BRPI0416713B1 - Métodos de produção de uma planta e de uma célula vegetal resistentes a um fungo fitopatogênico, célula vegetal e planta resistentes a um fungo fitopatogênico, arroz, tabaco, métodos para a identificação de um gene essencial ao desenvolvimento ou à patogenicidade de um fungo fitopatogênico, método para inibir a expressão de um gene de fungo, métodos para reduzir a expressão de gene de fungo e uso de um constructo - Google Patents
Métodos de produção de uma planta e de uma célula vegetal resistentes a um fungo fitopatogênico, célula vegetal e planta resistentes a um fungo fitopatogênico, arroz, tabaco, métodos para a identificação de um gene essencial ao desenvolvimento ou à patogenicidade de um fungo fitopatogênico, método para inibir a expressão de um gene de fungo, métodos para reduzir a expressão de gene de fungo e uso de um constructo Download PDFInfo
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Abstract
"métodos de produção de uma planta e de uma célula vegetal resistentes a um fungo fitopatogênico, célula vegetal e planta resistentes a um fungo fitopatogênico, arroz, tabaco, métodos para a identificação de um gene essencial ao desenvolvimento ou à patogenicidade de um fungo fitopatogênico, método para inibir a expressão de um gene de fungo, métodos para reduzir a expressão de gene de fungo e uso de um constructo". a presente invenção tem por objeto um sistema de controle do desenvolvimento dos fungos durante um ataque fitopatogênico. o sistema de acordo com a presente invenção consiste em fazer com que uma planta expresse um constructo que permita inibir a expressão de um gene essencial ao desenvolvimento ou à patogenicidade do fungo. a presente invenção trata também das plantas e das células obtidas.
Description
(54) Título: MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA E DE UMA CÉLULA VEGETAL RESISTENTES A UM FUNGO FITOPATOGÊNICO, CÉLULA VEGETAL E PLANTA RESISTENTES A UM FUNGO FITOPATOGÊNICO, ARROZ, TABACO, MÉTODOS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE UM GENE ESSENCIAL AO DESENVOLVIMENTO OU À PATOGENICIDADE DE UM FUNGO FITOPATOGÊNICO, MÉTODO PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE UM GENE DE FUNGO, MÉTODOS PARA REDUZIR A EXPRESSÃO DE GENE DE FUNGO E USO DE UM CONSTRUCTO (51) Int.CI.: C12N 15/82; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 02/07/2004 FR 0407373, 23/12/2003 FR 0315228 (73) Titular(es): BAYER SAS (72) Inventor(es): RACHEL BALTZ; RAPHAEL DUMAIN; STÉPHANE PEYRARD; JEAN-MARC FERULLO; ROLAND BEFFA
1/35 “MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA OU DE UMA CÉLULA VEGETAL RESISTENTE A UM FUNGO FITOPATOGÊNICO, MÉTODOS PARA INIBIR OU REDUZIR A EXPRESSÃO DE UM GENE DE FUNGO E
USO DE UMA CONSTRUÇÃO”
Campo da Invenção [001] A presente invenção se refere a um sistema de controle do desenvolvimento dos fungos durante um ataque fitopatogênico. O sistema de acordo com a presente invenção consiste em fazer com que a planta expresse uma construção que permita inibir a expressão de um gene essencial ao desenvolvimento ou à patogenicidade do fungo. Esse sistema é comumente denominado interferência RNA. As plantas assim transformadas constituem um dos aspectos da presente invenção.
Antecedentes da Invenção [002] As doenças das plantas causam perdas de rendimentos consideráveis, que resultam em perdas econômicas para os agricultores, além de numerosos problemas nutricionais para as populações locais que vivem de sua agricultura. Economicamente e ecologicamente, é muito interessante dispor de plantas resistentes a seus patógenos e mais particularmente a seus fungos na ausência de produtos fitossanitários. Até hoje, foi possível empregar diferentes estratégias:
- Os métodos de seleção tradicionais foram utilizados para desenvolver plantas especificamente resistentes a certos patógenos. Entretanto, esses métodos são limitados às espécies que podem ser cruzadas e a introgressão de caracteres de resistência a patógenos constitui um trabalho longo e laborioso.
- O uso de um RNA anti-sense permite diminuir a expressão de um gene alvo endógeno (EP 240 208)
- O uso de um gene sense permite diminuir a expressão de um gene
Petição 870170004744, de 23/01/2017, pág. 4/49
2/35 alvo endógeno; essa tecnologia é chamada co-supressão (EP 465 572).
[003] A tecnologia utilizada na presente invenção é a interferência RNA ou RNAi. O RNAi provou sua eficácia quando um RNAi de filamento duplo (dsRNA) é injetado no nematódeo Caenorhabditis elegans (Fire et al. 1998, Nature 391: 806-811 e Montgomery et al., 1998, PNAS 95: 1550215507, WO 99/32619).
[004] A expressão em um organismo de uma sequência homóloga ao gene de interesse capaz de induzir a formação de RNA pequeno de filamento duplo permite, de modo muito específico, extinguir esse gene e observar o fenótipo resultante (Xiao et al., 2003, Plant Mol. Biol., 52(5): 95766). O exemplo mais marcante que ilustra essa capacidade é o de insetos alimentados com bactérias que expressam RNA pequenos de filamento duplo que correspondem a um gene expresso nos insetos, que é então inibido (WO 01/37654).
[005] O dsRNA desencadeia a degradação específica de um RNA homólogo apenas na região de identidade com o dsRNA (Zamore et al., 2000, Cell, 101: 25-33, Tang et al., 2003 Gene Dev., 17(1); 49-63). O dsRNA é uma molécula de RNA que contém uma sequência de filamento duplo de pelo menos 25 pares de bases (bp) que incluem um filamento sense e um filamento anti-sense. As moléculas de dsRNA caracterizam-se também pelo grau muito elevado de complementaridade entre os dois filamentos de RNA complementares. O dsRNA é degradado em fragmentos de RNA de 19 a 25 nucleotídeos (siRNA) e os sítios de clivagens no RNA alvo estão regularmente separados por 19 a 25 nucleotídeos. Os siRNA pequenos que resultam desse fato apresentam um grau de identidade muito elevado em relação ao RNA alvo, entretanto a falta de correlação de 3 a 4 nucleotídeos entre o siRNA e a porção correspondente de RNA alvo, permitem mesmo assim que o sistema funcione (Tang et al., 2003, Genes Dev., 17; 49-63). Portanto, sugeriu-se que esses
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3/35 fragmentos de 19 a 25 nucleotídeos constituam guias RNA para o reconhecimento do alvo (Zamore et al., 2000, Cell, 101: 25-33). Esses RNA pequenos foram também detectados em extratos preparados a partir de células Schneider 2 de Drosophila melanogaster que haviam sido transfectadas com dsRNA antes da lise das células (Hammond et al., 2000, Nature 404: 293-296). O papel de guia dos fragmentos de 19 a 25 nucleotídeos na clivagem dos mRNA é reforçado pela observação de que esses fragmentos de 19 a 25 nucleotídeos isolados a partir de dsRNA são capazes de atuar na degradação de mRNA (Zamore et al., 2000, Cell, 101: 25-33). Moléculas de RNA de tamanhos homólogos se acumulam também em tecidos vegetais que sofrem o fenômeno de PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing, Hamilton & Baulcome, 1999, Science: 950-952). Esses RNA pequenos podem regular a expressão dos genes em três níveis diferentes:
- a transcrição (TGS para Transcriptional Gene Silencing)
- a degradação dos RNA mensageiros (PTGG para Post Transcriptional Gene Silencing),
- a tradução.
[006] A regulação que envolve a degradação dos RNA mensageiros parece existir em todos os eucariontes, ao passo que a regulação no nível da transcrição só foi descrita em plantas, drosófila e C. elegans. Quanto à regulação da tradução, ela foi caracterizada em C. elegans e na drosófila e parece também existir nos mamíferos (Hannon, 2002, Nature, 418(6894):244-51). Na literatura, para fazer referência a esse fenômeno, dependendo dos organismos nos quais ele é estudado, fala-se de RNAi, de PTGS, de co-supressão ou de quelling (reservado aos fungos).
[007] A introdução de dsRNA foi realizada em plantas para induzir uma interferência de um gene alvo endógeno (Hamilton et al., 1998, Plant J, 15: 737-746, WO 99/15682), para induzir uma resistência a vírus de
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RNA graças ao uso de um transgene que expressa um RNA com uma identidade substancial em relação aos genes virais (Waterhouse et al., 1998, PNA 95: 13959-13964, Pandolfini et al., 2003, Biotechnol., 25; 3(1): 7, WO 98/36083, WO 99/15682, US 5,175,102), mas também para induzir uma resistência aos nematódeos (Chuang & Meyerowitz, 2000, PNAS,97: 49854990, WO 01/96584) ou ainda à bactéria Agrobacteirum (WO 00/26346, Escobar et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98(23):13437-13442).
[008] No caso do ataque de uma planta por uma bactéria ou por um vírus, os mecanismos de interação entre a planta e o patógeno envolvem claramente transferências de ácidos nucléicos. De fato, no caso de Agrobacterium tumefaciens, os mecanismos de patogenicidade comportam duas etapas: a primeira corresponde a uma transferência de gene horizontal e à integração desse(s) gene(s) na planta (é a transformação), a segunda etapa corresponde a eventos de pós-integração que ocorrem na planta (é a tumorigênese; Escobar et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98(23):1343713442) baseados no uso pela planta do material gênico do patógeno. No caso da infecção do tabaco com Plum Pox Virus (PPV), é a transferência para a planta de RNA de filamento simples do vírus que permite a síntese das proteínas de capsídeo e das polimerases necessárias à propagação da infecção (Pandolfini et al. 2003). Portanto, existe um elo e trocas muito elaboradas no nível genético entre a planta e seu patógeno, e os siRNA são transferidos durante suas trocas. Os mecanismos de infecção de uma planta por um fungo fitopatogênico não envolvem, de sua parte, qualquer transferência de gene.
Breve Descrição da Invenção [009] A presente invenção tem por objeto a criação de uma construção e seu uso em plantas ou células geneticamente modificadas a fim de torná-las resistentes a fungos patogênicos. A tecnologia utilizada se baseia em mecanismos de interferência RNA. Essas plantas apresentam a vantagem
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5/35 de não produzir proteínas, e os riscos de problemas alérgicos ficam consideravelmente reduzidos: os únicos elementos sobrexpressos são RNAs. Além disso, o mecanismo de interferência RNA é um sistema exponencial e autorreplicante, o que significa que basta induzi-lo para que ele se mantenha no organismo.
[010] Um dos objetos da presente invenção diz respeito a um método de produção de uma planta resistente a um fungo que compreende as seguintes etapas:
a) introduzir em uma célula vegetal uma construção que compreende:
- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais,
- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e antisense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido gene essencial,
- uma sequência de regulação terminadora,
b) colocação das células transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da construção,
c) seleção das células transformadas,
d) regeneração de plantas a partir das células transformadas.
[011] Outro objeto da presente invenção diz respeito a um método de produção de uma planta resistente a um fungo fitopatogênico que compreende as seguintes etapas:
a) introduzir em uma planta uma construção que compreende:
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- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais,
- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e antisense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido gene essencial,
- uma sequência de regulação terminadora,
b) colocação das plantas transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da construção,
c) seleção das plantas transformadas.
[012] Outro objeto da presente invenção diz respeito a um método de produção de uma célula vegetal resistente a um fungo fitopatogênico que compreende as seguintes etapas:
a) introdução em uma célula vegetal de uma construção que compreende:
- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais,
- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e antisense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido gene essencial,
- uma sequência de regulação terminadora,
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b) seleção das células transformadas,
c) colocação das células transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da construção.
[013] A presente invenção trata também de uma planta resistente a um fungo fitopatogênico que compreende uma construção caracterizada pelo fato de compreender:
- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais,
- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e antisense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido gene essencial,
- uma sequência de regulação terminadora.
As células vegetais resistentes a um fungo fitopatogênico que compreendem uma construção caracterizada pelo fato de compreender:
- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais,
- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e antisense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido gene essencial,
- uma sequência de regulação terminadora,
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8/35 são outros objetos da presente invenção.
[014] Outro objeto da presente invenção trata do uso de uma construção para criar uma célula vegetal ou uma planta resistente a um fungo, construção essa que compreende uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais, uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e anti-sense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido gene essencial, e uma sequência de regulação terminadora.
[015] A presente invenção tem também por objeto um método para a identificação de um gene essencial ao desenvolvimento ou à fitopatogenicidade de um fungo fitopatogênico que compreende as seguintes etapas:
a) transformação de uma célula vegetal ou de uma planta com uma construção que compreende:
- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais,
- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e antisense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende pelo menos uma sequência essencialmente homóloga a um gene supostamente essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido suposto gene essencial,
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- uma sequência de regulação terminadora,
b) colocação das células ou das plantas assim transformadas em contato com o fungo fitopatogênico,
c) estudo do fenótipo resultante,
d) caracterização do gene que corresponde à sequência de nucleotídeos assim inserida.
[016] Um método para inibir a expressão de um gene de fungo que compreende as seguintes etapas:
a) transformação de uma célula vegetal ou de uma planta com uma construção que compreende:
- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais,
- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e antisense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido gene essencial,
- uma sequência de regulação terminadora,
b) seleção,
c) colocação das células assim transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da referida construção,
d) colocação das células em contato com o fungo, constitui mais um aspecto da presente invenção.
[017] A presente invenção trata ainda de um método para reduzir a expressão de um gene de fungo que compreende as seguintes etapas:
a) transformação de uma célula vegetal ou de uma planta com
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10/35 uma construção que compreende:
- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais,
- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: sense e antisense pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua fitopatogenicidade, e a referida sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do referido gene essencial,
- uma sequência de regulação terminadora,
b) seleção
c) colocação das células assim transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da referida construção,
d) colocação das células em contato com o fungo.
Descrição Detalhada da Invenção [018] De acordo com a presente invenção, o termo “sequência de regulação promotora” designa qualquer sequência de regulação promotora de um gene que se expressa naturalmente nas plantas, em particular um promotor que se expressa em particular nas folhas das plantas, como por exemplo promotores chamados constitutivos de origem bacteriana, viral ou vegetal, ou ainda promotores chamados de fotodependentes, como o de um gene da pequena subunidade de ribulose-biscarboxilase/oxigenase (RuBisCO) de planta ou qualquer promotor apropriado conhecido que possa ser utilizado. Entre os promotores de origem vegetal, podem-se citar os promotores de histona tais como descritos no pedido EP 0 507 698, ou o promotor de actina de arroz (US 5.641.876). Entre os promotores de um gene de vírus de planta, podem-se citar o do mosaico da couve-flor (CAMV 19S ou 35S), o mosaico da
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11/35 mandioca (CsVMV: WO 97/48819) ou o promotor do circovírus (AU 689 311). Pode-se ainda utilizar uma sequência de regulação promotora específica de regiões ou de tecidos particulares das plantas, e mais particularmente promotores específicos das sementes (Datla, R et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev., 3, 269-296), em particular os promotores da napina (EP 255 378), da faseolina, da glutenina, da heliantina (WO 92/17580), da albumina (WO 98/45460), da oelosina (WO 98/45461). Um promotor indutível pode também ser empregado. Ele pode ser vantajosamente escolhido entre os promotores de fenilalanina amônia liase (PAL), de HMG-CoA redutase (HMG), de quitinases, de glucanaes, de inibidores de proteinase (PI), de genes da família PR1, da família nopalina sintase (nos) ou do gene vspB (US 5 670 349), o promotor MHG2 (US 5 670 349), o promotor de beta-galactosidase (ABG1) de maçã ou o promotor da amino ciclopropano carboxilato sintase (ACC sintase) de maçã (WO 98/45445).
[019] O termo “sequência de regulação terminadora” designa qualquer sequência que é funcional nas células vegetais ou plantas que compreende também as sequências de poliadenilação, sejam elas de origem bacteriana, como por exemplo, o terminador nos ou ocs de Agrobacterium tumefaciens, de origem viral, como por exemplo, o terminador do CAMV 35S, ou ainda de origem vegetal, como por exemplo, um terminador de histona tal como descrito no pedido EP 0 633 317.
[020] A etapa de seleção permite identificar as células e/ou as plantas transformadas que integraram a construção de acordo com a presente invenção pode ser realizada graças à presença de um gene de seleção presente na construção de acordo com a presente invenção ou no plasmídeo utilizado para a transformação das células ou das plantas e que compreende a referida construção. O gene de seleção pode estar na forma de um gene quimérico que compreende os seguintes elementos ligados de modo
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12/35 operacional no sentido da transcrição: uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais, uma sequência que codifica um marcador de seleção, uma sequência de regulação terminadora que é funcional nas células vegetais.
[021] Entre os marcadores de seleção que podem ser utilizados, podem-se citar marcadores que contêm genes de resistência aos antibióticos tais como, por exemplo, o do gene da higromicina fosfotransferase (Gritz et al., 1983, Gene 25:179-188), da neomicina fosfotransferase II que reduz a resistência à canamicina (Wirtz et al., 1987, DNA, 6(3): 245-253), ou da aminoglicosido 3”-adeniltransferase, mas também marcadores que contêm genes de tolerância aos herbicidas tais como gene bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) para a tolerância ao bialaphos, o gene EPSPS (US 5,188,642) para a tolerância ao glifosato ou ainda o gene HPPD (WO 96/38567) para a tolerância aos isoxazóis. Podem-se também citar genes que codificam enzimas facilmente identificáveis como a enzima GUS, genes que codificam pigmentos ou enzimas que regulam a produção de pigmentos nas células transformadas. Esses genes marcadores de seleção estão descritos em particular nos pedidos de patente WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, e WO 97/04103.
[022] De preferência, a sequência nucleotídica do gene essencial ao fungo ou à sua patogenicidade (gene alvo) corresponde a uma região que está transcrita e mais particularmente que está transcrita e traduzida.
[023] O comprimento da sequência nucleotídica sense tem um tamanho mínimo de 19 nucleotídeos.
[024] A sequência sense compreende uma sequência essencialmente homóloga a um gene essencial ao fungo ou à sua patogenicidade. De fato, de modo preferencial, a sequência de nucleotídeo sense e a sequência nucleotídica do gene alvo de fungo apresentam um grau de identidade de pelo menos 50 %, de preferência de pelo menos 70 %. De
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13/35 modo absolutamente preferencial, o grau de identidade é de 100 %.
[025] Entretanto, é preciso que a sequência nucleotídica sense compreenda sempre uma sequência de aproximadamente 19 nucleotídeos, particularmente de 20 nucleotídeos e mais particularmente de 25 nucleotídeos que apresentem pelo menos 80 % de identidade com a porção correspondente do gene alvo e de modo inteiramente preferencial 100 % de identidade.
[026] Em um dos aspectos da presente invenção, as sequências sense e anti-sense possuem tamanhos idênticos. De acordo com outro aspecto da presente invenção, a sequência sense tem um tamanho superior ao da sequência anti-sense. A título de exemplo, o tamanho da sequência sense pode ser aproximadamente 200 nucleotídeos maior que o tamanho da sequência anti-sense. Em outro aspecto da presente invenção, o tamanho da sequência anti-sense é maior que o da sequência sense.
[027] A sequência anti-sense compreende uma sequência essencialmente homóloga à sequência complementar do gene essencial ao fungo ou à sua patogenicidade. De fato, e de modo preferencial, a sequência de nucleotídeos anti-sense e a sequência complementar do gene alvo do fungo apresentam um grau de identidade de pelo menos 50 %, de preferência de pelo menos 70 %. De modo absolutamente preferencial, o grau de identidade é de pelo menos 85 %, e mais preferencialmente ainda, o grau de identidade é de 100 %.
[028] Entretanto, é preciso que a sequência nucleotídica antisense compreenda sempre uma sequência de aproximadamente 19 nucleotídeos, particularmente de 20 nucleotídeos e mais particularmente de 25 nucleotídeos que apresentam pelo menos 80 % de identidade com a porção correspondente do gene alvo e de modo inteiramente preferencial 100 % de identidade.
[029] A hibridação molecular é uma reação de emparelhamento
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14/35 que é efetuada entre filamentos complementares de polinucleotídeos que apresentam um certo grau de identidade entre as sequências nucleotídicas. Quanto maior for a identidade de sequência entre polinucleotídeos, mais a hibridação entre os referidos polinucleotídeos será possível e fácil, e maior será a probabilidade desses polinucleotídeos codificarem proteínas com propriedades equivalentes.
[030] O grau de identidade entre dois polinucleotídeos homólogos é obtido por comparação de suas sequências e é geralmente expresso por uma porcentagem de nucleotídeos idênticos entre sequências. Esse grau de identidade é medido sobre um comprimento de sequência dado, e a mais curta das sequências comparadas determina o tamanho da sequência na qual o grau de identidade das sequências é medido. Portanto, a presente invenção cobre polinucleotídeos que apresentam uma ou mais modificações de sequência em relação à outra e são homólogos do gene essencial ao fungo ou à sua patogenicidade.
[031] A sequência de DNA de acordo com a presente invenção pode ter dois aspectos, no primeiro, ela compreende duas sequências de nucleotídeos sense e anti-sense separadas por um íntron que não apresenta homologia com o gene do fungo. A figura 1 descreve uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais que está na frente da sequência de nucleotídeos na orientação sense do gene, seguida de um íntron e pela sequência de nucleotídeos em orientação anti-sense desse mesmo gene. Uma sequência de regulação terminadora se encontra no fim da construção sense/íntron/anti-sense. A sequência clonada em orientação sense e anti-sense é aquela cuja expressão se deseja inibir no patógeno. A transcrição dessa sequência de DNA (“DNA” na figura) rende assim um RNA grande de filamento simples (“mRNA” na figura) que corresponde à construção sense/íntron/anti-sense. Esse transcrito de RNA longo pode ser detectado em
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RT-PCR. Como as sequências sense e anti-sense são homólogas, elas vão se aparelhar, o íntron que as separa desempenha o papel de alça que permite o enovelamento. Um dsRNA é então obtido (“dsRNA” na figura) em todas as regiões homólogas. O dsRNA é degradado a seguir especificamente por um complexo enzimático denominado “DICER”. A degradação dos dsRNA forma então siRNA (“sirNA” na figura), RNA pequenos de filamentos duplos com um tamanho compreendido entre 19 e 25 bases. Esses são então os siRNA que, ao se emparelhar com os RNA transcritos provenientes do gene alvo provocarão sua degradação por meio da maquinaria enzimática da planta.
[032] No segundo aspecto, a sequência de DNA compreende duas sequências de nucleotídeos sense e anti-sense de tamanhos diferentes, e a estrutura em alça corresponde à parte da sequência nucleotídica que não apresenta homologia com a outra sequência nucleotídica. A figura 2 representa uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais que fica na frente da sequência sense do gene, seguida pela sequência antisense parcial desse mesmo gene. Uma sequência de regulação terminadora se encontra no fim da construção sense/anti-sense. A sequência de nucleotídeos clonada em orientação sense é essencialmente homóloga à sequência do gene alvo cuja expressão se deseja inibir. A sequência nucleotídica anti-sense é essencialmente homóloga ao filamento complementar da sequência do referido gene alvo. A transcrição dessa sequência de DNA (“DNA” na figura) rende assim um RNA grande de filamento simples (“mRNA” na figura) que corresponde à construção sense/anti-sense (esse transcrito longo de RNA pode ser detectado em RT-PCR). As sequências anti-sense homólogas se emparelham. Um dos dsRNA é então obtido (“dsRNA” na figura) em todas as regiões homólogas. O dsRNA é então degradado especificamente por um complexo enzimático denominado “DICER”. A degradação dos dsRNA forma então siRNA (“siRNA” na figura), RNA pequenos de filamentos duplos que
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16/35 possuem um tamanho compreendido entre 19 e 25 bases. Esses são então os siRNA que, ao se emparelhar com os RNA alvos, provocarão sua degradação por meio da maquinaria enzimática da planta.
[033] As sequências nucleotídicas de acordo com a presente invenção podem ser complementares de um gene essencial ao fungo ou à sua patogenicidade.
[034] De acordo com a presente invenção, a expressão “gene essencial ao fungo” significa um gene cuja inibição por uma molécula fungicida ou sua mutação provoca a morte do fungo ou a uma interrupção de seu desenvolvimento. Podem-se citar a título de exemplo os seguintes genes:
- gene que codifica a beta-tubulina (Katyar et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother., 38(9): 2086-90)
- da aceto-hidroxiácido isomerase (ilv5) que atua na via de biossíntese dos aminoácidos de cadeia ramificada (WO 03/022056),
- da C14-demetilase (erg11) ou da C24-metiltransferase (erg6) que atua na via de síntese do ergosterol (Barret & Dixon, 1995, Acta Biochem. Pol., 42(4): 465-479),
- inositol fosfoceramida sintase (aurl) que atua na transferência da inositil fosfoceramida para a ceramida na via de biossíntese dos esfingolipídios (Naglec et al., 1997, J. Biol. Chem., 272(15): 9809-9817) e da inositol fosforil transferase (iptl),
- glucano sintase e quitina sintase (Kang et al., 2001, Pest. Mana. Sci., 57(6): 491-500, Binks et al., 1993, J. Gen. Microbiol., 139(6) : 1371-1377),
- dos fatores ribossômicos (ef2 e ef3, Belfiel & Tuite, 1993, Mol. Microbiol., 9(3): 411-418),
- met4 e met30 (Aoki et al., 1996, Antimicrob. Agents Chemother, 40(1) : 127-132.
[035] Em um modo de realização da presente invenção, as
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17/35 plantas ou células vegetais compreendem uma sequência de DNA complementar de um gene essencial ao fungo, e o referido gene essencial é representado pela SEQ ID No 4.
[036] A presente invenção trata também de um método de produção de uma célula de tabaco resistente ao fungo Cercospora nicotianae por introdução de uma construção que compreende uma sequência DNA representada pela SEQ ID No 4.
[037] De acordo com a presente invenção, a expressão “gene essencial à patogenicidade do fungo” designa um gene cuja inibição não é letal para o fungo mas inibe seu poder patogênico. A título de exemplo, podem-se citar os seguintes fungos:
- 763 de Magnaporthe grisea (WO 01/75115),
- gene que codifica a poligalacturonase (Bonnin et al., 2001, Biochem. Biophys Acta, 1526(3) : 301-309),
- tri5 de Fusarium graminearum, que atua na via de biossíntese dos tricotecenos (Kimura et al., 2003, FEBS, 539(1-3) : 195-110,
- fum5 de Fusarium monoliforme, que atua na via de biossíntese das toxinas desse fungo (Proctor et al., 1999, Fungal Genet. Biol., 27(1): 100112, Proctor et al., 2003, Fungal Genet. Biol., 38(2) : 237-249),
- buf de Magnoporthe grisea que atua na via de biossíntese da melanina (Kawamura et al., 1997, Mol. Plant Microbe Interact, 10(4): 446-453).
[038] Em outro modo de realização da presente invenção, as plantas ou células vegetais compreendem uma sequência de DNA complementar de um gene essencial à patogenicidade do fungo, e o referido gene é representado pela sequência identificadora ID No 13.
[039] A presente invenção trata ainda de um método de produção de uma célula de arroz resistente ao fungo Magnoporthe grisea por introdução de uma construção que compreende uma sequência DNA
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18/35 representada pela SEQ ID No 13.
[040] As plantas e as células transformadas de acordo com a presente invenção podem ser monocotiledôneas ou dicotiledôneas. De preferência, essas plantas são plantas de interesse econômico.
[041] As células vegetais e as plantas da presente invenção podem ser monocotiledôneas como o trigo, o milho ou o arroz.
[042] Um modo de realização particular da presente invenção corresponde a uma planta de arroz resistente a Magnaporthe grisea que compreende uma sequência DNA representada pela SEQ ID No 13.
[043] As células vegetais e as plantas da presente invenção podem ser dicotiledôneas como a canola, a soja, o algodão ou o tabaco.
[044] Um modo de realização particular da presente invenção corresponde a uma planta de tabaco resistente a Cercospora nicotianae que compreende uma sequência DNA representada pela SEQ ID No 4.
[045] A referida planta pode ser obtida por regeneração das células transformadas de acordo com a presente invenção.
[046] Para obter as células ou plantas de acordo com a presente invenção, o técnico no assunto pode utilizar um dos diversos métodos de transformação conhecidos.
[047] Um desses métodos consiste em colocar as células ou tecidos dos organismos hospedeiros a ser transformados em presença de polietileno glicol (PEG) e dos vetores da presente invenção (Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115; Mercenier e Chassy, 1988, Biochimie, 70(4), 503-517). A eletroporação é outro método que consiste em submeter as células ou os tecidos a serem transformados e os vetores da presente invenção a um campo elétrico (Andreason e Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa e Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Outro método consiste em injetar diretamente os vetores nas células ou nos tecidos por
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19/35 micro-injeção (Gordon e Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). De modo vantajoso, o método “biobalístico” poderá ser utilizado. Ele consiste em bombardear células ou tecidos com partículas nas quais são absorvidos os vetores da presente invenção (Bruce et al., 1989, Proc. Natl Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 296-291; Patente US N° 4.495.050). De preferência, a transformação de células ou tecidos vegetais pode ser feita por meio de bactérias do gênero Agrobacterium, de preferência por infecção das células ou tecidos das referidas plantas por A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23(3) : 315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16:357384; Tepfer e Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). De preferência, a transformação de células ou tecidos vegetais por Agrobacterium tumefaciens é realizada de acordo com o protocolo descrito por Hiei et al., (1994, Plant J. 6(2): 271-282). O técnico no assunto escolherá o método apropriado em função da natureza dos organismos hospedeiros a serem transformados.
[048] As plantas de acordo com a presente invenção contêm células vegetais transformadas tais como definidas acima. Em particular, as plantas transformadas podem ser obtidas por regeneração das células transformadas descritas acima. A regeneração é obtida por qualquer método apropriado que dependa da natureza da espécie.
[049] A presente invenção compreende também partes dessas plantas, e a descendência dessas plantas. Por “parte dessas plantas”, entendese qualquer órgão dessas plantas, seja ele aéreo ou subterrâneo. Os órgãos aéreos são as hastes, as folhas e as flores que compreendem os órgãos reprodutores masculinos e femininos. Os órgãos subterrâneos são principalmente as raízes, mas podem também ser tubérculos. Por “descendência”, entende-se principalmente as sementes que contêm os embriões provenientes da reprodução dessas plantas entre si. Por extensão, o
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20/35 termo “descendência” se aplica a todas as sementes formadas a cada nova geração derivada de cruzamentos entre as plantas transformadas de acordo com a presente invenção. Uma descendência e sementes podem também ser obtidas por multiplicação vegetativa das referidas plantas transformadas. As sementes de acordo com a presente invenção podem ser revestidas com uma composição agroquímica que compreende pelo menos um produto ativo que possui uma atividade selecionada entre as atividades fungicida, herbicida, inseticida, nematicida, bactericida ou virucida.
[050] Os diferentes aspectos da presente invenção serão mais bem compreendidos através dos exemplos experimentais apresentados a seguir.
Exemplos [051] Todos os métodos ou operações descritos a seguir são dados a título de exemplo e correspondem a uma escolha, efetuada entre os diversos métodos disponíveis para chegar ao mesmo resultado. Essa escolha não afeta a qualidade do resultado e, conseqüentemente, qualquer método apropriado pode ser utilizado pelo técnico no assunto para atingir o mesmo resultado. Em particular, e salvo especificação diferente nos exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante empregadas são realizadas de acordo com os protocolos padrões descritos em Sambrook e Russel (2001, Molecular cloning: A laboratory manual, Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), in Ausubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA, Volumes 1 e 2), e in Brown (1998, Molecular Biology LabFax, Second edition, Academic Press, UK). Materiais e métodos padrões para a biologia molecular das plantas estão descritos em Croy R.D.D. (1993, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK). Materiais e métodos padrões para o PCR (Polymerase Chain Reaction) estão também descritos em Dieffenbach e
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Dveksler (1995, PCR Primer: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) e em McPherson et al. (2000, PCR - Basics: From background to bench, First edition, Springer Verlag, Germany).
Exemplo 1
Criação de um Tabaco Resistente a Cercospora nicotianae [052] Cercospora nicotianae é um patógeno do tabaco (Nicotiana tabacum). O gene alvo escolhido em Cercospora nicotianae é o gene que codifica a beta-tubulina. Os túbulos são estruturas dinâmicas presentes em todos os tipos celulares. Nas células que possuem a capacidade de se dividir, os microtúbulos constituem a base da formação do fuso mitótico para os outros tipos celulares. Eles constituem uma rede citoplásmica essencial para a organização do núcleo e das organelas no espaço citoplásmico. Os microtúbulos são heterodímeros de alfa e de beta-tubulina. A beta-tubulina é uma proteína vital para o patógeno e em particular o alvo dos benzimidazóis (Katyar et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother, 38(9): 2086-2090).
1. Construto Utilizado para Transformar Células de Tabaco [053] A construção utilizada para transformar o tabaco é o plasmídeo denominado PFA 115; ele compreende os seguintes marcadores de seleção: um gene de resistência à canamicina sob o controle do promotor nos, um gene de resistência à espectinomicina (aadA) sob o controle de um promotor bacteriano. O promotor CaMV 35S permite a transcrição da sequência ADN que compreende uma parte da sequência sense da betatubulina de Cercospora Nicotianae representada pela SEQ ID No 1, que é por sua vez seguida por um íntron representado pela SEQ ID No 2 e pela sequência anti-sense dessa mesma beta-tubulina representada pela SEQ ID No 3. Um terminador ocs está a jusante do conjunto sense-íntron-anti-sense. Esse conjunto é representado pela SEQ ID No 4.
[054] A variedade de Nicotiana tabacum Petit Havana é
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22/35 transformada com esse vetor pPAF 115.
2. Transformação de Tecidos Foliares de Tabaco pela solução de
Agrobacterium Transformado com o plasmídeo PPAF115 [055] A solução de Agrobacterium (DO = 1) é lavada em MGSO4. Discos são recortados em folhas de tabaco selvagem e são desinfetados durante 10 minutos em etanol a 75 %, e são incubados por 5 minutos na solução de Agrobacterium. Eles são esponjados a seguir, e depositados com a face inferior contra uma cápsula de Petri que contém Agar MS 0.05-2 (Murashige & Skoog M5519, 30 g/L sacarose, 0.05 ppm ANA, 2 ppm BAP, 7 g/L fitagar, pH = 5.7) para uma cultura de três dias. Os discos foliares são transferidos para cápsula MS 0,05-2 em presença de espectinomicina e canamicina durante duas a quatro semanas. Os discos foliares são colocados a seguir em meio MS 0-0 (Murashige & Skoog M5519, 30 g/L sacarose, 7 g/L fitagar, pH = 5.7) que contém também os antibióticos durante sete a dez dias. Os brotos de tabaco provenientes dos discos são isolados e enraizados em cápsula de Agar MC %-1/2 (1/2 Murashige & Skoog M5519, 15 g/L sacarose, , 7 g/L fitagar, pH = 5.7) que contêm antibióticos. Depois do aparecimento das primeiras folhas, os brotos são colocados na terra para que as plantas se desenvolvam.
3. Análises Moleculares Efetuadas com o Tabaco Transgênico [056] Foram obtidos três eventos diferentes.
3.1. - PCR [057] Primeiras experiências de PCR foram efetuadas com o DNA genômico dos diferentes eventos a fim de saber se eles contêm a construção de acordo com a presente invenção. Foram utilizados iniciadores que permitem detectar o gene da canamicina bem como da tubulina específica de Cercospora.
| Evento | 14 | 15 | 19 | wt |
| Canamicina | + | + | + | - |
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| Evento | 14 | 15 | 19 | WT |
| Tubulina | + | + | + | - |
WT: tipo selvagem, planta não transformada.
As sequências dos iniciadores utilizados são as seguintes: Canamicina:
- direto: 5'- CAA GAC CGA CCT GTC C-3' (SEQ ID No 5)
- inverso: 5' - CCA TCC GAG TAC GTC C - 3' (SEQ ID No 6) Tubulina de Cercospora nicotianae:
- direto: 5' - ATC GAT AAC GAG GCC C - 3' (SEQ ID No 7)
- inverso: 5'- ACA TCG TAA GCT GG - 3' (SEQ ID No 8)
Todas as plantas contêm o plasmídeo pPAF-115 de acordo com a presente invenção.
3.2. - RT-PCR quantitativa [058] O RNA dos eventos obtidos é extraído e uma transcrição reversa é realizada antes de efetuar uma PCR quantitativa. A transcrição reversa é feita a partir de 4 mg de RNA a partir de iniciadores aleatórios. A PCR quantitativa é feita de acordo com o seguinte esquema:
| cDNA 100 ng de tubulina de tabaco | cDNA 100 ng de tubulina de Cercospora |
| cDNA 10 ng de tubulina de tabaco | cDNA 10 ng de tubulina de Cercospora |
| cDNA 100 ng de tubulina de tabaco | cDNA 100 ng de tubulina de Cercospora |
| cDNA 10 ng de tubulina de tabaco | cDNA 10 ng de tubulina de Cercospora |
[059] O RNA é utilizado para fazer a reação de PCR a fim se obter a certeza de que a detecção de DNA obtida com o cDNA complementar é realmente devida a uma amplificação de DNA complementar e não de DNA genômico contaminante (a amplificação a partir do RNA deve ser nula).
[060] A detecção do DNA complementar da tubulina de tabaco graça ao uso dos iniciadores citados a seguir (SEQ ID No 9 e SEQ ID No 10)
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24/35 serve de nível de expressão de referência. O nível de expressão do transgene foi calculado em relação a essa expressão da tubulina do tabaco.
[061] T ubulina do tabaco
- direto 5' - GAA AAC ACG TCC CTC G - 3' (SEQ ID No 9)
- inverso 5' - TCT TGC CGT AGT CCA C - 3' (SEQ ID No 10) [062] Para todas as experiências:
- Os controles RNA são negativos. Não há portanto contaminação de DNA genômico.
- A diferença de expressão entre as concentrações de 100 e 10 ng é constante e de acordo com as expectativas para diluições de 10 vezes.
[063] A figura 3 mostra a posição dos iniciadores de tubulina de Cercospora nicotianae nas sequências de DNA e de RNA que compreendem o conjunto sense-íntron-anti-sense tal como definido pela SEQ ID No 4. Os pontilhados representam esquematicamente os iniciadores com os quais a PCR quantitativa (qPCR) é realizada após a transcrição reversa (RT).
[064] A qPCR só pode detectar os transcritos provenientes da construção de acordo com a presente invenção se eles não estiverem degradados. A RT-qPCR só detecta os transcritos longos, mRNA ou dsRNA.
| Evento | Nível de detecção (RT-PCR quantitativa) | Resultados |
| WT | — | • Não há detecção por PCR da construção • Não há detecção de RNA da construção |
| 14, 15 | +/- | • Positiva, mas fraca Detecção por PCR da construção • Detecção fraca de RNA da construção |
| 19 | + | • Detecção positiva por PCR da construção • Detecção nítida de RNA da construção |
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25/35 “+“ significa que o sinal é nitidamente detectado por RT-qPCR “+/-“ significa que o sinal é fracamente detectado “- - -“ corresponde à ausência de transgene.
3.3. - RT-PCR quantitativa em vista dos testes in vivo [065] Os testes in vivo são realizados em plantas T0 descritas acima. Trata-se dos eventos: 14, 14, 19 e WT. Para esses 4 eventos, os clones provenientes da planta T0 inicial vão portanto ser utilizados para efetuar os testes. Esses clones são realizados por recorte das folhas de cada evento cultivado novamente in vitro e regenerado (ver acima). A fim de efetuar um controle rápido, uma análise em RT-PCR quantitativa é efetuada em um clone dos eventos 14, 19 e WT (14A, 19A e WT respectivamente).
[066] Todos os controles (RNA, WT, e referência interna (tubulina do tabaco)) estão corretos. Após a validação desses controles, pode-se car um nível de expressão para cada clone: os resultados estão expressos qualitativamente em função dos valores obtidos graças à PCR quantitativa:
| Evento | Nível de expressão (RT-PCR quantitativa) | Resultados |
| WT | — | • Não há detecção por PCR da construção • Não há detecção de RNA da construção |
| 14A | +/- | • Positiva, mas detecção fraca por PCR da construção • Detecção fraca de RNA da construção |
| 19A | + | • Detecção positiva por PCR da construção • Detecção nítida de RNA da construção |
“+“ significa que o sinal é nitidamente detectado por RT-qPCR “+/-“ significa que o sinal é fracamente detectado “ — “ corresponde à ausência de transgene.
4. Testes Patológicos in vivo para Avaliação da Resistência dos Tabacos
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Transgênicos à Infecção por Cercospora nicotianae
Material vegetal:
[067] Clones (pelo menos nove) provenientes dos eventos T0 em um estágio de desenvolvimento das plantas que compreende pelo menos 5 folhas desenvolvidas.
[068] Produção: Estufa S2 (25°C de dia / 20°C de noite; 60 % de UR; Fotoperíodo de 15 horas de luz).
Inóculo:
[069] Suspensão de Cercospora nicotinanae (aproximadamente 104 esporos/ml).
Avaliação dos sintomas:
[070] A determinação da intensidade dos sintomas é determinada por critérios biológicos em função do tamanho e do aspecto das lesões constatadas nas folhas. Assim, como se pode ver na figura 4, a nota 1 corresponde à visualização de manchas muito leves na folha, apenas perceptíveis. A nota 2 corresponde a manchas nítidas na folha, mas muito pouco numerosas. A nota 3 corresponde a manchas nítidas e numerosas na folha. A nota 4 corresponde a manchas muito nítidas e muito numerosas com presença de manchas de grande tamanho. A nota 5 corresponde a um apodrecimento total da folha, ou seja a manchas numerosas de tamanho muito grande.
[071] As diferenças entre 1, 2, 3, 4 e 5 correspondem portanto a diferenças nítidas de sintomas. Assim, plantas que possuem notas de sintomas de 4 ou 5 são consideradas como afetadas de modo muito severo. Plantas de nota 3 são afetadas mas permanecem aceitáveis. Plantas de nota 2 são fracamente afetadas e as de nota 1 foram afetadas de modo muito ligeiro.
[072] Há, por outro lado, três leituras diferentes:
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1a leitura: 10 dias após a inoculação 2a leitura: 21 dias após a inoculação 3a leitura: 1 mês após a inoculação [073] Além disso, a determinação da porcentagem de contaminação da superfície foliar varia de 0 % a 100 %. 0 % corresponde a uma observação em que nenhum sintoma é visível na folha, parece haver uma ausência total do patógeno. 100 % corresponde a uma folha completamente recoberta pelo patógeno, isto é, uma folha marrom e podre. Como o resultado da leitura foi obtido com a média das folhas de uma mesma planta, não se pode obter valores tão extremos. Pode-se também considerar que acima de 30 % de superfície foliar contaminada, a planta está muito severamente afetada pela doença. Abaixo de 20 %, a contaminação pode ser considerada fraca e abaixo de 10-15 % como muito fraca.
[074] Os resultados são apresentados na forma de histogramas que correspondem às médias das plantas por evento (Resultados 28 dias após a infecção). O intervalo de confiança está representado para cada histograma.
[075] Para cada evento, o número de plantas analisadas está indicado bem como o número de folhas correspondente
- WT: 19 plantas (87 folhas)
- Evento 14: 14 plantas (67 folhas)
- Evento 15: 21 plantas (102 folhas)
- Evento 19: 12 plantas (60 folhas) [076] A figura 5 representa a intensidade dos sintomas anotada para cada evento.
[077] A figura 6 representa a porcentagem da superfície foliar contaminada para cada evento.
[078] Os resultados do teste in vivo estão claramente
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28/35 correlacionados com as análises moleculares: a detecção dos transcritos longos provenientes da construção de acordo com a presente invenção está nitidamente correlacionada com uma menor intensidade dos sintomas e portanto uma resistência da planta transgênica.
| Evento | Presença do transgene | RT-qPCR | Testes patológicos em plantas de tabacos T0 | |
| Resultados após 28 c | ias da infecção | |||
| Detecção | % de superfície | intensidade | ||
| dos RNA longos | foliar contaminada | dos sintomas | ||
| (intervalo de | (intervalo de | |||
| confiança) | confiança) | |||
| WT | Não | — | 37 % (6,6) | 4 (0,26) |
| 14 | Sim | -/+ | 11 % (3,8) | 2 (0,37) |
| 15 | Sim | -/+ | 17 % (3,85) | 3 (0,22) |
| 19 | Sim | + | 19 % (4,8) | 3,2 (0,34) |
“-/+”: detecção fraca detecção nítida “—“: nenhuma detecção [079] Os resultados apresentados abaixo são estabelecidos a partir de testes validados estatisticamente para ensaios biológicos. A população de cada evento permite estabelecer intervalos de confiança estatisticamente robustos.
Exemplo 2: Criação de um Arroz Resistente a Magnaporthe grisea [080] Magnaporthe grisea é um patógeno do arroz (Oryza sativa). O alvo escolhido em Magnaporthe grisea é o gene buf. O gene buf é um gene essencial à patogenicidade de Magnaporthe grisea. Em caso de deleção, Magnaporthe grisea é não-virulento e não pode contaminar o arroz. (Kawamura
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29/35 et al., 1997, Mol. Plant Microbe Interact, 10(4): 446-53).
1. Construção utilizada para Transformar Células de Arroz [081] A construção utilizada para transformar o arroz é o plasmídeo denominado pPAF 74; ele compreende o seguinte marcador de seleção: um gene de resistência à gentamicina sob o controle de um promotor bacteriano. O promotor CaMV 35S permite a transcrição da sequência DNA que compreende uma parte da sequência sense do gene buf representada pela SEQ ID N° 11, que é por sua vez seguida pela sequência anti-sense desse mesmo gene buf parcialmente deletado em relação à sequência sense representada pela SEQ ID N° 12. Um terminador nos está a jusante do conjunto sense-anti-sense que é representado pela SEQ ID N° 13. A variedade de Oryza sativa Nippon Bare é transformada com esse vetor pPAF 74.
2. Transformação de Tecidos de Arroz pela Solução de Agrobacterium transformado com o plasmídeo pPAF 74 [082] Os embriões são tirados do pericarpo e imersos em uma solução de etanol a 70 % durante 1 minuto. A seguir, eles são colocados em uma solução de água sanitária comercial diluída ao terço durante 30 minutos e agitados de vez em quanto. Eles são finalmente enxaguados 3 vezes com água estéril.
[083] Os embriões assim descontaminados são colocados sobre o flanco (12 por cápsula), em meio NB (Macroelementos N6, FeEDTA, Microelementos B5, Vitaminas B5, Mio-inositol, Prolina, Glutamina, Hidrolisado de caseína, Sacarose, 2,4-Fitagel). A cápsula é deixa entreaberta sob a coifa para secar bem o grão (estufa a 28°C - no escuro - 17 a 20 dias). Após um período de 17 a 20 dias (28°C - no escuro), as pequenas unidades embriogênicas (nódulos de diâmetro de 0,5 a 1 mm) que se formam a partir do calo primário, em contato com o meio, são cortadas e transplantadas no meio NB em cápsula 100 x 15 (estufa a 28°C - no escuro - 10 dias).
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30/35 [084] Uma cultura de Agrobactérias (3-5.109 bactérias/ml (DOeoo = 1) é utilizada para a transformação.
[085] A seguir, é preciso realizar uma inoculação e uma cocultura.
[086] Calos de 3 a 5 mm, bem redondos, rugosos, esbranquiçados e opacos são imersos na solução de agrobactérias que contêm o plasmídeo pPAF 74 (3-5.109 bactérias/ml) (20 ml por cápsula) durante 15 minutos sob ligeira agitação.
[087] Os calos são transferidos sobre papel Whatman estéril e secados. Os calos são colocados e seguir em cultura no meio R2-CS (macroelementos R2-I, macroelementos R2-II, FeEDTA, microelementos R2, Vitaminas R2, Glicose, 2,4-D, Agarose de tipo I), a uma temperatura de 25°C durante 3 dias (10 calos por cápsula).
[088] Os calos são transferidos para o meio de seleção R2S (macroelementos R2-I, macroelementos R2-II, FeEDTA, microelementos R2, vitaminas R2, sacarose, 2,4-D, agarose de tipo I, vancomicina, cefotaxima, higromicina) (28°C - no escuro - 2 semanas). Os calos são transplantados no meio NBS (macroelementos N6, FeEDTA, microelementos B5, vitaminas B5, mio-inositol, prolina, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, 2,4-D, agarose de tipo I, cefotaxima, vancomicina, higromicina) (28°C - no escuro - 1 semana). As proliferações (glóbulos) são espalhadas em torno de seu calo de origem, para colocá-las em contato com o meio de seleção (28°C - no escuro 1 a 2 semanas).
[089] A seguir, é preciso que os transformantes entrem em maturação:
[090] As proliferações resistentes são transplantadas (glóbulos bem desenvolvidos, de cor amarelo-branco) na meio PR-AG (macroelementos N6, FeEDTA, microlementos B5, vitaminas B5, mio-inositol, prolina, glutamina,
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31/35 hidrolisado de caseína, sacarose, ABA, BAP, ANA, agarose de tipo I, cefotaxima, higromicina, vancomicina, identificando o calo de origem (10 calos por cápsula) (28°C - no escuro - 8 dias).
[091] Regeneração dos transformantes:
[092] Os calos são transplantados no meio de regeneração RN (macroelementos N6, FeEDTA, microlementos B5, vitaminas B5, mio-inositol, prolina, glutamina, hidrolisado de caseína, sacarose, BAP, ANA, Fitagel) (28°C - luz contínua - 3 semanas).
[093] As plantas regeneradas são transplantadas em tubo (meio MS, sacarose, fitagel).
[094] Elas são transplantadas a seguir em compost, aclimatadas e cultivadas em estufa.
Aclimatação das plantas transformadas:
[095] Depois de bem desenvolvidas, as plântulas são aclimatadas em tubo (após aproximadamente 3-4 semanas). A plântula é retirada do tubo. As raízes são passadas sob um fio de água para eliminar o Agar. A extremidade das folhas e das raízes é cortada. As folhas mortas são eliminadas. A plântula é colocada em um vaso, em uma estufa pequena que contém 1-2 cm de água ou nenhuma água para evitar o apodrecimento, com a porta fechada. A parte superior da pequena estufa é protegida com papel absorvente. O conjunto é colocado na câmara de cultura in vitro. A porta é entreaberta gradualmente, e o papel é eliminado. Quando as raízes saírem do pote (depois de aproximadamente 15 dias), as plântulas são replantadas em compost, em um vaso.
Foram obtidos oito eventos diferentes.
3. Análises Moleculares Efetuadas no Arroz Transgênico
3.1. - PCR [096] Primeiras experiências de PCR são efetuadas no DNA
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32/35 genômico dos diferentes eventos a fim de saber se eles contêm a construção de acordo com a presente invenção. Foram usados iniciadores que permitem detectar o gene buf de Magnaporthe.
| Evento | M | L | F | WT |
| buf | + | + | + | - |
WT: tipo selvagem, planta não transformada.
As sequências dos iniciadores utilizados são os seguintes: buf de Magnaporthe:
Direto: 5' - TGA CCG TGT CTT TAC CA - 3' (SEQ ID No 16)
Indireto: 5' - AGC AAC CAC ATT AAC AGT - 3 (SEQ ID No 17)
Todas as plantas contêm o plasmídeo de acordo com a presente invenção.
3.2. RT-PCR quantitativa [097] O RNA desses eventos é extraído e uma transcrição reversa é realizada antes de efetuar uma PCR quantitativa. A transcrição reversa é feita a partir de 4 mg de RNA a partir de iniciadores aleatórios. A PCR quantitativa é feita d acordo com o seguinte esquema:
| cDNA 100 ng tubulina de arroz | cDNA 100 ng de buf de Magnaporthe |
| cDNA 10 ng tubulina de arroz | cDNA 10 ng de buf de Magnaporthe |
| cDNA 100 ng tubulina de arroz | cDNA 100 ng de buf de Magnaporthe |
| cDNA 10 ng tubulina de arroz | cDNA 10 ng de buf de Magnaporthe |
[098] O RNA é utilizado para fazer a reação de PCR a fim se obter a certeza de que a detecção de DNA obtida com o cDNA complementar é realmente devida a uma amplificação de DNA complementar e não de DNA genômico contaminante (a amplificação a partir do RNA deve ser nula).
[099] A detecção do DNA complementar da tubulina de tabaco serve de nível de expressão de referência. O nível de expressão do transgene
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33/35 foi calculado em relação a essa expressão da tubulina do tabaco.
[100] As sequências dos iniciadores são as seguintes:
Tubulina de arroz
- Direto: 5' - CAT TGA CTT CAC GCG G - 3' (SEQ ID No 14)
- Indireto: 5' - GAC ACT GGA TTT GAC GTT - 3' (SEQ ID No 15) buf de Magnaporthe
- Direto: 5' - TGA CCG TGT CTT TAC CA - 3' (SEQ ID No 16)
- Indireto: 5' - AGC AAC CAC ATT AAC AGT - 3' (SEQ ID No 17) [101 ] Para todas as experiências:
- Os controles RNA são negativos. Não há portanto contaminação de DNA genômico.
- A diferença de expressão entre as concentrações de 100 e 10 ng é constante e de acordo com as expectativas para diluições de 10 vezes.
| Evento | Nível de expressão (RT-PCR quantitativa) | Resultados |
| WT | • Não há detecção por PCR da construção • Não há detecção de RNA correspondente ao gene buf | |
| M | +/- | • Detecção por PCR da construção • Detecção fraca de RNA correspondente à construção buf |
| L | + | • Detecção por PCR da construção • Detecção nítida de RNA correspondente à construção buf |
| F | ++ | • Detecção por PCR da construção • Detecção muito nítida de RNA correspondente à construção buf |
Petição 870170004744, de 23/01/2017, pág. 36/49
34/35 “+“ significa que o sinal é detectado por RT-qPCR “—“ corresponde à ausência de transgene.
“++“ significa que o sinal é fortemente detectado por RT-qPCR.
4. Testes Patológicos in vivo para Avaliação da Resistência dos Arroz
Transgênicos à Infecção por Magnaporthe Grisea
Material vegetal:
Eventos T0 em um estágio de desenvolvimento das plantas que compreende pelo menos 5 folhas desenvolvidas.
Produção: Estufa S2 Inóculo:
Suspensão de Magnaporthe grisea (104 esporos/ml).
Avaliação dos sintomas:
[102] A determinação da intensidade dos sintomas é determinada por critérios biológicos em função do tamanho e do aspecto das lesões constatadas nas folhas. Assim, a nota 1 corresponde à visualização de manchas muito leves na folha, apenas perceptíveis. A nota 2 corresponde a manchas nítidas na folha, mas muito pouco numerosas. A nota 3 corresponde a manchas nítidas e numerosas na folha. A nota 4 corresponde a manchas muito nítidas e muito numerosas com presença de manchas de grande tamanho. A nota 5 corresponde a um apodrecimento total da folha, ou seja a manchas numerosas de tamanho muito grande. A nota 6 corresponde a uma planta 100 % afetada pela doença.
[103] As diferenças entre 1, 2, 3, 4, 5 e 6 correspondem portanto a diferenças nítidas de sintomas. Assim, plantas que possuem notas de sintomas de 6 são mortas, as plantas 4 ou 5 são consideradas como afetadas de modo muito severo. Plantas de nota 3 são afetadas mas permanecem aceitáveis. Plantas de nota 2 são fracamente afetadas e as de nota 1 só foram afetadas de modo muito ligeiro.
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35/35 [104] Os resultados são apresentados na forma de histogramas que correspondem às médias das plantas por evento. O intervalo de confiança está representado para cada histograma.
[105] A figura 7 apresenta a intensidade dos sintomas anotada para cada evento.
[106] Os resultados do teste in vivo estão claramente correlacionados com as análises moleculares: a detecção dos transcritos longos provenientes da construção de acordo com a presente invenção está nitidamente correlacionada com uma menor intensidade dos sintomas e portanto uma resistência da planta transgênica.
| Evento | Presença do transgene | RT-qPCR Detecção dos RNA longos | Intensidade dos sintomas após 15 dias da infecção |
| WT | Não | — | 5-6 |
| M | Sim | -/+ | 1 |
| L | Sim | + | 2-3 |
| F | Sim | ++ | 2-3 |
“-/+”: detecção fraca detecção “++”: detecção forte “---“: nenhuma detecção
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1/7
Claims (14)
- Reivindicações1. Método de produção de uma planta resistente a um fungo fitopatogênico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) introduzir em uma célula vegetal uma construção que compreende:- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais, operavelmente ligada a- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: senso e antisenso, pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos a uma porção do gene da beta-tubulina de Cercospora nicotianae (SEQ ID NO: 1) ou ao gene buf de Magnaporthe grisea (SEQ ID NO: 11), e a referida sequência anti-senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos à sequência complementar à referida porção do gene fúngico;- uma sequência de regulação terminadora, (b) colocação das células transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da construção, (c) seleção das células transformadas, (d) regeneração de uma planta a partir das células transformadas.
- 2. Método de produção de célula vegetal resistente a um fungo fitopatogênico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) introduzir em uma célula vegetal uma construção que compreende:- uma sequência de regulação promotora que é funcional nasPetição 870170032111, de 15/05/2017, pág. 7/192/7 células vegetais, operavelmente ligada a- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: senso e antisenso, pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos a uma porção do gene da beta-tubulina de Cercospora nicotianae (SEQ ID NO: 1) ou ao gene buf de Magnaporthe grisea (SEQ ID NO: 11), e a referida sequência anti-senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos à sequência complementar à referida porção do gene fúngico,- uma sequência de regulação terminadora, (b) colocação da célula vegetal transformada em cultura sob condições que permitem a transcrição da construção, (c) seleção da célula vegeta transformada.
- 3. Método de produção de uma célula vegetal resistente a um fungo fitopatogênico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) introduzir em uma célula vegetal uma construção que compreende:- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais, operavelmente ligada a- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: senso e antisenso, pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos a uma porção do gene da beta-tubulina de Cercospora nicotianae (SEQ ID NO: 1) ou ao gene buf de Magnaporthe grisea (SEQ ID NO: 11), e a referida sequência anti-senso compreende uma sequência de pelo menos 19Petição 870170032111, de 15/05/2017, pág. 8/193/7 nucleotídeos idênticos à sequência complementar à referida porção do gene fúngico,- uma sequência de regulação terminadora, (b) seleção das células transformadas (c) colocação das células transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da construção.
- 4. Método de produção de uma célula vegetal ou uma planta resistente a um fungo fitopatogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as sequências nucleotídicas senso e antisenso estão separadas por um polinucleotídeo que não apresenta qualquer homologia com o gene do fungo.
- 5. Método de produção de uma célula vegetal ou uma planta resistente a um fungo fitopatogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as sequências nucleotídicas senso e antisenso possuem tamanhos diferentes.
- 6. Método de produção de uma célula vegetal ou uma planta resistente a um fungo fitopatogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a planta é o tabaco e o fungo fitopatogênico é a Cercospora nicotianae.
- 7. Método de produção de uma célula vegetal ou uma planta resistente a um fungo fitopatogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a planta é o arroz e o fungo fitopatogênico é a Magnaporthe grisea.
- 8. Método para inibir a expressão de um gene fúngico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) transformação de uma célula vegetal com uma construção que compreende:- uma sequência de regulação promotora que é funcional nasPetição 870170032111, de 15/05/2017, pág. 9/194/7 células vegetais, operavelmente ligada a- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: senso e antisenso, pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos a uma porção do gene da beta-tubulina de Cercospora nicotianae (SEQ ID NO: 1) ou ao gene buf de Magnaporthe grisea (SEQ ID NO: 11), e a referida sequência anti-senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos à sequência complementar à referida porção do gene fúngico,- uma sequência de regulação terminadora, (b) seleção, (c) colocação das células assim transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da referida construção, (d) colocação das células em contato com o fungo,
- 9. Método para inibir a expressão de um gene fúngico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa adicional de regeneração das células transformadas.
- 10. Método para inibir a expressão de um gene fúngico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) transformação de uma planta com uma construção que compreende:- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais, operavelmente ligada a- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: senso e antisenso, pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeosPetição 870170032111, de 15/05/2017, pág. 10/195/7 idênticos a uma porção do gene da beta-tubulina de Cercospora nicotianae (SEQ ID NO: 1) ou ao gene buf de Magnaporthe grisea (SEQ ID NO: 11), e a referida sequência anti-senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos à sequência complementar à referida porção do gene fúngico,- uma sequência de regulação terminadora, (b) seleção, (c) colocação das plantas assim transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da referida construção, (d) colocação das plantas em contato com o fungo.
- 11. Método para reduzir a expressão de um gene fúngico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) transformação de uma célula vegetal com uma construção que compreende:- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais, operavelmente ligada a- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: senso e antisenso, pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos a uma porção do gene da beta-tubulina de Cercospora nicotianae (SEQ ID NO: 1) ou ao gene buf de Magnaporthe grisea (SEQ ID NO: 11), e a referida sequência anti-senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos à sequência complementar à referida porção do gene fúngico,- uma sequência de regulação terminadora, (b) seleção (c) colocação das células assim transformadas em cultura sobPetição 870170032111, de 15/05/2017, pág. 11/196/7 condições que permitem a transcrição da referida construção, (d) colocação das células em contato com o fungo.
- 12. Método para reduzir a expressão de um gene fúngico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa adicional de regeneração das células transformadas.
- 13. Método para reduzir a expressão de um gene de fungo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) transformação de uma planta com uma construção que compreende:- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais, operavelmente ligada a- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: senso e antisenso, pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos a uma porção do gene da beta-tubulina de Cercospora nicotianae (SEQ ID NO: 1) ou ao gene buf de Magnaporthe grisea (SEQ ID NO: 11), e a referida sequência anti-senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos à sequência complementar à referida porção do gene fúngico,- uma sequência de regulação terminadora, (b) seleção, (c) colocação das plantas assim transformadas em cultura sob condições que permitem a transcrição da referida construção, (d) colocação das plantas em contato com o fungo.
- 14. Uso de uma construção, caracterizado pelo fato de ser para criar uma célula vegetal ou uma planta resistente a um fungo, sendo que a referida construção compreende:Petição 870170032111, de 15/05/2017, pág. 12/197/7- uma sequência de regulação promotora que é funcional nas células vegetais, operavelmente ligada a- uma sequência de DNA que, quando é transcrita, gera uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas sequências: senso e antisenso, pelo menos parcialmente complementares, sendo que a referida sequência senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos a uma porção do gene da beta-tubulina de Cercospora nicotianae (SEQ ID NO: 1) ou ao gene buf de Magnaporthe grisea (SEQ ID NO: 11), e a referida sequência anti-senso compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos idênticos à sequência complementar à referida porção do gene fúngico,- uma sequência de regulação terminadora.Petição 870170032111, de 15/05/2017, pág. 13/191/7PromotorSeqüênciaDNATerminadorSeqüência ‘anti-sense”Região homóloga para a seqüência “anti-sense”SaltoRegião homóloga para a seqüência mRNA dsRNA siRNATranscriçãoDegradação pelo complexo denominado “Dicer’I i1 :T I I II 1 I I1I1 T11 I I I1 $ ii
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