BRPI0711028A2 - "polinucleotÍdeo isolado, construto de dna recombinente, cÉlula, mÉtodo para transformar uma cÉlula, mÉtodo para produzir uma planta trasfornanda, sementes transgÊnicas, mÉtodo para a produÇço de Ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa em uma cÉlula vegetal, àleos ou subporudots, mÉtodo para produzir pelo menos um Ácido graxo poliinsaturado em uma cÉlula vegetla de uma semente oleaginosa, plantas e molÉcula de Ácido nuclÉico isolada" - Google Patents

Abstract

POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, CONSTRUÇçO DE DNA RECOMBINANTE, CÉLULA, MÉTODO PARA TRANSFORMAR UM CÉLULA,MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSFORMADA, SEMENTES TRANGENICAS, MÉTODO PARA A PRODUÇçO DE ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA, OLÉOS OU SUBPRODUTOS,MÉTODO PARA PRODUZIR PELO MENOS UM ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO, PLANTAS DE SEMENTE OLEAGINOSA, PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, PROGÊNIE DE PLANTAS E MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA. A presente invenção refere-se a fragmentos isolados de ácido nuclélco e construções recombinantes que compreendem tais fragmentos que codificam de saturase delta-5, junto com um método para produzir ácidos graxos poliinsaturados AGPs (polyunsaturated fatty acids - PUFAs) de cadeial onga que usam esta delta-5 desaturase em plantas e levedura oleaginosa. Em outras realizações, a presente invenção se refere também uma célula, método para transformar uma célula, método para produzir umaplanta transformada, sementes transgênicas, óleos ou subprodutos, plantas desemente oleaginosa, produtos alimentícios, progênies de plantas e molécula deácido nucléico isolada.

Description

"POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, CÉLULA, MÉTODO PARA TRANSFORMAR UM CÉLULA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSFORMADA, SEMENTES TRANGÊNICAS, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA, OLÉOS OU SUBPRODUTOS, MÉTODO PARA PRODUZIR PELO MENOS UM ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO, PLANTAS DE SEMENTE OLEAGINOSA, PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, PROGÊNIE DE PLANTAS E MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA"

Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório US 60/801.119, depositado em 17 de maio de 2006, o conteúdo inteiro do qual está aqui incorporado, a título de referência.

Campo da Invenção

Esta invenção é do campo da biotecnologia. Mais especificamente, esta invenção refere-se à identificação de fragmentos de ácido nucléico que codificam uma enzima desaturase de ácido graxo delta-5 e a utilização desta desaturase na fabricação de ácidos graxos poliinsaturados - AGPs (polyunsaturated fatty acids - PUFAs) de cadeia longa.

Antecedentes da Invenção

A importância dos AGPs é indiscutível. Por exemplo, certos AGPs são componentes biológicos importantes de células saudáveis e são reconhecidos como: ácidos graxos "essenciais" que não podem ser sintetizados de novo em mamíferos e, ao invés disto, precisam ser obtidos na dieta ou ser derivados por dessaturação adicional e alongamento do ácido linoléico (LA; 18:2 ômega-6) ou ácido a- linolênico (ALA; 18:3 ômega-3); constituintes de membranas plasmáticas de células, onde eles podem ser encontrados em formas como fosfolipídeos ou triacil gliceróis ; necessários para o desenvolvimento adequado (particularmente no desenvolvimento do cérebro de bebês) e para formação e reparo de tecidos; e, precursores de vários eicosanóides biologicamente ativos importantes em mamíferos (por exemplo, prostaciclinas, eicosanóides, leucotrienos, prostaglandinas). Adicionalmente, um alto consumo de AGPs ômega-3 de cadeia longa produz efeitos cardiovasculares protetores (Dyerberg, J. et al., Amer. J. Clin. Nutr., 28:958-966 (1975); Dyerberg, J. et al., Lancet, 2(8081): 117-119 (15 de julho de 1978); Shimokawa, H., WorldRev. Nutr. Diet, 88:100-108 (2001); Von Schacky, C. and Dyerberg, J., World Rev. Nutr. Diet, 88:90-99 (2001)). Ainda, numerosos estudos diferentes documentam benefícios de saúde numa ampla faixa obtidos pela administração de AGPs ômega-3 e/ou ômega-6 para uma variedade de sintomas e doenças (por exemplo, asma, psoríase, eczema, diabetes, câncer).

Uma variedade de hospedeiros diferentes incluindo plantas, algas, fungos e levedura estão sendo investigados como meios para produção comercial de AGP. A engenharia genética tem demonstrado que as habilidades naturais de certos hospedeiros (mesmo aqueles limitados nativamente à produção de ácido graxo LA e ALA) pode ser substancialmente alterada para resultar na produção de alto nível de vários AGPs ômega-3 ou ômega-6 de cadeia longa. Seja o resultado de habilidades naturais ou de tecnologia recombinante, a produção de ácido araquidônico (ARA; 20:4 ômega-6), ácido eicosapentaenóico (EPA; 20:5 ômega-3) e ácido docosaexaenóico (DHA; 22:6 ômega-3) pode requerer expressão de uma delta-5 desaturase.

A maioria das enzimas delta-5 desaturase identificadas até agora tem a habilidade primária de converter ácido diomo-gama-linolênico (DGLA; 20:3 ômega-6) em ARA, com atividade secundária de conversão de ácido eicosatetraenóico (ETA; 20:4 ômega-3) em EPA (onde DHA é, subseqüentemente, sintetizado de EPA, seguindo a reação com uma C20/22 elongase adicional e uma delta-4 desaturase). A delta-5 desaturase tem um papel em ambas as rotas delta-6 desaturase / delta-6 elongase (que é predominantemente encontrado em algas, musgos, fungos, nematóides e seres humanos, e que é caracterizada pela produção de ácido gama- linolênico (GLA; 18:3 ômega-6) ômega e/ou ácido estearidônico (STA; 18:4 ômega-3))ômega e as rotas delta-9 elongase / delta-8 desaturase (que opera em alguns organismos, como espécies euglenóides e que é caracterizada pela produção de ácido eicosadienóico (EDA; 20:2 ômega-6)ômega e/ou ácido eicosatrienóico (ETrA; 20:3 ômega-3)) ômega (figura 1).

Com base na função que as enzimas delta-5 desaturase desempenham na síntese de, por exemplo, ARA, EPA e DHA, tem sido feito um esforço considerável por várias fontes para identificar e caracterizar estas enzimas. Como resultado, numerosos delta-5 desaturases têm sido apresentados em ambas as literatura aberta (por exemplo, n° de acesso GenBank AF199596, n° AF226273, n° AF320509, n° AB072976, n° AF489588, n° AJ510244, n° AF419297, n° AF07879, n° AF067654 e n° AB022097) e literatura de patentes (por exemplo, patentes U.S. n° 5.972.664 e n° 6.075.183). Ainda, o pedido co-pendente de propriedade comum, que possui o pedido provisório n° 60/801.172 (depositado em 17 de maio de 2006), apresenta seqüências de aminoácidos e de ácido nucléicos para uma enzima delta-5 desaturase de Euglena gracilis, enquanto o pedido co- pendente de propriedade comum, que possui o pedido provisório n° 60/915.733 (BB1614) (depositado 3 de maio de 2007), apresenta seqüências de aminoácido e de ácidos nucléicos para uma enzima delta-5 desaturase de Euglena anabaena.

A presente invenção refere-se à identificação e isolamento de genes adicionais que codificam delta-5 desaturases de Peridinium sp. CCMP626 que seriam adequadas para expressão heteróloga em diversos organismos hospedeiros, para uso na produção de ácidos graxos de ômega- 3/ômega-6. Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado que compreende:

(a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade delta-5 desaturase, sendo que o polipeptídeo tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade de aminoácido quando comparada com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID n° 2, com base no método de alinhamento Clustal W;

(b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade delta-5 desaturase, sendo que a a seqüência de nucleotídeo tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade de seqüência, com base no método de alinhamento BLASTN, quando comparada com a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3;

(c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade delta-5 desaturase, sendo que a seqüência de nucleotídeos hibridiza, sob condições estringentes, com uma seqüência de nucleotídeos como estabelecida na SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3; ou

(d) um complemento da seqüência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c), sendo que o complemento e a seqüência de nucleotídeo consistem em quantidades iguais de nucleotídeos e são 100% complementares.

Em uma segunda realização, a invenção refere-se a uma construção de DNA recombinante que compreende quaisquer dos polinucleotídeos isolados da invenção, operacionalmente ligados a pelo menos uma seqüência reguladora.

Em uma terceira realização, a invenção refere-se a uma célula que compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante da invenção. Tais células podem ser células vegetais ou células de levedura. Em uma quarta realização, a invenção refere-se a um método para transformar uma célula, que compreende transformar uma célula com uma construção recombinante da invenção ou um polinucleotídeo isolado da invenção, e selecionar estas células transformadas com a construção recombinante ou o polinucleotídeo isolado.

Em uma quinta realização, a invenção refere-se a uma semente transgênica que compreende em seu genoma a construção recombinante da invenção ou uma semente transgênica obtida a partir de uma planta produzida pelo método da invenção. Também é de interesse o óleo ou subprodutos obtidos a partir de tais sementes transgênicas.

Em uma sexta realização, a invenção diz respeito a um método para a produção de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa em uma célula vegetal, que compreende:

(a) transformar uma célula com a construção recombinante da invenção, e

(b) selecionar as células transformadas que formam ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa.

Em uma sétima realização, a invenção refere-se a um método para produzir pelo menos um ácido graxo poliinsaturado na célula vegetal da semente oleaginosa, que compreende:

(a) transformar uma célula vegetal de semente oleaginosa com uma primeira construção de DNA recombinante, compreendendo um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um polipeptídeo delta-5 desaturase, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora e pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional, compreendendo um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo formado por uma delta-4 desaturase, uma delta-5 desaturase, uma delta-6 desaturase, uma delta-8 desaturase, uma delta-12 desaturase, uma delta-15 desaturase, uma delta-17 desaturase, uma delta-9 desaturase, uma delta-9 elongase, uma C14/16 elongase, uma C16/18 elongase, uma C18/20 elongase e uma C20/22 elongase;

(b) regenerar uma planta de semente oleaginosa a partir das células transformadas da etapa (a); e

(c) selecionar essas sementes obtidas a partir das plantas da etapa (b), com um nível alterado de ácidos graxos poliinsaturados, em comparação com o nível em sementes obtidas a partir de uma planta de semente oleaginosa não transformada.

Em uma oitava realização, a invenção diz respeito a uma planta de semente oleaginosa que compreende em seu genoma a construção recombinante da invenção. As plantas com sementes oleaginosas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, soja, espécies Brassica, girassol, milho, algodão, Iinho e cártamo.

Em uma nona realização, a invenção refere-se a uma planta de semente oleaginosa que compreende:

(a) uma primeira construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um polipeptídeo delta-5 desaturase, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora; e

(b) pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional que compreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo formado por uma delta-4 desaturase, uma delta-5 desaturase, uma delta-6 desaturase, uma delta-8 desaturase, uma delta-12 desaturase, uma delta-15 desaturase, uma delta-17 desaturase, uma delta-9 desaturase, uma delta-9 elongase, uma C14/16 elongase, uma C16/18 elongase, uma C18/20 elongase e uma C20/22 elongase;

Igualmente de interesse são as sementes transgênicas obtidas a partir de tais plantas de sementes oleaginosas, bem como o óleo ou subprodutos obtidos a partir dessas sementes transgênicas. Um subproduto preferencial é lecitina.

Em uma décima realização, a invenção refere-se a produtos alimentícios incorporando um óleo ou semente da invenção, ou produtos alimentícios que compreende um ingrediente derivado do processamento das sementes.

Em uma décima primeira realização, a invenção diz respeito à progênie de plantas obtidas a partir de uma planta produzida pelo método da invenção, ou uma planta de semente oleaginosa da invenção.

Breve Descrição das Figuras ε Listagem de Seqüências

A figura 1 ilustra a via biossintética de ácidos graxos ômega- 3/ômega-6.

A figura 2 mostra um cromatograma do perfil de lipídeo de um extrato celular de Peridinium sp. CCMP626, conforme descrito no exemplo 1.

A figura 3 mostra uma porção de um alinhamento entre proteínas delta-5 desaturase e proteínas delta-8 desaturase usando uma análise Clustal W (MegAlign™ programa de software DNASTAR).

A figura 4 representa graficamente a relação entre as SEQ ID: 1, 2, 4, 5, 6, 8 e 10, sendo que cada uma delas relaciona-se com a delta-5 desaturase 133 CCMP626 de Peridinium sp..

A figura 5A ilustra a estratégia de clonagem utilizada para a amplificação do gene delta-5 desaturase 136 CCMP626 (RD5) de Peridinium sp.. A figura 5B é um mapa do plasmídeo pZUF17, enquanto a figura 5C é um mapa do plasmídeo pDMW368.

A figura 6 fornece mapas de plasmídeo para: (A) pKUNF12T6E; (B) pRD5S; e (C) pZURD5S.

As figuras 7 A e 7B mostram uma comparação da seqüência de DNA do gene delta-5 desaturase CCMP626 de Peridinum sp. (designada como "RD5", SEQ ID n°1) com o códon otimizado do gene sintético para expressão em Yarrowia lipolytica (designado como "RD5S", SEQ ID n°3).

As figuras 8A e 8B mostram um alinhamento Clustal V (com os parâmetros pré-estabelecidos) de uma delta-8 desaturase de Pavlova lutheri (SEQ ID n° 18), uma delta-8 desaturase de Pavlova salina (SEQ ID n° 66), uma delta-8 desaturase de Euglena gracilis (SEQ ID n° 16), e duas diferentes desaturases de 1 o ácidos graxos delta-6 de Rhizopus stolonifer (SEQ ID n° 53 e 65).

A figura 9 fornece um mapa do plasmídeo para pY98.

A figura 10A fornece os perfis de ácidos graxos para Yarrowia lipolytica que expressa pY98 (SEQ ID n° 76; que compreende um gene delta-5 desaturase de Mortierella alpina designado como "MaD5") ou pDMW368 (SEQ ID n° 23; que compreende o gene delta-5 desaturase de Peridinium sp. CCMP626 designado como "RD5") e alimentados com diferentes substratos. A figura 10B fornece uma comparação entre a especificidade de substrato ômega-3 e ômega-6 de MaD5 versus RD5.

A figura 11 fornece mapas do plasmídeo para: (A) pKR916; (B) pKR1038 e (C) pKR328.

A figura 12A fornece os perfis médios de ácidos graxos durante dez eventos, apresentando maior atividade de delta-5 desaturase quando a enzima de Mortierella alpina (MaD5) é transformada em embriões de soja. A figura 12B fornece os perfis médios de ácidos graxos de dez eventos de maior atividade de delta-5 desaturase quando a enzima de Peridinium sp. CCMP626 (RD5) é transformada em embriões de soja. Os ácidos graxos são identificados como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oléico), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUP, ETA e EPA. Os ácidos graxos mencionados como "outros" incluem: 18:2 (5,9), GLA, STA1 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) ou 20:2 (8,11) e DPA. Cada um destes "outros" ácidos graxos está presentes em uma abundância relativa de menos de 3,0% do total de ácidos graxos. As composições de ácidos graxos de um embrião individual foram expressas em percentagem em peso (%) do total de ácidos graxos, e a composição média de ácidos graxos é uma média de seis embriões individuais para cada evento.

A figura 13 fornece a atividade da delta-5 desaturase para os substratos "corretos" (isto é, DGLA e ETA) versus os substratos "errados" (isto é, EDA e ERA). A atividade da delta-5 desaturase para os substratos "corretos" ("%delta-5 desaturase correta") está representada graficamente no eixo x, e a atividade da delta-5 desaturase para os substratos "errados" ("%delta-5 desaturase errada") está representada graficamente no eixo y para MaD5 (vide figura 12A) ou RD5 (vide figura 12B).

A invenção pode ser mais plenamente compreendida a partir da seguinte descrição detalhada e descrições de seqüências anexas, que fazem parte do presente pedido.

As seqüências a seguir obedecem a C.F.R. 37 § 1.821-1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequenee Rules") e são consistentes com World Intellectual Property Organization (WIPO) [Organização mundial de propriedade intelectual] padrão ST.25 (1998) e os requisitos para listagem de seqüência pelo EPO e PCT (regras 5.2 e 49.5 (a- bis), e seção 208 e anexo C das instruções administrativas). Os símbolos e formatos usados para os dados de seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos estão de acordo com as regras estabelecidas no 37 CFR § 1.822.

As SEQ ID n° 1 a 26, 50, 51, 53 a 56, 63 a 72 e 75 a 76 são ORFs que codificam genes ou proteínas (ou porções dos mesmos), ou plasmídeos, como identificado na tabela 1. Tabela 1

Sumário de Números de SEQ ID de Ácido Nucléico E Proteína

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As SEQ ID noS 27 a 29 correspondem a iniciadores AP, iniciador oligonucleotídeo Smart IV e iniciador CDSIII 5', respectivamente, usados para síntese de cDNA de Peridinium sp. CCMP626.

As SEQ ID noS 30 a 33 correspondem a iniciadores oligonucleotídeos degenerados 5-1 A, 5-1B, 5-1C e 5-1 D, respectivamente, que codificam a Região Conservada 1.

As SEQ ID noS 34 a 37 correspondem a iniciadores oligonucleotídeos degenerados 5-4AR, 5-4BR, 5-4CR e 5-4DR, respectivamente, que codificam Região Conservada 2.

As SEQ ID noS 38 a 42 correspondem a iniciadores ODMW520, ODMW521, DNR CDS 5', ODMW541 e ODMW542, respectivamente, usados para 5' RACE.

As SEQ ID noS 43 a 45 correspondem a iniciadores ODMW523, AUAP e ODMW524, respectivamente, usados para 3' RACE.

As SEQ ID noS 46 a 49 correspondem a iniciadores YL807, YL810, YL808 e YL809, respectivamente, usados para amplificação do cDNA de comprimento total de RD5.

A SEQ ID n° 52 corresponde a iniciador 17, usado para o seqüenciamento da biblioteca de cDNA de Pavlova lutheri (CCMP459).

As SEQ ID noS 57 e 58 correspondem a iniciadores SeqE e SeqW, respectivamente, usados para seqüenciamento de clones de Pavlova Iutheri (CCMP459).

As SEQ ID noS 59 e 60 correspondem ao iniciador universal AP1 e iniciador GSP PvDES, respectivamente, usados para amplificação de DNA genômico de Pavlova lutheri (CCMP459).

As SEQ ID noS 61 e 62 correspondem aos iniciadores M13-28Rev e PavDES seq, respectivamente, usados para seqüenciamento de insertos genômicos de Pavlova lutheri (CCMP459).

As SEQ ID noS 73 e 74 são iniciadores GPDsenso e GPDantisenso, respectivamente, usados para amplificar o promotor GPD.

As SEQ ID noS 79 e 80 correspondem a iniciadores oEugEL1-1 e oEugEL1-2, respectivamente, usado para amplificar uma delta-9 elongase de Euglena gracilis (EgD9e).

Descrição Detalhada da Invenção

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações citadas na presente invenção estão incorporados, em sua totalidade, a título de referência. Estas especificamente incluem os seguintes pedidos co-pendentes do cessionário requerente: Patente U.S. n° 7.125.672, Patente U.S. n° 7.189.559, Patente U.S. n° 7.192.762, Patente U.S. n° 7.198.937, Patente U.S. n° 7.202.356, pedidos de Patente U.S. n° 10/840.579 e n° 10/840.325 (depositados em 6 de maio de 2004), pedido de Patente U.S. n° 10/869.630 (depositado em 16 de junho de 2004), pedido de Patente U.S. n° 10/882.760 (depositado em 1 de julho de 2004), pedidos de Patente U.S. n° 10/985.254 e n° 10/985.691 (depositados em 10 de novembro de 2004), pedido de Patente U.S. n° 11/024.544 (depositado em 29 de dezembro de 2004), pedido de Patente U.S. n° 11/166.993 (depositado em 24 de junho de 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/183.664 (depositado em 8 de julho de 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/185.301 (depositado em 20 de julho de 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/190.750 (depositado em 27 de julho de 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/198.975 (depositado em 8 de agosto de 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/225.354 (depositado em 13 de setembro de 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/253.882 (depositado em 19 de outubro de 2005), pedidos de Patente U.S. n° 11/264.784 e n° 11/264.737 (depositados em 1 de novembro de 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/265.761 (depositado em 2 de novembro de 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/737.772 (depositado em de abril de 2007), pedido de Patente U.S. n° 11/787.772 (depositado em 17 de abril de 2007), pedido de Patente U.S. n° 11/740.298 (depositado em 26 de abril de 2007), pedidos de Patente U.S. n° 60/801.172 e n° 60/801.119 (depositados em 17 de maio de 2006), pedido de Patente U.S. n° 60/853.563 (depositado 23 de outubro de 2006), pedido de Patente U.S. n° 60/855.177 (depositado em 30 de outubro de 2006), pedidos de Patente U.S. n° 11/601.563 e n° 11/601.564 (depositados em 16 de novembro de 2006), pedido de Patente U.S. n° 11/635.258 (depositado 7 de dezembro de 2006), pedido de Patente U.S. n° 11/613.420 (depositado em 20 de dezembro de 2006), pedido de Patente U.S. n° 60/909.790 (depositado em 3 de abril 2007), pedido de Patente U.S. n° 60/911.925 (depositado em 16 de abril de 2007), pedido de Patente U.S. n° 60/910.831 (depositado em 10 de abril de 2007) e pedido de Patente U.S. n° 60/915.733 (BB1614) (depositado em 3 de maio de 2007). Isto também inclui os seguintes pedidos co-pendentes do cessionário requerente: Publicação PCT n0 US 2004/0172682, com respeito à produção de AGPs em plantas; e, Patente U.S. n° 7.129.089, com respeito aos promotores anexinas e seus usos na expressão de transgenes em plantas.

Para uso na presente invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência plural a menos que o contexto claramente indique o contrário. Assim, por exemplo, a referência "uma planta" inclui uma pluralidade de tais plantas, a referência "uma célula" inclui uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidas pelos técnicos no assunto, e assim por diante.

De acordo com a presente invenção, os requerentes identificaram uma nova enzima delta-5 desaturase de Peridinium sp. CCMP626, e gene que codifica a mesma, que pode ser usado para a manipulação de vias bioquímicas para a produção de AGPs saudáveis. Dessa forma, a presente invenção encontra muitas aplicações.

Os AGPs, ou seus derivados, criados pela metodologia apresentada neste documento podem ser usados como substitutos alimentares, ou suplementos, particularmente fórmulas para bebês, para pacientes submetidos à alimentação intravenosa, ou para prevenir ou tratar desnutrição. Alternativamente, os AGPs purificados (ou seus derivados) podem ser incorporados em óleos de cozinha, gorduras e margarinas formuladas de modo que, em condições normais de uso, o destinatário receba a quantia desejada para suplementação alimentar. Os AGPs podem também ser incorporados em fórmulas para bebês, suplementos nutricionais ou outros produtos alimentícios, e pode encontrar uso como antiinflamatório ou agentes redutores de colesterol. Opcionalmente, as composições podem ser usadas para fins farmacêuticos (humanos ou veterinários).

A suplementação de seres humanos ou animais com AGPs produzido por meios recombinantes pode resultar no aumento dos níveis de AGPs adicionado, bem como sua progênie metabólica. Por exemplo, o tratamento com EPA pode resultar não só no aumento dos níveis de EPA, mas também dos produtos a jusante da EPA, como eicosanóides (ou seja, prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanas). Os mecanismos reguladores complexos podem tornar desejável a combinação de várias AGPs, ou adicionar vários conjugados de AGPs, a fim de prevenir, controlar ou superar tais mecanismos para atingir os níveis desejados de AGPs específicos em um indivíduo.

Definições

Nesta descrição, uma série de termos e abreviações é usada. As definições são fornecidas a seguir.

"Estrutura de leitura aberta" é abreviada como ORF [Open reading frame].

"Reação em cadeia da polimerase" é abreviado como PCR.

"Coleção Americana de Cultura de Tipos - American Type Culture Collection" é abreviado como ATCC.

"Ácido(s) graxo(s) poliinsaturado(s)" é (são) abreviado(s) como AGP(s).

"Triacilgliceróis" são abreviados como TAGs.

O termo "invenção" ou "presente invenção" para uso no presente, não pretende se referir a uma realização específica da invenção, mas abrange qualquer e todas as realizações da invenção conforme descrito nas reivindicações e no relatório descritivo.

O termo "ácidos graxos" refere-se a ácidos alifáticos de cadeias longas (ácidos alcanóicos) de comprimentos de cadeia que varia de cerca de C12 a C22 (embora ácidos de comprimento de cadeia mais longo e mais curto sejam conhecidos). Os comprimentos de cadeia predominantes estão entre C16 e C22. A estrutura de um ácido graxo é representada por um simples sistema de notação "X: Y", onde X é o número total de átomos de carbono (C) no ácido graxo particular, e Y é o número de ligações duplas. Detalhes adicionais relativos à diferenciação entre "ácidos graxos saturados" e "á cidos graxos insaturados", "ácidos graxos monoinsaturados" e "ácidos graxos poliinsaturados" (ou "AGPs"), e "ácidos graxos ômega-6" (ômega-6 ou n-6) e "ácidos graxos ômega-3" (ômega-3 ou /7-3), são fornecidos na Patente U.S. Publicação N 0 2005/0136519.

Os ácidos graxos são descritos a seguir por um simples sistema de notação "X: Y", sendo que X é o número de átomos de carbono (C) no ácido graxo particular, e Y é o número de ligações duplas O número que segue a designação do ácido graxo indica a posição da dupla ligação a partir da extremidade carboxila do ácido graxo com o sufixo "c" para a configuração eis da ligação dupla (por exemplo, o ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oléico (18:1, 9c), ácido petroselínico (18:1, 6c), LA (18:2, 9c, 12c), GLA (18:3, 6c, 9c, 12c) e ALA (18:3, 9c, 12c, 15c)). Salvo indicação contrária, 18:1, 18:2 e 18:3 referem-se a ácidos graxos oléico, LA e ALA, respectivamente. Se não escrito especificamente de outro modo, presume-se que ligações duplas são da configuração c/s. Por exemplo, presume-se que as ligações duplas em 18:2 (9,12) estão na configuração eis.

A nomenclatura usada para descrever AGPs na presente descrição é mostrada a seguir na tabela 2. Na coluna intitulada "Notação abreviada", o sistema de referência ômega é usado para indicar o número de carbonos, o número de ligações duplas e a posição da dupla ligação mais próxima do carbono ômega, contando a partir do carbono ômega (que é numerado 1 com esse propósito). O restante da tabela resume os nomes comuns de ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 e seus precursores, as abreviaturas que serão usadas em todo relatório descritivo e o nome de cada composto químico.

Tabela 2

Nomenclatura de Acidos Graxos Poliinsaturados E Precursores

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Os termos "triacilglicerol", "óleo" e "TAGs" referem-se aos lipídeos neutros compostos por três resíduos de acilas graxas esterificadas com uma molécula de glicerol (e esses termos serão usados de maneira intercambiável em toda a descrição da presente invenção). Tais óleos podem conter AGPs de cadeia longa, bem como ácidos graxos saturados e insaturados mais curtos, e ácidos graxos saturados de cadeia mais longa. Dessa forma, "biossíntese de óleo" refere-se genericamente a síntese de TAGs na célula.

"Percentual (%) de AGPs nos lipídeos totais e frações de óleo" referem-se à porcentagem de AGPs em relação ao total de ácidos graxos nessas frações. O termo "fração de lipídeos totais" ou "fração lipídica" se referem à soma de todos os lipídeos (ou seja, neutro e polar), dentro de um organismo oleaginoso, dessa forma, incluindo os lipídeos que estão localizados na fração fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) e fração triacilglicerol (TAG ou óleo). Entretanto, os termos "lipídeo" e "óleo" serão usados de maneira intercambiável por todo o relatório descritivo.

Uma via metabólica, ou via biossintética, no sentido bioquímico pode ser considerada como uma série de reações químicas que ocorrem dentro de uma célula, catalisadas por enzimas, para atingir tanto a formação de um produto metabólico para ser usado ou armazenado pela célula, quanto o início de outra via metabólica (então chamada de um fluxo gerador de etapa). Muitas destas vias são elaboradas, e envolvem uma modificação passo a passo da substância inicial para moldá-la em um produto com a exata estrutura química desejada.

O termo "via biossintética de AGP" refere-se a um processo metabólico que converte ácido oléico para LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA e DHA. Este processo é bem descrito na literatura (por exemplo, vide Publicação PCT n0 WO 2006/052870). Resumidamente, este processo envolve o alongamento da cadeia de carbono através da adição de átomos de carbono e dessaturação da molécula através da adição de ligações duplas, através de uma série de enzimas para dessaturação especial e alongamento (ou seja, "enzimas da via biossintética de AGP") presentes na membrana do retículo endoplasmático. Mais especificamente, as "enzimas da via biossintética de AGP" referem-se a qualquer uma das seguintes enzimas (e genes que codificam estas ditas enzimas), associadas com a biossíntese de uma AGP, incluindo: uma delta-4 desaturase, uma delta-5 desaturase, uma delta-6 desaturase, uma delta-12 desaturase, uma delta-15 desaturase, uma delta-17 desaturase, uma delta-9 desaturase, uma delta-8 desaturase, uma delta-9 elongase, uma C14/16 elongase, uma C16/ie elongase, uma C18/20 elongase e/ou uma C20/22 elongase. O termo "via biossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6" refere-se a um conjunto de genes que, quando expressos sob as condições adequadas, codificam enzimas que catalisam a produção de um ou ambos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6. Tipicamente, os genes envolvidos na via biossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6 codificam enzimas da via biossintética de AGP. Uma via representativa é ilustrada na figura 1, que fornece a conversão do ácido mirístico, através de vários intermediários, para DHA1 o que demonstra como ambos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 podem ser produzidos a partir de uma fonte comum. A via é naturalmente dividida em duas porções, onde uma porção irá gerar ácidos graxos ômega-3 e a outra porção somente ácidos graxos ômega-6. Essa porção que apenas produz ácidos graxos ômega-3 será aqui referida como a via biossintética de ácido graxo ômega-3, enquanto que a porção que gera apenas ácidos graxos ômega-6 serão mencionados neste documento como a via biossintética de ácido graxo ômega-6.

O termo "funcional", como usado no presente, com a via biossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6, significa que alguns (ou todos) os genes na via expressam enzimas ativas, resultando em catálise in vivo ou conversão de substrato. Deve ser entendido que "via biossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6" ou "via biossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6 funcionais" não implica que todos os genes listados no parágrafo acima são necessários, já que uma série de produtos de ácidos graxos irá exigir apenas a expressão de um subconjunto dos genes desta via.

O termo "via delta-6 desaturase / delta-6 elongase" irá referir-se a uma via biossintética de AGP que inclui, minimamente, pelo menos uma delta-6 desaturase e pelo menos uma C18/20 elongase, permitindo assim a biossíntese de DGLA e/ou ETA, a partir de LA e ALA, respectivamente, com GLA e/ou STA como ácidos graxos intermediários. Com expressão de outras desaturases e elongases, ARA, EPA, DPA e DHA podem também ser sintetizados.

O termo "via delta-9 elongase / delta-8 desaturase" irá referir-se a uma via biossintética de AGP que inclui minimamente pelo menos uma delta-9 elongase e pelo menos uma delta-8 desaturase, permitindo assim a biossintese de DGLA e/ou ETA a partir de LA e ALA, respectivamente, com EDA e/ou ETrA como ácidos graxos intermediários. Com expressão de outras desaturases e elongases, ARA, EPA, DPA e DHA podem também ser sintetizados.

O termo "intermediário de ácidos graxos" refere-se a qualquer ácido graxo produzido em uma via metabólica de ácido graxo, que pode ainda ser convertido para um produto desejado de ácido graxo nesta via pela ação de outras enzimas da via metabólica. Por exemplo, quando EPA é produzido usando a via delta-9 elongase / delta-8 desaturase, EDA, ETrA, DGLA, ETA e ARA podem ser produzidos e são considerados "ácidos graxos intermediários", desde que estes ácidos graxos podem ser ainda convertidos para EPA através da ação de outras enzimas da via metabólica.

O termo "ácido graxo subproduto" refere-se a qualquer ácido graxo produzido em uma via metabólica de ácido graxo que não seja o produto desejado de ácido graxo nesta via, nem um "ácido graxo intermediário" da via metabólica. Por exemplo, quando EPA é produzida usando a via delta-9 elongase / delta-8 desaturase, ácido esciadônico (SIC) e ácido juniperônico (JUP) também podem ser produzidos pela ação de uma delta- 5 desaturase, em qualquer um EDA ou ETrA, respectivamente. Eles são considerados como "ácidos graxos subprodutos", já que nenhum deles pode ser ainda convertido para EPA pela ação de outras enzimas da via metabólica.

O termo "desaturase" refere-se a um polipeptídeo que pode desaturar, ou seja, introduzir uma ligação dupla, em um ou mais ácidos graxos para produzir um ácido graxo ou precursor de interesse. Apesar de usar o sistema de referência ômega em todo relatório descritivo ao se referir a determinados ácidos graxos, é mais conveniente para indicar a atividade de uma desaturase pela contagem a partir da extremidade carboxila do substrato usando o sistema delta. De particular interesse neste documento são as delta-5 desaturases que catalisam a conversão de DGLA para ARA e/ou de ETA para EPA. Outras desaturases incluem: 1.) delta-17 desaturases que desaturam um ácido graxo entre o 17° e 18° átomo de carbono, numerados a partir da extremidade terminal carboxila da molécula e que, por exemplo, catalisam a conversão da ARA para EPA e/ou DGLA para ETA; 2.) delta-6 desaturases que catalisam a conversão de LA para GLA e/ou ALA para STA; 3.) delta-12 desaturases que catalisam a conversão de ácido oléico para LA; 4.) delta-15 desaturases que catalisam a conversão de LA para ALA e/ou GLA para STA; 5.) delta-4 desaturases que catalisam a conversão de DPA para DHA; 6.) delta- 8 desaturases que catalisam a conversão de EDA para DGLA e/ou ETrA para ETA; e, 7.) delta-9 desaturases que catalisam a conversão de palmitato para ácido palmitoléico (16:1) e/ou estearato para ácido oléico. No estado da técnica, as delta-15 e delta-17 desaturases são também ocasionalmente referidas como " ômega-3 desaturases ", " w-3 desaturases ", e/ou" ômega-3 desaturases ", com base em sua capacidade de converter ácidos graxos ômega-6 em suas respectivas contrapartidas ômega-3 (por exemplo, a conversão de LA em ALA e ARA em EPA, respectivamente). Em algumas realizações, é altamente desejável que se determine empiricamente a especificidade de uma determinada desaturase de ácido graxo pela transformação de um hospedeiro adequado com o gene para a desaturase de ácido graxo, e determinação de seus efeitos sobre o perfil dos ácidos graxos do hospedeiro.

O termo " delta-5 desaturase" refere-se a uma enzima que desatura um ácido graxo entre o quinto e sexto átomo de carbono, numerados a partir da carboxila da extremidade terminal da molécula. Preferencialmente, uma delta-5 desaturase converte ácido diomo-gama linolênico [20:3, DGLA] para ácido araquidônico [20:4, ARA] ou converte ácido eicosatetraenóico [20:4, ETA] para eicosapentaenóico [20:5, EPA].

Para os fins da presente invenção, o termo "RD5" refere-se a uma enzima delta-5 desaturase (SEQ ID n° 2) isolada de Peridinium s p. CCMP626, codificada pela SEQ ID n° 1 da presente invenção. Semelhantemente, o termo "RD5S" refere-se à delta-5 desaturase sintética derivada de Peridinium sp. CCMP626 que é códon-otimizada para expressão em Yarrowia lipolytica (isto é, SEQ ID n° 3 e 2).

Os termos "eficiência da conversão" e "porcentagem de conversão do substrato" referem-se à eficiência com que uma enzima específica (por exemplo, uma desaturase) pode converter substrato em produto. A eficiência da conversão é medida de acordo com a fórmula a seguir: ([produto]/[substrato + produto])* 100, onde 'produto' inclui o produto imediato e todos os produtos na via derivados dele.

O termo "elongase" refere-se a um polipeptídeo que pode alongar uma cadeia de carbono de ácido graxo para produzir um ácido que é 2 carbonos mais longo do que o substrato de ácido graxo em contato com a elongase. Este processo de alongamento ocorre em um mecanismo multi-etapa, em associação com a sintase do ácido graxo, conforme descrito na Publicação de Patente U.S. n° 2005/0132442 e Publicação PCT n0 WO 2005/047480. Exemplos de reações catalisadas por sistemas elongases incluem a conversão de GLA para DGLA STA para ETA e EPA para DPA. Em geral, a seletividade de substrato de elongases é um pouco ampla, mas secretada pelas cadeias de comprimento e grau e tipo de insaturação. Por exemplo, uma Cum elongase irá utilizar um substrato C14 (por exemplo, ácido mirístico), uma C16/18 elongase irá utilizar um substrato C16 (por exemplo, palmitato), uma C18/20 elongase (também conhecida como delta-6 elongase já que os termos podem ser utilizados de maneira intercambiável) irá utilizar um substrato C18 (por exemplo, GLA1 STA) e uma C 20/22 elongase irá utilizar um substrato C20 (por exemplo, EPA). Do mesmo modo, uma delta-9 elongase é capaz de catalisar a conversão de LA e ALA para EDA e ETrA, respectivamente. É importante notar que algumas elongases têm ampla especificidade e, portanto, uma única enzima pode ser capaz de catalisar reações de elongase diversas (por exemplo, a mesma pode agir como uma C16/18 elongase e uma C18/20 elongase).

O termo "oleaginoso" refere-se àqueles organismos que tendem a estocar sua fonte de energia sob a forma de lipídeo (Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2nd Ed., Plenum, 1980). O termo "levedura oleaginosa" refere-se àqueles microorganismos classificados como leveduras que podem produzir óleo. Geralmente, o óleo celular ou conteúdo TAG de microorganismos oleaginosos seguem uma curva sigmóide, onde a concentração de lipídeos aumenta até atingir um máximo na fase logarítmica tardia ou no começo da fase estacionária de crescimento e, em seguida, diminui gradualmente durante as fases estacionárias tardias e morte (Yongmanitchai e Ward, Appl. Environ. Microbiol., 57:419-25 (1991)). É comum para microorganismos oleaginosos acumular um excesso de cerca de 25% de seu peso celular seco como óleo. Exemplos de levedura oleaginosa incluem, mas não estão de limitados aos seguintes gêneros: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporídium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.

O termo "substituição conservativa de aminoácido" refere-se a uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma determinada proteína com outro aminoácido, sem alterar a natureza química ou funcional daquela proteína. Por exemplo, é bem conhecido no estado da técnica que alterações em um gene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinado sítio (mas isto não afeta as propriedades estruturais e funcionais da proteína dobrada, codificada) são comuns. Para os propósitos da presente invenção, "substituições conservativas de aminoácidos" são definidas como trocas dentro de um dos cinco grupos a seguir:

1. Resíduos alifáticos pequenos, não-polar ou levemente polar: Ala [A], Ser [S], Thr [T] (Pro [P], Gly [G]);

2. Resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas: Asp [D], Asn [N], Glu [E], Gln [Q];

3. Resíduos polares, carregados positivamente: His [H], Arg [R], Lys [K];

4. Resíduos alifáticos grandes, não-polares: Met [M], Leu [L], Ile [I], Val [V] (Cys [C]); e,

5. Resíduos aromáticos grandes: Phe [F], Tyr [Y], Trp [W].

As substituições conservativas de aminoácidos geralmente mantêm: 1) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substituição; 2) a carga ou capacidade hidrofóbica da molécula no sítio desejado; ou 3) o volume da cadeia lateral. Adicionalmente, em muitos casos, não se espera que alterações das porções N-terminal e C-terminal das moléculas da proteína alterem a atividade da proteína.

Para uso na presente invenção, "ácido nucléico" significa um polinucleotídeo e inclui polímeros de bases de desoxirribonucleotídeo ou de ribonucleotídeo de fita simples ou dupla. Os ácidos nucléicos podem também incluir fragmentos e nucleotídeos modificados. Dessa forma, os termos "polinucleotídeo", "seqüência de ácido nucléico", "seqüência de nucleotídeos" ou "fragmento de ácido nucléico" são usados de maneira intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita sim pies ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleotídeo sintéticas, não-naturais ou alteradas. Os nucleotídeos (normalmente encontrados em sua forma 5'- monofosfato) são chamados pela designação de uma única letra como segue: "A" para a adenilato ou deoxiadenilato (por RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou deosicitidilato, "G" para o guanilato ou deoxiguanilato,"U" para uridilato, "Τ" para deositimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou Τ), "K" para G ou Τ, Ή" para A ou C ou Τ, T para inosina e "N" para qualquer nucleotídeo.

Os termos "subfragmento que são funcionalmente equivalentes" e "subfragmentos funcionalmente equivalentes" são usados aqui de maneira intercambiável. Esses termos referem-se a uma porção ou subseqüência de um fragmento isolado de ácidos nucléicos em que a capacidade de alterar expressão gênica ou produzir um determinado fenótipo é retida se o fragmento ou subfragmento codifica uma enzima ativa ou não. Por exemplo, o fragmento ou subfragmento podem ser usados no design dos genes quiméricos para produzir o fenótipo desejado na planta transformada. Os genes quiméricos podem ser projetados para uso na supressão ao ligar um fragmento ou subfragmento do ácido nucléico, codificando ou não uma enzima ativa, na orientação senso ou antisenso relativa à seqüência promotora da planta.

O termo "domínio conservado" ou "motivo", significa um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma seqüência alinhada de proteínas evolutivamente relacionadas. Enquanto aminoácidos em outras posições podem variar entre as proteínas homólogas, aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são essenciais na estrutura, estabilidade, ou na atividade de uma proteína. Porque eles são identificados pelo seu alto grau de conservação nas seqüências alinhadas de uma família de proteínas homólogas, eles podem ser usados como identificadores, ou "assinaturas", para determinar se uma proteína com uma nova seqüência determinada pertence a uma família protéica previamente identificada.

Os termos "homologia", "homólogo", "substancialmente similar" e "substancialmente correspondente" são usados de maneira intercambiável na presente invenção. Eles se referem a fragmentos de ácidos nucléicos em que mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a habilidade do fragmento de ácido nucléico de mediar expressão gênica ou produzir um determinado fenótipo. Estes termos também se referem às alterações dos fragmentos do ácido nucléico da presente invenção, como a supressão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alterem substancialmente as propriedades funcionais do fragmento resultante de ácido nucléico em relação ao fragmento inicial sem modificação. É, portanto, entendido, que os técnicos no assunto irão apreciar que a invenção abrange mais do que as seqüências exemplificadoras específicas.

Além disso, o técnico no assunto reconhece que as seqüências de ácidos nucléicos substancialmente similares abrangidas pela invenção também são definidas pela sua capacidade de hibridizar (sob condições moderadamente estrigentes, por exemplo, 0,5 X SSC1 0,1% SDS, 60°C) seqüências exemplificadas aqui, ou para qualquer porção das seqüências de nucleotídeos apresentadas aqui e que são funcionalmente equivalentes a qualquer uma das seqüências de ácidos nucléicos apresentadas neste documento. As condições de estringência podem ser ajustadas para testar por fragmentos moderadamente semelhantes, como seqüências homólogas de organismos aparentados de forma distante, e até por fragmentos muito semelhantes, como os genes que duplicam enzimas funcionais de organismos estreitamente aparentados. As lavagens pós hibridização determinam as condições de estringência.

O termo "hibridizar seletivamente" inclui referências à hibridização, sob severas condições de hibridização, de uma seqüência de ácido nucléico para uma determinada seqüência alvo de ácido nucléico com um maior grau detectável (por exemplo, pelo menos 2 vezes a mais que a base "2-fold over background") do que sua hibridização de seqüências de ácidos nucléicos que não são alvo e para a exclusão substancial dos ácidos nucléicos não-alvo. A hibridização seletiva de seqüências tipicamente tem cerca de pelo menos 80% de identidade, ou 90% de identidade, ou até e incluindo 100% de identidade, de seqüências (isto é, totalmente complementares) de uma com a outra.

Os termos "condições estrigentes" ou "condições estrigentes de hibridização" incluem referência às condições sob as quais uma sonda irá hibridizar seletivamente para sua seqüência-alvo. As condições estrigentes são dependentes da seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Ao controlar a estringência da hibridização e/ou das condições de lavagem, as seqüências-alvo que são 100% complementares podem ser identificadas para a sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma falta de correlação nas seqüências de modo que graus mais baixos de similaridade são detectados (sondagem heteróloga). Genericamente, uma sonda é menos que cerca de 1000 nucleotídeos em comprimento, opcionalmente menos que 500 nucleotídeos em comprimento.

Tipicamente, as condições estrigentes serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íons Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M concentração de íons Na (ou outros sais), de pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e, pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, mais que 50 nucleotídeos). As condições estrigentes podem também ser conseguidas com a adição de agentes desestabilizantes como formamida. As condições de baixa estringência exemplificadoras incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCI 1 M, SDS 1% (sulfato de sódio dodecila) a 37°C, e uma lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCI 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55°C. As condições de estringência moderada exemplificadoras incluem hibridização com formamida de 40 a 45%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,5X SSC de 55 a 60°C. As condições de alta estringência exemplificadoras incluem hibridização com formamida a 50%, NaCl 1 Μ, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,1X SSC de 60 a 65°C.

A especificidade é tipicamente a função de lavagens de pós- hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução final de lavagem. Para híbridos de DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138:267-284 (1984): Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüência- alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente compatível. A Tm é reduzida por cerca de 1°C para cada 1% de falta de correlação; dessa forma, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustados para hibridizar para seqüências da identidade desejada. Por exemplo, se forem procuradas seqüências com >90% de identidade, a Tm pode ser diminuída em 10°C. Geralmente, as condições estrigentes são selecionadas para ter cerca de 5°C menos que o ponto de fusão térmico (Tm) da seqüência específica e de seu complemento numa força iônica e pH definidos. Entretanto, condições severamente estrigentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C menos que o ponto de fusão térmico (Tm); condições moderadamente estrigentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C menos que o ponto de fusão térmico (Tm); condições pouco estrigentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14 15 ou 20°C menos que o ponto de fusão térmico (Tm); Usando a equação, hibridização e composições de lavagem, e Tm d esejada, aqueles de habilidade comum entenderão que as variações na estrigência da hibridação e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o desejado grau de falta de correlação resulta em uma Tm de menos de 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida) é preferível aumentar a concentração SSC para que uma temperatura mais elevada possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácido nucléicos é encontrado em Tijssen1 Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing e Wiley-Interscience, New York (1995). A hibridização e/ou as condições de lavagem podem ser aplicadas por pelo menos 10, 30, 60, 90,120 ou 240 minutos.

Uma "parte substancial" de um aminoácido ou seqüência de nucleotídeos é a parte que compreende o suficiente da seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo ou da seqüência de nucleotídeos de um gene para identificar putativamente que polipeptídeo ou gene, ou por avaliação manual da seqüência por um técnico no assunto, ou pela comparação e identificação seqüencial automática por computador, utilizando algoritmos como BLAST (Altschul, SF, et al., J. Mol. Altschul, S. F., etal., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)). Em geral, uma seqüência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleotídeos é necessária a fim de identificar putativamente uma seqüência de polipeptídeos ou de ácido nucléico como homóloga a uma proteína ou um gene conhecido. Além disso, no que diz respeito às seqüências de nucleotídeos, sondas de oligonucleotídeo de genes específicos, que compreendem de 20 a 30 nucleotídeos contíguos, podem ser utilizadas nos métodos de identificação dependentes de identificação de gene da seqüência (por exemplo, "Southern hybridization") e de isolamento (por exemplo, hibridização "in situ" de colônias bacterianas ou placas de bacteriófagos). Adicionalmente, oligonucleotídeos curtos de 12 a15 bases podem ser utilizados como iniciadores da amplificação por PCR, a fim de obter um determinado fragmento do ácido nucléico que compreende os iniciadores. Conseqüentemente, uma "parte substancial" de uma seqüência de nucleotídeos compreende bastante da seqüência para identificar especificamente e/ou isolar um fragmento do ácido nucléico que compreende a seqüência. O presente relatório descritivo ensina a completa seqüência de aminoácidos e nucleotídeos que codificam particulares proteínas algáceas. O técnico no assunto, tendo o benefício das seqüências como aqui relatadas, pode agora usar a totalidade, ou uma parte substancial, das seqüências divulgadas, para fins conhecidos pelos técnicos no assunto. Conseqüentemente, a presente invenção compreende as completas seqüências, conforme relatado pela listagem de seqüências anexa, bem como porções significativas dessas seqüências, como definido acima.

O termo "complementar" é utilizado para descrever a relação entre as bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar uma à outra. Por exemplo, no que diz respeito ao DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementar à guanina. Conseqüentemente, a invenção neste documento também inclui fragmentos isolados de ácidos nucléicos que são complementares às seqüências completas como relatado na lista de seqüências anexa, bem como as seqüências de ácidos nucléicos substancialmente semelhantes.

Os termos "homologia" e "homólogo" são usados de maneira intercambiável neste documento. Eles se referem a fragmentos de ácidos nucléicos em que mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a habilidade do fragmento de ácido nucléico de mediar expressão gênica ou produzir um determinado fenótipo. Estes termos também se referem às alterações dos fragmentos do ácido nucléico da presente invenção, como a supressão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alterem substancialmente as propriedades funcionais do fragmento resultante de ácido nucléico em relação ao fragmento inicial sem modificação. É, portanto, entendido que os técnicos no assunto são capazes de apreciar que a invenção abrange mais do que as seqüências exemplificadoras específicas.

Além disso, o técnico no assunto reconhece que as seqüências de ácidos nucléicos homólogas abrangidas por essa invenção também são definidas pela sua capacidade de hibridizar sob condições moderadamente severas (por exemplo, 0,5 X SSC, 0,1% SDS, 60°C) com as seqüências exemplificadas aqui, ou para qualquer parte do seqüências de nucleotídeos apresentadas aqui, e que são funcionalmente equivalentes a qualquer uma das seqüências de ácidos nucléicos apresentadas no presente.

"Degeneração do códon" refere-se à natureza no código genético que permite a variação da seqüência de nucleotídeos sem afetar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Conseqüentemente, a invenção refere-se a qualquer fragmento de ácido nucléico que codifica a totalidade ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos que codifica o polipeptídeo algáceo, conforme estipulado na SEQ ID n° 2. O técnico no assunto está bem consciente da "preferência do códon (codon-bias)" exibida por uma determinada célula hospedeira, no uso de códons de nucleotídeos para especificar um determinado aminoácido. Por isso, quando sintetizado um gene para a melhoria da expressão gênica em uma célula hospedeira, é desejável que o design do gene seja de tal forma que a sua freqüência de uso do códon seja próxima da freqüência preferencial de uso do códon da célula hospedeira.

"Quimicamente sintetizado", relacionado à seqüência de DNA, significa que os nucleotídeos componentes foram montados in vitro. A síntese química manual de DNA pode ser realizada usando-se procedimentos bem estabelecidos, ou síntese química automatizada, pode ser realizada usando-se uma da série de máquinas comercialmente disponíveis. "Genes sintéticos" podem ser montados a partir de estruturas básicas de oligonucleotídeos que são quimicamente sintetizados usando procedimentos conhecidos pelos técnicos no assunto. Estas estruturas básicas são ligadas e aneladas" para formar segmentos de gene que são então enzimaticamente montados para construir o gene inteiro. Conseqüentemente, os genes podem ser adaptados para otimizar a expressão gênica baseada na otimização da seqüência nucleotídica para refletir a preferência do códon da célula hospedeira. O técnico no assunto aprecia a possibilidade de expressão gênica bem sucedida se o uso do códon é tendencioso para os códons favorecidos pelo hospedeiro. A determinação dos códons preferenciais pode ser baseada em um estudo de genes derivados da célula hospedeira, onde a informação da seqüência está disponível.

"Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucléico que expressa uma proteína específica, e que pode se referir à região de codificação sozinha, ou pode incluir seqüências reguladoras que precedem (seqüências 5' não codificantes) e seguem (seqüências 3' não codificantes) a seqüência de codificação. "Gene nativo" refere-se a um gene como encontrado na natureza, com as suas próprias seqüências reguladoras. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, que compreende seqüências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Conseqüentemente, um gene quimérico pode compreender seqüências reguladoras e de seqüências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou seqüências reguladoras e seqüências de codificação obtidas a partir da mesma fonte, mas organizadas de uma forma diferente do que aquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo na sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene "exógeno" refere-se a um gene que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de genes. Os genes exógenos podem compreender os genes nativos inseridos em um organismo não-nativo, genes nativos introduzidos em um novo sítio dentro do hospedeiro nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. Um "gene otimizado por códon" é um gene tendo sua freqüência de uso de códon projetada para imitar a freqüência de uso preferencial de códon da célula hospedeira.

"Seqüência de codificação" refere-se a uma seqüência de DNA que codifica uma seqüência de aminoácidos específica. "Seqüências reguladoras adequadas" referem-se a seqüências de nucleotídeos localizadas a montante (uma seqüência 5' não codificante), no interior, ou a jusante (uma seqüência 3' não codificante) de uma seqüência de codificação e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da associada seqüência de codificação. As seqüências reguladoras podem incluir promotores, seqüências de iniciação de tradução, íntrons, seqüências de reconhecimento de poliadenilação, sítio de processamento de RNA, sítios efetivos de ligação e estruturas de haste e alça.

O termo "alelo" refere-se a uma de várias formas alternativas de um gene, que ocupa um dado locus no cromossomo. Quando todos os alelos presentes em um determinado locus de um cromossomo são os mesmos, então aquela planta é homozigota naquele locus. Se os alelos presentes em um determinado locus de um cromossomo diferem, então a planta é heterozigota naquele locus.

"Promotor" refere-se a uma seqüência de DNA capaz de controlar a expressão de uma seqüência de codificação ou RNA funcional. Em geral, uma seqüência de codificação está situada a 3' de uma seqüência promotora. Os promotores poderão ser derivados na sua totalidade a partir de um gene nativo, ou seja, composto por vários elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreende segmentos de DNA sintéticos. É conhecido dos técnicos no assunto que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tipos de células ou tecidos, ou em diferentes fases de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Os promotores que causam a um gene ser expresso na maioria dos tipos de células, na maioria das vezes, são comumente denominados "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos os exatos limites das seqüências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter idêntica atividade promotora.

A seqüência promotora pode consistir em elementos a montante proximal e mais distal, os últimos elementos freqüentemente chamados de amplificadores. Conseqüentemente, um "amplificador" é uma seqüência de DNA que pode estimular a atividade do promotor, e pode ser elemento inato de um promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ou especificidade quanto ao tecido de um promotor. Promotores novos de diversos tipos úteis em células vegetais estão constantemente sendo descobertos; numerosos exemplos podem ser encontrados na compilação por Okamuro, J. K., e Goldberg, R. B., Biochemistry of Plants, 15:1-82 (1989).

"Seqüência líder de tradução" refere-se à seqüência de polinucleotídeos localizada entre a seqüência promotora de um gene e a seqüência de codificação. A seqüência líder de tradução está presente no mRNA totalmente processado a montante da seqüência de partida de tradução. A seqüência líder de tradução pode afetar o processamento da transcrição primária para mRNA, estabilidade de mRNA ou eficiência da tradução. Os exemplos de seqüências líderes de tradução têm sido descritos (Turner, R. and Foster, G. D., Mol. Biotechnol., 3:225-236 (1995)).

Os termos "seqüências 3' não-codificantes "e" terminador de transcrição" referem-se a seqüências de DNA localizado a jusante de uma seqüência de codificação. Isso inclui seqüências de reconhecimento de poliadenilação e outras seqüências que codificam sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou a transformação genética. O sinal de poliadenilação é usualmente caracterizado por afetar a adição de ácido poliadenílico das regiões na extremidade 3' do precursor de mRNA. A região 3' pode influenciar a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA1 ou tradução da associada seqüência de codificação.

O "transcrito de RNA" refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada pela RNA polimerase, de uma seqüência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da seqüência de DNA, ele é referido como transcrito primário, ou ele pode ser uma seqüência RNA derivada de processamento pós-transcricional do transcrito primário, e é chamado de RNA maduro. "RNA mensageiro" ou "mRNA" refere-se ao RNA sem íntrons, e que pode ser traduzido em proteína pela célula. "cDNA" refere-se a um DNA de fita dupla que é complementar ao, e derivado do mRNA. "RNA senso" refere-se RNA transcrito que inclui o mRNA e, portanto, pode ser traduzido em proteína pela célula. "RNA antisenso" refere-se a uma transcrição de RNA que é complementar à totalidade ou parte de uma transcrição primária alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Patente US 5.107.065; PCT Publicação N° WO 99/28508). A complementaridade de um RNA antisenso pode ser com qualquer parte da transcrição específica do gene, ou seja, na parte da seqüência 5' não-codificante, da seqüência 3' não-codificante, ou da seqüência de codificação. "RNA funcional" refere-se ao RNA antisenso, RNA ribozima, ou outro RNA que não é traduzido e ainda tem um efeito sobre processos celulares.

O termo "operacionalmente ligado" refere-se à associação das seqüências de ácido nucléico em um único fragmento de ácido nucléico de modo que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado com uma seqüência de codificação quando é capaz de viabilizar a expressão da seqüência de codificação (ou seja, a seqüência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). As seqüências de codificação podem ser operacionalmente ligadas a seqüências reguladoras na orientação senso ou anti-senso.

O termo "expressão", conforme usado neste documento, refere-se à transcrição e acúmulo estável de RNA senso (mRNA) ou anti-senso derivados do fragmento de ácido nucléico da invenção. Expressão pode também referir-se a tradução de mRNA em um polipeptídeo.

Proteína "madura" refere-se a um polipeptídeo pós- traducionalmente processado, isto é, um a partir do qual qualquer prepeptídeo ou propeptideo presente no produto primário de tradução tenham sido removidos. Proteína "precursora" refere-se ao produto primário da tradução do mRNA, isto é, com prepeptídeos e propeptideos ainda presentes. Os prepeptídeos e propeptideos podem ser (mas não se limitam a) sinais de localização intracelular.

"Transformação" refere-se à transferência de uma molécula de ácido nucléico em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. A molécula de ácido nucléico pode ser um plasmídeo que se replica de forma independente, por exemplo, ou pode se integrar no genoma do organismo hospedeiro. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucléico transformados são referidos como organismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados".

Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" referem-se a um elemento extra cromossômico muitas vezes transportando genes que não fazem parte do metabolismo central da célula e, geralmente, sob a forma de fitas duplas circulares de fragmentos de DNA. Esses elementos podem ser seqüências livremente replicadas, seqüências integradoras de genoma, seqüências de nucleotídeos ou de fagos, circulares ou lineares, de fita de DNA ou RNA simples ou dupla, provenientes de qualquer fonte, na qual uma série de seqüências de nucleotídeos foram ligadas ou recombinadas em uma única construção, que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e seqüência de DNA para um gene produzido juntamente com uma adequada seqüência 3' não-traduzida em uma célula. "Cassete de expressão" se refere a um vetor específico quem contém um gene exógeno e que tem elementos em adição ao gene exógeno que permitem a aprimorada expressão do gene em um hospedeiro exógeno.

O termo "porcentagem de identidade", conforme é conhecido no estado da técnica, é uma relação entre duas ou mais seqüências de polipeptídeos ou duas ou mais seqüências de polinucleotídeos, conforme determinado por comparação das seqüências. No estado da técnica, o termo "identidade" significa também o grau de parentesco entre as seqüências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme o caso, como determinado pela correspondência entre as cadeias de tais seqüências. A "Identidade" e a "similaridade" podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados a, os descritos em: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.1 Biocomputing: Informatics and Genome Proiects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analvsis of Seouence Data. Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Seouence Analvsis in Molecular Biology (v on Heinje, G., Ed.) Academic (1987); e, 5.) Seguence Analvsis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).

As realizações preferenciais para determinar a identidade são projetadas para proporcionar a melhor comparação entre as seqüências testadas. Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os cálculos de porcentagens de identidade e seqüências de alinhamentos podem ser feitos com o programa MegAlign™ da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Os múltiplos alinhamentos das seqüências são realizados usando- se "método de alinhamento Clustal", que abrange várias variedades do algoritmo incluindo o "método de alinhamento Clustal V" correspondente ao método de alinhamento identificado como Clustal V (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS.5151-153 1989 Higgins1 D.G. et al., Comput. AppL Biosci., 8:189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAlign™ do LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc.). Para múltiplos alinhamentos, os valores pré- estabelecidos correspondem a GAP PENALTY=10 e GAP LENGTH PENALTY=10. Os parâmetros pré-estabelecidos para alinhamento em pares e cálculos de porcentagem de identidade de seqüências de proteína usando o método Clustal são KTUPLE=I, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucléicos esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das seqüências usando o programa Clustal V, pode-se obter uma "porcentagem de identidade" usando-se a tabela "distâncias da seqüência" no mesmo programa. Adicionalmente o "método de alinhamento Clustal W" está disponível e corresponde ao método de alinhamento identificado como Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appi 8:189-191(1992)) e encontrado no programa MegAlign™ v6.1 de LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc.). Os parâmetros pré-estabelecidos para múltiplos alinhamentos correspondem a (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=O,5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB). Após o alinhamento das seqüências usando o programa Clustal W, é possível obter uma "porcentagem de identidade" usando-se a tabela "distâncias da seqüência" no mesmo programa.

"Método de alinhamento BLASTN" é um algoritmo fornecido pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) para comparar seqüências de nucleotídeos usando parâmetros pré-estabelecidos.

É bem entendido pelo técnico no assunto que muitos níveis de identidade de seqüências são úteis na identificação de polipeptídeos, a partir de outras espécies, onde tais polipeptídeos têm funções ou atividades similares. Os fragmentos de ácido nucléico adequados (polinucleotídeos isolados da presente invenção) codificam polipeptídeos que são pelo menos cerca de 70% idênticos, de preferência, pelo menos cerca de 75% idênticos, e com mais preferência, pelo menos cerca de 80% idênticos às seqüências de aminoácidos aqui relatadas. Os fragmentos de ácido nucléico preferenciais codificam seqüência de aminoácidos que são pelo menos cerca de 85% idênticos às seqüências de aminoácidos aqui relatadas. Os fragmentos de ácido nucléico mais preferenciais codificam seqüência de aminoácidos que são pelo menos cerca de 90% idênticas às seqüências de aminoácidos aqui relatadas. Os fragmentos de ácido nucléico de máxima preferência codificam seqüência de aminoácidos que são pelo menos cerca de 95% idênticas às seqüências de aminoácidos aqui relatadas. Embora faixas preferenciais sejam descritas acima, qualquer identidade de aminoácidos inteiros de 67% a 100% pode ser útil na descrição da presente invenção, como 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.

Os fragmentos de ácidos nucléicos adequados não somente têm as homologias acima, mas tipicamente codificam um polipeptídeo que tem pelo menos 50 aminoácidos, de preferência, pelo menos 100 aminoácidos, com mais preferência, pelo menos 150 aminoácidos, ainda com mais preferência, pelo menos 200 aminoácidos, e de máxima preferência, pelo menos 250 aminoácidos.

O termo "software de análise de seqüências" refere-se a qualquer algoritmo computadorizado ou programa de software que é útil para a análise de seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos. "Software de análise de seqüências" pode estar disponível comercialmente ou desenvolvido independentemente. Típicos Softwares de análise de seqüências incluem, mas não estão limitados a eles: 1.) Software integrado de programas GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG)1 Madison, Wl); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, Wl); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml); e 5.) O programa FASTA que incorpora o algoritmo Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY). No contexto deste pedido, será entendido que onde o software de análise seqüencial é utilizado para a análise, os resultados da análise serão baseados nos "valores pré-determinados" do programa referenciado, salvo disposição em contrário. Para uso na presente invenção, "valores pré-determinados" significarão qualquer conjunto de valores ou parâmetros que vem com o software quando o mesmo é inicializado pela primeira vez. No que diz respeito ao algoritmo BLASTP usado aqui, os parâmetros pré-estabelecidos incluirão as freqüências de aminoácido Robinson e Robinson (Robinson A.B., Robinson L.R., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 88:8880-8884 (1991)), a matriz de pontuação BLOSUM62 e o "gap cost" Δ (g) = 11 + g.

O termo "partes da planta" inclui tecidos diferenciados e não diferenciados, incluindo, mas não limitados aos seguintes: raízes, caule, brotos, folhas, pólen, sementes, tecidos tumorais e diferentes formas de cultura e células (por exemplo, células isoladas, protoplastos, embriões e tecido de calos). O tecido vegetal pode ser na planta ou em um órgão, tecido ou cultura celular da planta.

O termo "órgão da planta" refere-se ao tecido vegetal ou grupo de tecidos que constituem uma parte morfologicamente e funcionalmente distinta de uma planta.

O termo "genoma" refere-se aos seguintes: (1) o complemento completo do material genético (genes e seqüências não-codificantes) presente em cada célula de um organismo, ou vírus ou organela; (2) um conjunto completo de cromossomos herdado como uma unidade (haplóide) a partir de um progenitor.

As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecular usadas na presente invenção são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas por Sambrook1 J., Fritsch, E. F. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989) (mais adiante neste documento "Maniatis"); e por Silhavy, T. J., Bennan1 M. L. e Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience, Hoboken, NJ (1987).

Os termos "construção recombinante", "construção de expressão", "construção quimérica, "construção" e "construção de DNA recombinante" são usados de maneira intercambiável na presente invenção. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucléico, por exemplo, seqüências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção quimérica pode compreender seqüências reguladoras e seqüências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou seqüências reguladoras e seqüências de codificação obtidas a partir da mesma fonte, mas organizadas de uma forma diferente do que aquela encontrada na natureza. Tal construção pode ser usada por si mesma ou pode ser usada em conjunto com um vetor. Se um vetor for usado, a escolha do vetor é dependente do método que será usado para transformar células hospedeiras, como é bem conhecido pelos técnicos no asunto. Por exemplo, um vetor plasmídeo pode ser usado. O técnico no assunto está perfeitamente consciente dos elementos genéticos que precisam estar presentes no vetor, a fim de transformar com sucesso, selecionar e propagar células hospedeiras que compreendem todos os fragmentos de ácido nucléico isolados da invenção. O técncio no assunto irá também reconhecer que os diferentes eventos independentes de transformação resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones etal., EMBO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al„ Moi Gen. Genetics 218:78-86 (1989)) e, portanto, aqueles vários eventos precisam ser rastreados, a fim de obter linhagens que mostram o nível de expressão e o padrão desejados. Tal triagem pode ser conseguida pela análise Southern de DNA1 análise Southern de mRNA, análise da expressão protéica imunobloting ou análise fenotípica, entre outros.

O termo "expressão", conforme usado neste documento refere-se à produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA ou uma proteína [precursora ou madura]).

O termo "introduzido" significa fornecer um ácido nucléico (por exemplo, construção de expressão) ou proteína em uma célula. O termo "introduzido" inclui referência a incorporação de um ácido nucléico em células procarióticas ou eucarióticas, sendo que o ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula, e inclui referências à provisão transitória de um ácido nucléico ou proteína para a célula. Introduzido inclui referência para os métodos de transformação estável ou transitória, bem como para cruzamentos sexuados. Dessa forma, "introduzido" no contexto da inserção de um fragmento do ácido nucléico (por exemplo, um construção de DNA recombinante/construção de expressão) em uma célula, significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução", e inclui referências à incorporação de um fragmento de ácido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica, sendo que o fragmento de ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial), convertido em uma replicação autônoma, ou transitoriamente expresso (por exemplo, mRNA transfectada).

Proteína "madura" refere-se a um polipeptídio pós- traducionalmente processado (ou seja, do qual quaisquer prepeptídeos ou propeptideos presentes no produto primário de tradução foram removidos).

Proteína "precursora" refere-se ao produto primário da tradução do mRNA, isto é, com prepeptídeos e propeptideos ainda presentes. Os prepeptídeos e propeptideos podem ser, mas não se limitam a, sinais de localização intracelular.

"Transformação estável" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucléico em um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo ambos os genomas nuclear e de organelas, resultando em herança geneticamente estável. Em contraste, "transformação transitória" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucléico para o núcleo, ou organela contendo DNA, de um organismo hospedeiro resultando na expressão gênica sem integração ou herança estável. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucléico transformados são referidos como organismos "transgênicos".

Para uso na presente invenção, "transgênico" refere-se a uma planta ou uma célula que compreende em seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Preferencialmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado de maneira estável no genoma, de forma que o polinucleotídeo é passado para gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de uma construção de expressão. O termo "transgênico" é usado aqui para incluir qualquer célula, linhagem de células, calos, tecido, parte da planta ou planta, o genótipo da qual tem sido alterado pela presença de ácidos nucléicos heterólogos incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados, bem como aqueles criados pelos cruzamentos sexuados ou propagação assexuada a partir do primeiro transgênico. O termo "transgênico", conforme usado neste documento, não abrange a alteração do genoma (cromossômica ou extra-cromossômica) por métodos convencionais de reprodução de plantas, ou por eventos que ocorrem naturalmente, como a fecundação cruzada aleatória, infecção viral não- recombinante, transformação bacteriana não-recombinante, transposição não- recombinante ou mutação espontânea.

"Inibição antisenso" refere-se à produção de transcrições de RNA antisenso capaz de suprimir a expressão da proteína alvo. O termo "co- supressão" refere-se à produção de transcritos de RNA senso capazes de suprimir a expressão de genes endógenos ou exógenos idênticos ou substancialmente similares (patente U.S. n° 5.231.020). A co-supressão de construções em plantas previamente tinha sido projetada através do foco na expressão excessiva de uma seqüência de ácido nucléico que tem homologia com um mRNA endógeno, na orientação senso, o que resulta na redução de todos os RNAs que tem homologia com as seqüências superexpressas (Vaucheret etal., Plant J. 16:651-659 (1998); Gura, Nature 404:804-808 (2000)). A eficiência global do fenômeno é baixa, e a extensão de redução do RNA é muito variável. Os trabalhos mais recentes têm descrito o uso de estruturas em grampo (hairpin) que incorporam toda, ou parte, de uma seqüência de codificação mRNA em uma orientação complementar que resulta em uma estrutura potencial "stem-loop" para o RNA expresso (Publicação PCT n0 WO 99/53050, publicada em 21 de outubro de 1999; Publicação PCT n° WO 02/00904, publicada em 3 de janeiro de 2002). Isto aumenta a freqüência de co-supressão nas plantas transgênicas recuperadas. Outra variação descreve o uso de seqüências virais de plantas para dirigir a supressão, ou "silenciamento", do mRNA proximal que codifica as seqüências (Publicação PCT n0 WO 98/36083, publicada em 20 de agosto de 1998). Ambos os fenômenos co-supressores ainda não foram elucidados mecanisticamente, embora evidência genética tenha começado a desvendar esta complexa situação (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757 (1998)). Uma Visão Geral: Biossíntese Microbiana de Ácidos Graxos E Triacil Gliceróis

Em geral, o acúmulo de lipídeos em microorganismos oleaginosos é desencadeado em resposta à razão global de carbono para nitrogênio presentes no meio de crescimento. Este processo, que leva à síntese de novo de palmitato livre (16:0) em microorganismos oleaginosos, é descrito em detalhes na Publicação PCT n0 WO 2004/101757. O palmitato é o precursor da maior cadeia de ácidos graxos saturados e insaturados derivados, que são formadas através da ação de elongases e desaturases (figura 1).

TAGs (a principal unidade de armazenamento para ácidos graxos) são formadas por uma série de reações que envolvem: 1.) a esterificação de uma molécula de acil-CoA para glicerol-3-fosfato através de um aciltransferase para produzir ácido lisofosfatídico; 2.) a esterificação de uma segunda molécula de acil-CoA através de um aciltransferase para produzir 1,2-diacilglicerol fosfato (comumente identificado como ácido fosfatídico); 3.) a remoção de um fosfato por ácido fosfatídico fosfatase para produzir 1,2 -diacilglicerol (DAG) e 4.) a adição de um terceiro ácido graxo pela ação de uma aciltransferase para formar TAG. Um amplo espectro de ácidos graxos pode ser incorporado nos TAGs, incluindo ácidos graxos saturados e insaturados e ácidos graxos de cadeia curta e de cadeia longa.

Biossíntese de Ácidos Graxos Ômega

O processo metabólico onde ácido oléico é convertido em ácidos graxos ômega-3/ômega-6 envolve alongamento da cadeia de carbono através da adição de átomos de carbono e dessaturação da molécula através da adição de ligações duplas. Isto exige uma série de dessaturações e alongamentos especiais das enzimas presentes na membrana do retículo endoplasmático. Entretanto, como pode ser visto na figura 1 e como descrito abaixo, existem muitas vezes várias vias alternativas para a produção de um determinado ácido graxo ômega-3/ômega-6.

Especificamente, todas as vias exigem a conversão inicial de ácido oléico para LA, o primeiro dos ácidos graxos ômega-6, por uma delta-12 desaturase. Então, usando a "via delta-6 desaturase / delta-6 elongase ", ácidos graxos ômega-6 são formados da seguinte forma: (1) LA é convertido para GLA por uma delta-6 desaturase; (2) GLA é convertido para DGLA por uma C18/20 elongase; e, (3) DGLA é convertido para ARA por uma delta-5 desaturase. Alternativamente, a "via delta-6 desaturase / delta-6 elongase" pode ser utilizada para formação de ácidos graxos ômega-3 da seguinte forma: (1) LA é convertido para ALA, o primeiro dos ácidos graxos ômega-3, por uma delta-15 desaturase; (2) ALA é convertido para STA por uma delta-6 desaturase; (3) STA é convertido para ETA por uma C18/2o elongase; (4) ETA é convertido para EPA por uma delta-5 desaturase; (5) EPA é convertido para DPA por uma C20/22 elongase; e, (6) DPA é convertido para DHA por uma delta-4 desaturase. Opcionalmente, ácidos graxos ômega-6 podem ser convertidos para ácidos graxos ômega-3; por exemplo, ETA e EPA são produzidos a partir de DGLA e ARA, respectivamente, por atividade de delta-17 desaturase.

As vias alternativas para a biossíntese de ácidos graxos ômega- 3/ômega-6 utilizam uma delta-9 elongase e delta-8 desaturase. Mais especificamente, LA e ALA podem ser convertidos para EDA e ETrA, respectivamente, por uma delta-9 elongase; então, uma delta-8 desaturase converte a EDA para DGLA e/ou ETrA para ETA.

É contemplado que as funcionalidades particulares exigidas para ser expressas em um determinado organismo hospedeiro para a produção de ácidos graxos ômega-3/ômega-6 dependerão da célula hospedeira (e os seus perfis AGP e/ou perfis desaturase/elongase nativos), a disponibilidade de substrato, e o(s) produto(s) final(is) desejado(s). O técnico no assunto será capaz de identificar vários genes candidatos, que codificam cada uma das enzimas desejadas para biossíntese dos ácidos graxos ômega-3/ômega-6. As seqüências desaturase e elongase úteis podem ser derivadas de qualquer fonte, por exemplo, isolada de uma fonte natural (a partir de bactérias, algas, fungos, plantas, animais, etc), produzidas através de uma via semi-sintética ou sintetizadas de novo. Embora a fonte particular dos genes desaturase e elongase introduzidos no hospedeiro não seja crítica, considerações para a escolha de um polipeptídeo específico que tem atividade desaturase ou elongase incluem: 1.) A especificidade de substrato do polipeptídeo; 2.) se o polipeptídeo ou um componente do mesmo é um limitador de taxa de enzima; 3.) Se a desaturase ou elongase é essencial para a síntese de uma desejada AGP; e/ou 4.) cofatores exigidos pelo polipeptídeo. O polipeptídeo expresso tem, de preferência, parâmetros compatíveis com o ambiente bioquímico da sua localização na célula hospedeira (consulte Publicação PCT n° WO 2004/101757 para detalhes adicionais).

Em realizações adicionais, ele também será útil para analisar a eficiência da conversão de cada desaturase e/ou elongase particular. Mais especificamente, uma vez que cada enzima raramente funciona com 100% de eficiência para converter substrato para produto, o perfil final do lipídeo de óleos não purificados produzidos em uma célula hospedeira vai ser tipicamente uma mistura de vários AGPs que consiste nos desejado ácidos graxos ômega- 3/ômega-6, bem como vários intermediários AGPs a montante. Assim, cada eficiência de conversão de enzima é também uma variável a considerar, quando se otimiza a biossíntese de um ácido graxo desejado.

Com cada uma das considerações acima em mente, os genes candidatos com as adequadas atividades de desaturase e elongase (por exemplo, delta-6 desaturases, C18/20 elongases, delta-5 desaturases, delta-17 desaturases, delta-15 desaturases, delta-9 desaturases, delta-12 desaturases, C14/16 elongases, C16/18 elongases, delta-9 elongases, delta- 8 desaturases, delta-4 desaturases e C20/22 elongases) podem ser identificados de acordo com a literatura disponível publicamente (por exemplo, GenBank), a literatura de patentes, e análises experimentais de organismos que tenham a capacidade de produzir AGPs. Estes genes serão adequados para serem introduzidos em um determinado organismo hospedeiro, para ativar ou reforçar a síntese de AGPs do organismo.

Identificação da Seqüência de uma Nova delta-5 Desaturase de Peridinium sp. CCMP626

Na presente invenção, uma seqüência de nucleotídeos (SEQ ID n° 1) tem sido isolada a partir de Peridinium sp. CCMP626 que codifica uma delta-5 desaturase (SEQ ID n° 2), chamada na presente invenção como "RD5".

A comparação da base de nucleotídeos RD5 e seqüências de aminoácidos, deduzida das bases de dados públicas, revela que as seqüências similares mais conhecidas são cerca de 67% idênticas às seqüências de aminoácidos RD5 aqui relatadas, ao longo de um comprimento de 463 aminoácidos usando um método de alinhamento Clustal W. Os fragmentos de aminoácidos mais preferenciais são pelo menos cerca de 70% a 80% idênticos às seqüências do presente documento, onde aquelas seqüências que são pelo menos cerca de 80% a 90% idênticas são especialmente adequadas e aquelas seqüências que são pelo menos cerca de 90% a 95% idênticas são de máxima preferência. Do mesmo modo, RD5 seqüências preferenciais de ácidos nucléicos de codificação correspondentes ao ORF presente que codifica proteínas ativas são aquelas que são pelo menos, cerca de 70% a 80% idênticas às seqüências de ácidos nucléicos RD5 aqui relatadas, onde aquelas seqüências que são pelo menos cerca de 80% a 90% idênticas são particularmente adequadas e aquelas seqüências que são pelo menos cerca de 90% a 95% idênticas são de máxima preferência.

Em realizações alternativas, a seqüência RD5 desaturase presente pode ser códon-otimizada para uma expressão no organismo hospedeiro particular. Como é bem conhecido no estado da técnica, isto pode ser um meio útil para otimizar ainda mais a expressão da enzima no hospedeiro alternativo, desde que o uso de códons preferidos pelo hospedeiro possa aumentar substancialmente a expressão do gene exógeno que codifica o polipeptídeo. Em geral, códons preferidos pelo hospedeiro podem ser determinados dentro de uma determinada espécie de hospedeiro de interesse por meio de um exame do uso de códon em proteínas (de preferência aquelas expressas na maior quantidade) e determinar quais os códons que são usados com maior freqüência. Em seguida, a seqüência de codificação de um polipeptídeo de interesse que tem, por exemplo, atividade de desaturase pode ser sintetizada no todo ou em parte, usando os códons preferenciais nas espécies de hospedeiros.

Em uma realização preferencial da presente invenção, RD5 foi otimizado para expressão em Yarrowia lipolytica. Isto foi possível pela determinação primeiro do perfil de utilização do códon Y. lipolytica (ver Publicações PCT No. WO 04/101757 e US Patente 7.125.672) e identificação daqueles códons que são preferenciais. Em seguida, para uma maior otimização da expressão gênica em Y. lipolytica, a seqüência consenso em torno do códon de iniciação "ATG" foi determinada. Esta otimização resultou em modificação de 247 bp da região codificante 1392 bp (17,7%) e de otimização de 229 códons do total de 463 códons (49,4%). Nenhuma dessas alterações no gene otimizado ("RD5S"; SEQ ID n° 3) alterou a seqüência de aminoácidos da proteína codificada (SEQ ID n° 2). Conforme descrito no exemplo 11, o gene otimizado foi 8,9% mais eficiente desaturando DGLA para ARA do que o gene de ocorrência natural, quando expressos em Y. lipolytica.

Um técnico no assunto seria capaz de utilizar os ensinamentos aqui descritos para criar diversas outras proteínas delta-5 desaturase códon- otimizadas, adequadas para otimizada expressão em hospedeiros alternativos (isto é, excluindo Yarrowia lipolytica), com base na seqüência RD5 de ocorrência natural. Assim, a invenção refere-se a qualquer proteína delta-5 desaturase códon-otimizada que é derivada do RD5 de ocorrência natural (ou seja, codificados por SEQ ID n° 2). Isto inclui, mas não se limita a, a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID n° 3, que codifica uma síntese protéica de delta-5 desaturase (ou seja, RD5S), que foi códon otimizada para a expressão em Yarrowia lipolytica.

Identificação E Isolamento de Homólogos

Qualquer uma das seqüências desaturase instantâneas (ou seja, RD5, RD5S) ou partes das mesmas, pode ser usada para procurar homólogos de delta-5 desaturase na mesma ou outras bactérias, algas, fungos, ou espécies vegetais utilizando análise de seqüência por software. Em geral, essas seqüências semelhantes encontradas por software de computador, que atribui diferentes graus de homologia para várias substituições, supressões e outras modificações.

Alternativamente, qualquer uma das seqüências desaturase instantâneas ou partes das mesmas também pode ser empregada como reagente de hibridização para a identificação de homólogos delta-5. Os componentes básicos de um teste de hibridização de ácido nucléico incluem uma sonda, uma amostra supostamente contendo o gene ou fragmento do gene de interesse, e um específico método de hibridização. As sondas da presente invenção são tipicamente seqüências de ácidos nucléicos de fita simples que são complementares às seqüências de ácidos nucléicos que serão detectadas. As sondas são "hibridizáveis" para a seqüência do ácido nucléico a ser detectada. Embora o comprimento sonda possa variar de 5 bases para dezenas de milhares de bases, tipicamente um comprimento de sonda adequado é de cerca de 15 bases a cerca de 30 bases. Apenas parte da molécula de sonda precisa ser complementar à seqüência de ácidos nucléicos a ser detectada. Além disso, a complementaridade entre a sonda e a seqüência alvo não necessita ser perfeita. A hibridização ocorre entre moléculas imperfeitamente complementares com ο resultado que uma determinada fração das bases na região hibridizada não é pareada com a base complementar própria.

Os métodos de hibridização são bem definidos. Tipicamente, a sonda e a amostra precisam ser misturadas sob condições que permitirão a hibridização do ácido nucléico. Isso envolve fazendo o contato da sonda e da amostra, na presença de um sal orgânico ou inorgânico sob condições próprias de concentração e temperatura. A sonda e a amostra de ácidos nucléicos precisam ficar em contato por um tempo longo o suficiente para que qualquer possível hibridização entre a sonda e a amostra de ácidos nucléicos possa ocorrer. A concentração da sonda ou alvo na mistura vai determinar o tempo necessário para que ocorra a hibridização. Quanto mais alta a concentração da sonda ou alvo, menor o tempo de incubação necessário para a hibridização. Opcionalmente, um agente caotrópico pode ser adicionado (por exemplo, cloreto guanidínio, tiocianato guanidínio, tiocianato de sódio, tetracloroacetato de lítio, perclorato de sódio, rubídio tetracloroacetato, iodeto de potássio, trifluoroacetato de césio). Se desejado, pode-se adicionar formamida à mistura de hibridização, tipicamente 30 a 50% em volume.

Várias soluções de hibridização podem ser empregadas. Tipicamente, estas compreendem cerca de 20 a 60% do volume, de preferência, 30% de um solvente orgânico polar. Uma solução comum de hibridização emprega cerca de 30 a 50% v/v de formamida, cloreto de sódio cerca de 0,15 a 1 M, tampão (por exemplo, citrato de sódio, Tris-HCI, tubagens ou HEPES (pH intervalo de cerca de 6 a 9))cerca de 0,05 a 0,1 M, cerca de 0,05 a 0,2% de detergente (por exemplo, dodecil sulfato de sódio), ou entre 0,5 a 20 mM EDTA, Ficoll (Pharmacia Inc.) (cerca de 300 a 500 kdal), polivinilpirrolidona (cerca de 250 a 500 kdal), e albumina de soro. Também serão incluídos na solução típica de hibridização os ácidos nucléicos transportadores não marcados (unlabeled) a partir de cerca de 0,1 a 5 mg/mL, DNA nucléicos fragmentados (por exemplo, DNA de timos de novilho ou esperma de salmão, ou RNA de levedura) e, facultativamente, a partir de cerca de 0,5 a 2% peso/vol de glicina. Outros aditivos podem também ser incluídos, tais como agentes de exclusão de volume que incluem uma variedade de agentes polares solúveis em água ou de intumescimento (por exemplo: polietileno glicol), polímeros aniônicos (por exemplo, poliacrilato ou polimetil acrilato) e polímeros sacarídicos aniônicas (por exemplo, sulfato de dextrano).

A hibridização de ácido nucléico é adaptável a uma variedade de formatos de ensaio. Um dos mais adequados é o formato de ensaio sanduíche. O ensaio sanduíche é particularmente adaptável a hibridização sob condições de não-desnaturação. O principal componente de um ensaio do tipo sanduíche é um suporte sólido. O suporte sólido tem, adsorvido nele ou covalentemente acoplado a ele, uma sonda de ácidos nucléicos imobilizada, não marcada e, complementar a uma porção da seqüência.

Em realizações adicionais, nenhum dos fragmentos de ácido nucléico de delta-5 desaturase descritos neste documento (ou qualquer homólogos identificados dos mesmos) podem ser usados para isolar genes que codificam proteínas homólogas a partir da mesma ou de outras espécies de bactérias, algas, fungos ou plantas. O isolamento de genes homólogos que utilizam protocolos dependentes de seqüência é bem conhecido no estado da técnica. Exemplos de protocolos dependentes de seqüência incluem, mas não estão limitados a: 1.) Métodos de hibridização de ácidos nucléicos; 2.) métodos de amplificação de DNA e RNA, como exemplificado para vários usos de tecnologias de amplificação de ácido nucléico [por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), Mullis et al., Patentes U.S. n° 4.683.202; reação em cadeia de ligase (LCR)1 Tabor, S. et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 82:1074 (1985); ou amplificação de deslocamento da fita (SDA - strand displacement amplification), Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)]; e 3.) métodos de construção de biblioteca e triagem por complementação.

Por exemplo, genes que codificam proteínas ou polipeptídeos semelhantes para as delta-5 desaturases descritas neste documento poderão ser isolados diretamente, usando a totalidade ou uma parte dos fragmentos de ácido nucléico instantâneos como sondas de hibridização de DNA para bibliotecas de triagem, por exemplo, ou qualquer levedura ou fungo desejado, usando metodologia bem conhecida dos técnicos no assunto (sendo que os organismos que produzem ARA [ou seus derivados] seriam preferíveis). As sondas de oligonucleotídeos específicas baseadas nas seqüências instantâneas de ácidos nucléicos e podem ser projetadas e sintetizadas por métodos conhecidos no estado da técnica (Maniatis, acima). Além disso, a seqüência inteira pode ser usada diretamente para sintetizar sondas de DNA através de métodos conhecidos pelo técnico no assunto (por exemplo, iniciadores aleatórios de marcação de DNA, tradução "nick" ou técnicas de marcação de extremidade), ou RNA usando sondas disponíveis em sistemas de transcrição vitro. Além disso, iniciadores específicos podem ser projetados e usados para amplificar parte de uma (ou todo o comprimento) seqüência instantânea. Os produtos resultantes da amplificação podem ser marcados diretamente durante as reações de amplificação ou marcados após as reações de amplificação, e usados como sondas para isolar todo o comprimento de fragmentos de DNA em condições adequadas de estrigência.

Tipicamente, nas técnicas de amplificação do tipo PCR, os iniciadores têm seqüências diferentes e não são complementares entre si. Dependendo das condições de teste desejada, as seqüências dos iniciadores devem ser projetadas para proporcionar a replicação eficiente e fiel do ácido nucléico alvo. Os métodos de design de iniciador PCR são comuns e bem conhecidos no estado da técnica (Thein e Wallace, "The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", em Human Genetic Diseases: A Practical Approach, Κ. Ε. Davis Ed., (1986) pp 33-50, IRL: Herndon, VA; e Rychlik, W., In Methods in Molecular Biology, White, B.A. Ed., (1993) Vol. 15, pp 31-39, PCR Protocole: Current Methods and Applications. Humania: Totowa, NJ).

Geralmente dois segmentos curtos das seqüências instantâneas podem ser usados em protocolos PCR para amplificar fragmentos mais longos do ácido nucléico que codificam genes homólogos de DNA ou RNA. O PCR também pode ser realizado em uma biblioteca de fragmentos clonados de ácido nucléico, onde a seqüência de um iniciador é derivada dos fragmentos de ácido nucléico instantâneos, e a seqüência do outro iniciador tira proveito da presença dos tratos de ácido poliadenílico na extremidade 3' do precursor de mRNA que codifica genes eucarióticos.

Alternativamente, a segunda seqüência iniciadora poderá basear- se em seqüências obtidas a partir do vetor de clonagem. Por exemplo, o técnico no assunto pode seguir o protocolo RACE (Frohman et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 85:8998 (1988)) para gerar cDNAs usando de PCR para amplificar cópias da região entre um ponto único na transcrição e as extremidades 3 'ou 5'. Os iniciadores orientados nas direções 3 'e 5' podem ser concebidos a partir das seqüências instantâneas. Usando os sistemas 3 'RACE ou 5' RACE disponíveis comercialmente (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), fragmentos específicos de cDNA 3 'ou 5' podem ser isolados (Ohara et al., Proc. Natl Acad Natl Acad. Sci. U.S.A., 86:5673 (1989); Loh et al., Science, 243:217 (1989)).

Em outras realizações, nenhum dos fragmentos de ácido nucléico de delta-5 desaturase descritos neste documento (ou qualquer homólogos identificados no mesmo) pode ser usado para criação de novas e melhoradas desaturases de ácidos graxos. Como é bem conhecido no estado da técnica, mutagênese "in vitro" e seleção, mutagênese química, métodos de embaralhamento de gene ("gene shutfling") ou outros meios podem ser empregados para obtenção das mutações de genes desaturase de ocorrência natural. Alternativamente, os ácidos graxos aprimorados poderão ser sintetizados por troca de domínio ("domain swapping"), sendo que um domínio funcional de qualquer dos fragmentos de ácido nucléico de delta-5 desaturase descritos a seguir étrocado com um domínio funcional em um gene desaturase alternativo para, assim, obter uma nova proteína.

Métodos para Produção de Diversos Ácidos Graxos Ômega-3 e/ou Ômega-6

Espera-se que a introdução de genes quiméricos que codificam as delta-5 desaturases aqui descritas (ou seja, RD5, RD5S ou outras enzimas mutantes, enzimas códon-otimizadas ou homólogos das mesmas), sob o controle de promotores adequados irá resultar em aumento da produção de ARA e/ou EPA no organismo hospedeiro transformado, respectivamente. Como tal, a presente invenção abrange um método para a produção direta de AGPs que compreendem um substrato de ácido graxo (ou seja, DGLA ou ETA) para as enzimas desaturase descritas neste documento (por exemplo, RD5, RD5S), de tal forma que o substrato é convertido para o produto de ácido graxo desejado (ou seja, ARA ou EPA, respectivamente).

Mais especificamente, é um objetivo da presente invenção, fornecer um método para a produção da ARA, em uma célula hospedeira (por exemplo, levedura oleaginosa, soja), sendo que a célula hospedeira compreende:

(i) uma molécula de nucleotídeo isolada que codifica um polipeptídeo delta-5 desaturase que tem pelo menos 67% de identidade com um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácidos estipulada na SEQ ID n° 2, com base em algoritmos BLASTP ou em métodos de alinhamento Clustal W; e,

(ii) uma fonte de diomo γ-ácido linoléico; sendo que a célula hospedeira é cultivada em condições tais que a delta-5 desaturase é expressa, e o DGLA é convertido para o ARA, e onde o ARA é opcionalmente recuperado.

O técnico no assunto irá reconhecer que a ampla gama de substratos da delta-5 desaturase pode adicionalmente permitir a utilização da enzima de conversão da ETA para EPA. Conseqüentemente, o invento proporciona um método para a produção de EPA, sendo que a célula hospedeira compreende:

(i) uma molécula de nucleotídeo isolada que codifica um polipeptídeo delta-5 desaturase que tem pelo menos 67% de identidade com um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácidos estipulada na SEQ ID n° 2, com base em algoritmos BLASTP ou em métodos de alinhamento Clustal W; e,

(ii) uma fonte de ETA; sendo que a célula hospedeira é cultivada em condições tais que a delta-5 desaturase é expressa e o ETA é convertido para o EPA, e onde o EPA é opcionalmente recuperado.

Alternativamente, cada gene de delta-5 desaturase e seu produto enzimático correspondente aqui descrito, podem ser usados indiretamente para a produção de ácidos graxos ômega-3 (ver Publicação de Patente U.S. N0 2005/0136519). A produção indireta de AGPs ômega-3/ômega-6 ocorre onde o substrato de ácido graxo é convertido indiretamente no produto desejado de ácido graxo, por meio de etapa(s) ou via(s) intermediária(s). Dessa forma, é observado que as delta-5 desaturases aqui descritas (por exemplo, RD5, RD5S ou outras enzimas mutantes, enzimas códon-otimizadas ou homólogos das mesmas) podem ser expressas em conjugação com outros genes que codificam enzimas da via biossintética de AGPs (por exemplo, delta-6 desaturases, C18/20 elongases, delta-17 desaturases, delta-15 desaturases, delta-9 desaturases, delta-12 desaturases, C14/16 elongases, C16/18 elongases, delta-9 elongases, delta-8 desaturases, delta-4 desaturases, C20/22 elongases) para resultar em níveis mais elevados de produção de ácidos graxos ômega-3 de cadeia mais longa (por exemplo, EPA, DPA e DHA). Os genes particulares incluídos em um cassete de expressão particular dependerão da célula hospedeira (e seu perfil AGP e/ou perfil desaturase/elongase), da disponibilidade de substrato e do produto(s) final(is) desejado(s).

Em realizações alternativas, pode ser útil perturbar a delta-5 desaturase nativa de um organismo hospedeiro, baseado nas seqüências completas aqui descrito, o complemento dessas seqüências completas, porções substanciais dessas seqüências, desaturases códon-otimizadas derivadas deles e as seqüências que são substancialmente homólogas a isso. Sistemas de Expressão, Cassetes ε Vetores, E Transformação da Planta Em uma realização, esta invenção diz respeito a uma construção recombinante que compreende qualquer um dos polinucleotídeos da delta-5 desaturase da invenção, operacionalmente ligados a pelo menos uma seqüência reguladora adequada para expressão em uma planta. O promotor é uma seqüência de DNA que direciona a maquinaria celular de uma planta para a produção de RNA a partir da seqüência de codificação contígua à jusante (3') do promotor. A região promotora influencia a taxa, estágio do desenvolvimento, e tipo de célula na qual a transcrição de RNA do gene é feita. O RNA transcrito é processado para produzir mRNA que serve como modelo para a tradução da seqüência de RNA em seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. A seqüência líder 5' não traduzida é uma região do mRNA a montante da região de codificação da proteína que pode desempenhar um papel na iniciação e tradução do mRNA. A terminação de transcrição/sinal de poliadenilação 3' é uma região não-traduzida a jusante da região codificação da proteína que funciona na célula vegetal para provocar a terminação do RNA transcrito e a adição de nucleotídeos de poliadenalato à extremidade 3' do RNA.

A origem do promotor escolhido para dirigir a expressão da seqüência de codificação da delta-5 desaturase não é importante, desde que haja suficiente atividade transcricional para realizar a invenção, ao expressar mRNA traduzível para os fragmentos de ácidos nucléicos no tecido do hospedeiro desejado e no tempo certo. Os promotores heterólogos ou não heterólogos (ou seja, endógenos) podem ser usados na prática da invenção.

Por exemplo, promotores adequados incluem, mas não estão limitados a: o promotor de subunidade alfa prime beta de conglicinina, o promotor de Kunitz inibidor 3 da tripsina, o promotor anexina, o promotor de glicinina GY1, o promotor de subunidade beta da beta conglicinina, o promotor P34/Gly Bd m 30k, o promotor de albumina, o promotor de Leg A1 e o promotor de Leg A2.

O promotor anexina, ou P34, é descrito em PCT Publicação N0 WO 2004/071178 (publicada em 26 de agosto de 2004). O nível de atividade do promotor anexina é comparável ao de muitos promotores de conhecida força, tais como: (1) o promotor CaMV 35S (Atanassova et al., Plant Mol. Biol. 37:275-285 (1998); Battraw and Hall, Plant Mol. Biol. 15:527-538 (1990); Holtorf et al., Plant Mol. Biol. 29:637-646 (1995); Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987); Wilmink et al., Plant Mol. Biol. 28:949-955 (1995)); (2) Os promotores de Arabidopsis oleosin (Plant et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205 (1994); Li, Texas A&M University Ph.D. dissertation, pp. 107-128 (1997)); (3) Os promotores de extensão de proteína Arabidopsis ubiquitin (Callis et al., J Biol. Chem. 265(21): 12486-93 (1990)); (4) Um promotor do gene de tomate ubiquitin (Rollfinke et al., Gene. 211(2):267-76 (1998)); (5) um promotor de proteína de soja "heat shock" (Schoffl et al., Mol Gen Genet. 217(2-3):246-53 (1989)); e, (6) um promotor do gene de histona H3 de milho (Atanassova et al., Plant Mol Biol. 37(2):275-85 (1989)).

Outra característica útil do promotor anexina é o seu perfil de expressão nas sementes em desenvolvimento. O promotor anexina está mais ativo nas sementes em desenvolvimento nas primeiras etapas (antes de 10 dias após a polinização), e é largamente quiescente em etapas posteriores. O perfil de expressão do promotor anexina é diferente de muitos promotores específicos de sementes, por exemplo, promotores que armazenam proteína em sementes, que muitas vezes fornecem maior atividade nas fases posteriores de desenvolvimento (Chen et al., Dev. Genet. 10:112-122 (1989); Ellerstrom et al., Plant Moi Biol. 32:1019-1027 (1996); Keddie et al., Plant Mol. Biol. 24:327-340 (1994); Plant et al., (acima); Li, (acima)). O promotor anexina tem um perfil de expressão mais convencional, mas permanece distinto de outros promotores específicos para sementes conhecidos. Assim, o promotor anexina será um candidato muito atraente quando a superexpressão ou a supressão de um gene em embriões é desejada em um estágio precoce de desenvolvimento. Por exemplo, pode ser desejável expressar excessivamente um gene que regula desenvolvimento embrionário precoce ou um gene envolvido no metabolismo antes da maturação das sementes.

Depois da identificação apropriada de um promotor adequado à expressão de uma seqüência de codificação de uma determinada delta-5 desaturase, o promotor é então operacionalmente ligado em uma orientação senso usando meios convencionais bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecular usadas aqui são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas mais detalhadamente em Sambrook, J. et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (mais adiante neste documento "Sambrook et al., 1989") ou Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. e Struhl, K., Eds.; In Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley and Sons: New York, 1990 (mais adiante neste documento "Ausubel et al., 1990").

Depois que a construção recombinante foi feita, ela pode então ser introduzida em uma célula vegetal de escolha por métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto (por exemplo, transfecção, transformação e eletroporação). As células vegetais de uma semente oleaginosa são as células vegetais preferenciais. A célula vegetal transformada é, em seguida, cultivada e regenerada e m condições adequadas, permitindo a expressão de AGP de cadeia longa, que é então opcionalmente recuperado e purificado.

As construções recombinantes da invenção podem ser introduzidas e m uma célula vegetal; ou, alternativamente, cada construção pode ser introduzida em células vegetais separadas.

A expressão em uma célula vegetal pode ser realizada de um modo temporário ou estável como é descrito acima.

Os AGPs de cadeia longa desejados podem ser expressos em sementes. Também, no âmbito da presente invenção são as sementes ou partes de plantas obtidas a partir dessas plantas transformadas.

As partes da planta incluem tecidos diferenciados e não diferenciados, incluindo, mas não limitados aos seguintes: raízes, caule, brotos, folhas, pólen, sementes, tecidos tumorais e diferentes formas de cultura e células (por exemplo, só as células, protoplastos, calos e embriões tecido). O tecido vegetal pode ser na planta ou em um órgão, tecido ou cultura celular da planta.

O termo "órgão da planta" refere-se ao tecido vegetal ou grupo de tecidos que constituem uma parte morfologicamente e funcionalmente distinta de uma planta. O termo "genoma" refere-se aos seguintes: (1) o complemento inteiro do material genético (genes e seqüências não- codificantes) que está presente em cada célula de um organismo, ou vírus ou organela; e/ou (2) um conjunto completo de cromossomos herdado como uma unidade (haplóide) a partir de um progenitor.

Assim, esta invenção também diz respeito um método para transformar uma célula, que compreende transformar uma célula com a construção recombinante da invenção e selecionar as células transformadas com a construção recombinante da invenção.

De igual interesse é o método para produzir uma planta transformada que compreende transformar uma célula vegetal com os polinucleotídeos delta-5 desaturase da presente invenção e regenerar a planta a partir de uma célula vegetal transformada.

Métodos para transformar dicotiledôneas (principalmente pelo uso de Agrobacterium tumefaciens) e obter plantas transgênicas têm sido publicados, entre outros, para: algodão (patente U.S. n° 5.004.863; patente U.S. n° 5.159.135); soja (patente U.S. n° 5.569.834; patente U.S. n° 5.416.011); Brassica (patente U.S. n° 5.463.174); amendoim (Cheng et al. célula vegetal Rep. 15:653-657 (1996); McKently et al. célula vegetal Rep. 14:699-703 (1995)); papaia (Ling, K. et al. Bio/technology 9:752-758 (1991)); e ervilha (Grant et al. célula vegetal Rep. 15:254-258 (1995)). para a análise de outros métodos comumente usados para transformação de plantas consulte Newell, C.A. (Mol. Biotechnol. 16:53-65 (2000)). Um desses métodos de transformação usa Agrobacterium rhizogenes (Tepfler, M. e Casse-Delbart, F. Microbioi Sei. 4:24-28 (1987)). A transformação de soja, usando métodos de entrega direta de DNA utilizando PEG fusão (PCT Publicação No. WO 92/17598), eletroporação tem sido publicados (Chowrira, GM et al., Mol Biotechnol. 3:17-23 (1995); Christou, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3962-3966 (1987)), microinjeção e bombardeamento de partículas (McCabe, D.E. et. al., Bio/Technology 6:923 (1988); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)).

Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais. O método específico de regeneração dependerá do tecido vegetal de partida e das espécies vegetais específicas a serem regeneradas. A regeneração, o desenvolvimento e a cultura de plantas a partir de transformantes protoplastos de uma única planta, ou de vários transformantes explantes é bem conhecido no estado da técnica (Weissbach e Weissbach, em: Methods for Plant Molecular Biology1 (Eds.), Academic: San Diego, CA (1988)). Esse processo de regeneração e crescimento inclui, tipicamente, as etapas de seleção de células transformadas e cultura dessas células individualizadas através dos habituais estágios de desenvolvimento embrionário, através de estágio de enraizamento da muda. Embriões e sementes transgênicos são regenerados de modo similar. Os brotos transgênicos resultantes enraizados são posteriormente plantados em um meio adequado para crescimento das plantas, como solo. Preferencialmente, as plantas regeneradas são auto-polinizáveis para fornecer plantas transgênicas homozigotas. Caso contrário, o pólen obtido das plantas regeneradas é usado para polinizar plantas de linhagens agronomicamente importantes e cultivadas a partir de semente. Inversamente, o pólen de plantas destas linhagens importantes é utilizado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção que contém um polipeptídeo desejado é cultivada por meio de métodos bem conhecidos pelo técnico no assunto.

Além dos procedimentos acima discutidos, os técnicos no assunto estão familiarizados com os materiais de recurso padrão que descrevem as condições e procedimentos específicos para: a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc); a geração de fragmentos de DNA recombinantes e construções de expressão recombinantes; e a triagem e isolamento de clones. Consulte, por exemplo: Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: NY (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor: NY (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, Vol.1, Cold Spring Harbor: NY (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, Vol.2, Cold Spring Harbor: NY (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997).

Exemplos de plantas de semente oleaginosa incluem, mas não estão limitados a: soja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão, Iinho e cártamo. Exemplos de AGPs que têm pelo menos vinte átomos de carbono e quatro ou mais ligações duplas carbono-carbono incluem, mas não estão limitados a, ácidos graxos ômega-3 como o EPA1 DPA e DHA e os ácidos graxos ômega-6 ARA. As sementes obtidas a partir de tais plantas também estão dentro do âmbito desta invenção, bem como os óleos obtidos a partir dessas sementes.

Dessa forma, em uma realização, essa invenção refere-se a uma planta com semente oleaginosa que compreende:

(a) uma primeira construção de DNA recombinante, que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo delta-5 desaturase, operacionalmente ligada a pelo menos uma seqüência reguladora;

e,

(b) pelo menos uma construção recombinante de DNA adicional que compreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado para pelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em uma delta-4 desaturase, uma delta-5 desaturase, uma delta-6 desaturase, uma delta-8 desaturase, uma delta-9 desaturase, uma delta-9 elongase, uma delta-12 desaturase, uma delta-15 desaturase, uma delta-17 desaturase, uma C14/16 elongase, uma C16/18 elongase, uma C18/20 elongase e uma C20/22 elongase.

Desaturases adicionais são discutidas, por exemplo, nas patentes U.S. η 0 6.075.183, n° 5.968.809, n° 6.136.574, n° 5.972.664, n° 6.051.754, n° 6.410.288 e PCT Publicações Nos. WO 98/46763, WO 98/46764, WO 00/12720 e WO 00/40705.

A escolha da combinação de cassetes usados depende em parte do perfil do AGP e/ou do perfil da desaturase/elongase das células vegetais oleaginosas a serem transformadas e da AGP de cadeia longa que deve ser expressa.

Em outro aspecto, esta invenção diz respeito a um método para produção de AGPs de cadeia longa em uma célula vegetal que compreende:

(a) transformar uma célula com a construção recombinante da invenção, e,

(b) selecionar aquelas células transformadas que formam AGPs de cadeias longas.

Em ainda outro aspecto, esta invenção diz respeito a um método para produzir pelo menos um AGP em uma célula de soja que compreende:

(a) transformar uma célula de soja com uma primeira construção de DNA recombinante que compreende:

(i) um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo delta-5 desaturase operacionalmente ligado a ao menos uma seqüência reguladora e,

(ii) pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional que compreendeum polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em uma delta-4 desaturase, uma delta-5 desaturase, uma delta-6 desaturase, uma delta-8 desaturase, uma delta-9 desaturase, uma delta-9 elongase, uma delta-12 desaturase, uma delta- 15 desaturase, uma delta-17 desaturase, uma C14/16 elongase, uma C16/18 elongase, uma C18/20 elongase e uma C20/22 elongase;

(b) regenerar uma planta de soja a partir das células transformadas da etapa (a); e,

(c) selecionar as sementes obtidas a partir das plantas da etapa (b), com uma alteração no nível de AGPs em comparação com o nível nas sementes obtidas a partir de uma planta de soja não transformada.

Em outras realizações preferenciais, a pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional codifica um polipeptídeo que tem atividade de delta-9 elongase, por exemplo, a delta- 9 elongase isolada ou derivada de Isochrysis galbana (n° acesso GenBank AF390174; lgD9e) ou a delta-9 elongase isolada ou derivada de Euglena gracilis.

Em outras realizações preferenciais, a pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional codifica um polipeptídeo que tem atividade de delta-8 desaturase. Por exemplo, a Publicação PCT N0 WO 2005/103253 (publicada em 22 de abril de 2005) divulga seqüências de aminoácidos e de ácidos nucléicos para uma enzima delta-8 desaturase a partir de Pavlova salina (ver também Publicação U.S. N0 2005/0273885). Sayanova et al. (FEBS Lett. 580:1946-1952 (2006)) descreve o isolamento e caracterização de um cDNA a partir de uma ameba Acanthamoeba castellanii viva e livre que, quando expresso em Arabidopsis, codifica uma C20 delta-8 desaturase. Ainda, o pedido co-pendente do cessionário de Pedido Provisório η 0 60/795810 depositado em 28 de abril de 2006 (Súmula do advogado n0 APA- 1566) divulga aminoácidos e seqüências de ácidos nucléicos para uma enzima delta-8 desaturase a partir de Pavlova lutheri (CCMP459). O Pedido Provisório U.S. n° 60/853563 (depositado em 23 de outubro de 2006; súmula do advogado N0. APA-1574) divulga seqüências de aminoácidos e de ácidos nucléicos para uma enzima delta-8 desaturase a partir de Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491, Eutreptiella sp. CCMP389 e Eutreptiella cf_gymnastica CCMP1594.

Sistemas de Expressão Microbiana. Cassetes ε Vetores, ε Transformação Os genes e produtos de delta-5 desaturase descritos neste documento (ou seja, o Peridinium sp. CCMP626 delta -5 desaturase, ou outras enzimas mutantes, enzimas códon-otimizadas ou homólogos das mesmas) também podem ser produzidas em células hospedeiras microbianas heterólogas, particularmente nas células de leveduras oleaginosas (por exemplo, Yarrowia lipolytica).

Os sistemas de expressão microbiana e vetores de expressão que contém seqüências reguladoras que dirigem expressão de alto nível de proteínas exógenas são bem conhecidas pelos técnicos no assunto. Qualquer um destes poderia ser utilizado para construir genes quiméricos para a produção de qualquer dos produtos do gene das seqüências instantâneas.

Estes genes quiméricos poderiam então ser introduzidos em microorganismos apropriados por meio de transformação para proporcionar expressão de alto nível das enzimas codificadas.

Os vetores ou cassetes de DNA úteis para a transformação das células hospedeiras microbianas adequadas são bem conhecidos no estado da técnica. A escolha de seqüências específicas presentes na construção é dependente dos produtos de expressão desejados (acima), da natureza das células hospedeiras, e dos meios propostos para a separação de células transformadas versus células não-transformadas. Tipicamente, no entanto, o vetor ou cassete contém seqüências que direcionam a transcrição e tradução do(s) gene(s) relevante(s), um marcador selecionável, e seqüências que permitam a replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados compreendem uma região 5' do gene que controla a iniciação transcricional (por exemplo, um promotor) e uma região 3' do fragmento de DNA que controla terminação transcricional (ou seja, um terminador). É da máxima preferência quando as duas regiões de controle são derivadas de genes a partir da célula hospedeira microbiana transformada, embora deva ser entendido que tais regiões de controle não precisam ser derivadas de genes nativos das espécies específicas escolhidas como um hospedeiro para produção.

As regiões de controle de início ou promotores que são úteis para dirigir a expressão instantânea das ORFs de delta-5 desaturase na célula hospedeira microbiana desejada são numerosas e familiares para os técnicos no assunto. Virtualmente qualquer promotor capaz de dirigir a expressão desses genes na célula hospedeira selecionada é adequado para a presente invenção. A expressão em uma célula hospedeira microbiana pode ser realizada de um modo temporário ou estável. A expressão transiente pode ser obtida pela indução da atividade de um promotor regulável operacionalmente ligado ao gene de interesse. A expressão estável pode ser obtida pelo uso de um promotor constitutivo operacionalmente ligado ao gene de interesse. Como um exemplo, quando a célula hospedeira é levedura, regiões funcionais transcricionais e de tradução em células de levedura são fornecidas, especialmente a partir de espécies hospedeiras (por exemplo, ver Publicação PCT N0 WO 2004/101757 e WO 2006/052870 para regiões reguladoras de iniciação transcricional preferenciais para uso em Yarrowia lipolytica). Qualquer uma de uma série de seqüências reguladoras pode ser usada, dependendo se transcrição constitutiva ou induzida é desejável, da eficiência do promotor ao manifestar o ORF de interesse, da facilidade de construção e similares.

As seqüências de nucleotídeos em torno do códon de iniciação de tradução "ATG" foram consideradas s usceptíveis de afetar a expressão em células de levedura. Se o polipeptídeo desejado é pouco expresso em leveduras, as seqüências de nucleotídeos de genes exógenos podem ser modificadas para incluir uma seqüência de iniciação de tradução eficiente para levedura, para obter expressão gênica ótima. Para expressão em levedura, isto pode ser feito pela mutagênese sítio-direcionada de um gene expresso ineficientemente pela fusão deste a um gene de levedura endógeno, de preferência um gene altamente expresso. Alternativamente, pode-se determinar a seqüência de iniciação de tradução consenso no hospedeiro e planejar essa seqüência em genes heterólogos para sua expressão ótima no hospedeiro de interesse.

A região de terminação pode ser derivada da região 3' do gene a partir da qual a região de iniciação foi obtida ou de gene diferente. Um grande número de regiões de terminação é conhecido e funcionam satisfatoriamente em uma variedade de hospedeiros (quando utilizadas nos mesmos e em diferentes gêneros e espécies de onde foram derivados). A região de terminação é normalmente selecionada mais como uma questão de conveniência, e não em virtude de qualquer propriedade particular. Preferencialmente, quando o hospedeiro microbiano é uma célula de levedura, a região de terminação é derivada de um gene de levedura (Saccharomyces particularmente, Schizosaccharomyces, Candida, Yarrowia ou Kluyveromyces). As regiões 3' de genes de mamíferos que codificam γ-interferon e a-2 interferon também são conhecidas por funcionar em levedura. As regiões de controle de terminação podem, também, ser derivadas de vários genes nativos para os hospedeiros preferenciais. Opcionalmente, um sítio de terminação pode ser desnecessário; entretanto, ele é da máxima preferência se incluído. Embora não se destina a limitar, as regiões de terminação úteis nesta descrição incluem: -100 bp da região 3' da protease extracelular de Yarrowia lipoiytica (XPR; n° de acesso GenBank M17741); Os terminadores de acil-CoA oxidase (Aco3: n° de acesso GenBank AJ001301 e n° CAA04661; Pox3: n° de acesso GenBank XP_503244); o terminador Pex20 (n° de acesso GenBank AF054613); o terminador Pex16 (n° de acesso GenBank U75433); o terminador Lipl (n° de acesso GenBank Z50020); o terminador Lip2 (n° de acesso GenBank AJ012632); e o terminador da 3-oxoacil-coA tiolase (OCT; n° de acesso GenBank X69988).

Como é conhecido do técnico no assunto, somente a inserção de um gene em um vetor de clonagem não garante que ele será expresso com êxito ao nível necessário. Em resposta à necessidade de uma elevada taxa de expressão, muitos vetores de expressão especializados foram criados através da manipulação de uma série de elementos genéticos que controlam diferentes aspectos da transcrição, tradução, estabilidade da proteína, limitação de oxigênio e secreção da célula hospedeira microbiana. Mais especificamente, algumas das características moleculares que têm sido manipuladas para controlar a expressão gênica incluem: (1) a natureza das seqüências promotoras e terminadoras transcricionais relevantes; (2) o número de cópias do gene clonado e se o gene é transportado por plasmídeo ou integrado no genoma da célula hospedeira; (3) a localização celular final da proteína exógena sintetizada; (4) a eficiência da tradução e dobramento correto da proteína no organismo hospedeiro; (5) a estabilidade intrínseca do mRNA e da proteína do gene clonado no interior da célula hospedeira; e (6) o uso de códon dentro do gene clonado, de tal forma que a sua freqüência se aproxima da freqüência de uso preferencial de códon da célula hospedeira. Cada um destes tipos de modificações é englobado na presente invenção, como meio para otimizar ainda mais a expressão delta-5 desaturase aqui descrita.

Depois que o DNA codifica um polipeptídeo adequado para uma expressão na célula hospedeira microbiana adequada (por exemplo, levedura oleaginosa) é obtido (por exemplo, um gene quimérico que compreende um promotor, ORF e terminador), ele é colocado em um vetor plasmídeo capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira, ou ele é diretamente integrado no genoma da célula hospedeira. A integração de cassetes de expressão pode ocorrer aleatoriamente dentro do genoma hospedeiro ou pode ser direcionada através do uso de contruções co ntendo regiões de homologia com o genoma hospedeiro suficientes para alcançar a recombinação no locus do hospedeiro. Quando construções são direcionadas para um locus endógeno, todas ou algumas das regiões reguladoras transcricionais e de tradução podem ser fornecidas ao locus endógeno.

Na presente invenção, o método preferencial de expressar em Yarrowia lipolytica é através da integração do DNA linear com o genoma do hospedeiro; e a integração em vários sítios dentro do genoma pode ser particularmente útil quando alto nível de expressão de genes é desejado [por exemplo, no locus Ura3 (n° de acesso GenBank AJ306421), no locus do gene Leu2 (n° de acesso GenBank AF260230), no gene Lys5 (n° de acesso GenBank M34929), no locus do gene Aco2 (n° de acesso GenBank AJ001300), no locus gene Pox3 (Pox3: n° de acesso GenBank XP_503244; ou, Aco3: n° de acesso GenBank AJ001301), no locus do gene delta-12 desaturase (Publicação PCT n0 WO 2004/104167), no locus do gene Lipl (n° de acesso GenBank Z50020) e/ou no locus do gene Lip2 (n° de acesso GenBank AJ012632)].

Vantajosamente, o gene Ura3 pode ser usado várias vezes em combinação com ácido 5-Fluororótico (5-fluorouracil-6-carboxílico monoidrato; "δ- FOA") seleção (infra), para permitir facilmente as modificações genéticas e para ser integrado no genoma de Yarrowia de uma forma fácil.

Quando dois ou mais genes são expressos a partir de vetores de replicação separados, é desejável que cada vetor tenha um meio diferente de seleção e deve também faltar homologia com a(s) outra(s) construção(s) para manter a expressão estável e impedir reagrupamento dos elementos entre construções. A escolha judiciosa das regiões reguladoras, meios de seleção e método de propagação da(s) construção(s) introduzida(s) podem ser determinadas experimentalmente, de modo que todos os genes introduzidos são expressos em níveis necessários para a síntese dos produtos desejados.

As construções que compreendem o gene de interesse podem ser introduzidas em uma célula hospedeira microbiana por qualquer técnica padrão. Estas técnicas incluem transformação (por exemplo, transformação de acetato de lítio [Methods in Enzymology1 194:186 - 187 (1991)]), fusão protoplástica, impacto bolístico, eletroporação, microinjecção, ou qualquer outro método que introduz o gene de interesse na célula hospedeira. Mais ensinamentos específicos aplicáveis para leveduras oleaginosas (ou seja, Yarrowia lipolytica) incluem U.S. 4.880.741 e U.S. 5.071.764 e Chen, D. C. et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)). Por conveniência, uma célula hospedeira que foi manipulada por qualquer método para ocupar uma seqüência de DNA (por exemplo, um cassete de expressão) será chamada de "transformada" ou "recombinante" neste documento. Assim, os termos "transformado" e "recombinante" são usados de maneira intercambiável no presente. O hospedeiro transformado terá pelo menos uma cópia da construção de expressão e pode ter duas ou mais, dependendo se o gene está integrado no genoma, amplificado ou está presente em um elemento extracromossômico que tem múltiplos números de cópias.

A célula hospedeira transformada pode ser identificada por diferentes técnicas de seleção, como descrito na PCT Publicação N0 WO 2004/101757 WO 2006/052870. Os métodos de seleção preferenciais para utilização neste documento são resistência à canamicina, higromicina e amino glicosídeo G418, bem como a capacidade de crescer em meios onde faltam uracil, leucina, lisina, histidina e triptofano. Em realizações alternativas, 5-FOA é utilizado para a seleção de leveduras mutantes de Ura. O composto é tóxico para células de levedura que têm um gene URA3 em funcionamento que codifica orotidina 5 '-monofosfato descarboxilase (OMP descarboxilase); Dessa forma, com base nesta toxicidade, 5-FOA é especialmente útil para a seleção e identificação de cepas mutantes de levedura Ura" (Bartel, PL e Fields, S., Yeast 2-Hybrid System, Oxford University: New York, v. 7, pp 109-147, 1997). Mais especificamente, um pode primeiro neutralizar o gene nativo Ura3 para produzir uma cepa com um fenótipo Ura, sendo que a seleção ocorre baseada em resistência a 5-FOA. Em seguida, um aglomerado de múltiplos genes quiméricos e um novo gene Ura3 podem ser integrados em um locus diferente do genoma de Yarrowia, para assim produzir uma nova cepa que tem um fenótipo Ura+. A integração subseqüente produz uma nova cepa Ura3 (novamente identificada usando seleção 5-FOA), quando o gene introduzido Ura3 está neutralizado. Assim, o gene Ura3 (em combinação com a seleção 5-FOA) pode ser usado como um marcador de seleção nas múltiplas sessões de transformação.

Seguindo a transformação, substratos adequados para a delta-5 desaturase instantânea (e, opcionalmente outras enzimas AGP que são co- expressas no interior da célula hospedeira) podem ser produzidos pelo hospedeiro quer naturalmente quer transgenicamente, ou eles podem ser fornecidos de maneira exógena.

As células hospedeiras microbianas para a expressão dos genes instantâneas e fragmentos de ácidos nucléicos podem incluir hospedeiros que crescem em uma variedade de matérias primas, incluindo carboidratos simples ou complexos, ácidos graxos, ácidos orgânicos, álcoois e óleos, e/ou hidrocarbonetos ao longo de uma vasta faixa de temperatura e pH. Com base nas necessidades do requerente cessionário, os genes descritos na presente invenção serão expressos em uma levedura oleaginosa (e em particular Yarrowia lipolytica); Entretanto, é entendido que porque transcrição, tradução e o aparato biossintético da proteína são altamente conservados, qualquer bactéria, levedura, alga e/ou fungo será um hospedeiro microbiano adequado para a expressão dos fragmentos do ácido nucléico presentes.

Os hospedeiros microbianos preferenciais, no entanto, são leveduras oleaginosas. Estes organismos são naturalmente capazes de síntese e acúmulo de óleo, sendo que o óleo pode compreender mais do que cerca de 25% do peso seco da célula, com mais preferência mais de que cerca de 30% do peso seco da célula, com a máxima preferência, mais do que 40% do o peso seco da célula. Os gêneros tipicamente identificados como leveduras oleaginosas incluem, mas não estão limitados a: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces. Mais especificamente, leveduras ilustrativas de síntese de óleo incluem: Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkeyii, L. lipoferus, Candida revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis, Trichosporon pullans, T. cutaneum, Rhodotorula glutinus, R. graminis, e Yarrowia lipolytica (anteriormente classificada como Candida lipolytica).

De máxima preferência é a levedura oleaginosa Yarrowia lipolytica; e, em outra realização, da máxima preferência são a cepas Y. lipolytica chamadas de ATCC n° 20362, ATCC n° 8862, n0 ATCC 18944, ATCC n° 76982 e/ou LGAM S (7) 1 (Papanikolaou S., e Aggelis G., Bioresour. Technoi 82(1):43-9 (2002)).

Historicamente, várias cepas de Y. lipolytica têm sido usadas para a fabricação e produção de: isocitrato liase; lipases; poliidroxialcanoato; ácido cítrico; eritritol; 2-ácido oxoglutarico; γ-decalactona; γ-dodecalatona; e ácido pirúvico. Os ensinamentos específicos aplicáveis para projetar a produção de ARA, EPA e DHA em V. lipolytica são fornecidos no pedido de Patente U.S. n° 11/264784 (WO 2006/055322), pedido de Patente U.S. n° 11/265761 (WO 2006/052870) e pedido de Patente U.S. n° 11/264737 (WO 2006/052871), respectivamente.

Outros hospedeiros microbianos preferenciais incluem bactérias, algas e outros fungos oleaginosos; e, dentro deste amplo grupo de hospedeiros microbianos, de particular interesse são os microorganismos que sintetizam ácidos graxos ômega-3/ômega-6 (ou aqueles que podem ser geneticamente projetados para este propósito [por exemplo, outras leveduras, como a Saccharomyces cerevisiae]). Assim, por exemplo, a transformação de Mortierella alpina (que é utilizado comercialmente para a produção da ARA) com qualquer um dos presentes genes delta-5 desaturase sob o controle de promotores induzíveis ou regulados poderiam produzir um organismo transformante capaz de sintetizar quantidades crescentes de DGLA O método de transformação de M. alpina é descrita por Mackenzie et al. (Appl. Environ. Microbiol., 66:4655 (2000)). Do mesmo modo, métodos para a transformação de microorganismos Thraustochytriales são apresentado na US 7.001.772.

Com base nos ensinamentos acima descritos, em uma realização, esta invenção é atraída para um método de produção, quer ARA ou ΑΡΕ, respectivamente, que compreende:

(a) proporcionar uma levedura oleaginosa que compreende:

(i) uma primeira construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo delta-5 desaturase, operacionalmente ligados a pelo menos uma seqüência reguladora; e,

(ii) uma fonte de substrato desaturase que consiste em DGLA ou de ETA, respectivamente, e,

(b) cultura da levedura da etapa (a) na presença de uma fonte de carbono fermentável adequada, sendo que o gene que codifica o polipeptídeo delta-5 desaturase é expresso e DGLA é convertido para ARA ou ETA é convertido para EPA, respectivamente, e,

(c) opcionalmente recuperar o ARA ou ΑΡΕ, respectivamente, da etapa (b).

Alimentação de substrato pode ser necessária.

Evidentemente, uma vez que AGPs produzidos naturalmente em levedura oleaginosa são limitados a ácidos graxos 18:2 (isto é, LA), e menos comumente, ácidos graxos 18:3 (ou seja, ALA), em realizações preferenciais da presente invenção, a levedura oleaginosa será geneticamente projetada para expressar várias enzimas necessárias para a biossíntese de AGP de cadeia longa (por meio disso, permitindo a produção de, por exemplo, ARA, EPA, DPA e DHA), além das delta-5 desaturases aqui descritas.

Especificamente, em uma realização, a presente invenção diz respeito a uma levedura oleaginosa que compreende:

(a) uma primeira construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo delta- õdesaturase, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora; e,

(b) pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional que compreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: uma delta-4 desaturase, uma delta-5 desaturase, delta-6 desaturase, uma delta-9 desaturase, uma delta-12 desaturase, uma delta-15 desaturase, uma delta-17 desaturase, uma delta-9 elongase, uma C14/16 elongase, uma C16/18 elongase, uma C18/20 elongase e uma C20/22 elongase.

Em realizações particularmente preferenciais, a pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional codifica um polipeptídeo que tem atividade de delta-9 elongase, por exemplo, a delta- 9 elongase isolada ou derivada de Isochrysis galbana (n° de acesso GenBank AF390174; lgD9e ou lgD9eS) ou a delta-9 elongase isolada ou derivada de Euglena gracilis.

Engenharia Metabólica de Biossíntese de Ácidos Graxos Ômega-3 e/ou Ômega-6 em Micróbios

Os métodos para manipulação de vias bioquímicas são bem conhecidos para os técnicos no assunto; e, espera-se que muitas manipulações serão possíveis para maximizar a biossíntese do ácido graxo ômega-3 e/ou ômega-6 em leveduras oleaginosas e, particularmente, em Yarrowia lipolytica. Esta manipulação pode exigir engenharia metabólica diretamente dentro da via biossintética AGP ou manipulação coordenada adicional de várias outras vias metabólicas.

No caso de manipulações dentro da via biossintética AGP, pode ser desejável, para aumentar a produção de LA, que se permita um aumento da produção de ácidos graxos ômega-6 e/ou ômega-3. Os genes de introdução e/ou ampliação que codificam delta-9 e/ou delta-12 desaturases podem conseguir isso. Para maximizar a produção de ácidos graxos ômega-6 insaturados, é bem conhecido pelo técnico no assunto que a produção é favorecida em um microorganismo hospedeiro que é substancialmente isento de ALA; dessa forma, preferencialmente, o hospedeiro é selecionado ou obtido por remoção ou inibição de atividade de desaturase tipo delta-15 ou ômega-3 que permitem a conversão de LA para ALA. Alternativamente, pode ser desejável maximizar a produção de ácidos graxos ômega-3 (e minimizar síntese de ácidos graxos ômega-6). Nesse exemplo, pode-se utilizar um microrganismo hospedeiro onde a atividade delta-12 desaturase que permite a conversão de ácido oléico para LA é removido ou inibido; subseqüentemente, cassetes de expressão adequados seriam introduzidos no hospedeiro, juntamente com substratos apropriados (por exemplo, ALA) para a conversão de ácidos graxos ômega-3 derivados de ALA (por exemplo, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA, DHA).

Em realizações alternativas, as vias bioquímicas que concorrem com a via biossintética de ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6 por energia ou carbono, ou enzimas da via biossintética nativa AGP que interferem com a produção de um determinado produto final, AGP, podem ser eliminadas por divisão de gene ou regulados para baixo por outros meios (por exemplo, mRNA antisenso).

Discussão detalhada das manipulações dentro da via biossintética AGP como um meio para aumentar ARA, EPA ou DHA (e técnicas associadas das mesmas) são apresentadas na publicação PCT n° WO 2006/055322, WO 2006/052870 e WO 2006/052871, respectivamente, bem como as manipulações desejáveis na via biossintética TAG e via de degradação TAG (e técnicas associadas das mesmas).

Dentro do contexto da presente invenção, pode ser útil para modular a expressão da via biossintética de ácido graxo por qualquer uma das estratégias acima descritas. Por exemplo, a invenção fornece métodos onde genes que codificam enzimas fundamentais na via biossintética delta-9 elongase / delta-8 desaturase são introduzidos em leveduras oleaginosas para produção de ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6. Será particularmente útil expressar os genes deIta-5 desaturase em leveduras oleaginosas que não apresentam, naturalmente, vias biossintética de ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6, e coordenar a expressão desses genes, para maximizar a produção dos produtos AGPs preferenciais usando vários meios para a engenharia metabólica do organismo hospedeiro.

Processos de Fermentação Microbiana para Produção de AGP

A célula hospedeira transformada é cultivada em condições que otimizam a expressão de genes desaturase quiméricos e produzem melhores e mais econômicos rendimentos de AGPs de interesse. Em geral, condições do meio que podem ser otimizadas incluem o tipo e a quantidade da fonte de carbono, o tipo e a quantidade da fonte de nitrogênio, a razão carbono- nitrogênio, a quantidade de íons minerais diferentes, o nível de oxigênio, aumento de temperatura, pH, comprimento da fase de produção da biomassa, comprimento da fase de acúmulo de óleo e o tempo e método de colheita de célula. As Yarrowia lipolytica geralmente são cultivadas em meios complexos (por exemplo, extrato de levedura, caldo de peptona-dextrose (YPD)) ou um meio mínimo definido que carece de um componente necessário para o crescimento e, assim, força a seleção dos desejados cassetes de expressão (por exemplo, LeveduraAzoto Básica (DIFCO Laboratories, Detroit, Ml)).

O meio de fermentação na presente invenção precisa conter uma adequada fonte de carbono. As fontes de carbono adequadas são ensinadas na Publicação PCT N0 WO 2004/101757. Embora seja esperado que a fonte de carbono utilizada na presente invenção possa abranger uma grande variedade de fontes de carbono, as fontes de carbono preferenciais são açúcares, glicerol e/ou ácidos graxos. As de máxima preferência são glicose e/ou ácidos graxos contendo entre 10 e 22 carbonos. O Nitrogênio pode ser fornecido a partir de uma fonte inorgânica (por exemplo, (NH4)2SO4) ou orgânica (por exemplo, uréia ou glutamato). Em adição às fontes adequadas de carbono e nitrogênio, o meio adequado de fermentação precisa conter minerais, sais, cofatores, tampões e outros componentes conhecidos pelostécnicos no assunto, adequados para o crescimento das culturas e promoção de uma via enzimática, necessária para produção de AGP. Particular atenção é dada aos vários íons metálicos (por exemplo, Mn+2, Co+2' Zn+2' Mg+2) que promovem a síntese de lipídeos e AGPs (Nakahara, T. et al., Appl. Single Cell Oils, D. J. Kyle and R. Colin, eds. pp 61-97 (1992)).

Os meios de crescimento preferenciais na presente invenção são meios comuns preparados comercialmente, como levedura a base de nitrogênio (DIFCO Laboratories, Detroit1 Ml). Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos podem também ser utilizados, bem como o meio adequado para o crescimento das células do hospedeiro transformantes será conhecido por um técnico de microbiologia ou ciência da fermentação. A faixa de pH adequada para a fermentação é normalmente entre cerca de pH 4,0 a pH 8,0, onde pH 5,5 a pH 7,5 é preferencial como a faixa para as condições iniciais do crescimento. A fermentação pode ser conduzida sob condições aeróbicas e anaeróbicas, sendo que as condições microaeróbicas são preferenciais.

Tipicamente, o acúmulo de elevados níveis de AGPs em células de levedura oleaginosa requer um processo em dois estágios, uma vez que o estado metabólico precisa ser "equilibrado" entre o crescimento e a síntese/armazenamento de gorduras. Dessa forma, com a máxima preferência, um processo de fermentação em dois estágios é necessário para a produção de AGPs em leveduras oleaginosas (e.g., Yarrowia lipolytica). Esta abordagem é descrita na Publicação PCT N0 WO 2004/101757, como são vários projetos de processos de fermentação adequados (ou seja, por batelada, por batelada com alimentação e contínuo) e considerações durante o crescimento. Purificação E Processamento de Óleos AGP

Os AGPs podem ser encontrados em plantas e microorganismos hospedeiros como ácidos graxos livres ou em formas esterificadas como acil gliceróis, fosfolipídeos, sulfolipideos ou glicolipídieos, e podem ser extraídos das células hospedeiras através de uma variedade de meios bem conhecidos no estado da técnica. Uma revisão de técnicas de extração, qualidade de análise e padrões de aceitabilidade para lipídeos de levedura é o de Z. Jacobs (Critical Reviews in Biotechnology, 12(5/6):463-491 (1992)). Uma breve revisão do processamento a jusante também está disponível em A. Singh e O. Ward (Adv. Appl. Microbiol., 45:271-312 (1997)).

Em geral, os meios para a purificação de AGPs podem incluir extração com solventes orgânicos, sonicação, extração de fluido supercrítica (por exemplo, usando o dióxido de carbono), saponificação e meios físicos, como prensas, ou combinações dos mesmos. Consulte a Publicação PCT N 0 WO 2004/101757 para obter detalhes adicionais. Métodos para isolamento de óleos de sementes são bem conhecidos no estado da técnica: (Young et al., Processing of Fats and Oils, In The Lipid Handbook, Gunstone et al., eds., Chapter 5 pp 253-257; Chapman & Hall: London (1994)). Por exemplo, óleo de soja é produzido usando uma série de etapas que envolvem a extração e purificação de um produto de óleo comestível a partir de sementes oleaginosas. Os óleos e subprodutos de soja são produzidos usando as etapas generalizadas mostradas na tabela 3.

Tabela 3

Etapas Generalizadas para Produção de Óleo de Soja E Subprodutos

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Mais especificamente, as sementes de soja são limpas, temperadas, descascadas e floculadas, aumentando assim a eficiência da extração de óleo. A extração de óleo é normalmente realizada por solvente (por exemplo, hexano), mas também pode ser conseguida por uma combinação de pressão física e/ou extração por solvente. O óleo resultante é chamado de óleo bruto. O óleo bruto pode ser degomado por hidratantes fosfolipídeos e outros complexos lipídicos polares e neutros que facilitam a sua separação da fração triglicerídeos não hidratante (óleo de soja). As gomas lecitina resultantes podem ser tratados posteriormente para produzir comercialmente importantes produtos de Iecitina usados em uma variedade de alimentos e produtos industriais, como agentes de emulsificação e liberação (ou seja, não adesivos). O óleo degomado pode ser aperfeiçoado para a remoção de impurezas (principalmente ácidos graxos livres, gomas e pigmentos residuais). O refino é realizado através da adição de um agente cáustico que reage com ácidos graxos livres para formar sabão, hidratos fosfatídeo e proteínas no óleo bruto. A água é usada para remover vestígios de sabão formados durante o refino. A "borra" (soapstock), um subproduto, pode ser usada diretamente na alimentação animal ou acidulada para recuperar os ácidos graxos livres. A cor é removida através de adsorção com terra descolorante que remove a maioria dos compostos de clorofila e carotenóides. O óleo refinado pode ser hidrogenado, resultando assim em gorduras com várias propriedades de fusão e texturas. A preparação para o inverno (fracionamento) pode ser usada para remover a estearina do óleo hidrogenado através de cristalização sob condições cuidadosamente controladas de resfriamento. A desodorização (principalmente através de destilação a vácuo) é o último passo e é projetado para remover compostos que conferem odor ou sabor ao óleo. Outros valiosos subprodutos, como esteróis e tocoferóis podem ser removidos durante o processo de desodorização. Os destilados desodorizados que contém esses subprodutos podem ser vendidos para a produção de vitamina E natural e outros produtos de alto valor farmacêutico. Os óleos e gorduras refinados, alvejados, (hidrogenado, fracionado) e desodorizados podem ser embalados e vendidos diretamente ou ainda processados em produtos mais especializados. Uma análise mais pormenorizada referente ao processamento de sementes de soja, produção e utilização de óleo de soja e seus derivados pode ser encontrada em Erickson, Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization, The American Oil Chemists' Society and United Soybean Board (1995). O óleo de soja é um líquido à temperatura ambiente, porque ele tem teores relativamente baixos de ácidos graxos saturados, em comparação com óleos como o de coco, de palma, de caroço de palma e de manteiga de cacau.

Óleos vegetais e microbianos contendo AGPs que foram refinadas e/ou purificados podem ser hidrogenados, para assim resultar em gorduras com diversas propriedades de fusão e texturas. Muitas gorduras processadas (incluindo coberturas, gorduras de confeitaria, manteigas, margarinas, gordura vegetal, etc) exigem diferentes graus de solidez à temperatura ambiente e só podem ser produzidos através da alteração das propriedades físicas da fonte do óleo. Isto é mais comumente realizado através de hidrogenação catalítica.

A hidrogenação é uma reação química na qual hidrogênio é adicionado às ligações duplas de ácido graxo insaturado com o auxílio de um catalisador como níquel. Por exemplo, o óleo de soja alto oléico contém oléicos insaturados, LA e ácidos graxos linolênicos e cada um destes pode ser hidrogenado. A hidrogenação tem dois efeitos primários. Primeiro, a estabilidade oxidativa do óleo é aumentada como conseqüência da redução do teor de ácidos graxos insaturados. Em segundo lugar, as propriedades físicas do óleo são alteradas porque as alterações dos ácidos graxos aumentam o ponto de fusão, resultando em uma gordura semilíquida ou sólida em temperatura ambiente.

Existem muitas variáveis que afetam a reação de hidrogenação que, por sua vez, altera a composição do produto final. As condições de operação, incluindo pressão, temperatura, tipo de catalisador e concentração, agitação e design do reator estão entre os mais importantes parâmetros que podem ser controlados. As condições de hidrogenação seletivas podem ser usadas para hidrogenar os ácidos graxos mais insaturados, em detrimento dos menos insaturados. Muito pouca ou hidrogenação de "pincelada" é freqüentemente empregada para aumentar a estabilidade de óleos líquidos. Adicional hidrogenação converte um óleo líquido para uma gordura fisicamente sólida. O grau de hidrogenação depende do desempenho desejado e características de fusão projetadas para um produto final específico. A gordura vegetal líquida (usada na fabricação de produtos de panificação, gorduras sólidas e gorduras vegetais usadas para operações comerciais de fritar e assar) e o estoque básico para fabricação de margarinas estão entre as miríades de possíveis produtos de óleos e gorduras obtidos através de hidrogenação. Uma descrição mais detalhada da hidrogenação e produtos hidrogenados pode ser encontrada em Patterson1 Η. B. W., Hydrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice. The American Oil Chemists' Society (1994).

Os óleos hidrogenados tornaram-se um tanto controversos, devido à presença de isômeros de ácidos graxos trans que resultam do processo de hidrogenação. A ingestão de grandes quantidades de isômeros trans tem sido associada com efeitos nocivos a saúde, incluindo um aumento das razões de lipoproteínas de baixa densidade para alta densidade no plasma sangüíneo e aumento do risco dé doença coronária.

Os ÓLEOS QUE CONTÉM AGP PARA USO EM GÊNEROS ALIMENTÍCIOS

O mercado atualmente suporta uma grande variedade de produtos alimentícios e refeições, incorporando ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6 (particularmente ARA, EPA e DHA). É observado que os óleos vegetais ou de sementes, as sementes modificadas e óleos microbianos da invenção que compreendem AGPs irão funcionar em produtos alimentícios e refeições, para transmitir os benefícios de saúde das atuais formulações. Comparado com outros óleos vegetais, acredita-se que os óleos da invenção funcionam de forma semelhante a outros óleos em aplicações alimentícias a partir de um ponto de vista físico (por exemplo, óleos parcialmente hidrogenados, como óleo de soja são amplamente usados como ingredientes para coberturas, margarina e gordura vegetal para fritar e assar).

Os óleos vegetais e os de sementes, as sementes modificadas e óleos microbianos contendo ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6, conforme descritos a seguir serão adequados para uso em uma variedade de alimentos e produtos para alimentação animal, incluindo, mas não limitados a: alimentos análogos, produtos à base de carne, produtos à base de cereais, alimentos assados, biscoitos e salgadinhos e produtos lácteos. Adicionalmente, os presentes óleos vegetais e os de sementes, as sementes modificadas e óleos microbianos podem ser usados em formulações para conferir benefício à saúde, incluindo nutricionais médicos, suplementos dietéticos, fórmulas para bebês, bem como os produtos farmacêuticos. O técnico no assunto de processamento e formulação de alimentos irá compreender que quantidade e em qual composição os óleos vegetais e microbianos podem ser acrescentados aos produtos alimentícios e refeições . Esta quantidade será mencionada neste documento como uma quantidade "eficaz" e dependerá do tipo de produto, da dieta que o produto se destina a complementar ou a condição médica que o médico ou nutricionista se destina a corrigir ou tratar.

Os análogos de alimentos podem ser produzidos usando processos bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Podem ser mencionados os análogos de carne, análogos de queijo, análogos de leite e similares. Os análogos de carne produzidos a partir de soja contêm proteína de soja e tofu ou outros ingredientes misturados entre si para simular diversos tipos de carnes. Essas carnes alternativas são vendidas como carnes congeladas, secas ou alimentos enlatados. Geralmente, elas podem ser usadas da mesma forma que os alimentos que substituem. As carnes alternativas feitas a partir de soja são excelentes fontes de proteínas, ferro e vitaminas B. Exemplos de análogos de carne incluem, mas não estão limitados a: análogos de presunto, análogos de salsicha, análogos de toucinho e similares.

Os análogos de alimentos podem ser classificados como imitação ou substitutos, dependendo de suas características funcionais e de composição. Por exemplo, uma imitação de queijo só precisa parecer com o queijo a que se destina a substituir. Entretanto, um produto pode geralmente ser chamado um substituto de queijo só se for nutricionalmente equivalente ao queijo que está substituindo e cumpre os requisitos mínimos de composição para aquele queijo. Assim, ο substituto de queijo vai muitas vezes ter maiores níveis protéicos do que a imitação de queijo e ser enriquecido com vitaminas e minerais.

Os produtos alimentícios análogos de lácteos ou de não lácteos incluem, mas não estão limitados a, imitações de sobremesas congeladas lácteas e não lácteas (por exemplo, aquelas feitas a partir de produtos de soja e/ou proteína de soja).

Os produtos de carne abrangem uma grande variedade de produtos. Nos Estados Unidos "carne" inclui "carnes vermelhas" produzidas a partir de bovinos, porcos e ovelhas. Além das carnes vermelhas, existem aves, que incluem frangos, perus, gansos, guineas, os patos e também existem os peixes e crustáceos. Existe um amplo sortimento de produtos de carne processada e temperada: fresca, curada e frita, e curada e cozida. Salsichas e cachorros quentes são exemplos de produtos de carne processada. Assim, o termo "carne", conforme usado neste documento inclui, mas não está limitado a produtos de carne processada.

Um produto alimentício a base de cereal é um produto alimentício resultante do processamento de um grão de cereal. Um grão de cereal inclui todas as plantas da família das gramíneas que produzem grãos comestíveis (sementes). Os mais populares grãos são cevada, milho, milheto, aveia, quinoa, arroz, centeio, sorgo, triticale, trigo e arroz selvagem. Exemplos de um produto alimentício a base de cereal incluem, mas não estão limitados a: grãos inteiros, grãos esmagados, farinha grosseira, farinha, farelo, germe, cereais para desjejum, alimentos extrudados, massas e similares.

Um produto "assado" compreende qualquer dos produtos a base de cereal mencionados acima que tem sido cozido ou processado em uma forma comparável à cozedura (ou seja, seco ou endurecido ao ser submetido a calor). Exemplos de um produto assado incluem, mas não estão limitados a: pães, bolos, sonhos, massas, migalhas de pão, salgadinhos fritos, mini- biscoitos, mini-crackers, mini-cookies, e mini-pretzels. Como foi mencionado anteriormente, o óleo da invenção pode ser usada como ingrediente.

Um produto alimentício compreende qualquer um dos produtos alimentícios descritos acima ou abaixo.

Um produto alimentício frito compreende qualquer um dos produtos alimentícios descritos acima ou abaixo, que tenha sido frito.

Um produto alimentício saudável refere-se a qualquer produto alimentício que transmite um benefício de saúde. Muitos produtos alimentícios derivados de oleaginosas podem ser considerados saudáveis.

A bebida pode estar em forma líquida ou como um pó seco.

Por exemplo, podem ser mencionadas bebidas não-carbonatadas, como sucos de frutas frescos, congelados, enlatados ou concentrado; leite puro ou aromatizado, etc. As fórmulas nutricionais para adultos e bebês são bem conhecidas no estado da técnica e comercialmente disponíveis (por exemplo, Similac®, Ensure®, Jevity®, e Alimentum® de Ross Products Division, Abbott Laboratories).

As fórmulas para bebês são líquidos ou pó reconstituídos para alimentar lactentes e crianças jovens. A "fórmula para bebês" é definida aqui como um produto nutricional enteral, que pode ser substituído por leite humano na alimentação infantil e normalmente é composta de um percentual de gordura desejado, misturada com percentuais de carboidratos e proteínas desejados em uma solução aquosa (por exemplo, ver Patent U.S. No. 4.670.285). Baseado em estudos de composição no mundo inteiro, bem como níveis especificados por grupos de peritos, o leite humano médio contém normalmente cerca de 0,20% a 0,40% de ácidos graxos total (presumindo cerca de 50% de calorias a partir de gordura); e, em geral, a razão de DHA para ARA se situa entre cerca de 1:1 para 1:2 (ver, por exemplo, formulações de Enfamil LIPIL™ (Mead Johnson & Company) e Similac Advance™ (Ross Products Division, Abbott Laboratories)). As fórmulas para bebês têm um papel especial a desempenhar na dieta das crianças porque elas são muitas vezes a única fonte de nutrientes para lactentes; e, apesar do aleitamento materno ainda ser o melhor alimento para lactentes, a fórmula infantil é como segunda opção suficiente não só para que os bebês sobrevivam, mas que também prosperem.

Um produto lácteo não é um produto derivado do leite. Um produto análogo lácteo ou não lácteo é obtido a partir de uma fonte diferente do leite, por exemplo, leite de soja, como discutido acima. Esses produtos incluem, mas não estão limitados a: leite integral, leite desnatado, produtos de leite fermentado como iogurte ou leite azedo, nata, manteiga, leite condensado, leite desidratado, branqueador de café, formador de cremosidade para café, sorvete, queijo, etc.

Produtos alimentícios adicionais, em que os óleos que contém AGPs da invenção podem ser incluídos são, por exemplo, gomas de mascar, confeitos e coberturas, gelatinas e pudins, balas macias e duras, compotas e geléias, açúcar branco granulado, açúcar substitutos, molhos doces, coberturas e xaropes e misturas em pó.

OLEOS QUE CONTEM AGP PARA USO EM PRODUTOS ALIMENTICIOS SAUDAVEIS E FARMACEUTICOS

Um produto alimentício saudável é qualquer produto alimentício que transmite um benefício de saúde e inclui alimentos funcionais, alimentos medicinais, nutricionais e suplementos medicinais dietéticos. Adicionalmente, os óleos vegetais e de sementes, as sementes modificadas e óleos microbianos da invenção pode ser usados em composições farmacêuticas padrão (por exemplo, o AGP de cadeia longa que contém óleos poderia facilmente ser incorporado em qualquer um dos produtos alimentícios acima mencionados, para assim produzir um alimento funcional ou médico). As formulações mais concentradas que compreendem AGPs incluem cápsulas, pós, comprimidos, pílulas, cápsula de gel, líquidos concentrados e emulsões, que podem ser usados como um suplemento dietético em seres humanos ou animais.

Os óleos que contém AGP para uso na alimentação animal

As rações para animais são genericamente aqui definidas como produtos destinados à alimentação ou a mistura na alimentação de animais não humanos. Os óleos vegetais e de sementes, as sementes modificadas e óleos microbianos da invenção pode ser usados como ingredientes em diversos alimentos para animais.

Mais especificamente, embora não se limitando a isso, espera- se que os óleos da invenção possam ser usados dentro de produtos alimentícios para animais de estimação, ruminantes, aves e em produtos alimentícios destinados a aquacultura. Os produtos alimentícios para animais de estimação são os produtos destinados à alimentação de um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos, pássaros, répteis, roedores). Estes produtos podem incluir o cereal e produtos alimentícios saudáveis acima, bem como carnes e subprodutos de carnes, produtos de proteína de soja, produtos de feno e capim (por exemplo, alfafa, aveia ou legumes). Os produtos alimentícios para ruminantes e aves são aqueles onde o produto é destinado à alimentação de um animal (por exemplo, perus, galinhas, gado bovino e suínos). Tal como acontece com os alimentos para animais de estimação acima, estes produtos podem incluir cereais e produtos alimentícios saudáveis, produtos de proteína de soja, carnes e subprodutos de carne, e produtos de feno e capim conforme listado acima. Os produtos alimentícios agrícolas são os produtos destinados a ser utilizados em fazendas aquáticas, ou seja, que diz respeito à propagação, cultura ou criação de organismos aquáticos e/ou animais em água doce ou salgada.

Exemplos

A presente invenção está adicionalmente definida nos exemplos a seguir. Deve ficar entendido que estes exemplos, apesar de indicarem realizações preferenciais da invenção, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e destes exemplos, um técnico no assunto pode conhecer as características essenciais desta invenção e, sem que se desvie do caráter e âmbito da mesma, podemos fazer várias alterações e modificações na invenção para adaptá-la às suas diferentes utilizações e condições.

Métodos Gerais

As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecular usadas nos exemplos são bem conhecidas no estado da técnica, e descritas por Sambrook, J., Fritsch, E. F. 1.) Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989) (Maniatis); 2.) T. J. Silhavy, M. L. Bennan, e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); e 3.) Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley- lnterscience, Hoboken, NJ (1987).

Os materiais e métodos adequados para a manutenção e o crescimento de culturas microbianas são bem conhecidos no estado da técnica. As técnicas adequadas para utilização nos seguintes exemplos podem ser encontradas de acordo com o Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology. Washington, D.C. (1994)); ou por Thomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd ed., Sinauer Associates: Sunderland, MA (1989). Todos os reagentes, enzimas de restrição e materiais usados para o crescimento e manutenção de células microbianas foram obtidas a partir de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), DIFCO Laboratories (Detroit, Ml), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a não ser que indicado de outra forma. Células de Ε. coli (XLI-Azul) competentes foram compradas da Stratagene Company (San Diego, CA). As cepas de E. coli foram cultivados tipicamente a 37°C em placas Luria Bertani (LB).

A clonagem molecular geral foi realizada de acordo com métodos padrão (Sambrook et al., acima). A seqüência de DNA foi gerada em um seqüenciador automático ABI usando tecnologia corante terminador (Patente U.S. 5.366.860; PE 272.007) usando uma combinação de vetor e iniciadores específicos de inserção. A edição da seqüência foi realizada em Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). Todas as seqüências representam cobertura de pelo menos duas vezes nos dois sentidos. Exceto onde indicado em contrário, as comparações de seqüências genéticas foram realizadas usando software DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, Wl).

O significado das siglas é o seguinte: "sec" significa segundo(s), "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "d" significa dia(s), "pL" significa microlitro(s), "mL" significa millilitro(s), "L" significa litro(s), "μΜ" significa micromolar, "mM" significa millimolar, "M" significa molar, "mmol" significa millimole(s), "pmole" significa micromole(s), "g" significa grama(s), "pg" significa micrograma(s), "ng" significa nanograma(s), "U" significa unidade(s), "bp" significa pares(s) de base e "kB" significa kilobase(s).

Transformação E Cultivacão de Yarrowia Lipolytica

Yarrowia lipolytica cepa ATCC #20362 foi adquirido da Coleção Americana de Cultura de Tipos (Rockville, MD). Cepas de lipolytica eram normalmente cultivadas a 28°C em YPD ágar (1% de extrato levedura, 2% de bactopeptona, 2% de glicose, 2% de ágar).

A transformação de Y. lipolytica foi realizada de acordo com o método de Chen, D. C. et al. (Appl. Microbiol Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)), exceto onde especificado em contrário. Resumidamente, Yarrowia foi aplicada por esfregaço em uma placa YPD e cultivada a 30°C por aproximadamente 18 horas. Várias "loopfuls" grandes de células foram raspadas da placa e postas em ressuspensão em 1 mL de tampão de transformação contendo: 25 mL de PEG 50%, peso molecular médio 3350; 0,125 mL de acetato de Li 2 M, pH 6,0; 0,125 mL de TDT 2 M; e 50 mg de DNA de esperma do salmão cisalhado. Depois, aproximadamente 500 ng de DNA plasmidial linear foi incubado em 100 pL de células em ressuspensão, e mantidos a 39°C durante 1 hora com mistura por vórtice em intervalos de 15 minutos. As células foram colocadas em placas com o meio selecionado e mantidas a 30°C durante 2 a 3 dias.

Para seleção de transformantes, meio mínimo ("MM") foi geralmente usado; a composição de MM é a seguinte: 0,17% de base nitrogenada de levedura (DIFCO Laboratories, Detroit, Ml) sem sulfato de amônio ou aminoácidos, 2% de glicose, 0,1% prolina, pH 6,1). Suplementos de uracil foram adicionados como adequado para uma concentração final de 0,01% (produzindo assim meio de seleção "MMU", preparado com ágar 20 g/L).

Alternativamente, transformantes foram selecionados em meios de seleção de ácido 5-ácido fluororótico ("FOA"; também ácido 5-fluorouracil-6- carboxílico monoidratado), compreendendo: 0,17% base nitrogenada de levedura (DIFCO Laboratories) sem sulfato de amônio ou aminoácidos, 2% glicose, 0,1% prolina, uracil 75 mg/L, uridina 75 mg/L, FOA 900 mg/L (Zymo Research Corp, Orange, CA) e ágar 20 g/L.

Análise de Ácidos Graxos deYarrowia Lipolytica

Para análise dos ácidos graxos, as células foram coletadas por centrifugação e lipídeos foram extraídos como descrito no Bligh, EG & Dyer, W. J. (Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-917 (1959)). Os ácidos graxos de metil ésteres foram preparados por transesterificação do extrato lipídico com metóxido de sódio (Roughan, G., I. e Nishida, Arch Biochem Biophys., 276 (1):38-46 (1990)) e posteriormente analisados com um cromatógrafo Hewlett GC-Packard 6890 equipado com uma coluna 30-m X 0,25 mm (id) INNOWAX-HP (Hewlett-Packard). A temperatura do forno era de 170°C (25 min no início) a 185°C a 3,5°C/min.

Para transesterificação de base direta, cultura de Yarrowia (3 mL) foi colhida, lavada uma vez em água destilada, e seca sob vácuo em uma Speed-Vac por 5 a 10 minutos.

Metóxido de sódio (100 pL de 1%) foi acrescentado à amostra e, em seguida, a amostra foi misturada por vórtice e agitada por 20 minutos. Depois de adicionar 3 gotas de NaCl 1 M e 400 μL de hexano, a amostra foi misturada por vórtice e agitada. A camada superior foi retirada e analisada por cromatografia gasosa, conforme descrito acima.

Exemplo 1

PERFIL LlPÍPICO E ISOLAMENTO DE RNA DE PERIDINIUM SP. CCMP626

Peridinium sp. CCMP626 (algas vermelhas) foi comprado do Centro Nacional de Cultura da Marinha Provasoli-Guillard Fitoplâncton (Boothbay Harbor, Maine). Cerca de 200 mg de células foram secas durante 5 min a vácuo, ressuspendidas em 100 pL de hidróxido trimetilsulfônio (TMSH) e incubadas em temperatura ambiente por 15 min com agitação. Após isto, 0,5 mL de hexano foi adicionado e os frascos foram incubados durante 15 minutos em temperatura ambiente com agitação. Os ésteres metílicos de ácidos graxos (5 pL injetados da camada de hexano) foram separados e quantificados usando um cromatógrafo de fase gasosa Hewlett- Packard 6890 equipado com uma com coluna capilar Omegawax 320 sílica fundida (Catálogo # 24152, Supelco Inc., Bellefonte, PA). A temperatura do forno foi programada para permanecer a 220°C por 2 a 7 min, aumentar para 240°C a 20°C/min, e depois permanecer a 240°C por 2,3 min. O gás de arraste foi fornecido por um gerador de hidrogênio Whatman. Os tempos de retenção foram comparados aos de ésteres metílicos de padrões disponíveis comercialmente (Catálogo # U-99-A, Nu-Chek Prep, Inc., Elysian, MN) e o cromatograma resultante é apresentado na figura 2.

O perfil cromatográfico demonstraram que células de Peridinium sp. CCMP626 produziram grandes quantidades de ambos ARA e EPA1 sugerindo a presença de uma delta-5 desaturase com alta eficiência. Já que apenas um traço de uma quantidade de GLA foi detectado, foi hipotetizado que Peridinium sp. CCMP626 usa uma via delta-9 elongase / delta-8 desaturase para produção de AGP.

O RNA total foi extraído a partir de células CCMP626. Especificamente, células de 1 L de cultura foram coletadas por centrifugação, rapidamente congelados em líquido de N2 e armazenadas a -80°C. O pellet de célula sedimento foi ressuspenso em 1 mL de reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia), misturado com 0,6 mL de microesferas de vidro (0,5 mm), e a mistura foi homogeneizada na configuração mais alta em uma Biospec Mini Beadbeater (Bartlesville, OK) por 3 minutos. O RNA total foi isolado em seguida, de acordo com o protocolo de Invitrogen para Trizol. Desta forma, o RNA total (34 μg) foi obtido a partir de 1 L da cultura. A amostra de RNA total foi usada para a preparação de cDNA.

Exemplo 2

Síntese do cDNA de Peridinium sp. CCMP626

O cDNA foi sintetizado diretamente do RNA total de Peridinium sp. 2305 CCMP626 da seguinte forma. Especificamente, o RNA total foi inicializado com iniciador AP (SEQ ID n° 27) adaptado a partir do kit Invitrogen 3'-RACE (Carlsbad, Califórnia), na presença do oligonucleotídeo Smart IV (SEQ ID n° 28) a partir do kit da biblioteca de cDNA BD-Clontech creator™ Smart™ (Mississauga, ON, Canadá). A transcrição reversa foi feita com transcriptase reversa sobrescrito II a partir do kit 3'-RACE de acordo com o protocolo do kit da biblioteca de cDNA Creator™ Smart™.

A 1 a síntese de mistura de cepa de cDNA foi usada como modelo para a amplificação de PCR, usando o iniciador AP (SEQ ID n° 27) como o iniciador 3' e iniciador CDSIII 5' (SEQ ID n° 29) como o iniciador 5' (fornecido com o kit da biblioteca de cDNA BD-CIontech creator™ Smart™). A amplificação foi realizada com mistura de polimerase de cDNA Clontech Advantage a 94°C durante 30 segundos, seguidos por 20 ciclos de 94°C por 10 segundos e 68°C por 6 minutos. Foi realizada uma extensão final a 68°C por 7 min.

Exemplo 3

Isolamento de uma Porção da Região de Codificação do Gene da Delta-5 Desaturase de Peridinium sp. CCMP626.

Os presentes exemplos descrevem a identificação de uma porção do gene de Peridinium sp. CCMP626 que codifica delta-5 desaturase (aqui designada como "RD5" [isto é, algas vermelhas [red algae] D5] e correspondendo a SEQ ID ηos: 1 e 2), pela utilização de oligonucleotídeos derivados de regiões conservadas de outras conhecidas seqüências de delta -5 e delta-8 desaturases.

Foram feitas várias considerações ao avaliar que desaturases podem capacitar designs de iniciadores degenerados adequados para isolar a delta-5 desaturase de Peridinium sp. CCMP626. Especificamente, os requerentes sabiam que só seqüências de delta-5, delta-6 e delta-8 desaturases compreendem um motivo conservado 'HPGG' em seu N-terminal (onde o domínio 'HPGG' é parte do bem conhecido domínio do citocromo B5); em contraste, delta- 9 desaturases têm um motivo 'HPGG' do domínio do citocromo B5 em seu C- terminal, enquanto as duas delta-17 e delta-12 desaturases não têm o domínio do citocromo B5. Com base nos resultados cromatográficos descritos na figura 2, pensava-se que uma via delta-9 elongase / delta-8 desaturase operava em Peridinium sp. CCMP626; assim, entre as desaturases que partilham o motivo conservado 1HPGG' N-terminal, só delta-5 e delta-8 desaturases eram esperadas no organismo. Finalmente, embora só algumas seqüências de delta-8 desaturase são conhecidas, numerosas delta-5 desaturases estão disponíveis publicamente. Os requerentes selecionaram aquelas seqüências de delta-5 desaturase que tinham menor homologia com genes "tradicionais" de delta-5 desaturase e que também partilhavam alta homologia entre si.

Com base no exposto acima, as quatro delta-5 desaturase e duas delta-8 desaturases mostradas a seguir na tabela 3 foram alinhadas, usando o método de Clustal W (opções Gonnet lenta, precisa; Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22:4673-4680 (1994)) do MegAlign™ programa de software DNASTAR.

Tabela 3

Delta-5 E Delta-8 Desaturases Alinhadas Para Identificar Regiões de Aminoácidos Conservados

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A Figura 3 mostra uma porção do alinhamento resultante, que contém vários trechos da seqüência de aminoácidos conservada entre os seis diferentes organismos. Baseado nesse alinhamento, dois conjuntos de oligonucleotídeos degenerados foram projetados para amplificar uma porção da região de codificação do gene delta-5 desaturase de Peridinium sp. CCMP626, correspondentes às regiões da figura 3 que estão marcadas como "Região conservada 1" e "Região conservada 2". Especificamente, a seqüência de aminoácidos conservada GHH (IA/) YTN (SEQ ID n° 19) foi projetada para corresponder à região conservada 1, enquanto que a seqüência de aminoácidos conservada NFQ (V/A) (S/N) HV (SEQ ID n° 20) foi projetada para corresponder à região conservada 2. Para reduzir a degeneração dos oligonucleotídeos, quatro conjuntos de oligonucleotídeos (ou seja, 5-1A, 5-1B, 5-1C e 5-1D) foram projetados para codificar a Região conservada 1, e 4 conjuntos de oligonucleotídeos (ou seja, 5-4AR, 5-4BR, 5-4CR e 5-4DR) foram projetados para codificar os fitas anti-senso da Região conservada 2.

Tabela 4

Oligonucleotídeos Degenerados Usados para Amplificar o Gene Delta-5 Desaturase de Peridinium sp. CCMP626

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[Nota: O código de degeneração de ácido nucléico usado para as SEQ ID n° 30 a 37 é da seguinte forma: R= A/G; Y=C/T; B=G/T/C; e H=A/C/T.] Baseada no comprimento total de seqüência das seqüências delta-5 da figura 3, foi hipotetizado que o fragmento de gene delta-5 de Peridinium sp. CCMP626 amplificado conforme descrito acima seria de cerca de 630 bp de comprimento (faltando cerca de 210 aminoácidos, na sua N- terminal e 70 aminoácidos, na sua C-terminal).

Um total de dezesseis diferentes amplificações PCR foram realizadas, assim como todas as combinações de iniciadores foram testadas (ou seja, iniciador 5-1A foi usado com cada um dos 5-4AR, 5-4BR, 5-4CR e 5- 4DR, individualmente, semelhantemente, iniciador 5-1B foi usado com cada 5- 4AR, 5-4BR, 5-4CR e 5-4DR; etc.). As amplificações de PCR foram executadas em um volume total de 50 μL que compreende: tampão PCR (contendo KCI 10 mM, (NH4)2SO4IO mM, Tris-HCI 20 mM (pH 8,75), MgSO4 2 mM, Triton X- 100 0,1%), BSA 100 pg/ml_(concentração final), 200 μM cada desoxirribonucleotídeo trifosfato, 10 pmole de cada iniciador, 10 ng cDNA de Peridinium sp. CCMP626 e 1 μΙ_ de Taq DNA polimerase (Epicentre Technologies, Madison, Wl). As condições do termociclador foram estabelecidas para 35 ciclos de 95°C por 1 min, 56°C por 30 seg e 72°C por 1 min, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 min.

Os produtos da PCR foram purificados usando um kit Qiagen de purificação de PCR (Valencia, CA). Um fragmento do tamanho esperado aproximado foi então mais purificado, após eletroforese em gel de agarose 1% (peso por volume) e então clonado no vetor pGEM-T-easy (Promega, Madison, Wl). O DNA ligado foi usado para transformar células de E. coli DH10B e transformantes foram selecionados em LB (1% Bacto-Triptona, 0,5% Bacto- extrato de levedura e 1% NaCI) ágar contendo ampicilina (100 mg/mL). Análise do DNA plasmidial a partir de um grupo de 12 transformantes confirmam a presença da inserção com o tamanho esperado (plasmídeos foram designados como "pT-12-D1", "PT-12-D2", "PT-12-D3", etc. até "pT-12-D12"). As seqüência de análises mostraram que pT-12-D5 continha um fragmento 563 bp (SEQ ID n° 4), que codifica 187 aminoácidos (SEQ ID n° 5) (incluindo aminoácidos que correspondem às regiões conservadas 1 e 2). A identidade da seqüência Peridinium sp. CCMP626 foi determinada por pesquisas feitas com a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., J. MoL Biol., 215:403-410 (1993)) em bancos de dados BLAST "nr" (que compreendem todas as traduções GenBank CDS não redundantes, as seqüências derivadas da estrutura tridimensional do Brookhaven Protein Data Bank, o banco de dados de proteínas SWISS-PROT, e os bancos de dados EMBL e DDBJ). A seqüência foi analisada por similaridade para todas seqüências de DNA publicamente disponíveis contido na base de dados "nr" usando o algoritmo BLASTN fornecidos pela National Center for Biotechnology Information (NCBI). A SEQ ID n° 4 foi comparada por similaridade para todas as seqüências protéicas publicamente disponíveis incluídas na base de dados "nr", usando o algoritmo BLASTX (Gish, W. e Estados, DJ1 Nature Genetics, 3:266 - 272 (1993)) fornecido pela NCBI.

Os resultados da comparação BLASTX resumindo a seqüência com a qual a SEQ ID n° 4 tem a maior similaridade são reportados de acordo com a percentagem de identidade, a percentagem de similaridade e o valor de expectância. "Percentagem de identidade" é definida como o percentual de aminoácidos idênticos entre as duas proteínas. "Porcentual de semelhança" é definido como o percentual de aminoácidos que são idênticos ou conservados entre as duas proteínas. O "valor de expectância" estima a importância estatística da semelhança, especificando o número de aminoácidos idênticos, com uma determinada pontuação, que são esperados em uma pesquisa de uma base de dados desta dimensão, absolutamente por acaso. Dessa forma, a seqüência de aminoácidos traduzida da SEQ ID n° 4 (isto é, SEQ ID n° 5) tinha 64% de identidade e 78% de similaridade com a seqüência de aminoácidos da delta-8-esfingolipídeo desaturase de Thalassiosira pseudonana (n° de acesso GenBank AAX14502; SEQ ID n° 21), com um valor de expectância de 2E-64; adicionalmente, o fragmento parcial da SEQ ID n° 4 teve 65% de identidade e 78% de semelhança com a ácido graxo delta-5 desaturase de Phaeodactylum tricornutum (n° de acesso GenBank AAL92562; SEQ ID n° 14), com um valor de expectância de 7E-62.

Exemplo 4

Isolamento da Região de Codificação 5' do Gene da Delta-5 Desaturase de Peridinium sp. CCMP626

Para isolar a porção N-terminal da delta-5 desaturase putativa identificada no Exemplo 3, uma técnica 5' RACE modificada baseada em protocolos RACE de duas diferentes empresas (isto é, Invitrogen e BD- Clontech) foi utilizada.

Resumidamente, o cDNA de fita dupla de Peridinium sp. CCMP626(exemplo 2) foi usado como o modelo em um experimento 5' RACE, que compreende duas separadas sessões de amplificação PCR. Na primeira sessão de PCR, os iniciadores oligonucleotídeos que consistem em um gene específico oligonucleotídeo (isto é, ODMW520; SEQ ID n° 38) e o iniciador genérico de oligonucleotídeo CDSIII 5' (SEQ ID n° 29) a partir do kit da biblioteca de cDNA BD-CIontech creator™ Smart™ As amplificações PCR foram realizadas em um volume total de 50 μL, compreendendo: 25 pL de Taq LA™ pré-mistura (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, 520-2193, Japão), 10 pmole de cada iniciador e 1 pL de Taq DNA polimerase (Epicenter Technologies, Madison, Wl). As condições do termociclador foram estabelecidas para 35 ciclos de 95°C por 1 min, 56°C por 30 seg e 72°C por 1 min, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 min.

A segunda sessão de amplificação PCR usou 1 μL do produto tendo a primeira sessão de reação de PCR como modelo. Os iniciadores consistem em um gene específico oligonucleotídeo (ou seja, ODMW521; SEQ ID n° 39) e do oligonucleotídeo genérico DNR CDS 5* (SEQ ID n° 40), fornecido com o kit da biblioteca de cDNA BD-Clontech Creator™ Smaifs™. A amplificação foi conduzida conforme descrito acima.

Os produtos da segunda sessão da reação de PCR passaram por eletroforese em agarose 1% (peso por volume). Os produtos entre 400 bp e 800 bp foram em seguida purificados a partir de gel e clonados no vetor pGEM-T-easy (Promega, Madison, Wl). O DNA ligado foi usado para transformar E. coli DH10B e transformantes foram selecionados em ágar LB contendo ampicilina (100 mg/mL).

A análise do DNA de um plasmídeo de um transformante compreendendo a região 5' do gene delta-5 desaturase putativo confirmou a presença do esperado plasmídeo, chamado pT RD5-5'C2. A análise da seqüência mostrou que pT-RD5-5'C2 contém um fragmento de 693 bp (SEQ ID n° 6), que se sobrepõe com 182 bp do fragmento e 563 bp da extremidade 5' do dpT-12-D5 (exemplo 3; SEQ ID n° 4) e fornece adicionalmente 511 bp d e seqüência 5' a montante (SEQ ID n° 7) (figura 4). A seqüência de pT-RD5-5'C2 também corrige a seqüência correspondente a região conservada 1, resultante da utilização de um oligonucleotídeo degenerado para a amplificação PCR inicial do fragmento de 563 bp em pT-12-D5 (exemplo 3). Entretanto, não havia códon de iniciação de tradução no fragmento prolongado de 693 bp da SEQ ID n° 6.

Uma segunda sessão da 5' RACE modificada foi realizada conforme descrito acima, exceto que os oligonucleotídeos ODMW541 (SEQ ID n° 41) e ODMW542 (SEQ ID n° 42) foram usados como iniciadores específicos para o gene. Os produtos entre 200 bp e 400 bp foram em seguida purificados a partir de gel e clonados no vetor pGEM-T-easy (Promega, Madison, Wl). O DNA ligado foi transformado em E. coli DH10B e transformantes foram selecionados em ágar LB contendo ampicilina (100 mg/mL).

A análise do DNA de um plasmídeo de um transformante compreendendo a região 5' do gene delta-5 desaturase putativo confirmou a presença do plasmídeo desejado, chamado pT RD5-5'2nd A análise da seqüência mostrou que pT-RD5-5'2nd contém um fragmento de 358 bp (SEQ ID n° 8), que se sobrepõe com 197 bp do fragmento de DNA da extremidade 5' em pT-RD5-5'C2 descrito acima e fornece adicionalmente 161 bp da seqüência 5' a montante (SEQ ID n° 9). Cento e dezesseis (116) bp do fragmento estendido 5' codifica a porção N-terminal do gene delta-5 desaturase putativo, incluindo códon de iniciação da tradução, proporcionando, assim, a completa seqüência 5' do gene.

Exemplo 5

Isolamento da Região de Codificação 3' do Gene da Delta-5 Desaturase de Peridinium sp. CCMP626

Para isolar a porção C-terminal da delta-5 desaturase putativa identificadas no exemplo 3, uma técnica RACE 3' foi utilizada. A metodologia foi descrita acima no exemplo 4; entretanto, os iniciadores usados em ambas a primeira e a segunda sessão de amplificação de PCR foram conforme mostrado abaixo na tabela 5.

Tabela 5

Iniciadores de Oligonucleotídeos Usados para 3' RACE

<table>table see original document page 107</column></row><table>

* Iniciador AUAP foi fornecido em kit 3-RACE Invitrogen (Carlsbad, Califórnia).

Após o isolamento e purificação de produtos (ou seja, 200 a 500 bp), os fragmentos foram clonados no vetor pGEM-T-easy (Promega) e transformados em Ε. coli DH10B, como no exemplo 4.

A análise do plasmídeo de DNA de um transformante compreendendo a região 3' do gene delta-5 desaturase confirmou a presença do esperado plasmídeo, designado pT RD5-3'. A análise da seqüência mostrou que pT-RD5-3' continha um fragmento de 299 bp (SEQ ID n° 10), que sobrepõe 52 bp a partir da extremidade 3' do fragmento de 563 bp de pT-12-D5 (exemplo 3, SEQ ID n°: 4) e fornece 247 bp de seqüência adicional de 3' a jusante (SEQ ID n° 11). Os primeiros 202 bp do fragmento estendido com 247 bp incluído dentro de pT-RD5-3' codifica a região de codificação C-terminal (incluindo o códon de parada de tradução) do gene delta-5 desaturase putativo. A seqüência de pT-RD5-3'C2 também corrige a seqüência correspondente a região conservada 2, resultante da utilização de um oligonucleotídeo degenerado para a amplificação PCR inicial do fragmento de 563 bp em pT-12-D5 (exemplo 3).

Depois de 2 sessões de 5' RACE e uma sessão de 3' RACE1 a seqüência de DNA de toda a região de codificação Peridinium sp. CCMP626 delta-5 desaturase (RD5) putativa foi determinada. Conforme mostrado na figura 4, o CDS RD5 foi 1392 bp em comprimento (SEQ ID n° 1) e um codificou um polipeptídeo com 463 aminoácidos (SEQ ID n° 2), com base no alinhamento das SEQ ID η 0 s: 4, 6, 8 e 10. Os resultados dos algoritmos da análise de seqüência BLASTP usando o comprimento total do gene RD5 como a seqüência de consulta mostrou que 67% de identidade e 81% de similaridade são partilhadas com o ácido graxo delta-5 desaturase de Phaeodactylum tricornutum (n° de acesso GenBank AAL92562; SEQ ID n°: 14), com um valor de expectância de 0,0. Adicionalmente, o gene de comprimento total RD5 partilhou 64% de identidade e 76% de similaridade com a delta-8 esfingolipídeo desaturase de Thalassiosira pseudonana (n° de acesso GenBank AAX14502; SEQ ID n° 21), com um valor de expectância de 2E-178. Exemplo β

Geração de Construção PDMW368 que Compreende RD5

O presente exemplo descreve a geração de pDMW368, compreendendo um gene quimérico FBAIN:: RD5:: Pex20 (figura 5C). Este foi projetado para integrar o gene quimérico para o genoma de Yarrowia lipolytica e, em seguida, estudar a função da Peridinium sp. CCMP626 delta-5 desaturase em Yarrowia lipolytica.

Com base no comprimento total do cDNA de RD5 (SEQ ID n° 1), oligonucleotídeos YL807 e YL810 (SEQ ID n°s: 46 e 47, respectivamente) foram usados como iniciadores para amplificar a primeira porção do RD5 (figura 5A). Iniciador YL807 contendo um sítio Ncol e um iniciador YL810 contendo um sítio BamW. Em seguida, iniciadores YL808 e YL809 (SEQ ID η° s: 48 e 49, respectivamente) foram usados como iniciadores para amplificar a segunda porção do RD5. O iniciador YL809 contendo um sítio BamHI, enquanto o iniciador YL808 continha um sítio Notl. As reações PCR, usando os pares de iniciadores YL807/YL810 ou YL808/YL809, com Peridinium sp. CCMP626 cDNA (exemplo 2) como modelo, foram realizadas individualmente em um volume total de 50 μL que compreende: tampão PCR (contendo KCl 10 mM, (NH4)2SO4IO mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,75), MgSO4 2 mM, Triton X- 100 0,1%), BSA 100 pg/mL(concentração final), 200 μΜ cada desoxirribonucleotídeo trifosfato, 10 pmole de cada iniciador, e 1 μL de Pfu DNA polimerase (Stratagene, San Diego, CA). As condições do termociclador foram estabelecidas para 35 ciclos de 95°C por 1 min, 56°C por 30 seg e 72°C por 1 min, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 min.

Os produtos PCR individuais foram purificados usando um kit Qiagen de purificação de PCR (Valencia, CA). Os produtos PCR amplificados a partir da reação com iniciadores YL807/YL810 foram digeridos com Ncol e SamH1, enquanto os produtos PCR amplificados a partir da reação com iniciadores YL808/YL809 foram digeridos com BamH1 e Notl. O s fragmentos de DNA NcollBamH1- e BamH1/Notl-digeridos foram purificados após eletroforese em gel em agarose 1% (peso por volume) e, em seguida, ligados direcionalmente com Ncol/Notl-digeridos pZUF17 (figura 5B; SEQ ID n° 22; compreendendo um gene sintético delta-17 desaturase ["D17st"] derivado de Saprolegnia diclina (Publicação de Patente U.S. N0 2003/0196217 A1), otimizados para expressão em Yarrowia Iipolytica (Publicação PCT N0 WO 2004/101757)). O produto desta ligação foi pDMW368 (figura 5C; SEQ ID n° 23), que contém, assim, os seguintes componentes:

Tabela 6

Componentes do Plasmideo PDMW368

<table>table see original document page 110</column></row><table> Os termos "promotor FBAIΝ" ou "região de promotor FBAIN " referem-se a região 5' a montante não-traduzida em frente ao "ATG" códon de iniciação de tradução da enzima aldolase frutose bisfosfato Yarrowia lipolytica (CE 4.1.2.13) codificada pelo gene fbal e que é necessário para a expressão, mais uma porção de região de codificação 5' que tem um íntron do gene fbal.

Exemplo 7

A Geração de Cepas M4 de Yarrowia Lipolytica para Produzir cerca de 8% de DGLA de Lipídeos Totais

O presente exemplo descreve a construção da cepa M4, derivada de Yarrowia Iipolytica ATCC # 20362, capaz de produzir 8% DGLA em relação ao lipídeos totais. Esta cepa foi projetada para expressar a via delta-6 desaturase / delta-6 elongase, através de introdução do construção pKUNF12T6E (figura 6A; SEQ ID n° 24). Este construção foi gerado para integrar quatro genes quiméricos (compreendendo uma delta-12 desaturase, uma delta-6 desaturase e duas C18/20 elongases) para os locos Ura3 de ocorrência natural de Yarrowia cepa ATCC # 20362, para por meio disto permitir a produção de DGLA. Dessa forma, pKUNF12T6E contém os componentes a seguir:

Tabela 7

Descrição de Plasmídeo PKUNF12T6E (SEQID n° 24)

<table>table see original document page 111</column></row><table> <table>table see original document page 112</column></row><table> <table>table see original document page 113</column></row><table>

O plasmídeo pKUNF12T6E foi digerido com ASCl/SphI e, em seguida, usado para transformação Y. lipolytica ATCC n° 20362 de ocorrência natural, de acordo com os métodos gerais. As células transformantes foram colocadas em placas com o meio selecionado FOA e mantidas a 30°C durante 2 a 3 dias. As colônias resistentes a FOA foram colhidas e aplicadas por esfregaço para placas de seleção MM e MMU. As colônias que poderiam crescer em placas MMU mas não sobre placas MM, foram selecionadas como cepas Ura. As colônias únicas de cepas Ura foram então inoculadas em MMU líquido a 30°C e agitadas a 250 rpm/min por 2 dias. As células foram coletadas por centrifugação, os lipídeos foram extraídos e ésteres metílicos de ácidos graxos foram preparados pela trans-esterificação, e posteriormente analisados com um cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6890.

As análises cromatográficas mostraram a presença de DGLA nos transformantes contendo os 4 genes quiméricos de pKUNF12T6E, mas não na cepa de controle Yarrowia de ocorrência natural. A maioria das cepas selecionadas 32 Ura produziram cerca de 6% DGLA de lipídeos totais. Houve 2 cepas (ou seja, cepas M4 e 13-8) que produziram cerca de 8% DGLA de lipídeos totais.

Exemplo 8

Análise Funcional de Genes RD5 em cepa M4 de Yarrowia Lipolytica

O plasmídeo pZURD5S (exemplo 6; que compreende um gene quimérico FBAIN:: RD5S:: Pex20), foi transformado em cepa M4 (Exemplo 7), conforme descrito nos métodos gerais. Os transformantes foram selecionados em placas MM. Após 2 dias de crescimento em 30°C, 3 transformantes que cresceram nas placas MM foram colhidos e reaplicadas por esfregaço em novas placas MM. Depois que cresceram, estas cepas foram inoculadas individualmente em 3 mL líquido MM a 30°C e agitados a 250 rpm/min durante 2 dias. As células foram coletadas por centrifugação, os lipídeos foram extraídos e ésteres metílicos de ácidos graxos foram preparados pela trans-esterificação, e posteriormente analisados com um cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6890.

As análises cromatográficas mostraram que houve cerca de 4,2% de DGLA e 2,2% de ARA de lipídeos totais produzidos em todos os três transformantes, onde a eficiência da conversão de DGLA à ARA nestas três cepas foi determinada como sendo de cerca de 35% (em média). A eficiência da conversão é medida de acordo com a fórmula a seguir: ([produto]/[substrato + produto])*100, onde 'produto' inclui o produto imediato e todos os produtos na via derivados dele. Assim, os dados do presente experimento demonstraram que os Peridinium sp. CCMP626 delta-5 desaturase clonados, aqui descritos como SEQ ID n°s: 1 e 2, de forma eficiente dessaturaram DGLA à ARA.

Exemplo 9

Síntese de um Gene Otimizado da delta-5 Desaturase ("RD5S") para Expressão em Yarrowia Lipolytica

O uso do códon do gene da delta-5 desaturase de Peridinium sp. CCMP626 (SEQ ID n° 1 e 2; RD5) foi otimizado para a expressão em Yarrowia lipolytica, de um modo semelhante ao descrito na Publicação PCT N0 WO 2004/101753 e Patente U.S. 7.125.672. Especificamente, um gene códon otimizado delta-5 desaturase (chamado "RD5S", SEQ ID n° 3) foi projetado baseado na seqüência de codificação do gene delta-5 desaturase de RD5 (SEQ ID n° 2), de acordo ao padrão de uso de códon da Yarrowia (Publicação PCT N0 WO 2004/101753), a seqüência de consenso em torno do códon de iniciação de tradução "ATG", e as regras gerais de estabilidade de RNA (Guhaniyogi, G. e J. Brewer, Gene, 265 (1-2):11-23 (2001)). Em adição a modificação do sítio de iniciação da tradução, 247 bp dos 1392 bp da região de codificação foram modificados (17,7%, figuras 7A e 7B) e 229 códons foram otimizados (49,4%). O conteúdo cromatográfico foi aumentado de 49,3% dentro do gene de ocorrência natural (ou seja, RD5) para 54,2% no interior do gene sintético (isto é, RD5S). Os sítios Ncol e Notl foram incorporadas ao redor do códon de iniciação de tradução e após o códon de parada do RD5S (SEQ ID n° 3), respectivamente. Nenhuma modificação no gene otimizado mudou a seqüência de aminoácidos da proteína codificada (SEQ ID n° 2). O gene RD5S projetado foi sintetizado por GenScript Corporation (Piscataway, NJ) e clonado em pUC57 (n° de acesso GenBank Y14837) para gerar pRD5S (SEQ ID n° 50; figura 6B) (RD5S identificada como "RD5S (626)" na figura).

Exemplo 10

Geração de Construção PZURD5S que compreende RD5

O presente exemplo descreve a construção de um plasmídeo pZURD5S compreendendo um gene quimérico FBAIN:: RD5S:: Pex20. O plasmídeo pZURD5S (SEQ ID n° 51; figura 6C) foi construído pela substituição do fragmento Nco l/Not I de pZUF17 (figura 5B; SEQ ID n° 22) com o fragmento Nco l/Not I RD5S de pRD5S (SEQ ID n° 50; figura 6B). O produto desta ligação foi pZURD5S (figura 6C; SEQ ID n° 51), que contém, assim, os seguintes componentes: Tabela 8

Componentes do Plasmídeo PZURD5S

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Exemplo 11

Expressão da Delta-5 Desaturase ("RD5S") Códon-Otimizada em Cepa M4 de Yarrowia Lipolytica

O plasmídeo pZURD5S (exemplo 10; que compreende um gene quimérico FBAIN:: RD5S:: Pex20), foi usado para transformação em cepa M4 (Exemplo 7), conforme descrito nos métodos gerais. Oito (8) transformantes que cresceram nas placas MM foram colhidos e reaplicadas por esfregaço em pratos MM frescos. Depois que cresceram, estas cepas foram inoculadas individualmente em 3 mL líquido MM a 30°C e agitados a 250 rpm/min durante 2 dias. As células foram coletadas por centrifugação, os lipídeos foram extraídos e ésteres metílicos de ácidos graxos foram preparados pela trans-esterificação, e posteriormente analisados com um cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6890.

Os resultados da cromatografia mostraram que houve cerca de 5.4% de DGLA e 3.3% de ARA de lipídeos totais produzidos em todos os 8 transformantes. A eficiência da conversão na qual RD5S converteu DGLA à ARA nestes 8 cepas foi a uma taxa média anual de cerca de 38%. A eficiência da conversão foi medido de acordo com a seguinte fórmula: ([produto]/[substrato + produto])*100, onde 'produto' inclui o produto imediato e todos os produtos na via derivados dele. Dessa forma, os presentes dados experimentais demonstraram que o gene códon otimizada de delta-5 desaturase (RD5S, conforme estabelecido em SEQ ID n° 3) derivado de Peridinium sp. CCMP626 foi de cerca de 8.9% mais eficientes para converter DGLA para ARA do que o RD5 de ocorrência natural (exemplo 8).

Exemplo 12

Isolamento de uma Delta-8 Desaturase de Lutheri Pavlova (CCMP459)

O presente exemplo descreve o isolamento da delta-8 desaturase de Iutheri Pavlova (CCMP459) usada no exemplo 3 e na figura 3 (também descrito no pedido de Patente U.S. n° 11/737772, depositado em 20 de abril de 2007). Isto exigia: síntese de Pavlova Iutheri (CCMP459) cDNA; biblioteca de construção e seqüenciamento; identificação de homólogos de delta-8 desaturase; e a clonagem de uma delta-8 desaturase de comprimento total a partir de DNA genômico.

Síntese. Biblioteca de Construção E Seqüenciamento do cDNA de Pavlova Lutheri (CCMP459).

Uma biblioteca cDNA de Pavlova lutheri (CCMP459) foi sintetizada conforme descrito na Publicação PCT n0 WO 2004/071467 (publicada em 26 de agosto de 2004). Resumidamente, pellets congelados de Pav459 foram obtidos do Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (CCMP, West Boothbay Harbor, ME), estes pellets foram esmagados em nitrogênio líquido e RNA total foi extraído de Pav459 com o kit Qiagen RNeasy® Maxi (Qiagen, Valencia, CA), seguindo as instruções do fabricante. A partir do RNA total, mRNA foi isolado usando resina de celulose oligo dT, e foi então usado para a construção de uma biblioteca de cDNA usando o vetor pSportl (Invitrogen, Carlsbad, CA). O cDNA produzido dessa forma foi clonado direcionalmente(vetor 5' Sall/3' Notl into pSportl. A biblioteca Pav459 contém aproximadamente 6,1 χ 105 clones por mL, com um tamanho médio de inserção de aproximadamente 1200 bp. A biblioteca de Pavlova lutheri foi chamada epslc.

Para seqüenciamento, os clones foram primeiro recuperados a partir de arquivada culturas de glicerol cultivadas ou congelados em placas de meio de congelamento 384, e inoculadas com uma automática escolhedora de colônia (Genetix) QPix® em 96 placas fundas contendo LB + 100mg/mL de ampicilina. Depois de crescer por 20 horas a 37°C, as células foram revestidas por centrifugação e armazenadas a -20°C. Os plasmídeos, em seguida, foram isolados em um robô Eppendorf 5Prime, usando um formato bem modificado do método alcalino 96-lise miniprep (Eppendorf PerfectPrep®). Resumidamente, um filtro e tubulação de vácuo foi usado para facilitar a remoção dos fragmentos celulares após a precipitação de acetato. O DNA plasmídeo foi, então, ligado a uma segunda placa de filtro diretamente e filtrado, lavado, seco e eluído.

Os plasmídeos foram seqüenciados pela extremidade em placas 384-well, usando iniciador de vetor 17 (SEQ ID n° 52) e a versão 3 do kit de seqüenciamento Prism ABI BigDye. Para o seqüenciamento da reação, 100 a 200 ng do modelo e 6,4 pmol de iniciadores foram usados, e as seguintes condições de reação foram repetidas 25 vezes: 96°C por 10 sec, 50°C por 5 sec e 60°C por 4 min. Depois de limpeza à base de etanol, produtos do ciclo de seqüenciamento de reação foram detectados e resolvidos em seqüenciadores automáticos Perkin Elmer ABI-3700.

A identificação de enzimas homólogas de delta-8 desaturase a partir de cDNA de Pavlova Lutheri da Biblioteca de Clones de eps1c

Os cDNAs que codificam homólogos da delta-8 desaturase de Pavlova lutheri (aqui chamadas delta-8 desaturase) foi feita através da realização de pesquisas BLAST para similaridade com seqüências contidas na base de dados BLAST "nr" (como descrito no exemplo 3). O P - valor (probabilidade) de se observar uma compatibilidade de uma seqüência de cDNA com uma seqüência contida na base de dados revisada apenas por acaso, como calculado pelo BLAST, estão aqui relatados como valores "pLog", que representam o negativo do Iogaritmo do P - valor relatado. Assim sendo, quanto maior o valor pLog, maior a probabilidade de que o cDNA da seqüência e o BLAST "encontrado" representam proteínas homólogas.

A pesquisa BLASTX usando a seqüência de nucleotídeos do clone eps1c.pk002.f22 revelou similaridade das proteínas codificadas pelo DNA com a delta-6 desaturase de Rhizopus stolonifer (SEQ ID n° 53) (NCBI n° de acesso AAX22052 (Gl 60499699), locus AAX22052, CDS AY795076; Lu et al., não publicados). A seqüência de uma porção de elemento de inserção de cDNA do clone eps1c.pk002.f22 é mostrada em SEQ ID n° 54 (extremidade 5' do elemento de inserção de cDNA). Posteriormente, a seqüência de inserção plena (eps1c.pk002.f22:fis) foi obtida e é mostrada em SEQ ID n° 55. A seqüência para a seqüência de aminoácidos deduzida (a partir de nucleotídeo 1 de SEQ ID n° 55 até o primeiro códon de parada no nucleotídeo 864 da SEQ ID n° 55) é mostrada em SEQ ID n° 56. O seqüenciamento do elemento de inserção completo foi realizado usando um protocolo de transposição modificado. Os clones identificados para seqüenciamento do elemento de inserção completo foram recuperados a partir de estoques de glicerol arquivados como única colônias, e plasmídeos de DNA foram isolados através de Iise alcalina. Os modelos de plasmídeos foram transpostos por intermédio do kit de transposição Sistema de Geração de Modelo [Template Generation System] (TGS II) (Finnzymes Oy1 Espoo, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante. O DNA transposto foi transformado em células eletro-competentes de EH10B (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD), através de eletroporação. Os transformantes múltiplos foram selecionados aleatoriamente a partir de cada reação de transposição, DNA plasmídeo foi elaborado, modelos foram seqüenciados como acima (ABI BigDye v3.1) para fora do sítio do evento da transposição, usando iniciadores únicos SeqE (SEQ ID n° 57) e SeqW (SEQ ID n° 58).

Os dados da seqüência foram coletados (ABI software "Prism Collections") e montados usando o programa de montagem de seqüência Phrap (P. Green, University of Washington, Seattle). As montagens foram vistas pelo editor de seqüência "Consed" (D. Gordon, University of Washington, Seattle) para a edição final.

A seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID n° 56 foi avaliada por BLASTP, produzindo um valor pLog de 19,52 (valor E de 3e- 20) versus a delta-6 desaturase de Mortierella alpina (NCBI n° de acesso BAC82361 (Gl 34221934), Locus BAC82361, CDS AB070557; Sakuradani e Shimizu, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67:704-711 (2003)). Com base nos resultados obtidos a partir da comparação BLASTP da Mortierella alpina e outras desaturases de ácidos graxos, a delta-8 desaturase Pavlova lutheri não estava completa e faltavam seqüência na extremidade de 5'. A Clonagem de uma delta-8 Desaturase de Comprimento total a partir do DNA Genômico de Pavlova Lutheri

O DNA genômico foi isolado de lutheri Pavlova (CCMP459) usando o Kit Plant Maxi Prep de Qiagen DNeasy®, de acordo com o protocolo do fabricante. Usando uma coluna maxi por 1 grama de pellets de células congeladas, um total de 122 microgramas de DNA genômico foi isolado a partir de 4 de gramas de cultura de Pavlova lutheri. A concentração final de DNA genômico foi 22,8 ng/μL. As bibliotecas GenomeWaIker foram sintetizados usando o kit Universal GenomeWalker™ (BD Biosciences Clonetech, Palo Alto, Califórnia), seguindo o protocolo do fabricante (Prot # PT3042-1, versão PR03300). Resumidamente, quatro digestões de restrição foram criadas usando como protocolo 300 ng de DNA genômico por reação. Após a limpeza com fenol, os pellets foram dissolvidos em 4 pL de água e adaptadores foram ligados como no protocolo.

Para os PCR primários, o kit PCR Advantage® -GC Genomic (BD Biosciences Clonetech) foi usado seguindo o protocolo do fabricante (Prot # PT3090-1, versão PR1X433). Para cada digestão de restrição, 1 μL da biblioteca foi combinado com 22,8 μL de água grau PCR, 10 pL de tampão de reação 5X GC genômico PCR, 2,2 pL de Mg (CH 3 CO 2) 2 25 mM, 10 pL de GC-MeIt (5 M), 1 pL de 50x dNTP mix (10 mM cada), 1 pL de Vantagem Genomic Pol-GC. Mix (50 X), 1 pL de iniciador Universal GenomeWalker™ AP1 (10 M, SEQ ID n° 59) e 1 pL de SPG PvDES (10 M, SEQ ID n° 60). Depois de desnaturação a 95°C, as seguintes condições de reação foram repetidas 35 vezes: 94°C por 30 sec, 68°C por 6 min. depois destas condições de reação, uma prorrogação adicional a 68°C foi realizada por 6 min seguida de resfriamento a 15°C até serem removidos.

A principal reação de PCR para cada biblioteca foi analisado por eletroforese em gel agarose e bandas de DNA com pesos moleculares de aproximadamente 6 kB, 3,5 kB, 2,5 kB e 1,2 kB foram observados. As bandas de DNA para cada biblioteca foram purificadas usando o kit de recuperação gel DNA Zymoclean™ (Zymo Research, Orange, CA), seguindo o protocolo do fabricante. O DNA resultante foi clonado no vetor pGEM® -T Easy (Promega), seguindo o protocolo do fabricante e os elemento de inserção foram seqüenciados usando os iniciadores T7 (SEQ ID n° 52) e M13 -28Rev (SEQ ID n° 61), como descrito acima. A seqüência adicional foi então obtida utilizando um iniciador de seqüenciamento específico para gene PavDES seq (SEQ ID n° 62) que foi derivada dos recém-adquiridos dados de seqüência. A completa extremidade 5' da seqüência obtida pelo genoma "walking" é mostrado na SEQ ID n° 63. A seqüência das regiões sobrepostas da seqüência genômica (SEQ ID n° 63) e as EST eps1c.pk002.f22:fis totalmente seqüenciadas (SEQ ID n° 55) foram alinhadas usando Sequencher™ (Versão 4.2, Gene Códigos Corporation, Ann Arbor, Ml), utilizando o algoritmo "Large Gap assembly". Curiosamente, a comparação mostrou que o EST que estava originalmente seqüenciado (SEQ ID n° 55) faltava 459 bp, em comparação com a seqüência genômica (SEQ ID n° 63). Essa seqüência ausente no EST parecia ser uma deleção em vez de um íntron, já que nenhum sítio claro de junção de íntron foi identificado no DNA genômico, na extremidade 5' do gene. A seqüência genômica para a extremidade 5' (SEQ ID n° 63) foi combinada com a extremidade 3" da seqüência EST (SEQ ID n° 55) para produzir a SEQ ID n° 64. Usando o software nEditSeq™ 6,1 para análise de seqüência (DNASTAR Inc., Madison, Wl), foi identificado um ORF (SEQ ID n° 17). A seqüência de aminoácidos codificadas pelo SEQ ID n° 17 é mostrada na SEQ ID n° 18.

A seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID n° 18 foi avaliada por BLASTP, produzindo um valor pLog de 35,10 (valor E de 8e-36) versus a delta-6 desaturase de Rhizopus stoionifer (SEQ ID n° 65) (NCBI n° de acesso ABB96724 (Gl 83027409), locus ABB96724, CDS DQ291156; Zhang et al., não publicados). Além disso, a delta-8 desaturase Pavlova lutheri é 78,0% idêntica a seqüência Pavlova salina delta-8 desaturase (SEQ ID n° 66) apresentada na Publicação PCTWO 2005/103253 n° (publicada em 22 de abril de 2005) usando o método Jotun Hein. Os cálculos de porcentagem de identidade de seqüências pelo método Jotun Hein (Hein, JJ1 Meth. Enz., 183:626-645 (1990)) foram feitos usando-se o programa de computação MegAlign™ v6.1 LASERGENE bioinformática suite (DNASTAR Inc., Madison, Wl) com os parâmetros padrão para o alinhamento de pares (KTUPLE = 2). A Pavlova Iutheri delta-8 desaturase é 76,4% idêntica a seqüência Pavlova salina delta-8 desaturase usando o método Clustal V. Os cálculos de porcentagem de identidade de seqüência pelo método Clustal V (Higgins, DG e Sharp, PM, Comput. Appi Biosci., 5:151-153 (1989); Higgins et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) foram feitos usando o programa de computação MegAlign™ v6.1 LASERGENE bioinformática suite (DNASTAR Inc.) com os parâmetros predefinidos para o alinhamento de pares (KTUPLE = 1, GAP SANÇÃO = 3, 5 = WlNDOW, diagonais SAVED = 5 e GAP COMPRIMENTO SANÇÃO = 10). As pontuações e probabilidades BLAST indicam que o fragmento da SEQ ID n° 17 codifica uma inteira Pavlova lutheri delta-8 desaturase.

As figuras 8A e 8B mostram um alinhamento Clustal V (com os parâmetros padrão) de SEQ ID n° 18 (seqüência de aminoácidos da Pavlova lutherid elta-8 d esaturase), SEQ ID n° 66 (a seqüência de aminoácidos da seqüência Pavlova salina delta-8 desaturase, acima), SEQ ID n° 16 (seqüência de aminoácidos delta-8 desaturase d e Euglena gracilis seqüência divulgada como SEQ ID n° 2 em Publicação PCT N 0 WO 2006/012325; publicado em 2 de fevereiro de 2006), SEQ ID n° 65 (seqüência de aminoácidos para os ácidos graxos da delta-6 desaturase de Rhizopus stolonifer (NCBI n° de acesso ABB96724, supra)) e SEQ ID n° 53 (seqüência de aminoácidos para os ácidos graxos da delta-6 desaturase de Rhizopus stolonifer (NCBI n° de acesso AAX22052, acima)). Os resultados do alinhamento Clustal V mostram que as SEQ ID n0 18 é 76,4%, 22,6%, 22,2% e 22,2% idênticas às SEQ ID n° 66, SEQ ID n° 16, SEQ ID n° 65 e SEQ ID n° 53, respectivamente.

Exemplo 13

Transformação de Culturas de Embriões Somáticos de Soja Condições da Cultura

As culturas de suspensões embriogênicas de soja (cv. Jack) são mantidas em 35 mL de meio líquido SB196 (infra) em um agitador rotativo, a 150 rpm, 26°C com luz fluorescente branca fria em 16:8 h dia/noite fotoperíodo com intensidade de luz de 60-85 μE/m2/s. As culturas são subculturadas a cada 7 dias ou até 2 semanas por inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de líquido SB196 novos(de preferência o intervalo da subcultura é a cada 7 dias).

As suspensões celulares embriogênicas de soja são transformados com plasmídeos de expressão de soja pelo método de arma de bombardeamento de partículas [particle guri bombardmenf] (Klein et al., Nature, 327:70 (1987)) usando um instrumento DuPont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste de hélio) para todas as transformações.

Iniciação da Cultura de Suspensão Embriogênica da Soja:

As culturas de soja são iniciadas duas vezes cada mês, com 5 a 7 dias entre cada início. As vagens com sementes imaturas de plantas de soja disponíveis 45 a 55 dias após o plantio são colhidas, removidas de suas cascas e colocadas em uma caixa esterilizada magenta. As sementes de soja são esterilizadas por agitação durante 15 min em uma solução com 5% de Clorox com uma gota de sabão (ou seja, 95 mL de água destilada autoclavada acrescida de 5 mL de Clorox e uma gota de sabão, bem misturados). As sementes são lavadas usando duas garrafas de 1 litro de água destilada estéril e aquelas com menos de 4 mm são colocadas nas lâminas para microscópio individuais. A pequena extremidade da semente é cortada e os cotilédones são prensados para fora do revestimento das sementes. Os cotilédones são transferidos para placas contendo meio SB1 (25 a 30 cotilédones por placa). As placas são envoltos com fita de fibra e armazenadas durante 8 semanas. Depois deste tempo os embriões secundários são cortados e colocados em meio líquido SB196 por 7 dias.

Preparação de DNA para Bombardeamento:

Quer um plasmídeo intacto ou um fragmento de DNA plasmidial contendo os genes delta-5 desaturase de interesse e o gene marcador selecionável são usados para bombardeamento. Os fragmentos de plasmídeos de expressão de soja compreendendo a delta-5 desaturase da presente invenção são obtidos por isolamento de gel de plasmídeos digeridos. Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese em gel de agarose 1% SeaPIaque GTG (BioWhitaker aplicações moleculares) e os fragmentos de DNA contendo cassetes de genes são cortadas do gel agarose. O DNA é purificado a partir de agarose usando a enzima digerindo GELase seguindo o protocolo do fabricante.

Uma alíquota de 50 pL de água destilada estéril contendo 3 mg de partículas de ouro é adicionado a 5 pL de um solução de DNA 1 mg/μL (ou plasmídeo intacto ou fragmento de DNA preparado como descrito acima), 50 μL de CaCI 2,5 M 2 e 20 pL de espermidina 0,1 Μ. A mistura é agitada durante 3 min no nível 3 de um agitador de vórtice e agitadas 10 segundos numa microcentrífuga. Depois de uma lavagem com 400 pL de etanol a 100%, o pellet é suspenso por sonicação em 40 μL de etanol a 100%. A suspensão de DNA (5 μL) é dispensada para cada disco "flying" da Biolistic de disco intrumental PDS1000/HE. Cada 5 μL da alíquota contém aproximadamente 0,375 mg de partículas de ouro por bombardeamento (ou seja, por disco).

Preparação do Tecido E Bombardeio com DNA:

Cerca de 150 a 200 mg de culturas de suspensão embrionárias com 7 dias é colocado em um prato petri vazio e estéril de 60 χ 15 mm e o prato é coberto com rede de plástico. O tecido é bombardeada 1 ou 2 vezes por placa com pressão de ruptura membrana fixada em 1100 PSI e da câmara é evacuada a um vácuo de 27 a 28 polegadas de mercúrio. O tecido é colocado aproximadamente 3,5 centímetros a partir da tela de retenção ou parada.

Seleção de Embriões Transformados:

Os embriões transformados são selecionados usando higromicina como o marcador selecionável. Especificamente, após o bombardeio, o tecido é colocado em meio SB196 limpo e cultivado como descrito acima. Seis dias após o bombardeamento, o SB196 é trocado por SB196 limpo contendo higromicina 30 mg/L. O meio de seleção é atualizado semanalmente. Quatro a seis semanas após a seleção, tecido verde transformado é observado crescendo de agrupamentos embriogênicos necróticos não transformados. O tecido verde isolado é removido e inoculado em placas multiwell para gerar novas culturas de suspensões embriogênicas transformadas propagadas por clone.

Maturação do Embrião:

Os embriões são cultivados por 4 a 6 semanas a 26°C no SB196 com lâmpadas fluorescentes brancas frias (Phillips branca fria Econowatt F40/CW/RS/EW) e Agro (Phillips Agro F40) (40 Watt) em um fotoperíodo 16:8 horas com intensidade de luz de 90 a 120 pE/m2s. Depois deste tempo os agrupamentos de embriões são removidas para um meio sólido de ágar, SB166, por 1 a 2 semanas. Os aglomerados são então subculturados em meio SB103 por 3 semanas. Durante este período, os embriões individuais são retirados dos aglomerados e testados por alterações na sua composição dos ácidos graxos, como descrito acima.

Receitas de Meios:

SB 196 - FN Lite Meio de Proliferação Líquido (por litro)

<table>table see original document page 126</column></row><table> <table>table see original document page 127</column></row><table>

FN Lite soluções de estoque

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* adicionar primeiro, dissolver em garrafa escura com agitação 2 MS sulfato 100x estoque

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3 FN Lite haletos 100x estoque <table>table see original document page 128</column></row><table>

4 FN Lite Ρ, Β, Mo 100χ estoque

<table>table see original document page 128</column></row><table>

SB1 meio sólido (por litro)

1 embalagem MS sais (Gibco/BRL - Cat. n° 11117-066)

1 mL vitaminas B5 1000X estoque

31,5 g sacarose

2 mL 2,4-D (20 mg/L concentração final)

pH 5,7

8 g TC ágar

SB 166 meio sólido (por litro)

1 embalagem MS sais (Gibco/BRL - Cat. n° 11117-066)

1 mL vitaminas B5 1000X estoque

60 g maltose

750 mg MgCI2 hexaidrato

5 g carvão vegetal ativado

pH 5,7

2 g gelrite SB 103 meio sólido (por litro)

1 embalagem MS sais (Gibco/BRL - Cat. n° 11117-066)

1 mL vitaminas B5 1000X estoque

60 g maltose

750 mg MgCI2 hexaidrato

PH 5,7

2 g gelrite

SB 71 -4 meio sólido (por litro)

1 garrafa Gamborg's B5 sais com sacarose (Gibco/BRL - Cat. n° 21153-036)

pH 5,7

5 g TC ágar

2,4-D estoque

Obtido pré-produzido a partir de Phytotech Cat. n0 D 295 - concentração 1 mg/mL

vitaminas B5 estoque (por 100 mL)

Alíquotas estocadas a -20°C

10 g mio-inositol

100 mg ácido nicotínico

100 mg piridoxina HCl

1 g tiamina

Se a solução não se dissolver com rapidez suficiente, aplicar um baixo nível de calor através da placa de agitação quente. Exemplo 14

Análise Funcional da delta-5 Desaturase (SEQ ID N°s: 1 E 2) em Embriões Somáticos de Soja

Os embriões somáticos de soja maduros são um bom modelo para embriões zigóticos. Enquanto no estado globular em cultura líquida, os embriões somáticos de soja contêm quantidades muito baixas de triacilglicerol (TAG) ou proteínas de armazenamento típicas de embriões de soja zigóticos maduros. Nesse estágio de desenvolvimento, a razão entre triacilglicerido total e lipídeos polares totais (fosfolipídeos e glicolipídeo) é de cerca de 1:4, como é típico de embriões zigóticos de soja no estágio de desenvolvimento a partir do qual a cultura somática de embrião foi iniciada. No estágio globular também, os mRNAs para as sementes de proteínas proeminentes, α'-subunidade de β- conglicinina, inibidor da tripsina Kunitz 3, e a lectina da semente estão essencialmente ausentes. Após a transferência para meio livre de hormônio para permitir diferenciação ao estágio de maturação somática do embrião, TAG torna-se a classe de lipídeos mais abundante. Igualmente, os mRNAs para α'- subunidade de β-conglicinina, inibidor da tripsina Kunitz 3, e a lectina da semente tornam-se mensagens muito abundantes na população total de mRNA. Nestas bases, o sistema de embrião somático de soja comporta-se muito semelhantemente a embriões zigóticos em maturação de soja in vivo, e é, assim, um bom e rápido sistema modelo de análise de efeitos fenotípicos de modificação da expressão dos genes na via biossintética de ácido graxo (ver Publicação PCT N0 WO 2002/00904, exemplo 3). Sobretudo, o sistema modelo também é preditivo da composição de ácidos graxos de sementes de plantas derivadas de embriões transgênicos.

Os embriões somáticos transgênicos de soja contendo a delta-5 desaturase da presente invenção são analisadas da seguinte forma. Os ésteres metílicos de ácidos graxos são preparados a partir de embriões somáticos de soja únicos e maduros por transesterificação. Os embriões individuais são colocados em um frasco contendo 50 μL de hidróxido trimetilsulfônio (TMSH) e 0,5 mL de hexano e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação. Os ésteres metílicos de ácidos graxos (5 μL injetados da camada de hexano) foram separados e quantificados usando um cromatógrafo de fase gasosa Hewlett- Packard 6890 equipado com uma com coluna capilar Omegawax 320 sílica fundida (Catálogo n° 24152, Supelco Inc.). A temperatura do forno foi programada para permanecer a 220°C por 2,6 minutos, aumentar para 240°C a 20°C/min, e depois permanecer a 240°C por mais 2,4 min. O gás de arraste foi fornecido por um gerador de hidrogênio Whatman. Os tempos de retenção foram comparados aos de ésteres metílicos de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep, Inc.). Freqüentemente, 5 a 10 embriões por evento são analisadas por cromatografia gasosa, usando a metodologia descrita acima.

Exemplo 15

Co-expressões de outras combinações de cassete Promotor/Gene/Terminapor em Embriões Somáticos de Soja

Além dos genes, promotores, terminadores e cassetes gene descrito aqui, um perito na matéria percebo que o outro promotor/gene/terminador cassete combinações podem ser sintetizados em uma via semelhante, mas não limitado a, aquela descrita neste documento. Por exemplo, Publicações PCT n0 WO 2004/071467 e n0 WO 2004/071178 descrevem o isolamento de uma série de promotor e seqüências terminadoras de transcrição para uso em expressão específicas para embrião em soja. Além disso, Publicações PCT n0 WO 2004/071467, WO 2005/047479 e WO 2006/012325 descrevem a síntese de múltiplas combinações cassete promotora/gene/terminador pela ligação de promotores individuais, terminadores de transcrição e de genes juntos em combinações únicas. Geralmente, um sítio Notl ladeado pelo promotor adequado (por exemplo, que figuram na, mas não limitado a, tabela 9) e um terminador de transcrição (por exemplo, que figuram nas listas, mas não limitado a, tabela 10) é usado para clonar o gene desejado. Os sítios Notl podem ser adicionados a um gene de interesse, como os que figuram na, mas não limitado a, tabela 11 usando amplificação PCR com oligonucleotídeos projetados para introduzir sítios Notl nas extremidades 5' e 3' do gene. O produto PCR resultante é então digerido com Notl e clonado em um adequado cassete promotor/Notl/terminador.

Além disso, Publicações PCT n° WO 2004/071467, WO 2005/047479. e WO 2006/012325 descrevem os adicionais ajuntamentos de cassetes de gene individuais em combinações únicas, junto com cassetes marcadores selecionáveis adequados, a fim de obter a expressão fenotípica desejada. Embora isso seja feito principalmente usando diferentes restrições de sítios de enzimas, um técnico no assunto pode apreciar que uma série de técnicas podem ser utilizadas para alcançar a desejada combinação de terminador de promotor/gene/transcrição. Ao se fazer isso, qualquer combinação promotor/gene/transcrição de cassetes terminador específica para embrião poderá ser alcançada. O técnico no assunto também pode apreciar o fato de que estes cassetes podem ser localizados em fragmentos individuais de DNA ou em múltiplos fragmentos onde a co-expressão dos genes é o resultado de co-transformação dos múltiplos fragmentos de DNA.

Tabela 9

Promotores Específicos para Semente

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Tabela 11

Genes da Via Biossintética de AGP

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Exemplo 16

Seleção de Chlorsulfuron (ALS) E Regeneração da Planta Seleção de Chlorsulfuron (ALS):

Seguindo no bombardeamento, o tecido vegetal é dividido entre 2 frascos com meio SB196 limpo e cultivado conforme descrito no exemplo 13. Seis a sete dias após o bombardeamento, o SB196 é trocado por SB196 limpo contendo agente de seleção Chlorsulfuron 100 ng/mL. O meio de seleção é atualizado semanalmente. Quatro a seis semanas após a seleção, um tecido transformado verde é observado crescendo sobre agrupamentos embriogênicos necróticos não transformados. O verde tecido Isolado é removido e inoculado em placas de multiwell contendo SB196 para gerar culturas de suspensões embriogênicas transformadas novas, propagadas clonalmente.

Regeneração de Embriões Somáticos de soja em Plantas:

Para obter a planta inteira, a partir de culturas de suspensões embriogênicas, o tecido precisa ser regenerado. Os embriões são amadurecidos como descrito no exemplo 13. Depois de subcultura em meio SB103 durante 3 semanas, vários embriões são retirados dos aglomerados e testado para alterações na sua composição dos ácidos graxos, como descrito no exemplo 14. Deve ser observado que qualquer fenótipo detectável, que resultam da expressão dos genes de interesse, pode ser rastreado neste estágio. Isso pode incluir, mas não se limitar a: alterações no perfil de ácidos graxos, perfil protéico e conteúdo, conteúdo de carboidratos, taxa de crescimento, viabilidade, ou a habilidade de se desenvolver normalmente em uma planta de soja.

Os embriões individuais amadurecidos são desidratados ao serem colocados em uma placa de petri vazia e pequena (35 χ 10 mm) por cerca de 4 a 7 dias. As placas são seladas com fita de fibra (criando uma pequena câmara de umidade). Os embriões desidratado são plantados em meio SB71-4 onde são deixados para germinar sob as mesmas condições de cultura descritas acima. As mudas germinadas são removidas do meio de germinação e lavadas cuidadosamente com água e, em seguida, são plantadas em Redi-Earth em uma célula de uma bandeja com 24 células, coberta por uma redoma de plástico claro. Depois de 2 semanas a redoma é removida e as plantas aclimatadas por mais uma semana. Se as mudas parecem aclimatadas, são transplantadas para potes de 10" de Redi-Earth, com até 3 plantas por vaso. Depois de 10 a 16 semanas, as sementes maduras são colhidas, retalhadas e analisadas por ácidos graxos como descrito no exemplo 14.

As receitas dos meios podem ser encontradas no exemplo 13 e estoque de Chlorsulfuron é de 1 mg/ml em hidróxido de amônio 0,01 N.

Exemplo 17

Comparando a Especificidade do Substrato da delta- 5 Desaturase de Mortierella Alpina (MaD5) com a delta-5 Desaturase de Peridinium sp. 3426 CCMP626 (RD5) em Yarrowia Lipolytica

O presente exemplo descreve a comparação de especificidade do substrato de uma delta-5 desaturase de Mortierella alpina (MaD5; SEQ ID n° s: 67 e 68), que é descrito na Patente U.S. 6.075.183 e Publicação PCT N0 WO 2004/071467, e n.0 WO 2005/047479) com a de RD5 (SEQ ID n° 2) em Yarrowia lipolytica.

Este trabalho incluiu as seguintes etapas: (1) construção de vetor de expressão Yarrowia pY98 que compreende MaD5; (2) transformação da pY98 e pDMW368 em cepa Yarrowia Y2224; e 3.) comparação de perfis de lipídeos em organismos transformantes que compreendem pY98 ou pDMW368 após a alimentação dos substratos de ácidos graxos.

Construção de Vetor de Expressão Yarrowia pY98 que compreende MaD5;

O plasmídeo pY5-22 (SEQ ID n°: 69) é um plasmídeo bifuncional (shuttle) que pode se replicar tanto em E. coli e Yarrowia lipolytica, contendo o seguinte: uma seqüência de replicação autônoma Yarrowia (ARS18; n° de acesso GenBank M91600); uma origem de replicação de plasmídeo ColE1, um gene resistente a ampicilina (AmpR) para seleção em E. coli, um gene Yarrowia URA3 (n° de acesso GenBank AJ306421) para seleção em Yarrowia; e, um cassete quimérico TEF::Ncol/Notas:: XPR, sendo que "XPR" foi ~ 100 bp da região de 3' do gene Yarrowia Xpr (n° de acesso GenBank M17741). Embora a construção de plasmídeo pY5-22 não está aqui descrita em detalhes, ela foi derivada de pY5 (anteriormente descrito na Publicação PCT N 0 WO 2004/101757).

O Plasmídeo pY5-22GPD (SEQ ID n° 70) foi criado a partir de pY5- 22 (SEQ ID n°: 69), substituindo o promotor TEF com o promotor Yarrowia lipolytica GPD (SEQ ID n°: 71) usando técnicas bem conhecidas pelo técnico no assunto. O "promotor GPD" Yarrowia refere-se à região 5' a montante não- traduzida em frente do "ATG" códon de iniciação de tradução de uma proteína codificada pelo gene do gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Yarrowia lipolytica (GPD) e que é necessário para a expressão (Publicação PCT N0 WO 2005/003310). Mais especificamente, o promotor Yarrowia lipolytica GPD foi amplificado a partir do plasmídeo pYZDE2-S (SEQ ID n°: 72; que foi anteriormente descrito no pedido de Patente U.S. n° 11/737772 (o conteúdo da qual está aqui incorporada, por referência)) usando oligonucleotídeos GPDsenso (SEQ ID n° 73) e GPDantisenso(SEQ ID n°: 74). O fragmento de DNA resultante foi digerido com Sall/Notl e clonado no fragmento Sall/Notl de pY5-22 (SEQ ID n° 69), dessa forma substituindo o promotor e sítio Ncol/Notl com o promotor GPD e um único sítio Notl1 e produzindo assim pY5-22GPD (SEQ ID n° 70).

O gene de delta-5 desaturase de Mortierella alpina (SEQ ID n° 67) foi liberado da pKR136 (SEQ ID n° 75; que foi previamente descrito na Publicação PCT N 0 WO 2004/071467 (o conteúdo da qual está aqui incorporada, por referência)) pela digestão com Notl e clonado no sítio Notl de pY5-22GPD para produzir pY98 (SEQ ID n° 76; figura 9).

Transformação do pY98 (que compreende MaD5) ε PDMW368 (que compreende RD5) na cepa YARROWIA Y2224 e comparação de perfis de LlPÍDEOS

Cepa Y2224 foi isolada da seguinte maneira: As células de Yarrowia lipolytica ATCC # 20362 a partir de uma placa de ágar YPD (1% de extrato levedura, 2% de bactopeptone, 2% de glicose, 2% de ágar) foram aplicadas por esfregaço em uma placa MM (75 mg/L de cada um uracil e uridina, 6,7 g/L de YNB com sulfato de amônia, sem aminoácidos, e 20 g/L de glicose), contendo 250 mg/L 5-FOA (Zymo Research). As placas foram incubadas a 28°C e quatro das colônias resultantes foram corrigidos separadamente em placas MM contendo 200 mg/mL de 5-FOA e placas MM sem uracil e uridina para confirmar uracil Ura3 auxotrófica.

A cepa Y2224 foi transformada com pY98 (SEQ ID n° 76, figura 9) e pDMW368 (SEQ ID n° 23; figura 5C; exemplo 6), conforme descrito nos métodos gerais.

As únicas colônias de transformantes Yarrowia lipolytica contendo pY98 (SEQ ID n° 76) ou pDMW368 (SEQ ID n° 23) foram cultivadas em 3 mL de MM sem uracil suplementado com tergitol 0,2% a 30°C por 1 dia. Depois disso, 0,1 mL foi transferido para 3 mL do mesmo meio suplementado com qualquer uma das EDA, ETrA, DGLA, a ETA ou sem ácidos graxos. Estas foram incubadas por 16 horas a 30°C, 250 rpm e, em seguida, pellets foram obtidos por centrifugação. As células foram lavadas com água uma vez, revestidas por centrifugação e secas ao ar. Aspellets foram transesterificadas (Roughan, G. and Nishida, I., Arch. Biophys., 276 (1):38-46 (1990)) com 500 μL de metóxido de sódio 1% por 30 minutos a 50°C depois dos quais 500 μL de NaCl 1 M e 100 μL de heptano foram adicionados. Depois de uma boa homogeneização e centrifugação, ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMEs) foram analisados por cromatografia gasosa.

Os FAMEs (5 pL injetados da camada de hexano) foram separados e quantificados utilizando um cromatógrafo de fase gasosa Hewlett-Packard 6890 equipado com uma coluna capilar Omegawax 320 sílica fundida (Catálogo n° 24152, Supelco Inc.). A temperatura do forno foi programada para permanecer a 220°C por 2,6 minutos, aumentar para 240°C a 20°C/min, e depois permanecer a 240°C por mais 2,4 min. O gás de arraste foi fornecido por um gerador de hidrogênio Whatman. Os tempos de retenção foram comparados aos de ésteres metílicos de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep, Inc.).

O perfil de ácidos graxos para Yarrowia Iipolytica que expressam pY98 (SEQ ID n° 76) ou pDMW368 (SEQ ID n° 23) e que alimentam diferentes substratos estão representados na figura 10A. O sombreamento na figura 10A indica substratos alimentados e produtos produzidos; os ácidos graxos são identificados como 16:0 (palmitato), 16:1, 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oléico), LA, GLA, ALA, STA, EDA, SCI (ácido esciadônico ou ácido cis-5,11,14- eicosatrienóico; 20:3 ômega-6), DGLA, ARA, ETrA, JUP (ácido juniperônico ou ácido cis-5,11,14,17-eicosatrienóico; 20:4 ômega-3), ETA e EPA. As composições de ácidos graxos foram expressas como percentagem de peso (%) do total de ácidos graxos.

O percentual de dessaturação de delta-5 ("% dessat. delta-5") de RD5 e MaD5 para cada substrato é mostrado na figura 10B e foi calculado pela divisão da porcentagem em peso por produto (quer SCI, JUP, ARA ou ΑΡΕ) pela soma da porcentagem em peso do substrato e do produto (quer EDA e SCI, ETrA e JUP, DGLA e ARA, ou ETA e EPA, respectivamente) e multiplicando por 100, para expressar como uma porcentagem, dependendo do substrato que foi alimentado.

As atividades de MaD5 e RD5 são comparadas através da razão entre a percentagem de dessaturação do delta-5 ("Razão dessat. R/Ma") na figura 10B e são calculadas dividindo a percentagem de dessaturação de delta- 5 por RD5 em um determinado substrato pela porcentagem de dessaturação do delta-5 por MaD5 no mesmo substrato.

A especificidade do substrato RD5 e MaD5 para o substrato de ácido graxo ômega-6 correto (ou seja, DGLA) versus o subproduto de ácidos graxos (ou seja, SCI) ou o substrato de ácido graxo ômega-3 correto (ou seja, ETA) versus o subproduto de ácidos graxos (ou seja, JUP) também está mostrada na figura 10B. Especificamente, a especificidade do substrato ("razão Prod/Subprod.") para os substratos ômega-6 foi calculada dividindo-se a percentagem de dessaturação de delta-5 (% dessat. delta-5) por DGLA pela percentagem de dessaturação de delta-5 (% dessat. delta-5) por EDA e é mostrado nos mesmos termos que os resultados para DGLA. A especificidade do substrato ("razão Prod/Subprod.") para os substratos ômega-3 foi calculada dividindo-se a percentagem de dessaturação de delta-5 (% dessat. delta-5) por ETA pela percentagem de dessaturação de delta-5 (% dessat. delta-5) por ETrA e é mostrado nos mesmos termos que os resultados para DGLA. Além disso, a razão da especificidade de substrato ("razão Prod/Subprod R/Ma") para os substratos ômega-6 foi determinada dividindo-se a especificidade do substrato por RD5 nos substratos ômega-6 (isto é, DGLA/EDA) por aquela de MaD5. A razão da especificidade de substrato ("razão Prod/Subprod R/Ma") para os substratos ômega-3 foi determinada dividindo-se a especificidade do substrato por RD5 nos substratos ômega-3 (isto é, ETA/ETrA) por aquela de MaD5. A preferência dos RD5 e MaD5 por substratos ômega-6 ou ômega- 3 é comparada usando a razão das percentagens de dessaturação de delta-5 ("razão n-6/n-3") na figura 10B e é calculada dividindo-se a percentagem de dessaturação de delta-5 por RD5 e MaD5 sobre um determinado substrato ômega-6 (quer DGLA ou EDA) pela percentagem de dessaturação de delta-5 no substrato correspondente ômega-3 (ou ETA ou ETrA, respectivamente).

A partir dos resultados da figura 10B, é claro que RD5 é de aproximadamente 3,0 a 9,7 vezes mais ativo em Yarrowia do que em MaD5 quando DGLA, EDA, ETrA e ETA são usados como substratos. A especificidade do substrato RD5 comparada ao MaD5 (RD5/MaD5) para o substrato ômega-6 correto (ou seja, DGLA versus EDA) é de aproximadamente 0,4 e para o substrato ômega-3 (ou seja, ETA versus ETrA) é de aproximadamente 0,6. O RD5 também tem uma preferência aproximada 1,4 vezes por substratos ômega-6 (ou seja, EDA e DGLA) sobre os substratos ômega-3 (ou seja, ETrA e ETA), respectivamente.

Exemplo 18

Construção de Vetor de Expressão de Soja pKR916 Para Co-Expressão da delta-5 Desaturase de Mortierella alpina (MaD5) Com uma delta-9 Elongase derivada de Euglena gracilis (EgD9e) E uma Delta-8 Desaturase derivada da Euglena Gracilis (EgD8)

O presente exemplo descreve a construção de um vetor de soja para a co-expressão de MaD5 (SEQ ID n° 67; exemplo 17) com EgD9e (SEQ ID n° 77; que é descrita no pedido U.S. n° 11/601563 (depositado em 16 de novembro de 2006; Súmula de advogado n° APA-1562) e EgD8 (SEQ ID n° 78; descrito como Eg5 na Publicação PCT N0 WO 2006/012325).

Delta-9 Elongase de Euglena Gracilis (EgD9e):

Um clone da biblioteca cDNA de Euglena (eeglc), chamado eeg1c.pk001.n5f, contendo a delta-9 elongase de Euglena gracilis (EgD9e; SEQ ID n° 77) foi usado como modelo para amplificar EgD9e com iniciadores de oligonucleotídeos oEugELI-1 (SEQ ID n° 79) e oEugEL1-2 (SEQ ID n° 80) usando o VentR® polimerase de DNA (Catálogo No. M0254S, New England Biolabs Inc., Beverly, MA), seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Blun t® usando o kit de clonagem Zero Blunt® PCR (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR906 (SEQ ID n° 81).

Um plasmídeo de partida pKR72 (ATCC n° de acesso PTA-6019; SEQ ID n° 82, seqüência de 7085 bp), um derivado do pKS123 que foi previamente descrito na Publicação PCT N0 WO 02/008269 (o conteúdo da qual está aqui incorporada por referência), contém o gene da higromicina B fosfotransferase (HPT) (Gritz, L. e Davies, J., Gene, 25:179-188 (1983)), ladeado pelo promotor T7 e terminador de transcrição (ou seja, um cassete T7prom/HPT/T7term), e uma origem de replicação de bactérias (ORI) para seleção e replicação em bactérias (por exemplo, E. coli). Além disso, pKR72 também contém HPT, ladeado pelo promotor 35S (Odell et al., Nature, 313:810-812 (1985)) e terminador de transcrição NOS 3' (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:561-570 (1982)) (isto é, um cassete 35S/HPT/NOS3 ') para seleção em plantas como a soja. PKR72 também contém um sítio de restrição Notl, ladeado pelo promotor para a subunidade a' da β-conglicinina (Beachy et al., EMBO J., 4:3047 - 3053 (1985)) e a região 3' de terminação de transcrição do gene da faseolina (Doyle et al., J. Biol Chem., 261:9228-9238 (1986)), permitindo assim uma forte expressão específica nos tecidos das sementes de soja de genes clonados no sítio Notl.

O fragmento ASCI do plasmídio pKS102 (SEQ ID n° 83), anteriormente descrito na Publicação PCT N0 WO 02/00905 (o conteúdo da qual está aqui incorporada por referência), contendo um cassete T7prom/hpt/T7term e ori bacteriano, foi combinado com o fragmento ASCI de plasmídeo pKR72 (SEQ ID n° 82), contendo um cassete 3con/Notl/Phas para produzir pKR197 (SEQ ID n° 84), anteriormente descrito na Publicação PCT N0 WO 04/071467 (o conteúdo da qual está aqui incorporada por referência).

O gene para a delta-9 elongase de Euglena gracilis foi liberado de pKR906 (SEQ ID n° 81) por digestão com Notl e clonado no sítio de Notl de pKR197 (SEQ ID n° 84) para produzir o vetor de clonagem intermediário pKR911 (SEQ ID n°: 85).

Delta-8 desaturase de Euglena Gracilis ("egd8")

Um Plasmídeo pKR680 (SEQ ID n° 86), que foi anteriormente descrito na Publicação PCT N0 WO 2006/012325 (o conteúdo da qual está aqui incorporada por referência), contém a delta-8 desaturase de Euglena gracilis (EgD8; SEQ ID n° 78; descrito como Eg5 em WO 2006/012325) ladeada pelo promotor inibidor de tripsina em soja Kunitz (KTI) (Jofuku et al., Plant Cell, 1:1079 -1093 (1989)) e a região de terminação KTI 3', o isolamento da qual é descrito na Patente U.S. 6.372.965, seguido pelo terminador de transcrição albumina de soja, que foi anteriormente descrito na Publicação PCT N0 WO 2004/071467 (ou seja, um cassete Kti/Notl/Kti3'Salb3').

O plasmídeo pKR680 (SEQ ID n° 86) foi digerido com BsiWI e o fragmento contendo EgD8 foi clonado no sítio BsiWI de pKR911 (SEQ ID n° 85) para produzir pKR913 (SEQ ID n° 87).

Delta-5 desaturase de Mortierella Alpina (mad5):

O plasmídeo pKR767 (SEQ ID n° 88), que foi anteriormente descrito na Publicação PCT N ° WO 2006/012325 (o conteúdo da qual está aqui incorporada, por referência), contém a delta-5 desaturase de Mortierella alpina (MaD5; SEQ ID n° 67) ladeado pelo promotor para o gene GY1 glicinina de soja e região de terminação de transcrição A2 3' da Ieguminosa ervilha (ou seja, um cassete Gy1/MaD5/legA2; a construção da qual é descrita no WO 2006/012325).

O cassete Gy1/Mad5/legA2 foi liberado da pKR767 (SEQ ID n° 88) por digestão com Sbfl e o fragmento resultante foi clonado no sítio Sbfl de pKR913 (SEQ ID n° 87) para produzir pKR916 (SEQ ID n° 89). A representação esquemática de pKR916 é mostrado na figura 11 A. Desta forma, a Euglena gracilis delta-9 elongase (identificada como "EUG el1" na figura 11A) foi co-expressa com a Euglena gracilis delta-8 desaturase (identificada como "EUG d8-sq5" na figura 11 A) e a Mortierella alpina delta-5 desaturase (identificada como" DELTA 5 DESATURASE M ALPINA" na figura 11 A) e são promotores fortes específicos para sementes.

Exemplo 19

Construção do Vetor de Expressão de Soja PKR1038 para Co-Expressão da delta-5 Desaturase (RD5) de Piridinum sp. CCMP626 com uma delta-9 Elongase Derivada de Euglena Gracilis (EgD9e) E uma delta-8 Desaturase Derivada de Euglena Gracilis (EgD8)

O presente exemplo descreve a construção de um vetor de soja para a co-expressão de RD5 (SEQ ID n° 1, exemplo 5) com EgD9e (SEQ ID n° 77, Exemplo 18) e EgD8 (SEQ ID n° 78, exemplo 18).

O plasmídeo de partida pKR974 (SEQ ID n° 90) é idêntico ao pKR767 (SEQ ID n° 88, exemplo 18), exceto o fragmento Notl contendo MaD5 que foi substituído por um fragmento Notl contendo a delta-5 desaturase de Saprolegnia diclina (SdD5; SEQ ID n° 91, que é descrita na Publicação PCT N0 WO 2004/071467). Além disso, um sítio Mfel no terminador legA2 de pKR767 (SEQ ID n° 88) foi removido por digestão com Mfel, enchendo o sítio Mfel e sendo religado (ou seja, CAATTG convertido para CAATTAATTG) e, portanto, o terminador legA2 de pKR974 (SEQ ID n° 90) é 770 bp versus 766 bp por pKR767 (SEQ IDn0 88).

Para clonar RD5 em vetor de expressão de soja o sítio de restrição Notl precisava ser introduzido na extremidade 5' do gene. O técnico no assunto irá perceber que há muitas maneiras de introduzir sítios de restrição em genes como, mas não se limitando a, PCR ou por subclonagem em vetores contendo os sítios apropriados. Neste caso, para introduzir um sítio Notl na extremidade 5' de RD5 (SEQ ID n° 1), pDMW368 (SEQ ID n° 23) foi digerido com Mfel e, em seguida, parcialmente digerido com Ncol. O fragmento de Ncol/Mfel contendo um RD5 de comprimento total (SEQ ID n° 1) foi clonado no sítio Ncol/Mfel de um vetor de clonagem intermediário que possui um sítio Notl diretamente a montante do sítio Ncol (ou seja, GCGGCCGCAAACCATGG). O plasmídio resultante, em seguida, foi digerido com Notl e o fragmento contendo RD5 (SEQ ID n° 1) foi clonado no sítio de Notl de pKR974 (SEQ ID n° 90) para produzir pKR1033 (SEQ ID n° 92).

O cassete Gy1/EgD5/legA2 foi liberado da pKR1033 (SEQ ID n° 92) por digestão com Sbfl e o fragmento resultante foi clonado no sítio Sbfl de pKR913 (SEQ ID n° 87) para produzir pKR1038 (SEQ ID n° 93). A representação esquemática de pKR1038 (SEQ ID n° 93) é mostrada na figura 11B. Desta forma, a delta-9 elongase de Euglena gracilis (identificada como "EUG el 1" na figura 11B), poderia ser co-expressa com a delta-8 desaturase de Euglena gracilis (identificada como "EUG d8-sq5" na figura 11B) e a delta- 5 desaturase de Peridinium sp. CCMP626 (identificada como "CCMP626 D5 DS" na figura 11B) são promotores fortes, específicos de sementes.

Exemplo 20

A co-Expressão da Delta-9 Elongase de Euglena Gracilis. a Delta-8 Desaturase de Euglena Gracilis ε a Delta-17 Desaturase de Saprolegnia Diclina com a Delta-5 Desaturase de Mortierella Alpina (pKR916 & PKR328) ου a Delta-5 Desaturase de Peridinium sp. CCMP626 (PKR1038 ε PKR328) em Embriões Somáticos de Soja

Os presentes exemplos descrevem a transformação e expressão em embriões somáticos de soja pKR916 (SEQ ID n° 89, exemplo 18; contendo EgD9e, EgD8 e MaD5) com pKR328 (SEQ ID n° 94, figura 11C1 anteriormente descrito na publicação PCT WO 04/071467), contendo a delta-17 desaturase de Saprolegnia diclina (SdD17) e o gene higromicina fosfotransferase para a seleção em higromicina. Os presentes exemplos descrevem ainda a transformação e expressão em embriões somáticos de soja pKR1038 (SEQ ID n° 93, exemplo 19; contendo EgD9e, EgD8 e RD5) com pKR328 (SEQ ID n° 94, figura 11C).

A cultura de suspensões embriogênicas de soja (cv. Jack) foi transformada com o fragmento ASCI contendo o cassete de expressão pKR916 (SEQ ID n° 89) e plasmídeo intacto pKR328 (SEQ ID n° 94), ou com o fragmento ASCI contendo o cassete de expressão pK1038 (SEQ ID n° 93) e plasmídeo intacto pKR328 (SEQ ID n° 94), conforme descrito no exemplo 13.

Os embriões foram maturados em histodiferenciação de soja em meio líquido de maturação (sham líquido mídia; Schmidt et al., Cell Biology and MorfDhogenesis, 24:393 (2005)) usando um procedimento modificado. Resumidamente, após 4 semanas de seleção em SB196 conforme descrito no exemplo 13, agrupamentos de embrião foram removidos em 35 mL de SB228 (meio líquido SHaM) em um erlenmeyer de 250 mL. O tecido foi mantido em meio líquido SHaM sobre um agitador rotativo a 130 rpm e 26°C com luz fluorescente branca fria em um fotoperíodo de 16:8 h dia/noite, a uma intensidade de luz de 60 a 85 μE/m2/s durante 2 semanas, enquanto os embriões amadureciam. Os embriões crescidos por 2 semanas em meio líquido SHaM foram equivalentes em termos de tamanho e teor de ácidos graxos aos embriões cultivados em SB166/SB103 por 5 a 8 semanas, conforme descrito no exemplo 13.

Receitas de Meios:

SB 228- Histodiferenciação e Maturação da Soia (SHaM) (por litro)

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*Nota: O volume final será 1010 mL depois da adição de glutamina.

Já que a glutamina se degrada de forma relativamente rápida, pode ser preferível adicionar imediatamente antes de usar o meio. Expiração 2 semanas após a glutamina é adicionada. O meio básico pode ser mantido por mais tempo sem a glutamina.

FN-lite Macro para SHAM 10X- estoque #1 (por litro)

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MS Micro 100X- estoque #2 (por 1 litro)

<table>table see original document page 147</column></row><table> <table>table see original document page 148</column></row><table>

FeEDTA 100X- estoque #3 (por litro)

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*EDTA precisa ser completamente dissolvido antes da adição do ferro. Trazer para volume

A solução é fotossensível. As garrafas(s) devem ser revestidas em folhas metálicas para impedir a entrada de luz.

Autoclave

Ca 100X- estoque #4 (por litro)

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Vitamina B5 1000X- estoque #5 (por litro)

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Glutamina 4% - estoque #6 (por litro)

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Gradualmente adicionar durante agitação e com pouco aquecimento.

Não exceder 35°C.

Completar o volume total

Filtro esterilizado

Estocar congelado

*Nota: Aquecer estoque descongelado em banho a 31°C para dissolver os cristais completamente.

Após a maturação em meio líquido SHAM1 embriões individuais foram retirados dos agrupamentos, secos e testados para alterações na sua composição dos ácidos graxos, como descrito acima.

Um subconjunto de embriões de soja (ou seja, seis embriões por evento) transformado com pKR916 ou (SEQ ID n° 89) e pKR328 (SEQ ID n° 94), ou com pKR1038 (SEQ ID n° 93) e pKR328 (SEQ ID n° 94), foi colhido e colocado em frascos de vidro GC e ésteres metílicos de ácidos graxos foram preparados pela transesterificação. Para transesterificação, 50 μL de hidróxido trimetilsulfônio (TMSH) e 0,5 mL de hexano foram adicionados aos embriões nos frascos de vidro e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação. Os ésteres metílicos de ácidos graxos (5 μL injetados da camada de hexano) foram separados e quantificados usando um cromatógrafo de fase gasosa Hewlett-Packard 6890 equipado com uma coluna capilar Omegawax 320 sílica fundida (Catálogo n° 24152, Supelco Inc.). A temperatura do forno foi programada para permanecer a 220°C por 2,6 minutos, aumentar para 240°C a 20°C/min, e depois permanecer a 240°C por mais 2,4 min. O gás de arraste foi fornecido por um gerador de hidrogênio Whatman. Os tempos de retenção foram comparados aos de ésteres metílicos de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep, Inc.).

Desta forma, 60 eventos transformados com pKR916 (SEQ ID n° 89) e pKR328 (SEQ ID n° 94) e 31 eventos transformados com pKR1038 (SEQ ID n° 93) e pKR328 (SEQ ID n° 94) foram analisados. Os perfis médios de ácidos graxos para os dez eventos de maior atividade de delta-5 desaturase para cada transformação (pKR916 e pKR328, pKR1038 e pKR328) são mostrados nas figuras 2A e 12B, respectivamente.

Nas figuras 12A e 12B, ácidos graxos são identificados como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oléico), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUP, ETA e EPA. Os ácidos graxos mencionados como "outros" incluem: 18:2 (5,9), GLA, STA, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) ou 20:2 (8,11) e DPA. Cada um destes "outros" ácidos graxos está presente em uma abundância relativa de menos de 3,0% do total de ácidos graxos. As composições de ácidos graxos de um embrião individual foram expressas como percentagem em peso (%) do total de ácidos graxos e a composição média de ácidos graxos é uma média de seis embriões individuais para cada evento.

A atividade da delta-5 desaturase para os "corretos" substratos (ou seja, DGLA e ETA) é expressa em porcentagem de dessaturação de delta- 5 ("% correta de dessat. de delta-5 "), calculado segundo a seguinte fórmula: ([produto]/[substrato + produto])*100. Mais especificamente, a percentagem de dessaturação de delta-5 para os substratos "corretos" foi determinada como: ([ARA + EPA]/[DGLA + ETA + ARA + EPA])*100.

A atividade da delta-5 desaturase para os substratos "errados" (ou seja,, EDA e ERA) também é expresso em porcentagem de dessaturação de delta-5 % errada de dessat. de delta-5 "), calculada da seguinte forma: ([SCI + JUP]/[EDA + ERA + SCI + JUP])*100.

As especificidades do substrato MaD5 e RD5 para os substratos "corretos" (isto é, DGLA e ETA) versus os substratos "errados" (isto é, EDA e ERA) foram comparados e a comparação é mostrada na figura 13. Na figura 13, a atividade da delta-5 desaturase para os substratos "corretos" ("porcentagem de delta-5 desaturase correta") está representada graficamente no eixo χ e a atividade da delta-5 desaturase para os substratos "errados" ("porcentagem de delta-5 desaturase errada") está representada graficamente no eixo y para MaD5 (dados da figura 12A) ou RD5 (dados da figura 12B).

Claims (36)

1. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade delta-5 desaturase, sendo que o polipeptídeo tem pelo menos -80% de identidade com aminoácidos, com base no método de alinhamento Clustal W, quando comparado com uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 2; (b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade delta-5 desaturase, sendo que a seqüência de nucleotídeos tem pelo menos 80% de identidade, com base no método de alinhamento BLASTN, quando comparada com a seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID n°: 1 ou na SEQ ID n°: 3; (c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de delta-5 desaturase, sendo que a seqüência de nucleotídeos hibridiza, sob condições estringentes, com a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3; ou (d) um complemento da seqüência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c), sendo que o complemento e as seqüências de nucleotídeos consistem em quantidades iguais de nucleotídeos, e são 100% complementares.

2. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos compreende a SEQ ID n° 1 ou a SEQ ID n° 3.

3. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo compreende: (a) SEQ ID n° 2; ou (b) uma seqüência de aminoácidos que difere da seqüência de aminoácidos de (a) em pelo menos uma substituição conservativa de aminoácidos.

4. CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme descrito em uma das reivindicações 1, 2 ou 3, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora.

5. CÉLULA, caracterizada pelo fato de que compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante conforme descrita na reivindicação 4.

6. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a mencionada célula é selecionada do grupo que consiste em plantas e levedura.

7. MÉTODO PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA, caracterizado pelo fato de que compreende transformar uma célula com a construção recombinante conforme descrita na reivindicação 4, e selecionar essas células transformadas com a construção recombinante descrita na reivindicação 4.

8. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSFORMADA, caracterizado pelo fato de que compreende transformar uma célula vegetal com o polinucleotídeo conforme descrito em uma das reivindicações 1, 2 ou 3 e regenerar a planta a partir da célula vegetal transformada.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a planta é soja.

10. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato de que compreende em seu genoma a construção recombinante conforme descrita na reivindicação 4.

11. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir da planta produzida pelo método conforme descrito em uma das reivindicações 8 ou 9.

12. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS POLI INSATU RADOS DE CADEIA LONGA, em uma célula vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula com a construção recombinante conforme descrita na reivindicação 4; (b) selecionar essas células transformadas que produzem ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa.

13. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, caracterizados pelo fato de que são obtidos a partir da semente conforme descrita na reivindicação 10.

14. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, caracterizados pelo fato de que são obtidos a partir da semente conforme descrita na reivindicação 11.

15. MÉTODO PARA PRODUZIR PELO MENOS UM ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO, em uma célula vegetal de semente oleaginosa, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula vegetal de semente oleaginosa com uma primeira construção de DNA recombinante, que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um polipeptídeo delta-5 desaturase, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora e pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional, que compreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo formado por delta-4 desaturase, delta-5 desaturase, delta-6 desaturase, delta-8 desaturase, delta-12 desaturase, delta-15 desaturase, delta-17 desaturase, delta-9 desaturase, delta-9 elongase, C14/16 elongase, C16/18 elongase, C18/20 elongase e C20/22 elongase; (b) regenerar uma planta de semente oleaginosa a partir das células transformadas da etapa (a); e (c) selecionar essas sementes obtidas a partir das plantas da etapa (b), que têm um nível alterado de ácidos graxos poliinsaturados quando comparadas com o nível em sementes obtidas a partir de uma planta com sementes oleaginosas não transformadas.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a planta de semente oleaginosa é selecionada do grupo formado por soja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão, linho e cártamo.

17. PLANTA DE SEMENTE OLEAGINOSA, caracterizada pelo fato de que compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante conforme descrita na reivindicação 4.

18. PLANTA DE SEMENTE OLEAGINOSA, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado, que codifica pelo menos um polipeptídeo delta-5 desaturase, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora; e (b) pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional que compreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo formado por delta -4 desaturase, delta-5 desaturase, delta-6 desaturase, delta-8 desaturase, delta-12 desaturase, delta-15 desaturase, delta-17 desaturase, delta-9 desaturase, delta-9 elongase, C14/16 elongase, C16/18 elongase, C18/20 elongase e C20/22 elongase.

19. PLANTA DE SEMENTE OLEAGINOSA, de acordo com uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que a planta com semente oleaginosa é selecionada do grupo formado por soja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão, Iinho e cártamo.

20. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir da planta de semente oleaginosa conforme descrita na reivindicação 15.

21. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir da planta de semente oleaginosa conforme descrita na reivindicação 16.

22. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, caracterizados pelo fato de que são obtidos a partir da semente conforme descrita na reivindicação 20.

23. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, caracterizados pelo fato de que são obtidos a partir da semente conforme descrita na reivindicação 21.

24. ÓLEO, caracterizado pelo fato de que é obtido pelo método conforme descrito em umas das reivindicações 12 ou 15.

25. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato de que incorporam o óleo conforme descrito na reivindicação 22.

26. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato de que incorporam o óleo conforme descrito na reivindicação 23.

27. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato de que incorporam o óleo conforme descrito na reivindicação 24.

28. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato de que compreendem a semente conforme descrita na reivindicação 20.

29. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato de que compreendem a semente conforme descrita na reivindicação 21.

30. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato de que compreendem um ingrediente derivado do processamento das sementes conforme descrito na reivindicação 20.

31. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato de que compreendem um ingrediente derivado do processamento da semente conforme descrito na reivindicação 21.

32. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, de acordo com a reivindicação 22, caracterizados pelo fato de que o subproduto é lecitina.

33. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, de acordo com a reivindicação 23, caracterizados pelo fato de que o subproduto é lecitina.

34. PROGÊNIE DE PLANTAS, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir da planta produzida pelo método conforme descrito em uma das reivindicações 8 ou 9.

35. PROGÊNIE DE PLANTAS, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir da planta de semente oleaginosa conforme descrita em uma das reivindicações 20 ou 30.

36. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, caracterizada pelo fato de que codifica uma delta-5 desaturase conforme apresentada na SEQ ID n° 3, sendo que pelo menos um códon é otimizado para expressão em Yarrowia sp.