 - - 0,5 - - 2001 PAAC _ _ _ 0,03 0,03 0,03 _ DETBCHD 0,03 0,05 0,05 _ _ _ Protease B 0,07 0,05 0,05 0,03 0,06 0,01 0,04 Amilase 0,12 0,01 0,01 _ 0,02 _ 0,01 Lipase - 0,00 - 0,005 - 0,005 - 1 Variante de ASP 0,07 0,05 0,08 0,03 0,06 0,01 0,04 MCAEM (C8-Ci0E2 3,5 5,6 4,8 5,3 3,6 8,0 4,7 Acetato) Tabela 20. Composições detergentes líquidas de limpeza de superfície dura Componente Composição I Il Ill IV V Vl Vll Pectina Liase 0,001 _ 0,001 _ _ _ 0,002 PB1 3,5 4,6 2,7 3,8 3,6 4,2 2,7 Equilíbrio a 100% perfume / corante, e/ou água O pH destas composições é de cerca de 7,4 a cerca de 9.5.

Exemplo 21

Ração animal compreendendo ASP

A presente invenção também provê composições de ração ani- mal compreendendo variantes de ASP. Neste exemplo, tal ração, apropriada para aves domésticas, é provido. No entanto, não se pretende que a presen- te invenção seja limitada para esta formulação específica, como as protea- ses da presente invenção encontram uso com outras numerosas formula- ções de ração. Ainda pretende-se que as rações da presente invenção se- jam apropriadas para administração a qualquer animal, incluindo mas não- Iimitado a animais de criação (por exemplo, gado, porcos, carneiros, etc.), bem como animais domésticos (por exemplo, cães, gatos, cavalo, roedores, etc.). A tabela seguinte provê uma formulação para uma mistura, isto é uma ração para filhotes a base de milho apropriada para administração a perus pequenos de até 3 semanas de vida._

Tabela 21-1. Composição de ração animal Quantidade de Ingrediente (% em peso) Milho 36,65 Farelo de soja (45,6% de CP) 55,4 Gordura animal-vegetal 3,2 Fosfato de dicálcio 2,3 Calcário 1,5 Pré-mistura de mineral 0,3 Pré-mistura de vitamina 0,3 Cloreto de sódio 0,15 DL metionina 0,2 Em algumas modalidades, a formulação de ração é suplementa- da com várias concentrações da(s) protease(s) da presente invenção (por exemplo, 2.000 unidades/kg, 4.000 unidades/kg, e 6.000 unidades/kg).

Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório são 5 indicativas dos níveis do versado na técnica à qual a invenção pertence. To- das as patentes e publicações são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada a ser incorporada por referência.

Tendo descrito as modalidades preferidas da presente invenção, será evidente para o versado na técnica que várias modificações podem ser feitas nas modalidades descritas, e que estas modificações são destinadas a estar no escopo da presente invenção.

Os versados na técnica irão prontamente apreciar que a presen- te invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e alcançar as finalida- 15 des e vantagens mencionadas, assim como as inerentes aqui. As composi- ções e métodos descritos aqui são representativos de modalidades preferi- das são exemplares e não-destinados como limitações do escopo da inven- ção. É prontamente evidente para um versado na técnica que a variação de substituições e modificações pode ser feita na invenção aqui descrita sem 20 sair do escopo e espírito da invenção.

A invenção descrita de modo ilustrativo aqui pode ser praticada de modo apropriado na ausência de qualquer elemento, ou elementos, limi- tação ou limitações, que não é especificamente aqui descrito. Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e 25 não de limitação, e não se tem intenção de que no uso deste termos e ex- pressões excluir quaisquer equivalentes dos aspectos mostrados e descritos ou porções dos mesmos, mas reconhece-se que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Assim, seria entendido que apesar da presente invenção ter sido especificamente descrita por mo- 30 dalidades preferidas e aspectos opcionais, modificação e variação dos con- ceitos aqui descritos podem ser notadas pelos versados na técnica, e que estas modificações e variações são consideradas como dentro do espírito desta invenção, como definida pelas reivindicações anexas.

A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui. Cada uma das espécies e agrupamentos subgenéricos mais estreitos caindo den- tro da descrição genética também forma parte da invenção. Isto inclui a des- 5 crição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa remo- vendo qualquer assunto do gênero, sem levar em conta se ou não o material extirpado é especificamente descrito aqui.

Claims

1. Variante de serina protease isolada tendo uma seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as referidas substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

2. Composição compreendendo a variante de serina protease isolada como definida na reivindicação 1.

3. Composição compreendendo a variante de serina protease isolada como definida na reivindicação 1, em que referida variante de serina protease isolada tem reatividade cruzada imunológica com referdia Cellulomonas 69B4 serina protease compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

4. Serina protease isolada de acordo com a reivindicação 1, em que referida seqüência compreende pelo menos duas substituições de aminoácidos, em que as referidas pelo menos duas posições de aminoácidos são selecionadas dentre posições 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, .13,14, 15, 16, 18, 19, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, .38,39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 59, 61, .20 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, .81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 99, 100, 101, 103, 104, . 105,107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 123, 124, .125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 140, 141, 142, .143, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, .160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 176, 177, .179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, e 189, em que as referidas pelo menos duas substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

5. Serina protease isolada de acordo com a reivindicação 4, em que as referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre G12D, R14I, R14L, R14M, R14S, R16I, R16L, R16Q, Ν24Ε, Ν24Η, Ν24Μ, Ν24Τ, N24W, R35E, R35F, R35H, T36S, G49A, G54D, G54L, R61V, Α64Κ, G65Q, Q71F, Y75G, S76A, S76L, S76N, S76T, S76V, R79K, R79T, Q81K, Q81P, Τ86Κ, A93G, Α93Η, A93S, S99A, Τ109Μ, Ν112Ε, Τ116Ε, R123F, R123L, R123Q, R123S, R127A, R127K, R127Q, R159E, R159F, R159G, R159K, R159L, R159Q, R179N, R179Q, 1181K, I181Q, 1181Τ, D184N, D184T, e S187Q, em que referidas pelo menos duas substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

6. Protease de acordo com a reivindicação 5, em que referida protease compreende substituições múltiplas selecionadas dentre R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R123L, R14L/R127Q/R159Q, R14L/R179Q, R123L/R127Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q, R16Q/R79T, R35E/R123L/R127Q/R179Q, e G12D/R35E/G63R/R79K/T109M.

7. Protease de acordo com a reivindicação 5, em que referida protease compreende as seguintes substituições R123L, R127Q, e R179Q.

8. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre D2G, D2Q, V3I, V3L, N7A, N7L, N7S, 111 A, 111Q, R14E, N24A, N24E, N24H, N24L, N24M, N24Q, N24T, N24V, T36D, T36F, T36G, T36H, T36I, T36L, T36N, T36P, T36R, T36S, T36V, T36W, T36Y, A38D, A38F, A38H, A38L, A38N, A38R, A38S, G49F, S51A, G54A, G54D, G54H, G54K, G54L, G54M, G54R, N55F, A64H, A64N, A64R, A64W, A64Y, G65L, G65P, G65Q, G65R, G65S, G65T, G65Y, G65V, V66A, V66D, V66E, V66H, V66l, V66L, N67A, N67G, N67L, N67K, L69H, L69S, L69V, A70D, A70H, A70S, Q71A, Q71G, Q71H, Q71I, Q71K, Q71M, Q71N, N73S, N73T, N74G, Y75F, Y75G.Y75I, S76L, S76Y, S76V, S76W, G77S, G77T, G78A, G78D, G78H, G78N, G78S, G78T, R79P, V80H, V80L, Q81H, Q81K, Q81V, H85Q, H85T, V90I, V90P, V90S, S92G, W103I, W103M, H104K, T109A, T109H, T109I, S114G, T116F, P118A, P118F, P118H, P118R, E119K, E119R, N145E, N145I, N145Q, V150L, R159F, N170Y, G177M, R179A, R179D, R179E, R179I, R179K, R179L, R179M, R179N, R179T, R179Y, R179V, Ι181Η, Τ183Ι, G186E, G186I, G186V, S187P, S187T, e S188M.

9. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1A, F1T, D2A, D2H, D2N, V3T, N7H, N7I, A8G, A8K, T10G, T10K, I11S, I11T, G12W, G13M, S15F, N24F, N24S, A30S, R35F, T36C, A38G, A38I, A38K, A38V, A38Y, T40S, T40V, A41N, N42H, F47I, F47M, G49A, G49K, G49L, S51F, S51Q, G54I, G54Q, N55K, N55Q, R61M, T62I, G63Q, G63V, G63W, A64F, A64I, A64K, A64L, A64M, A64Q, A64S, A64T, A64V,G65A, G65H, V66M, V66N, N67D, N67F, N67H, N67Q, N67R, N67S, N67T, N67V, N67Y, L68W, L69W, A70G, Q71D, Q71F, Q71L, Q71R, V72I, N73H, S76E, S76I, S76K, S76A, S76N, S76Q, S76R, S76T, G77N, G77Y, G78I, S78R, G78V, R79G, V80F, Q81D, Q81I, A83N, H85R, H85K, H85L, T86A, P89N, V90A, V90L.V90T, T107H, T107M, T107S, T107V, T109G, T109L, T109P, T109R, A110S, A110T, N112I, P118E, P118I, P118K, P118Q, R123E, R123I, I126L, R127F, I28L, T129S, E133Q, L142V, A143N, A143S, N145G, N145L, N145T, V150M, T151L, R159E, T163L, Q167N, N170A, N170D, N170L, 171S, G177S, I181G, 1181N, T182V, T183K, T183M, D184F, D184H, D184Q, D184R, S185I, S185V, S187E, e S187L.

10. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos de referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre D2P, A8G, T10C, T10L, 111E, 111Q, 111T, 111W, G12D, G12I, G12N, G12Q, G12S, G12V, R14A, R14C, R14E, R14D, R14G, R14I, R14N, R14Q, R14S, R14T, S15C, S15E, S15H, S15R, S15Y, R16C, R16D, R16E, R16T, R16V, A22C, A22S, N24E, R35A, R35C, R35D, R35E, R35H, R35M, R35N, R35P, R35Q, R35S, R35T, R35V, T36C, A38C, A38D, A41C, A41D, T44E, T46C, T46E, T46F, T46V, T46Y, F47R, A48E, G49A, G49C, G49E, G49H, G49L, G49N, G49Q, G49V, G54C, N55G, D56L, Y57G, F59W, R61E, R61M, R61T, R61V, G91Q, S99A, T100A, T100R, T107R, T109E, N112P, S113C, S114C, P118K, P118R, E119G, E119R, E119T, E119V, E119Y, T121E, T121F, T121L, R123C, R123D, R123E, R123F, R123H, R123N, R123Q, R123S, R123T, R123V, R123W, R123Y, G124D, L125Q, R127D, R127E, R127K, R127Q, R127S, P134R, Tl51C1 T151L, S155C, S155I, S155W, S155Y, R159D, R159E, R159Q, R159S, R159T, R159V, T163D, F165E, F165W, Q167E, N170C, N170D, G177D, R179D, R179E, e M180L.

11.Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1N, F1P, D2I, D2M, D2T, D2V, A8R, A8T, T10D, T10E, T10F, T10M.T10Q, T10Y, G12H, G12P, G12Y, G13D,G13E, R14H, R14L, R14M, S15F, S15G, S15N, R16I, R16Q, N24G, N24T, I28V, R35K, T36V, A41S, A41T, N42D, T44C, F47V, G49F, G49K,G49S, S51A, S51C, S51L, S15M, G54E, N55A, D56F, R61K, R61Q, A64C, G65D, V66N, A70G, A70M, A70P, R79T, R79V, Q81A, Q81G, Q81P, A83E, A83D, A83H, T86E, A87C, A87E, A88F, S92T, S99G, S99H, S99K, S99Q, T100K, T100Q,W103L, T109K, N112D, N112E, S113A, S113D, S114E, T115C, T116G, T116N, P118A, P118C, P118G, P118W, E119A, E119L, E119N, E119Q, E119S, T121A, T121D, R123A, R123G, R123I, R123K, R123M, A132S, L125M, R127A, R127C, T128A, S140P, L141M, T151V, S155E, S155F, S155T, S155V, N157D, R159A, R159C, R159K, R159M, R159N, T160D, T163C, F165H, N170L, I172A, Q174C, Q174S, Q174T, A175T, G177E, R179C, R179F, R179I, R179L, R179M, R179N, R179S, R179T, R179V, R179W, R179Y, S187E, e S188E.

12. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre V3R, I4D, I4G, I4P, Y9E, Y9P, T10F, T10W, T10Y, G12D, S18E, A22C, A22S, A22T, N24T, G26E, G26I, G26K, G26Q, G26V, G26W, F27V, F27W, I28P, I28T, T29E, A30M, A30N, A30P, A30Y, G31H, G31M, G31N, G31V, G31Y, C33E, C33L, C33M, C33N, A38D, A38G, T39R, T40D, T40H, T40N, T40P, T40Q, R43D, P43G, P43H, P43K, P43L, P43N, G45A, G45V, T46V, T46Y, T46W, A48P, Y57M, Y57N, F59K, T62G, T62R, A70G, A70P, N73P, R79T, Q81A, Q81D, Q81F, Q81G, Q81H, Q81P, Q81S, A83H, G84C, G84P, P89W, G91L, A93S, R96C, R96E, R96F, S99A, TlOOA1 C105E, C105G, C105K, C105M, C105N, C105P, C105S, C105W, Tl21E1 R123F, R123N, R123W, R123Y, L125A, Τ128Α, T128C, T128G, T128S, T128V, I28W, T129W, S137R, S140P, Q146P, Α147Ε, S155F, S155K, S155P, S155R, S155W, S155Y, G156I, G156L, G156P, C158G, C158H, C158M, R159K, Τ160Ι, G161I, G161L, G161V, T164G, T164L, F166S, Q167L, Ρ168Υ, Υ176Ρ, G186S, e S188A.

13. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre A8G, T10C, T10L, G12A, G12H, S15C, S15N, S15Q, S15R, S15T, N24E, N24S, G25S, F27I, G31A, H32A, C33D, T36V, T39V, A41S, T46F, G49A, S51V, F59W, Q71A, Q71Y, N74F, R79V, Q81C, Q81E, A83E, A83F, A83M, A83R, G84M, G84V.T86I, T86M, T86S, A87E, A87S, P89A, V90A, V90M, S92T, A93D, S99G, T100Q, T101S, W103N, C105A, C105L, C105T, C105Y, T107A, T107F, T107L, T107Q.T107S, T110D, A110G, L111K, V115I, V115L, T116Q, Y117K, Y117Q, Y117R, Y117V, P118T, E119L, T121A, T121D, R123I, R123K, R123L, R123Q, R123T, L125M, R127F, R127K, R127Q, T129Y, V130T, A132C, P134W, L141C, A143H, G144A, V150N, T151C, G153K, G153V, G154L, G154R, S155T, R159Q, R159T, R159V, T160E, T160Q, G161K, G162P, T163I, F166A, F166C, P168I, N170D, N170E, G177N, R179K, M180L, T182L, T183A, T183I, T183P, S185R, G186P, S188C, S188E, S188G, S188M, S188T, S188V, e P189S.

14. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1T, T10N, R14D, R14G, R14I, R14L, R14N, R14Q, R14T, N24A, N24E, N24H, N24L, N24Q, N24T, N24V, R35A, R35E, R35F, R35L, R35Q, R35T, T36G, T36I, T36N, T36S, A38D, A38F, A38H, A38N, A38R, G49A, G49S, S51D, G54D, G54E, N55E, N55F, A64I, G65D, G65P, G65Q, G65S, G65T, G65V, N67D, L69S, N73T, N74G, Y75F, Y75G, S76D, S76E, S76I, S76L, S76N, S76T, S76V, S76Y, G77T, G78A, G78D, R79A, R79D, R79E, R79G, R79L, R79M, R79P, R79S, R79T, R79V, Q81E, A83E, H85Q, H85T, T86D, T86E, V90I, V90P, V90S, V90T, S99N, S99V, Τ107Ε, Τ107Η, T107S, T107V, Τ109Ε, N112D, Ν112Ε, N112L, N112Q, N112V, Τ116Ε, T116Q, Τ121Ε, R123A, R123D, R123E, R123F, R123H, R123I, R123L, R123N, R123Q, R127A, R127Q, T129S, L142V, Ν145Ε, R159D, R159E, R159F, R159N, R159Q, N170D, Ν170Υ, Ι172Τ, R179A, R179D, R179E, R179I, R179K, R179M, R179N, R179T, R179V, R179Y, 1181L, e G186N.

15. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1D, V3L, N7L, A8E, A8G, T10D, T10E, G12D, G13S, R14A, R14K, R14S, R14M, S15W, I19V, N24M, R35H, R35M, R35S, R35W, R35Y, T36D, T36H, A38L, A38S, A38T, A38Y, T40V, A41D, A41N, A48E, G49F, G49H, S51H, S51Q, S51T, S51V, R61E, R61H, R61M, R61S, R61T, G63D, A64F, A64H, A64L, A64M, A64N, A64P, A64Q, A64S, A64T, A64V, A64W, A64Y, G65L, G65Y, N67E, N67G, N67H, N67S, N67T, A70D, A70G, A70H, Q71D, Q71G, Q71H, Q71S, V72I, S76Q, S76W, G77S, Q81D, Q81H, Q81V, H85L, H85M, V90N, S92A, S92G, A93D, A93E, A93S, S99D, S99T, T101S, W103M, T107A, T107I, T107M, T107N, T109A, T109G, T109I, A110S, N112Y, S113T, S114A, V115A, T116F, T121D, N121I, R123G, R123S, R123T, R123V, R123Y, R127H, R127K, R127E, R127S, R127Y, N145D, N145T, R159A, R159C, R159K, R159L.R159S, R159Y, T160E, T163D, N170L, R179L, T182V, T183E, T183I, e S185N.

16. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre D2Q, V3L, N7L, 111 A,I11Q, R14I, R14M, R16L, R16Q, N24A, N24E, N24H, N24M, N24Q, N24T, N24V, R35F, R35L, T36D, T36G, T36H, T36I, T36L, T36N, T36P, T36S, T36W, T36Y, A38L, A38R, A38S, A48Q, G49A, G54D, G54I, G54Q, G54N, R61V, A64F, A64H, A64Y, G65L, G65P, G65Q, G65S, G65T, G65Y, V66H, N67A, N67G, N67L, N67S, N67V, N67Y, L69H, L69S, Q71I, N73T, N74G, Y75F, Y75G, Y75I, S76A, S76D, S76E, S76I, S76L, S76N, S76T, S76V, S76W, S76Y, G77T, G78D, R79G, R79P, Q81P, H85F, H85K, H85L, H85Q, H85R, P89D, S92A, A93T, A93S, S99A, S99D, S99N, S99T, S99W, T109E, N112E, S113A, S114G, T116F, T121D, R123F, R123I, R123L, R127A, R127F, R127G, R127H, R127K, R127L, R127Q, R127S, R127T, R127Y, A132V, Ρ134Ε, Α143Ν, N157D, R159D, R159E, R159F, R159H, R159K, R159N, R159Y, G161K, Ν170Υ, R179V, I181Q, D184F, D184H, G186E, G186I, G186V, e S187P.

17. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre F1T, A8D, A8G, T10E, T10L, T10Q, I11L, I11S, I11T, G12D, G12Y, R14E, R14L, R14N, R14P, S15E, R16A, R16G, R16I, R16N, N24L, N24S.V31F, R35A, A38D, A38F, A38N, A38V, A38Y, T40V, A41N, N42H, G49F, G49H, G49S, S51Q, S51T, G54A, G54L, G54M, N55F, R61H, R61K, R61M, R61S, R61T, A64N, A64S, A64T, A64V, A64W, G65R, G65V, V66D, N67F, N67K, N67M, N67Q, N67T, L69W, A70G, A70P, Q71D, Q71F, Q71H, Q71L, Q71T, G77N, G77S, G78A, G78N, R79D, V80H, V80L, H85T, H85Y, T86N, A88F, P89N, P89V.V90I, V90P, V90T S92G, A93D, A93E, S99G, L111D, L111E, N112D, N112G, N112L, N112Q, S113G, T121E, R123E, R123K, R123Q, L125V, P134G, S140A, L142V, A143S, N145D, V150L, R159A, R159C, R159L, R159V, T160E, G161E, T163D, T163I, N170D, N170L, R179D, R179E, R179K, R179N, R179T, 1181 Η, T183I, D184R, D184L, D184Q, D184T, S185W, S185I, G186L, S187E, S187Q, e S188Q.

18. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre A8R, A8S, A8T, A8V, R14E, R14L, R14M, R16Q, N24A, N24E, N24Q, N24T, R35F, R35L, T36D, T36G, T36I, T36N, T36P, T36S, A38D, A38F, A38L, A38R, A38S, S51A, S51D, G54D, G54I, N55E, N55F, N55S, R61M, R61T.G63V, A64H, A64N, A64S, G65Q, G65P, G65R.G65S, G65T, G65Y, V66D, N67D, S76E, N67F, N67G, N67L, N67M, N67S, N67T, N67V, N67Y, L69H, L69S, L69V, L69W, N73T, N74G, Y75F, Y75G, S76C, S76D, S76I, S76L, S76N, S76W, S76Y, S76V, G77T, G78D, R79C, R79D, R79E, R79G, R79P, Q81V, A83N, T85A, H85Q, T86F, T86I, T86L, V90I, V90N, V90P, V90S, V90T, A93D, A93E, T107M, T107N, T107S, Τ109Α, Τ109Ε, Τ109Ι, Ν112Ε, T121D, Τ121Ε, R123D, R123E, R123F, R123I, I126L, R127A, R127H, R127K, R127L, R127Q, R127S, R127Y, Ρ134Α, Ρ134Ε, L142V, Α143Ν, Ν145Ε, N145S, R150Y, R159C, R159D, R159E, R159F, R159K, R159Q, G161E, T163D, Ν170Υ, I172V, G177M, R179A, R179D, R179E, R179I, R179K, R179L, R179M, R179N, R179T, R179V, R179Y, M180D, T182V, Τ183Ι, G186E, G186V, e S187P.

19. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre V3L, I4M, A8E, A8H, A8L, A8N, A8P, 111T, R14I, R14Q, R16L, N24H, N24L, N24M, N24V, R35A, R35E, T36V, T36Y, A38H, A38I, A38N, T40V, A41N, G49A, G49L, S51F, S51Q, G54A, G54E, G54M, G54Q, N55Q, N55V, R61V, T62I, G63D, G63L, G63P, G63Q, A64F, A64I, A64L, A64M, A64Q, A64R, A64T, A64V, A64W, G65A, G65D, V66E, N67A, N67C, N67Q, N67R, L69Q, A70G, A70P, A70S, Q71D, Q71M, S76A, S76Q, S76T, G77N, G77Q, R79L, Q81E, Q81H, Q81I, A83D, A83I, H85L, H85R, T86E, T86M, A88F, V90L, S92C, S92G, A93Q, R96K, T101S, W103M, W103Y, T107A, T107E, T107H, T107Q, T107V, T109G, T109H, T109L, T109N, A110S, A110T, N112D, S114G, T116F, T121L, R123A, R123H, R123K, R123L, R123P, R123Q, L125V, R127F, R127T, T129G, T129S, A132V, P134D, P134G, S140A, N145G, N145P, N145Q, N145T, Q146D, T151V, R159A, R159H, R159L, R159N, R159V, S161K, F166Y, N170C, N170D, P171M, A175T, A175V, Y176L, R179W, T182W, T183E, T183K, T183L, T183Q, G186I, G186L, G186P, G186T, S187E, S187T, e S188E.

20. Protease de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência de aminoácidos da referida protease compreende pelo menos duas substituições selecionadas dentre T10A, T10G, T10L, I11A, I11S, I11T, G12I, R14G, R14M, S15E, S15F, S15G, R16K, R16N, A22V, N24A, N24E, N24L, N24Q, N24T, N24V, G34A, T36G, T36I, T36N, T36S, A38F, A38T, G49A, G49F, S51A, G65V, L69H, L69S, Q71I, N73T, N74G, S76D, S76L, S76V, S76W, S76Y, G77T, V80A, V90I, V90P, S99N, S99V, T107K, T107R, N112S, S118A, E119R, R127F, P134D, P134E, P134H, P134L, P134R, P134V, S140A, L142V, V150L, 159F, R159K, ΤΊ63Ι, F166Y, Q167N, Ν170Υ, R179V, T182V, G186E, G186S, e G186V.

21. Variante de serina protease isolada de acordo com a reivindicação 1 em que referida variante tem estabilidade melhorada, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

22. Variante de acordo com a reivindicação 21, em que referida variante tem melhorada termoestabilidade como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

23. Variante de acordo com a reivindicação 22, em que a referida variante compreende substituições múltiplas selecionadas dentre T121E/R123F/R159E, R79T/R127Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q, R16Q/R79T/R123L/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R123L, R16Q/R79T, R16Q/R123L/R159Q, R14QAT121E, R14L/R79T, R123L/R159Q, R123L/R127Q/R159Q, G12D/S15E/R35D/R123F/R159E, G12D/S15E/R159E, G12D/S15E, G12D/R35H/T121E/R123Q, G12D/R35H/R123Q, G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H, G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E, G12D/R159E, G12D/R14Q/S15E/R35D, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14Q/R159E, G12D/R14E, G12D/R127Q/R159E, e G12D/R123E/R159E, e R35E/R123L/R127Q/R175Q.

24. Variante de acordo com a reivindicação 21, em que a referida variante tem melhorada estabilidade LAS como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

25. Variante de acordo com a reivindicação 24, em que a referida variante compreende substituições múltiplas selecionadas dentre T121E/R123F/R159E, S15Em21E/R123Q, S15E/R35H/R159E, S15E/R35E/R159E, S15E/R35E/R127Q/R159E, S15E/R35E, S15E/R35D/T121E/R123Q, S15E/R35D/R123Q, S15E/R35D/R123F/R159E, S15E/R35D, S15E/R159E, S15E/R127Q, S15E/R123Q, S15E/R123E, R79T/R127Q/R179Q, R35H/R159E, R35H/R127Q/R159E, R35H/R123D/R159Ε, R35F/R61S/R159Q, R35F/R159Q, R35E/T121E/R123E, R35E/R159E, R35E/R127Q, R35D/R159E, R35D/R127Q/R159E, R35D/R127Q, R35D/R123Q/R159E, R16Q/R79T/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q, R16Q/R79T/R123L/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R123L/R159Q, R16Q/R79T/R123L, R16Q/R79T, R16Q/R61S/R159Q/R179Q, R16Q/R61 S/R 123L/R159Q, R16Q/R35F/R61S/R159Q, R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R35F/R123L/R159Q, R16Q/R35F, R16Q/R159Q/R179Q, R16Q/R159Q, R16Q/R127Q/R179Q, R16Q/R127Q/R159Q, R16Q/R123L/R159Q, R14Q/T121E, R14Q/R35E/T121E, R14Q/R35E/R159E, R14Q/R35E, R14Q/R35D/R127Q, R14Q/R35D/R123E/R159E, R14Q/R35D/R123D/R159E, R14Q/R35D, R14Q/R123Q, R14L/R79T/R127Q/R159Q, R14L/R79T, R14L/R61S/R79T/R123 L, R14L/R61S/R123L, R14L/R35F/R79T/R123L/R159Q, R14L/R35F/R61S, R14L/R127Q/R159Q/R179Q, R14L/R123L/R159Q, R14I/R35E/T121E/R159E, R14I/R35E/R127Q, R14I/R35E/R123E, R14I/R35D/R159E, R14I/R35D/R127Q/R159E, R14E/S15E/R35H, R14E/R35H/R127Q, R14D/S15E/R35E/R159E, R14D/R35H/R123Q/R159E, R127Q/R159E, R127Q/R159Q, R123Q/R159E, R123Q/R127Q/R159E, R123L/R159Q, R123L/R127Q/R159Q, R123F/R159E, R123E/R127Q/R159E, R123E/R127Q, G12D/S15E/R35H/R159E, G12D/S15E/R35H/R123F/R127Q/R159E, G12D/S15E/R35E/R159E, G12D/S15E/R35D/R127Q, G12D/S15E/R35D/R123F/R159E, G12D/S15E/R35D/R123E, G12D/S15E/R35D, G12D/S15E/R159E, G12D/S15E, G12D/R35H/T121E/R123Q, G12D/R35H/R159E, G12D/R35H/R123Q/R159E, G12D/R35H/R123Q, G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H, G12D/R35E/R159E, G12D/R35E/R123Q/R159E, G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E, G12D/R35D/R159E, G12D/R35D/R127Q, G12D/R35D/R123Q/R159E, G12D/R35D, G12D/R159E, G12D/R14Q/S15E/R35D, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14Q/R35E/R127Q/R159E, G12D/R14Q/R35D/R123H, G12D/R14Q/R159E, G12D/R14I/R35H, G12D/R14E, G12D/R14D/R35H/R123D/R127Q, G12D/R127Q/R159E, G12D/R123E/R159E, R127A/R159K, R14I/G65Q, R14I/G65Q/N67L/R159K, R14I/G65Q/N67L/Y75G/R127A/R159K, R14I/G65Q/R159K, R14I/G65Q/S76V/R127A/R159K, R14I/R127A, R14I/R127A/R159K, R14I/R159K, R14I/R35F, R14I/R35F/G65Q, R14I/R35F/G65Q/R127A/R159K, R14I/R35F/N67L/R127A/R159K, R14I/R35F/R127A/R159K, R14I/R35F/R159K, R14I/S76V, R14I/T36S/G65Q/R127A/R159K, R35F/R127A/R159K, R35F/S76A/R127A, N024A/G049A/A093H/S099N/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024A/S076A/A093H/S099G/R127K/R159K, N024A/S076T/A093S/S099G/R127K/R159K, N024E/G049A/A093G/S099G/R127K/A143N/R159K/I181T, N024E/G049A/A093H//R127K/A143N/R159K/I181Q, N024E/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T/V090I, N024E/G049A/A093S/S099D/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024H/G049A/A093T/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024H/S076A/A093G/S099G/R127K/R159K, N024H/S076A/A093H/S099G/R127K/R159K, N024H/S076A/A093S/S099A/R127K/R159K/G054H/L069H, N024H/S076A/A093T/S099G/R127K/R159K, N024H/S076N/A093Q/S099W/R127K/R159K, N024H/S076V/A093Q/S099G/R127K/R159K, N024L/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024L/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Q1 N024L/S076V/A093H/S099G/R127K, N024L/S076V/A093S/S099A/R127K/R159K, N024M/G049A/A093G/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024M/G049A/A093H/S099D/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024M/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024M/G049A/A093S/S099W/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024Q/G049A/A093H/S099A/R127Κ/Α143N/R159Κ/1181T1 N024Q/G049A/A093S/S099A/R127Κ/Α143N/R159Κ/1181Q, N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T, N024Q/S076A/A093H/S099A/R127K/R159K/T039N, N024Q/S076A/A093H/S099W/R127K/R159K, N024Q/S076I/A093T/S099G/R159Κ, N024Q/S076T/A093S/R127K/R159Κ, N024S/S076A/A093G/S099G/R127K/R159K/G054A, N024S/S076A/A093H/S099T/R127K/R159Κ, N024S/S076A/A093S/S099W/R127K/R159Κ, N024S/S076A/A093T/S099W/R127 Κ, N024S/S076T/A093Q/S099W/R127K/R159Κ, 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R14I/A64K/G78D/R123F/R127Q/R159N/D184T, R14I/N24A/R35E/A64K/G78D/R123F/R159N/D184T, R14I/A64K/R123F/R127K/R159E/D184T, R14I/N24A/R35E/A64K/N67S/G78D/R123F/R127K/R159F/D184T, R14I/A64K/G78D/R123F/R159E/D184T, R14I/N24E/R35D/A64K/N67A/G78D/R123F/R159K/D184T, N24T/R35D/G78D/R159K, N24T/R35E/N67A/G78D/R127Q, N24Q/R35E, R127K/R159N, R35D/R159E, R35E/G54D/N67S/G78D/R159K, N24Q/G54D/G78D/R159N, R127K/R159E, R127Q/R159K, N24E/R35E/G54D/N67S/R127K/R159N, R35D/G78D/R159K, N67S/R159E, G54D/R127K/R159K, G78D/R127K/R159K, G78D/R127K/R159E, N24E/R35D/G78D/R127K/R159N, R35D/G78D/R127K/R159N, N24A/R35E/G78D/R159N, N24Q/R35D/N67S/R127K/R159E, N24T/R35D/G78D/R159K, N67S/G78D/R127K/R159K, N24Q/R35D/R127K/R159K, N24E/G54D/G78D/R159K, R35D/R159K, R35E/R159K, R127K/R159K, R35E/N67S/G78D/R127Q, N24E/R35D/G78D, R35D/G78D/R127K/R159E, N24E/R35E/G54D/N67S/G78D/R127K/R159K, N24T/N67S/R159E, N24D/R35D/G78D/R159F, N24Q/R35D/N67S/G78D/R127K/R159F, R35D/G78D/R127Q/R159K, G78D/R159F, N24A/N67S/R159K, G78D/R127Q/R159K, N24T/G54D/N67S/G78D/R127Y/R159E, R14I/A63K/G78D/R123F/D184T, R14I/A63K/R123F/R159E/D184T, R14I/A63K/R123F/R159F/D184T, R14I/A63K/R123F/R159K/D184T, R14I/A63K/R123F/R159N/D184T, R14I/A63K/R123K/D184T, R14I/A63K/R123Q/D184T, R141/A63K/R123Y/D 184T, R14I/A64K/G78D/T86K/T116E/R123F, R14I/A64K/T86K/T116E/R123F/R159E, R14I/A64K/T86K/T116E/R123F/R159K, R14I/A64K/T86K/T116E/R123K, R14I/A64K/T86K/T116E/R123Q, R14I/A64K/T86K/T116E/R123Y, R14I/G54D/A63K/R123F/D184T, R14I/G54D/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/G54D/S76N/A93H/R127K/R159K/I181Q1 R141/G54 D/S76V/A93S/R127K/R159K/1181K, R14I/N24A/A63K/R123F/D184T, R14I/N24A/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24E/A63K/R123F/D184T, R14I/N24E/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24Q/A63K/R123F/D184T, R14l/N24Q/A64KfT86K/T116E/R123F, R14I/N24T/A63K/R123F/D184T, R14I/N24T/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24TS76N/A93H/R127K/R159K/I181Q, R14I/N24TS76V/A93S/R127K/R159K/I181K, R14I/N67AS76N/A93H/R127K/R159K/I181Q, R14I/N67LS76N/A93H/R127K/R159K/1181Q, R14I/N67SS76N/A93H/R127K/R159K/1181Q1 R14I/R35D/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/R35D/S76N/A93H/R127K/R159K/I181Q, R14I/R35E/A63K/R123F/D184T, R14I/R35E/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/R35E/S76N/A93H/R127K/R159K/1181Q, R14I/R35E/S76V/A93S/R127K/R159K/I181K, R14I/R35K/A63K/R123F/D184T, R14I/S76N/A93H/R127K/R159E/I181Q, R14I/S76N/A93H/R127K/R159F/I181Q, R14I/S76N/A93H/R127K/R159N/I181Q, R14I/S76N/A93H/R127Q/R159K/I181Q, R14I/S76N/A93H/R127Y/R159K/I181Q, R14I/S76N/G78D/A93H/R127K/R159K/1181Q, R14I/S76V/A93S/R127K/R159F/I181K, R14I/S76V/A93S/R127K/R159N/1181K, R14I/S7 6V/A93S/R127 Q/R 159K/1181K1 R14I/S76V/A93S/R127Y/R159K/I181 Κ, R14M/G54D/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K, R14M/N24A/S76N/A93G/R127K/R159K/1181 Κ, R14M/N24E/S76N/A93G/R127K/R159Κ/Ι181 Κ, R14M/N24Q/S76N/A93G/R127K/R159Κ/Ι181 Κ, R14M/N24T/S76N/A93G/R127K/R159Κ/1181 Κ, R14M/N67S/S76N/A93G/R127K/R159Κ/1181 Κ, R14M/R35D/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K, R14M/R35E/S76N/A93G/R127K/R159Κ/1181 Κ, R14M/S76N/A93G/R127K/R159Ε/1181 Κ, R14M/S76N/A93G/R127K/R159F/I181K, R14M/S76N/A93G/R127K/R159Ν/1181 Κ, R14M/S76N/A93G/R127Q/R159K/I181K, R14M/S76N/A93G/R127Y/R159K/I181K, e R14M/S76N/G78D/A93G/R127K/R159Κ/1181 Κ.

26. Variante de acordo com a reivindicação 1, em que a referida variante tem atividade melhorada, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

27. Variante de acordo com a reivindicação 26, em que a referida variante tem melhorada atividade caseinolítica, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

28. Variante de acordo com a reivindicação 27, em que a referida variante compreende substituições múltiplas selecionadas dentre R14L/R79T, G12D/R35H/R159E, G12D/R35H/R123Q, G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H, G12D/R35E/R159E, G12D/R35E/R123Q/R159E, G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E, G12D/R35D/R159E, G12D/R35D/R123Q/R159E, G12D/R35D, G12D/R159E, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14I/R35H, 024E/G049A/A093H/R127K/A143N/R159K/1181Q, N24M/S76V/A93H/R127K/R159K, R14I/N24E/R35D/A64K/N67A/G78D/R123F/R159K/D184T R127A/R159K, R14I/G65Q, e R14I/G65Q/R159K R14I/S76V.

29. Variante de acordo com a reivindicação 26, em que a referida variante tem melhorada atividade queratinolítica, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

30. Variante de acordo com a reivindicação 27, em que a referida variante compreende substituições múltiplas selecionadas dentre N024E/G049A/A093H/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024E/G049A/A093H/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T/V090I, N024E/G049A/A093S/S099D/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181T, N024Q/G049A/A093S/S099N/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024T/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181T, N024W/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/I181Q, N24A/G54E/S76D/A93G/R127K/R159K, N24E/A93G/R127K/R159K, N24E/G54L/S76E/A93G/R127K/R159K, N24E/G54Q/A93S/R127K/R159K, N24E/S76D/A93T/R127K/R159K, N24M/G54E/A93H/R127K/R159K, N24M/G54E/S76N/A93S/R127K/R159K, N24Q/A93G/R127K/R159K, N24Q/G54D/S76L/A93G/R127K/R159K, N24Q/G54I/S76E/A93H/R127K/R159K, N24T/G54D/S76V/A93G/R127K/R159K, N24T/G54E/S76V/A93H/R127K/R159K, N24W/G54D/A93H/R127K/R159K, N24W/S76E/A93G/R127K/R159K, R0141/S076A/A093G/R127K/R159K/1181T, R014I/S076A/A093H/R127K/R159K/1181Q, R014I/S076D/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014I/S076D/A093H/R127K/R159K/I181T, R014I/S076D/A093S/R127K/R159K/1181T, R014I/S076E/A093S/R127K/R159K/I181Q, R014I/S076E/A093T/R127K/R159Κ/1181K1 R0141/S0761/A093S/R127K/R159Κ/1181Q, R014I/S076N/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014I/S076T/A093G/R127K/R159K/I181Q, R014I/S076V/A093H/R127K/R159K/1181Q, R014K/S076A/A093S/R127K/R159K/1181T, R014K/S076E/A093H/R127K/R159K/1181T, R014K/S076E/A093S/R127K/R159K/1181T1 R014K/S076T/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014L/S076A/A093H/R127K/R159K, R014L/S076A/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014L/S076D/A093H/R127K/R159K/1181T1 R014L/S076E/A093H/R127K/R159K/1181K, R014M/S076A/A093G/R127K/R159K/1181T, R014M/S076A/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076A/A093S/R127K/R159K/I181K, R014M/S076A/A093S/R127K/R159K/1181T, R014M/S076A/A093T/R127K/R159K/1181Q, R014M/S076D/A093S/R127K/R159K/1181T, R014M/S076E/A093G/R127K/R159K/1181T, R014M/S076E/A093H/R127K/R159K/1181T, R014M/S076E/A093S/R127K/R159K/1181T, R014M/S076N/A093G/R127K/R159K/1181K, R014M/S076N/A093G/R127K/R159K/1181T, R014M/S076N/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076N/A093S/R127K/R159K/1181T, R014M/S076V/A093G/R127K/R159K/1181Q, R14I/N24Q/A64K/G78D/R123F/R159K/D184T, R14I/N24A/A64K/N67S/G78D/R123F/R159K/D184T, R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184T, R14I/N24E/A64K/R123F/R127K/R159K/D184T, R14I/N24Q/A64K/R123F/R127Q/R159K/D184T, R14I/N24Q/A64K/G78D/R123F/R127Q/R159N/D184T, R14I/N24E/A64K/N67L/G78D/R123F/R159K/D184T, R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184T, R127Q/R159K, G78D/R127K/R159K, N67S/G78D/R127K/R159K, R35D/R159K, G78D/R127Q/R159K, N24A/N67A/R159K, T36S/R127Q/R159E, S15En"121E/R123Q, S15E/R35H/R159E, S15E/R35E, S15E/R159E, S15E/R123Q, S15E/R123E, R79T/R127Q/R179Q, R35H/R159E, R35H/R127Q/R159E, R35F/R61S/R159Q, R35F/R159Q, R35E/R159E, R35E/R127Q, R35D/R159E, R35D/R127Q, R16Q/R79T/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q, R16Q/R79T/R123L, R16Q/R79T, R16Q/R35F/R123L/R159Q, R16Q/R159Q/R179Q, R16Q/R127Q/R159Q, R16Q/R123L/R159Q, R14Q/T121E, R14Q/R35E/T121E, R14Q/R35E/R159E, R14Q/R35E, R14Q/R35D/R127Q, R14Q/R35D, R14L/R79T/R127Q/R159Q, R14L/R61S/R79T/R123L, R14L/R35F/R61S, R14L/R127Q/R159Q/R179Q, R14L/R123L/R159Q, R14I/R35E/R127Q, R14I/R35E/R123E, R14I/R35D/R159E, R14E/R35H/R127Q, R127Q/R159E, R127Q/R159Q, R123Q/R159E, R123Q/R127Q/R159E, R123L/R159Q, R123L/R127Q/R159Q, R123F/R159E, R123E/R127Q/R159E, R123E/R127Q, G12D/S15E/R35H/R159E, G12D/S15E/R35D, G12D/S15E/R159E, G12D/S15E, G12D/R35H/T121E/R123Q, G12D/R35H/R159E.G12D/R35H/R127Q/R159E, G12D/R35H/R123Q, G12D/R35H/R123F/R159E, G12D/R35H, G12D/R35E/R159E, G12D/R35E/R123Q/R159E, G12D/R35E/R123Q, G12D/R35E, G12D/R35D/R 159E, G12D/R35D/R127Q, G12D/R35D, G12D/R159E, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14Q/R35D/R123H, G12D/R14Q/R159E, G12D/R14I/R35H, G12D/R14E, G12D/R127Q/R159E, G12D/R123E/R159E, R127A/R159K, R14I/G65Q, R14I/G65Q/R127A/R159K, R14I/G65Q/R159K, R14I/R127A, R14I/R127A/R159K, R14I/R159K, R14I/R35F, R14I/R35F/G65Q, R14I/R35F/G65Q/R127A/R159K, R14I/R35F/R159K, R14I/S76V, R14I/T36S/G65Q/R127A/R159K, e R35F/R127A/R159K.

31. Variante de acordo com a reivindicação 26, em que referida variante tem melhorada atividade de desempenho de lavagem como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

32. Variante de acordo com a reivindicação 31, em que referida variante compreende substituições múltiplas selecionadas dentre N24F/R159G,/N24F/R159L/R123V, N24I/R127S,/N24L/R159S, N24S/R159A, N24V/R159L, N24Y/R159F, R14A/N24K/R127S, R14A/R159W, R14L/N24Y, R14L/R159G, R14L/R159S, R14L/T109M, R14L/T39P, R14M/R159W, R14S/N24V, R14S/N24Y, R14T/N24A, R14V/N24G/P189S, R14V/R159W, R127A/R159K, R14I/G65Q, R14I/S76V, R14I/G65Q/N67L/R159K, R14I/G65Q/R159K, R14I/S76V, R35F/R159Q, R16Q/R79T, R16Q/R35F, R16Q/R159Q, R14L/R79T, R123L/R159Q, G12D/S15E, G12D/R35H, G12D/R35D, N024E/G049A/A093H//R127K/A143N/R159K/1181Q, N024H/S076A/A093S/S099A/R127K/R159K/G054H/L069H, N024H/S076A/A093T/S099G/R127K/R159K, N024L/S076V/A093S/S099A/R127K/R159K, N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/I181T, N024T/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181T, N24E/G54Q/A93S/R127K/R159K, N24H/A93H/R127K/R159K, N24H/G54L/S76V/A93H/R127K/R159K, N24L/G54Q/S76A/A93H/R127K/R159K, N24M/A93G/R127K/R159K, N24M/G54E/A93H/R127K/R159K, N24M/S76V/A93H/R127K/R159K, N24Q/G54Q/S76T/A93H/R127K/R159K, N24Q/S76A/A93G/R127K/R159K, N24T/G54Q/S76N/A93G/R127K/R159K, N24T/S76I/R127K/R159K, N24W/G54D/A93H/R127K/R159K, N24W/S76A/A93H/R127K/R159K, N24W/S76T/A93G/R127K/R159K, N24W/S76V/A93G/R127K/R159K, N24W/S76Y/A93G/R127K/R159K, R014I/S076A/A093G/R127K/R159K/I181T, R014I/S076A/A093H/R127K/R159K/I181K, R014I/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181Q, R014I/S076A/A093H/R127K/R159K/I181T, R014I/S076D/A093S/R127K/R159K/1181T1 R014I/S076E/A093T/R127K/R159K/1181 Κ, R014I/S076N/A093H/R127K/R159K/1181Q, R014I/S076V/A093H/R127K/R159K/I181Q, R014I/S076V/A093S/R127K/R159K/1181 Κ, R014K/S076A/A093S/R127K/R159K/1181T1 R014K/S076E/A093H/R127K/R159K/I181K, R014K/S076I/A093S/R127K/R159K/I181T, R014K/S076T/A093H/R127K/R159K/1181K1 R014K/S076T/A093H/R127K/R159K/1181 Τ, R014K/S076V/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014L/S076A/A093H/R127K/R159Κ, R014L/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181Q1 R014L/S076D/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014L/S076E/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076A/A093G/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076A/A093G/R127K/R159K/I181T, R014M/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076A/A093S/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076A/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076A/A093T/R127K/R159Κ/1181Q, R014M/S076I/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076I/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076N/A093G/R127K/R159K/I181K, R014M/S076N/A093G/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076N/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076N/A093S/R127K/R159K/I181T, R014M/S076T/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076V/A093G/R127K/R159Κ/1181Q, R014M/S076W/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076Y/A093H/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076Y/A093H/R127K/R159K/I181T, G012D/R035E/D184N, G012D/R035E/N067K, R14I/A64K/R123F/R159F/D184T, R14I/A64K/R123F/R159F/D184T, R14I/N24Q/A64K/G78D/R123F/R159K/D184Τ, R14I/N24Q/A64K/N67S/R123F/R159F/D184T, R14I/N24Q/A64K/N67A/R123F/R159K/D184T, R14I/N24A/A64K/N67S/G78D/R123F/R159K/D184Τ, R14I/A64K/R123F/D184Τ, R14I/N24A/A64K/R123F/R159N/D184Τ, R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184Τ, R14I/N24Q/A64K/N67A/R123F/R159K/D184T, R14I/N24E/A64K/R123F/R127K/R159K/D184T, R14I/N24A/A64K/R123F/D184T, R14I/A64K/R123F/R127K/R159F/D184T, R141/A64 K/R 12 3 F/R 15 9 N/D 184T, R14I/A64K/R123F/R159K/D184T, R14I/A64K/R123F/R127Y/R159K/D184T, R14I/N24Q/A64K/R123F/R127Q/R159K/D184T, R14I/A64K/R123F/R159K/D184T, R14I/N24Q/R35D/A64K/N67S/R123F/R159K/D184T, R14I/A64K/N67S/G78D/R123F/R127K/R159K/D184T, R14I/N24Q/A64K/N67A/R123F/R127K/R159K/D184T, R127K/R159K, N24A/N67S/R 159K, N24A/N67A/R159K, R14I/A63K/G78D/R123F/D184T, R14I/A63K/N67A/R123F/D184T, R14I/A63K/N67L/R123F/D184T, R141/A63K/N67S/R123F/D184T, R14I/A63K/R123F/R159F/D184T, R14I/A63K/R123F/R159K/D184T, R14I/A63K/R123F/R159N/D184T, R14I/A63K/R123K/D184T, R14I/A63K/R123Q/D184T, R141/A63K/R123Y/D 184T, R14I/A64K/G78D/T86K/T116E/R123F, R14I/A64K/N67A/T86K/T116E/R123F, R14I/A64K/N67L/T86K/T116E/R123F, R14I/A64K/T86K/T116E/R123F/R159K, R14I/A64K/T86K/T116E/R123K, R14I/G54D/A63K/R123F/D184T, R14I/G54D/A64K/T86K/T116E/R123F, R141/N24A/A63K/R 123F/D 184T, R14I/N24A/A64K/T86K/T116E/R123F, R141/N24A/S76V/A93S/R127K/R159K/1181K, R14I/N24E/A63K/R123F/D184Τ, R14l/N24E/A64K/T86Kmi6E/R123F, R14I/N24Q/A63K/R123F/D184T, R14I/N24Q/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24Q/S76V/A93S/R127K/R159K/1181 Κ, R14I/N24T/A63K/R123F/D184T, R14I/N24T/A64K/T86K/T116E/R123F, R14I/N24TS76V/A93S/R127K/R159K/1181 Κ, R14I/N67SS76N/A93H/R127K/R159Κ/1181Q, R14I/R35E/A63K/R123F/D184T, R14I/R35K/A63K/R123F/D184T, R14I/S7 6V/A93S/R127K/R159F/1181K1 R14I/S76V/A93S/R127K/R159N/1181K, R14I/S76V/A93S/R127Y/R159K/1181K, R14M/N24T/S76N/A93G/R127K/R159K/1181K, R14M/N67S/S76N/A93G/R127K/R159K/I181K, R14M/S76N/A93G/R127K/R159F/1181K, e R14M/S76N/G78D/A93G/R127K/R159K/1181K.

33. Variante de acordo com a reivindicação 26, em que referida variante tem melhorada atividade de desempenho de lavagem de louça, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

34. Variante de acordo com a reivindicação 33, em que referida variante compreende substituições múltiplas selecionadas dentre R14N/R127K/R159L, R14I/A64K/T86K/N112E/R123F/D184T, G12D/R35E/G63R/R79K/T109M, R14L, G12D/R35E, e R14M/S76D/A93H/R127K/R159K/I181K.

35. Variante de acordo com a reivindicação 26, em que referida variante tem melhorada atividade de remoção de manchas, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

36. Variante de acordo com a reivindicação 35, em que referida variante compreende substituições múltiplas selecionadas dentre G54E/R14L, N24D/R127Y/R159V, N24E/R127S, N24E/R159C, N24F/R159G, N24F/R159G/G54E, N24F/R159L/R123V, N24G/R127Y, N24H/R159Y/T46I, N24I/R127S, N24I/R127V/R14/N24L/R159S, N24S/R159A, N24V/R127M/R159V, N24V/R127S/R159H, N24V/R159L, N24Y/G54A, N24Y/R127L, N24Y/R127S, N24Y/R127V, N24Y/R159F, R127A/R159F, R127H/R159Q, R127H/R159T/S185F, R127M/R159V, R127S/R159G, R127S/R159L, R127T/R159F, R127V/R159G, R127Y/R159L, R14A/N24K/R127S, R14A/R127Y/R159W, R14G/N24S/R127C, R14G/R127G, R14L/N24D, R14L/N24Y, R14L/R123L, R14L/R127S, R14L/R127V, R14L/R127Y, R14L/R159G, R14L/R159S, R14L/T39P, R14M/N24L/R159S/R123V, R14M/R159F, R14M/R159W, R14Q/R123F, R14S/N24E/R127W, R14S/N24V, R14S/N24Y, R14T/N24T/R127Q, R14T/R127Y, R14V/N24D/R 127C, R14V/N24G/P189S, R14V/N24L/R127F, R14V/R127A, R14V/R159F, R14V/R159W, R14W/N24A, R14W/R123L, R14W/R123V, R14W/R159V, R159V/G49D, R159V/R123G, N024E/G049A/A093H/R127K/A143N/R159K/I181Q, N024E/G049A/A093S/S099D/R127K/A143N/R159K/1181Q, N024Q/G049A/A093S/S099A/R127K/A143N/R159K/1181Τ, N24A/G54E/S76D/A93G/R127K/R159K, N24E/A93G/R127K/R159K, N24E/G54L/S76E/A93G/R127K/R159K, N24E/G54Q/A93S/R127K/R159K, N24E/S76D/A93T/R127K/R159K, N24H/G54E/A93G/R127K/R159K, N24L/S76T/A93G/R127K/R159K, N24M/A93S/R127K/R159K, N24M/A93T/R127K/R159K, N24M/G54E/A93H/R127K/R159K, N24M/G54E/S76N/A93S/R127K/R159K, N24M/S76V/A93H/R127K/R159K, N24Q/A93G/R127K/R159K, N24Q/G54D/S76L/A93G/R127K/R159K, N24Q/G54I/S76T/A93G/R127K/R159K, N24Q/G54Q/A93G/R127K/R159K, N24Q/S76A/A93G/R127K/R159K, N24T/G54Q/S76N/A93G/R127K/R159K, N24T/G54Q/S76V/R127K/R159K, N24T/S76l/R 127K/R159K, N24W/A93G/R127K/R159K, N24W/G54D/A93H/R127K/R159K, R014I/S076A/A093G/R127K/R159K/118 TT1 R014I/S076A/A093H/R127K/R159K/I181Q1 R014I/S076D/A093H/R127K/R159K/1181Q, R014I/S076D/A093H/R127K/R159K/1181T, Tl R014I/S076D/A093S/R127K/R159Κ/1181T1 R014I/S076E/A093S/R127K/R159K/I181Q, R0141/S076E/A093T/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014I/S076N/A093H/R127K/R159Κ/1181Q1 R014L/S076A/A093H/R127K/R159K, R014L/S076A/A093H/R127K/R159Κ/1181Q, R014L/S076D/A093H/R127K/R159K/I181T, R014M/S076A/A093G/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076A/A093S/R127K/R159Κ/1181K1 R014M/S076A/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076A/A093T/R127 K/R 159Κ/1181Q, R014M/S076D/A093S/R127K/R159K/I181T, R014M/S076E/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076E/A093S/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076N/A093G/R127K/R159Κ/1181 Κ, R014M/S076N/A093G/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076N/A093H/R127K/R159Κ/1181 Τ, R014M/S076N/A093S/R127K/R159Κ/1181T1 T36S/R127Q/R159Ε, S15E/R35E, S15E/R35D, S15E/R159E, S15E/R127Q, S15E/R123Q, S15E/R123E, R79T/R127Q/R179Q, R35H/R159E, R35F/R61S/R159Q, R35F/R159Q, R35D/R127Q, R16Q/R79T/R159Q/R179Q, R16Q/R79T/R123L, R16Q/R79T, R16Q/R35F, R16Q/R159Q/R179Q, R16Q/R159Q, R14Q/T121E, R14Q/R35E, R14Q/R35D, R14Q/R123Q, R14L/R79T, R127Q/R159E, R127Q/R159Q, R123Q/R159E, R123L/R159Q, R123F/R159E, G12D/S15E, G12D/R35H/R159E, G12D/R35H/R123Q, G12D/R35H, G12D/R35E, G12D/R35D, G12D/R159E, G12D/R14Q/R35H, G12D/R14I/R35H, G65Q/R127A/R159K, R127A/R159K, R14I/G65Q, R14I/G65Q/N67L/R159K, R14I/G65Q/R127A, R14I/G65Q/R127A/R159K, R14I/G65Q/R159K, R14I/R127A, R14I/R127A/R159K, R14I/R159K, R14I/R35F, R14I/R35F/G65Q, R14I/R35F/R159K, R14I/S76V, e R35F/R127A/R159Κ.

37. Variante de serina protease isolada de acordo com a reivindicação 1, em que referida variante demonstra uma alterada propriedade de superfície, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

38. Protease de acordo com a reivindicação 37, em que referida variante compreende substituições de pelo menos duas substituições em posições selecionadas dentre as posições 1, 2, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, .15,16, 22, 24, 25, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, .48,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, .73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, . 95, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, . 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, .132, 133, 134, 135, 137, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 152, 153, 154, 155, .156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, .173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, e 184, em que referidas pelo menos duas substituições são feitas em posições equivalentes às posições em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

39. Variante de serina protease isolada de acordo com a reivindicação 1, em que referida protease tem pelo menos uma propriedade melhorada, como comparado com protease de Cellulomonas 69B4 de tipo selvagem compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

40. Protease de acordo com a reivindicação 39, em que referida pelo menos uma propriedade melhorada é selecionada dentre o grupo consistindo em estabilidade em ácido, termoestabilidade, hidrólise de caseína, hidrólise de queratina, desempenho de limpeza, e estabilidade LAS.

41. Vetor de expressão compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos codificando uma variante de serina protease isolada como definida na reivindicação 1.

42. Célula hospedeira compreendendo referido vetor de expressão como definido na reivindicação 41.

43. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 42, em que o referido hospedeiro é selecionado dentre Bacillus sp., Streptomyces sp., Aspergillus sp., e Trichoderma sp.

44. Variante de serina protease produzida pela referida célula hospedeira como definida na reivindicação 43.

45. Composição compreendendo pelo menos uma porção de uma variante de serina protease isolada como definida na reivindicação 1.

46. Seqüência de polinucleotídeos codificando uma variante de serina protease isolada como definida na reivindicação 1.

47. Vetor de expressão compreendendo a seqüência de polinucleotídeos como definida na reivindicação 46.

48. Célula hospedeira compreendendo referido vetor de expressão como definido na reivindicação 47.

49. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 48, em que o referido hospedeiro é selecionado dentre o grupo consistindo em Bacillus sp., Streptomyees sp., Aspergillus sp., e Triehoderma sp.

50. Variante de serina protease produzida pela referida célula hospedeira como definida na reivindicação 49.

51. Composição de limpeza compreendendo pelo menos um variante de serina protease como definida na reivindicação 1.

52. Composição de limpeza compreendendo pelo menos uma variante de serina protease como definida na reivindicação 1, em que a referida variante de serina protease tem reatividade cruzada imunológica com a Cellulomonas 69B4 serina protease compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

53. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 51, em que referidas substituições são feitas em posições equivalentes às posições 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 22, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 51, 52, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 96, 99, 100, 101, 103 , 104, 105, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, . 116, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 132, 133,134, 135, 136 , 137, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158 , 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167,168, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 179, 180 , 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, e 189, em uma protease de Cellulomonas 69B4 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID N0 8.

54. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 53, ainda compreendendo uma ou mais enzimas adicionais ou derivados de enzimas selecionadas dentre o grupo consistindo em proteases, amilases, lipases, mannanases, pectinases, cutinases, oxidorredutases, hemicelulases, e celulases.

55. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 51, ainda compreendendo pelo menos um agente estabilizante.

56. Composição de acordo com a reivindicação 55, em que o referido agente estabilizante é selecionado dentre bórax, glicerol, e inibidores competitivos.

57. Composição de acordo com a reivindicação 56, em que o referidos inibidores competitivos estabilizam referida serina protease para tensoativos aniônicos.

58. Composição de acordo com a reivindicação 55, em que a referida serina protease é uma variante autoliticamente estável.

59. Composição de limpeza compreendendo pelo menos 0,0001 por cento, em peso, da serina protease como definida na reivindicação 1, e opcionalmente, um ingrediente adjunto.

60. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 59, em que a referida composição compreende de cerca de 0,001 a cerca de 0,5 por cento, em peso, de referida serina protease.

61. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 59, em que a referida composição compreende de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 por cento, em peso, de referida serina protease.

62. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 61, em que a referida composição compreende um ingrediente adjunto.

63. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 59, referida composição compreendendo uma quantidade suficiente de um modificador de pH para prover referida composição com um pH simples de cerca de 3 a cerca de 5, referida composição sendo essencialmente livre de materiais que hidrolisam em um pH de cerca de 3 a cerca de 5.

64. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 63, em que os referidos materiais que hidrolisam compreendem um material tensoativo.

65. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 64, em que o referido material tensoativo compreende um tensoativo de alquil sulfato de sódio que compreende uma porção de óxido de etileno.

66. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 51, em que a referida composição de limpeza é selecionada dentre composições líquidas, em pó, granulares e em comprimidos.

67. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 51, em que a referida composição ainda compreende uma fonte de peróxido de hidrogênio.

68. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 67, em que a referida fonte de peróxido de hidrogênio compreende pelo menos um persal, em que referido persal é perborato de metal alcalino, percarbonato de metal alcalino, perfosfato de metal alcalino, persulfato de metal alcalino, ou uma mistura dos mesmos.

69. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 68, em que a referida composição ainda compreende um catalisador alvejante, ativador alvejante/ou misturas dos mesmos.

70. Método de limpeza, referido método compreendendo as etapas de: a) contatar uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com a composição de limpeza como definida na reivindicação 51; e b) opcionalmente lavar e/ou enxaguar referida superfície ou material.

71. Método de limpeza, referido método compreendendo as etapas de: a) contatar uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com a composição de limpeza como definida na reivindicação 59; e b) opcionalmente lavar e/ou enxaguar referida superfície ou material.

72. Método de limpeza, referido método compreendendo as etapas de: a) contatar uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com a composição de limpeza como definida na reivindicação 63; e b) opcionalmente lavar e/ou enxaguar referida superfície ou material.

73. Método de limpeza, referido método compreendendo as etapas de: a) contatar uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com a composição de limpeza como definida na reivindicação 64; e b) opcionalmente lavar e/ou enxaguar referida superfície ou material.

74. Método de limpeza, referido método compreendendo as etapas de: a) contatar uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com a composição de limpeza como definida na reivindicação 67; e opcionalmente lavar e/ou enxaguar referida superfície ou material.

75. Ração animal compreendendo uma variante de serina protease como definida na reivindicação 1.

76. Composição de processamento de têxtil ou couro compreendendo uma variante de serina protease como definida na reivindicação 1.