BR112024027500B1 - Polipeptídeo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o polipeptídeo, composição, uso do polipeptídeo, e, método para promover a proliferação de uma célula in vitro - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO, USO DO POLIPEPTÍDEO, E, MÉTODO PARA PROMOVER A PROLIFERAÇÃO DE UMA CÉLULA IN VITRO. O presente pedido provê um método de preparação para biossíntese de um material estrutural do corpo humano. Um polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 4, 5 ou 6. O colágeno humanizado recombinante tipo VII preparado no presente pedido tem alta atividade de promover a proliferação celular e não produz uma resposta imune quando aplicado ao corpo humano, e o método de preparação para isso é novo e pode obter o colágeno humanizado recombinante tipo VII em larga escala, sendo amplamente aplicado na preparação de materiais estruturais do corpo humano. O método de preparação é aplicado aos campos de preparação de instrumentos médicos de ponta, como curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, de injeção e preenchimento de tecidos, de reparo e regeneração da pele, de reparo e regeneração da mucosa bucal, de reparo e regeneração da mucosa cervical, materiais biológicos para ginecologia e obstetrícia, materiais biológicos de órgãos artificiais para impressão 3D; matérias-primas cosméticas de ponta e materiais auxiliares medicinais de ponta;(...).

Description

[001] O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido de PatenteChinês n° 202211017546.9 intitulado “PREPARATION METHOD FOR BIOSYNTHESIS OF HUMAN BODY STRUCTURAL MATERIAL”, depositado em 23 de agosto de 2022, que é incorporado neste documento por referência.

Campo Técnico

[002] O presente pedido pertence ao campo da biotecnologiasintética e se refere a um método de preparação para a biossíntese de material estrutural do corpo humano.

Fundamento

[003] Os materiais estruturais do corpo humano são principalmenteproteínas estruturais, incluindo colágeno. Essas proteínas têm funções de adesão e suporte para células e tecidos e são o principal componente da matriz extracelular.

[004] O colágeno é um tipo de proteína amplamente distribuída nostecidos conjuntivos humanos e também é a proteína mais abundante no corpo humano, respondendo por 25% a 35% da proteína total. Atualmente, verificou-se que existem pelo menos 28 subtipos de colágeno no corpo humano, que estão localizados em diferentes tecidos ou órgãos. Dentre eles, o colágeno tipo VII é um colágeno fibroso distribuído na área da membrana basal do epitélio escamoso estratificado, como pele, mucosa bucal e colo do útero. Assim, o colágeno tipo VII também é chamado de colágeno da membrana basal. O colágeno tipo VII é o principal componente das fibrilas de ancoragem na pele. Essas fibrilas se estendem dos dendritos lamelares da membrana basal epidérmica até o tecido conjuntivo dérmico, o que contribui para a aderência entre a epiderme e a derme. Experimentos em animais mostraram que o colágeno tipo VII promove a migração de fibroblastos e a secreção de citocinas, além de participar de danos e reparos na pele por meio da laminina tecidual; o colágeno tipo VII também corrige a epidermólise bolhosa de desnutrição por meio de injeção artificial de colágeno tipo VII recombinante.

[005] Atualmente, o produto bruto do colágeno tipo VII é obtidoprincipalmente por extração de tecidos animais ou por transfecção lentiviral. Infelizmente, o colágeno tipo VII tem um teor relativamente baixo no organismo, e o processo de extração do colágeno tipo VII é relativamente complicado. Além disso, as respostas imunológicas derivadas de animais são uma razão importante para a limitação da aplicação do colágeno. Em contraste, embora a transfecção lentiviral seja menos imunogênica, ela é difícil de operar e é mais limitada na capacidade dos genes alvo. Com o crescente crescimento da indústria de colágeno em nosso país, a utilização de vias biossintéticas para obtenção de colágeno tem se tornado cada vez mais madura, especialmente no colágeno humanizado, que tem estado na vanguarda do mundo. Em 2021, a Administração Nacional de Produtos Médicos conduziu a nomeação e classificação do colágeno biossintético. Entre eles, o colágeno humanizado recombinante se refere ao fragmento de sequência de aminoácidos total ou parcial codificado pelo gene do tipo específico de colágeno humano preparado pela tecnologia de DNA recombinante, ou uma combinação contendo fragmentos funcionais de colágeno humano.

[006] O colágeno tipo VII é um homotrímero composto de trêscadeias α1 idênticas, e a forma molecular é α1α1α1(VII). As três cadeias α1(VII) se torcem juntas para formar uma molécula de procolágeno cordonal de cadeia tripla. As moléculas de procolágeno são secretadas pelas células e os fragmentos de proteína em excesso são removidos das extremidades por tratamento enzimático. Após o processamento, as moléculas de procolágeno são organizadas em feixes longos e finos, para formar um colágeno tipo VII maduro. Cada cadeia polipeptídica α1 contém uma região central de hélice tripla colágena, flanqueada por extremidades amino e carboxila não colágenas. A região estrutural colágena é um domínio de hélice tripla composto de uma sequência característica de repetição Gly-X-Y. A mutação genética do colágeno tipo VII causa distúrbios de síntese ou anormalidades estruturais do colágeno, levando a vários graus de bolhas. Os sintomas envolvem a pele, a mucosa bucal, o esôfago e outros locais. Embora a maioria seja mutações não orientadas, mutações de sentido trocado ainda podem ocorrer, o que resulta na retenção e na dobragem deficiente do colágeno nas células, afetando a conexão entre a mucosa vaginal e a lâmina própria da membrana basal.

[007] Atualmente, o colágeno tipo VII tem sido obtidoprincipalmente por digestão enzimática e transfecção lentiviral. A digestão enzimática se refere à extração de derivados de colágeno tipo VII por meio do tratamento de tecidos derivados de animais com proteases. Entretanto, o colágeno extraído por esse método perdeu sua atividade biológica original e não consegue exercer a verdadeira função do colágeno. A transfecção lentiviral se refere à construção de um vetor retroviral, seguida pela transfecção celular e, finalmente, pela purificação do colágeno tipo VII. Entretanto, o processo de preparação desse método apresenta falhas, pois a preparação é difícil e não é fácil obter vírus de alta pureza; a integração de vetores lentivirais no genoma do hospedeiro é aleatória, o que pode interferir na expressão de genes no local de inserção e genes vizinhos; é difícil obter controle preciso do número de cópias integradas; e a capacidade do gene alvo é pequena. Portanto, há uma necessidade urgente de um método biossintético para colágeno humanizado recombinante tipo VII que supere esses defeitos, permitindo ampla aplicação como material estrutural do corpo humano.

Sumário da Invenção

[008] Tendo em vista os defeitos da técnica anterior, o presentepedido projeta um processo de triagem e síntese da região funcional central do colágeno tipo VII humanizado recombinante. O presente pedido projeta um processo de triagem da região funcional e síntese da proteína de colágeno tipo VII humanizado recombinante, o que é uma descoberta inédita.

[009] Em um aspecto, o presente pedido provê um polipeptídeo quecompreende uma estrutura de (unidade de repetição)n, em que a unidade de repetição compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 1, cada unidade de repetição está diretamente ligada e o número n da unidade de repetição é de 4 a 20. Em uma modalidade, o polipeptídeo é um colágeno tipo VII humanizado recombinante.

[0010] Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID N° 4.

[0011] Em um aspecto, o presente pedido provê um ácido nucleicoque compreende sequência nucleotídica da sequência polipeptídica conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência nucleotídica que codifica uma etiqueta de purificação. A etiqueta de purificação pode ser uma etiqueta His, uma etiqueta GST, uma etiqueta MBP, uma etiqueta SUMO, ou uma etiqueta NusA. Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência líder.

[0012] Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende umasequência nucleotídica da SEQ ID N° 7.

[0013] Em um aspecto, o presente pedido provê um vetor quecompreende o ácido nucleico conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, o ácido nucleico pode compreender um elemento de controle de expressão operativamente ligado ao ácido nucleico. Em uma modalidade, o elemento de controle de expressão pode ser um promotor, um terminador e/ou um intensificador.

[0014] Em um aspecto, o presente pedido provê uma célulahospedeira que compreende o ácido nucleico conforme descrito neste documento ou o vetor conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula eucariótica ou procariótica. Em uma modalidade, a célula eucariótica é uma célula de levedura, uma célula animal e/ou uma célula de inseto. Em uma modalidade, a célula procariótica é uma célula de Escherichia coli. Em uma modalidade, a E. coli é E. coli BL21.

[0015] Em um aspecto, o presente pedido provê um método paraproduzir o polipeptídeo conforme descrito neste documento, que compreende: (1) cultivar a célula hospedeira descrita neste documento sob uma condição de cultura apropriada;(2) colher as células hospedeiras e/ou o meio de cultura que compreende o polipeptídeo; e(3) purificar o polipeptídeo.

[0016] A etapa de purificação pode ser realizada pelas etapasselecionadas a partir do grupo que consiste em (1) purificação grosseira do polipeptídeo em uma coluna cromatográfica de afinidade de Ni; (2) adição da enzima TEV para digestão enzimática; (3) purificação fina do polipeptídeo em uma coluna de troca iônica.

[0017] Em um aspecto, o presente pedido provê composições quecompreendem o polipeptídeo conforme descrito neste documento, o ácido nucleico conforme descrito neste documento, o vetor conforme descrito neste documento e/ou a célula hospedeira conforme descrita neste documento. Por exemplo, a composição pode compreender um polipeptídeo. O polipeptídeo pode estar em uma concentração de mais de 1 mg/ml, mais de 5 mg/ml, mais de 10 mg/ml ou mais de 12 mg/ml.

[0018] Em uma modalidade, a composição é um ou mais dentrecurativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, materiais de stent cardiovascular, materiais de revestimento, materiais de injeção e preenchimento de tecidos, materiais oftálmicos, materiais biológicos de ginecologia e obstetrícia, materiais de reparo e regeneração de nervos, materiais de tecido hepático e materiais de reparo e regeneração vascular, biomateriais de órgãos artificiais para impressão 3D, matérias-primas cosméticas, materiais auxiliares medicinais e aditivos alimentares.

[0019] Em um aspecto, o presente pedido provê o uso do polipeptídeoconforme descrito neste documento, do ácido nucleico conforme descrito neste documento, do vetor conforme descrito neste documento e/ou da célula hospedeira conforme descrita neste documento e/ou da composição conforme descrita neste documento na promoção da adesão celular in vitro ou na fabricação de um produto ou kit para promover a adesão celular.

[0020] Em um aspecto, o presente pedido provê o uso do polipeptídeoconforme descrito neste documento, do ácido nucleico conforme descrito neste documento, do vetor conforme descrito neste documento e/ou da célula hospedeira conforme descrita neste documento e/ou da composição conforme descrita neste documento na fabricação de dispositivos médicos de ponta, como curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, stent cardiovascular, revestimento, materiais de injeção e preenchimento de tecido, materiais oftálmicos, materiais biológicos de ginecologia e obstetrícia, materiais de reparo e regeneração de nervos, materiais de tecido hepático e materiais de reparo e regeneração vascular, materiais biológicos de órgãos artificiais para impressão 3D, etc.; matérias-primas cosméticas de ponta e materiais auxiliares medicinais; e aditivos alimentares.

[0021] Em um aspecto, o presente pedido provê um método parapromover a proliferação celular, que compreende colocar a célula em contato com o polipeptídeo conforme descrito neste documento. Preferivelmente, a célula é uma célula animal, como uma célula de mamífero.

[0022] As modalidades do presente pedido incluem:1. Tendo em vista a situação atual da pesquisa, o presente pedido provê um método para biossintetizar colágeno humanizado recombinante tipo VII, ou seja, um método para preparar materiais estruturais do corpo humano. Os processos específicos compreendem (1) triagem da região funcional e construção de cepa; (2) cultura de fermentação biológica em larga escala e expressão induzível da proteína; e (3) purificação e digestão enzimática opcional do colágeno tipo VII humanizado.

[0023] 2. De acordo com o item 1, a triagem da região funcional e aconstrução da deformação podem ser conduzidas da seguinte forma: (1) triagem das regiões funcionais em larga escala para obter o segmento do gene alvo; (2) inserção do segmento obtido do gene alvo em um vetor de expressão PET-28a-Trx-His para obter um plasmídeo de expressão recombinante; e (3) transformação do plasmídeo de expressão recombinante em células competentes de E. coli BL21 (DE3) para obter bactérias geneticamente modificadas de E. coli positivas por triagem.

[0024] 3. De acordo com o item 1, a fermentação biológica em largaescala pode ser conduzida da seguinte forma: adicionando bactérias E. coli positivas geneticamente modificadas obtidas por triagem em um frasco de agitação que contém uma solução estoque de antibiótico, e cultivando as bactérias em um agitador de temperatura constante a 220 rpm e 37°C.

[0025] 4. De acordo com o item 1, a expressão induzível da proteínapode ser conduzida da seguinte forma: (1) resfriar o frasco de agitação após a cultura a 30°C; (2) adicionar solução estoque de IPTG para expressão induzível; e (3) colocar o líquido bacteriano após a expressão induzível em um frasco de centrífuga, e coletar as células bacterianas após centrifugação a 6.000 rpm e 4°C por 12 minutos.

[0026] 5. De acordo com o item 1, a purificação e a digestão enzimática opcional do colágeno tipo VII humanizado podem ser conduzidas da seguinte forma: (1) purificação grosseira do colágeno tipo VII humanizado em uma coluna de cromatografia de afinidade de Ni; (2) adição da enzima TEV em uma determinada razão para digestão enzimática; e (3) purificação fina do colágeno tipo VII humanizado em uma coluna de troca iônica.

[0027] 6. De acordo com o item 2, as regiões funcionais triadas são asseguintes.

[0028] (1) A sequência de aminoácidos do colágeno humanizado tipoVII recombinante C7P7:GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGF PGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKG DRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQ GLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGE PGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTG PKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKGDRGETGSK GEQGLPGERGLRGEP (SEQ ID N° 4)(2) A sequência de aminoácidos do colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P11:GLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGK PGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAPGLTG PTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGASGKD GDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAPGLTGPTGAVGLPGPPGPS GLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGL PGPVGPKGEPGPTGAPGLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQ VGETGKPGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTG AP (SEQ ID N° 5)(3) A sequência de aminoácidos do colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P12:GEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQKG APGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQ KGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGED GQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPG EDGQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGD PGEDGQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEP GDPGEDGQKGAPGPKGFKGDP (SEQ ID N° 6).

[0029] 7. Ele foi otimizado para os codãos de E. coli no presentepedido, e as sequências de bases otimizadas são as seguintes.

[0030] (1) A sequência de base para o colágeno humanizado tipo VIIrecombinante C7P7 é:GGATTTCCCGGGGTCCCGGGAGGCACCGGCCCTAAA GGCGATCGTGGTGAAACCGGCAGCAAGGGCGAGCAGGGTCTGCCG GGCGAGCGCGGTTTGAGAGGCGAACCGGGTTTTCCAGGCGTGCCG GGCGGTACGGGTCCGAAGGGTGACCGTGGCGAAACCGGCAGCAA GGGTGAACAAGGTTTACCGGGTGAACGCGGTCTGCGTGGTGAGCC GGGCTTCCCAGGTGTTCCGGGCGGAACCGGTCCTAAAGGTGATCG TGGCGAAACCGGTTCCAAAGGCGAACAAGGTCTTCCGGGTGAGCG CGGTCTGCGTGGCGAACCGGGTTTCCCGGGCGTGCCGGGAGGCAC CGGCCCAAAGGGCGACCGCGGAGAAACCGGCAGCAAAGGCGAGC AGGGCCTGCCGGGTGAACGTGGCCTGCGTGGTGAGCCGGGATTCC CGGGTGTTCCGGGCGGCACCGGTCCGAAAGGTGATCGTGGTGAAA CCGGTAGCAAGGGTGAACAGGGTCTGCCGGGCGAGCGCGGCTTGA GAGGTGAGCCTGGTTTTCCGGGGGTGCCCGGCGGTACGGGCCCGA AAGGCGACCGTGGCGAAACCGGTTCTAAGGGTGAGCAGGGTCTGC CGGGTGAGCGTGGTCTGCGCGGTGAGCCGGGTTTCCCGGGCGTTC CGGGTGGCACTGGTCCGAAGGGCGACCGTGGCGAGACTGGCTCGA AAGGTGAACAGGGTTTGCCGGGTGAGCGTGGTCTGCGTGGTGAGC CGGGTTTTCCGGGCGTGCCGGGTGGCACGGGCCCAAAAGGCGATC GTGGTGAGACCGGTTCCAAGGGCGAGCAAGGTCTGCCGGGCGAGC GCGGTCTCCGCGGTGAACCG (SEQ ID N° 7);(2) A sequência de base para o colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P11 é:GGACTAACAGGGCCGACCGGTGCGGTCGGCCTGCCG GGACCACCGGGCCCCAGCGGTCTGGTTGGTCCTCAGGGTTCCCCG GGTCTTCCGGGCCAGGTTGGTGAGACAGGCAAGCCGGGTGCGCCG GGCCGTGACGGTGCCTCTGGTAAAGACGGCGATCGTGGTTCGCCG GGCGTTCCGGGTTCGCCGGGTCTGCCGGGTCCGGTCGGTCCGAAA GGTGAACCGGGGCCCACTGGTGCGCCAGGCTTGACCGGTCCGACC GGTGCGGTTGGCCTCCCGGGCCCACCGGGACCGAGCGGTCTGGTT GGCCCACAAGGTTCCCCGGGCTTACCGGGCCAGGTTGGAGAAACC GGTAAGCCGGGTGCACCGGGGCGCGACGGCGCAAGCGGTAAGGA CGGCGACCGCGGTAGCCCGGGCGTGCCGGGTAGCCCGGGCCTGCC GGGCCCGGTGGGCCCCAAGGGTGAGCCGGGACCGACCGGCGCTCC GGGGTTGACCGGTCCAACGGGCGCTGTGGGCCTGCCGGGTCCACC GGGTCCGAGCGGTCTGGTTGGCCCGCAGGGTAGCCCGGGTCTGCC GGGCCAAGTTGGTGAAACCGGTAAACCGGGAGCACCAGGCCGTGA TGGTGCCTCCGGTAAGGACGGCGATCGCGGTTCTCCGGGCGTCCC GGGCTCCCCGGGTCTGCCGGGCCCGGTGGGTCCGAAAGGTGAGCC GGGCCCGACGGGCGCGCCGGGCTTGACCGGCCCGACGGGTGCTGT GGGTCTGCCGGGCCCTCCGGGTCCAAGCGGTCTGGTGGGCCCTCA AGGTTCTCCGGGTCTGCCGGGACAGGTGGGCGAAACCGGTAAGCC GGGTGCGCCAGGTCGTGATGGCGCGAGCGGCAAAGATGGTGATCG TGGCAGTCCGGGGGTGCCGGGCAGCCCGGGCTTGCCGGGTCCAGT AGGTCCGAAAGGCGAGCCGGGCCCGACCGGCGCGCCT (SEQ ID N° 8); e(3) a sequência de base para o colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P12 é:GGAGAACCCGGGGCGAAGGGCGACCGCGGTCTGCCG GGTCCGCGTGGTGAAAAAGGTGAGGCGGGCCGCGCAGGCGAACC GGGTGACCCGGGCGAGGATGGTCAGAAAGGCGCGCCAGGTCCGA AAGGTTTTAAAGGCGATCCGGGCGAACCGGGTGCCAAGGGCGATA GAGGTCTGCCGGGTCCGCGTGGCGAAAAGGGTGAAGCGGGTCGTG CGGGTGAACCGGGTGACCCGGGCGAGGACGGTCAGAAGGGCGCG CCAGGTCCGAAAGGCTTCAAAGGTGACCCGGGTGAACCGGGCGCG AAAGGCGACCGTGGTTTACCGGGTCCGCGTGGTGAGAAGGGGGAG GCTGGTCGTGCCGGTGAACCGGGCGACCCAGGCGAGGATGGTCAG AAAGGCGCGCCTGGTCCCAAGGGCTTCAAGGGCGACCCGGGTGAA CCGGGTGCCAAAGGGGATCGCGGTTTGCCAGGTCCTCGCGGTGAA AAGGGCGAGGCTGGTCGCGCTGGTGAGCCGGGCGACCCGGGTGAA GATGGTCAAAAAGGCGCTCCGGGTCCGAAGGGTTTTAAAGGTGAT CCGGGCGAGCCGGGTGCGAAGGGCGATCGTGGCCTGCCGGGCCCA CGTGGTGAGAAAGGCGAGGCCGGTCGTGCAGGCGAACCGGGTGA CCCCGGCGAAGATGGCCAAAAGGGTGCGCCTGGCCCGAAGGGATT CAAAGGCGATCCGGGTGAGCCGGGCGCGAAAGGCGACCGCGGCC TGCCGGGTCCGCGTGGTGAGAAGGGCGAGGCAGGCCGTGCAGGTG AACCGGGTGACCCGGGTGAGGATGGTCAAAAAGGTGCTCCGGGTC CGAAGGGCTTTAAGGGCGACCCG (SEQ ID N° 9).

[0031] A sequência de aminoácidos do colágeno humanizado tipo VIIrecombinante preparado no presente pedido é derivada da região funcional do colágeno tipo VII natural humano e compreende a região funcional e uma região funcional semelhante, bem como proteínas com sequência de aminoácidos mutada e modificada, respectivamente.

[0032] O campo de aplicação do colágeno humanizado recombinantetipo VII preparado no presente pedido inclui a preparação de dispositivos médicos de ponta, como curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, injeção e preenchimento de tecidos, reparo e regeneração da pele, reparo e regeneração da mucosa bucal, reparo e regeneração da mucosa cervical, materiais biológicos para ginecologia e obstetrícia, materiais biológicos de órgãos artificiais para impressão 3D, etc.; matérias-primas cosméticas de ponta e materiais auxiliares medicinais de ponta; e aditivos alimentares, etc.

[0033] As vantagens do presente pedido incluem:1. O presente pedido provê a região funcional central e a sequência de aminoácidos do colágeno humanizado tipo VII recombinante.

[0034] 2. O presente pedido biossintetizou com sucesso colágenohumanizado tipo VII recombinante pela primeira vez.

[0035] 3. O colágeno humanizado recombinante tipo VII preparadono presente pedido tem um bom efeito de adesão celular e um bom efeito de promoção da proliferação celular, e não causa uma resposta imune quando aplicado ao corpo humano.

[0036] 4. O método de preparação é simples e o colágeno humanizadotipo VII recombinante pode ser obtido em larga escala.

[0037] 5. O excelente desempenho do colágeno humanizadorecombinante tipo VII faz com que se espere que ele seja amplamente aplicado em áreas como curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, injeção e preenchimento de tecidos, reparo e regeneração da pele, reparo e regeneração da mucosa bucal, reparo e regeneração da mucosa cervical, materiais biológicos para ginecologia e obstetrícia, materiais biológicos de órgãos artificiais para impressão 3D, etc.; matérias-primas cosméticas de ponta e materiais auxiliares medicinais de ponta; e aditivos alimentares, etc.

Descrição dos Desenhos

[0038] Figura 1: A purificação do colágeno humanizado tipo VIIrecombinante C7P7 (5, nenhuma amostra carregada; 6, a amostra de fluxo contínuo carregada coletada em purificação fina, que é a proteína alvo).

[0039] Figura 2: A purificação do colágeno humanizado tipo VIIrecombinante C7P11 (3 e 4, a amostra de fluxo contínuo carregada coletada em purificação fina, que é a proteína alvo).

[0040] Figura 3: A purificação do colágeno humanizado tipo VIIrecombinante C7P12 (22, a amostra de fluxo contínuo carregada é coletada em purificação fina, que é a proteína alvo; 26, a proteína pós-digestão enzimática; 27, a proteína pós-troca de tampão).

[0041] Figura 4: Gráfico do efeito pró-proliferação do colágenohumanizado recombinante tipo VII C7P7.

[0042] Figura 5: Gráfico do efeito pró-proliferação do colágenohumanizado recombinante tipo VII C7P11.

[0043] Figura 6: Gráfico do efeito pró-proliferação do colágenohumanizado recombinante tipo VII C7P12.

Descrição detalhada

[0044] A fim de tornar o propósito, as soluções técnicas e asvantagens do presente pedido mais claros, as soluções técnicas nas modalidades do presente pedido serão descritas de forma clara e completa abaixo em combinação com as modalidades do presente pedido. É óbvio que as modalidades descritas são uma parte, mas não todas as modalidades do presente pedido. Com base nas modalidades do presente pedido, todas as outras modalidades obtidas por pessoas com conhecimento comum na técnica, sem trabalho criativo, se enquadram no escopo de proteção do presente pedido.

[0045] Conforme usado aqui, um polipeptídeo se refere a umapluralidade de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Neste documento, um polipeptídeo compreende uma pluralidade de unidades de repetição derivadas de colágeno humano tipo VII. Um polipeptídeo pode compreender (unidade de repetição)n, e a unidade de repetição compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 1. Neste documento, cada unidade de repetição pode estar diretamente ligada ou pode ser separada por um ou mais resíduos de aminoácidos. O número n de unidades de repetição pode ser de 4 a 20, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19. A concentração do polipeptídeo pode ser maior que 1 mg/ml, maior que 5 mg/ml, maior que 10 mg/ml, ou maior que 12 mg/ml.

[0046] Neste documento, a unidade de repetição do presente pedidopode compreender ou ser uma sequência de:GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP (SEQ ID N° 1);GLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGK PGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAP (SEQ ID N° 2); ouGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQKG APGPKGFKGDP (SEQ ID N° 3).

[0047] Conforme usado aqui, “ácido nucleico” se refere a umapluralidade de nucleotídeos ligados por ligação internucleotídica. A ligação internucleotídica pode ser, por exemplo, uma ligação fosfodiéster. O ácido nucleico aqui descrito pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do presente pedido. Para facilitar o processamento subsequente do polipeptídeo, o ácido nucleico do presente pedido também pode compreender nucleotídeos que codificam uma etiqueta de purificação, como uma etiqueta His, uma etiqueta GST, uma etiqueta MBP, uma etiqueta SUMO ou uma etiqueta Nus, e uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência líder quando necessário.

[0048] Conforme usado aqui, o termo “vetor” é uma ferramentatransportadora de ácido nucleico na qual um polinucleotídeo é inserido. Quando um vetor permite a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo inserido, o vetor é chamado de vetor de expressão. O vetor pode ser introduzido em uma célula hospedeira por meio de transformação, transdução ou transfecção, de modo que os elementos do material genético que ele carrega possam ser expressos na célula hospedeira. O vetor é bem conhecido pelos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a: plasmídeos; fagemídeos; cosmídeos; cromossomos artificiais, como cromossomos artificiais de levedura (YAC), cromossomos artificiais bacterianos (BAC) ou cromossomos artificiais derivados de P1 (PAC); fagos, como fagos lambda ou fagos M13; e vírus animais e similares. O vetor pode conter uma variedade de elementos para controlar a expressão, incluindo, mas não se limitando a sequências promotoras, sequências de iniciação de transcrição, sequências intensificadoras, elementos de seleção e genes repórteres. Além disso, o vetor também pode conter uma origem de replicação. O vetor pode compreender o ácido nucleico do presente pedido para facilitar a introdução em uma célula para expressão. O vetor pode compreender um elemento de controle de expressão, como um promotor, um terminador e/ou um intensificador operativamente ligado ao dito ácido nucleico.

[0049] Conforme usado aqui, o termo "célula hospedeira" é umacélula na qual uma molécula de ácido nucleico foi introduzida por técnicas de biologia molecular. Essas técnicas incluem transfecção com vetores virais, transformação com vetores plasmídeos e introdução de DNA nu por eletroporação, lipofecção e aceleração de pistola de partículas. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica ou uma célula procariótica. A célula eucariótica é, por exemplo, uma célula de levedura, uma célula animal e/ou uma célula de inseto. A célula procariótica pode ser uma célula de E. coli.

[0050] Neste documento, a unidade de repetição do polipeptídeo ou opolipeptídeo do presente pedido pode ter certas mutações. Por exemplo, a sequência de aminoácidos de uma ou mais dessas porções pode ter uma substituição, exclusão, adição ou inserção de resíduo de aminoácido. Ou seja, variantes da unidade de repetição podem ser usadas no presente pedido, desde que as variantes mantenham a atividade na promoção da adesão e/ou proliferação celular. Especificamente, uma variante pode ter uma certa porcentagem de identidade, como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade com uma sequência especificada. A sequência especificada pode ser qualquer sequência do presente pedido, como SEQ ID NOs. 1-6, mas é preferível que essas variantes mantenham a sequência central identificada no presente pedido.

[0051] Os polipeptídeos do presente pedido podem ser preparados porquaisquer meios adequados, por exemplo, por síntese. De preferência, o polipeptídeo do presente pedido pode ser preparado por meios recombinantes.

[0052] O polipeptídeo, ácido nucleico, vetor e/ou célula hospedeira dopresente pedido podem ser preparados em uma composição ou um kit. A composição ou kit pode compreender um ou mais dentre curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, materiais de stent cardiovascular, materiais de revestimento, materiais de injeção e preenchimento de tecidos, materiais oftálmicos, materiais biológicos de ginecologia e obstetrícia, materiais de reparo e regeneração de nervos, materiais de tecido hepático e materiais de reparo e regeneração vascular, biomateriais de órgãos artificiais para impressão 3D, matérias-primas cosméticas, materiais auxiliares medicinais e aditivos alimentares. A composição pode ser um ou mais dentre curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, materiais de stent cardiovascular, materiais de revestimento, materiais de injeção e preenchimento de tecidos, materiais oftálmicos, materiais biológicos de ginecologia e obstetrícia, materiais de reparo e regeneração de nervos, materiais de tecido hepático e materiais de reparo e regeneração vascular, biomateriais de órgãos artificiais para impressão 3D, matérias-primas cosméticas, materiais auxiliares medicinais e aditivos alimentares. A composição ou kit pode ser usado para promover a adesão ou proliferação celular in vitro ou in vivo.

[0053] O presente pedido descreve um processo específico de triagemda região funcional e processo de síntese do colágeno humanizado tipo VII recombinante, que pode ser usado como preparação de material estrutural do corpo humano. O presente pedido pertence ao campo da biotecnologia sintética. O método biossintético para preparar colágeno humanizado tipo ^ recombinante no presente pedido compreende os seguintes processos específicos: (1) triagem da região funcional e construção de cepa; (2) fermentação biológica, indução e expressão; (3) purificação e digestão enzimática opcional do colágeno tipo VII humanizado. A sequência de aminoácidos do colágeno humanizado recombinante preparado no presente pedido é derivada da região funcional do colágeno humano natural tipo VII e compreende a região funcional e uma região funcional semelhante, e proteínas com sequência de aminoácidos mutada e modificada, respectivamente. O colágeno humanizado recombinante tipo VII preparado no pedido tem uma alta atividade de promoção de adesão celular ou atividade de promoção de proliferação celular e não produz uma resposta imune quando aplicado ao corpo humano. O método de preparação do colágeno humanizado tipo VII recombinante é novo. O colágeno humanizado recombinante tipo VII pode ser obtido em larga escala e é amplamente aplicado na preparação de materiais estruturais humanos. Os campos de aplicação incluem a preparação de dispositivos médicos de ponta, como curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, injeção e preenchimento de tecidos, reparo e regeneração da pele, reparo e regeneração da mucosa bucal, reparo e regeneração da mucosa cervical, materiais biológicos para ginecologia e obstetrícia, materiais biológicos de órgãos artificiais para impressão 3D; matérias-primas cosméticas de ponta e materiais auxiliares medicinais de ponta; e aditivos alimentares e similares.

Exemplos

[0054] Os exemplos a seguir são providos para ilustrar o presentepedido. Os versados na técnica devem entender que os exemplos são apenas ilustrativos, mas não limitantes. O presente pedido é limitado apenas pelo escopo das reivindicações anexas.

Exemplo 1: Construção e expressão do colágeno humanizado tipo VII recombinante

[0055] Foi realizada uma triagem de regiões funcionais em largaescala para obter os seguintes segmentos de genes alvo diferentes do colágeno humanizado tipo VII recombinante:(1) a sequência de aminoácidos do colágeno tipo VII humanizado recombinante C7P7 (SEQ ID N° 4):GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEP;(2) a sequência de aminoácidos do colágeno tipo VII humanizado recombinante C7P11 (SEQ ID N° 5):GLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGK PGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAP GLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGA SGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAP GLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGA SGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAPGLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGA SGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAP;(3) a sequência de aminoácidos do colágeno tipo VII humanizado recombinante C7P12 (SEQ ID N° 6):GEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQKG APGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQ KGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGED GQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPG EDGQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGD PGEDGQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEP GDPGEDGQKGAPGPKGFKGDP;(4) a sequência de base do colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P7 é (SEQ ID N° 7):GGATTTCCCGGGGTCCCGGGAGGCACCGGCCCTAAA GGCGATCGTGGTGAAACCGGCAGCAAGGGCGAGCAGGGTCTGCCG GGCGAGCGCGGTTTGAGAGGCGAACCGGGTTTTCCAGGCGTGCCG GGCGGTACGGGTCCGAAGGGTGACCGTGGCGAAACCGGCAGCAA GGGTGAACAAGGTTTACCGGGTGAACGCGGTCTGCGTGGTGAGCC GGGCTTCCCAGGTGTTCCGGGCGGAACCGGTCCTAAAGGTGATCG TGGCGAAACCGGTTCCAAAGGCGAACAAGGTCTTCCGGGTGAGCG CGGTCTGCGTGGCGAACCGGGTTTCCCGGGCGTGCCGGGAGGCAC CGGCCCAAAGGGCGACCGCGGAGAAACCGGCAGCAAAGGCGAGC AGGGCCTGCCGGGTGAACGTGGCCTGCGTGGTGAGCCGGGATTCC CGGGTGTTCCGGGCGGCACCGGTCCGAAAGGTGATCGTGGTGAAA CCGGTAGCAAGGGTGAACAGGGTCTGCCGGGCGAGCGCGGCTTGA GAGGTGAGCCTGGTTTTCCGGGGGTGCCCGGCGGTACGGGCCCGA AAGGCGACCGTGGCGAAACCGGTTCTAAGGGTGAGCAGGGTCTGC CGGGTGAGCGTGGTCTGCGCGGTGAGCCGGGTTTCCCGGGCGTTC CGGGTGGCACTGGTCCGAAGGGCGACCGTGGCGAGACTGGCTCGA AAGGTGAACAGGGTTTGCCGGGTGAGCGTGGTCTGCGTGGTGAGC CGGGTTTTCCGGGCGTGCCGGGTGGCACGGGCCCAAAAGGCGATC GTGGTGAGACCGGTTCCAAGGGCGAGCAAGGTCTGCCGGGCGAGC GCGGTCTCCGCGGTGAACCG;(5) a sequência de base do colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P11 é (SEQ ID N° 8):GGACTAACAGGGCCGACCGGTGCGGTCGGCCTGCCG GGACCACCGGGCCCCAGCGGTCTGGTTGGTCCTCAGGGTTCCCCG GGTCTTCCGGGCCAGGTTGGTGAGACAGGCAAGCCGGGTGCGCCG GGCCGTGACGGTGCCTCTGGTAAAGACGGCGATCGTGGTTCGCCG GGCGTTCCGGGTTCGCCGGGTCTGCCGGGTCCGGTCGGTCCGAAA GGTGAACCGGGGCCCACTGGTGCGCCAGGCTTGACCGGTCCGACC GGTGCGGTTGGCCTCCCGGGCCCACCGGGACCGAGCGGTCTGGTT GGCCCACAAGGTTCCCCGGGCTTACCGGGCCAGGTTGGAGAAACC GGTAAGCCGGGTGCACCGGGGCGCGACGGCGCAAGCGGTAAGGA CGGCGACCGCGGTAGCCCGGGCGTGCCGGGTAGCCCGGGCCTGCC GGGCCCGGTGGGCCCCAAGGGTGAGCCGGGACCGACCGGCGCTCC GGGGTTGACCGGTCCAACGGGCGCTGTGGGCCTGCCGGGTCCACC GGGTCCGAGCGGTCTGGTTGGCCCGCAGGGTAGCCCGGGTCTGCC GGGCCAAGTTGGTGAAACCGGTAAACCGGGAGCACCAGGCCGTGA TGGTGCCTCCGGTAAGGACGGCGATCGCGGTTCTCCGGGCGTCCC GGGCTCCCCGGGTCTGCCGGGCCCGGTGGGTCCGAAAGGTGAGCC GGGCCCGACGGGCGCGCCGGGCTTGACCGGCCCGACGGGTGCTGT GGGTCTGCCGGGCCCTCCGGGTCCAAGCGGTCTGGTGGGCCCTCA AGGTTCTCCGGGTCTGCCGGGACAGGTGGGCGAAACCGGTAAGCC GGGTGCGCCAGGTCGTGATGGCGCGAGCGGCAAAGATGGTGATCG TGGCAGTCCGGGGGTGCCGGGCAGCCCGGGCTTGCCGGGTCCAGT AGGTCCGAAAGGCGAGCCGGGCCCGACCGGCGCGCCT;(6) a sequência de base do colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P12 é (SEQ ID N° 9):GGAGAACCCGGGGCGAAGGGCGACCGCGGTCTGCCG GGTCCGCGTGGTGAAAAAGGTGAGGCGGGCCGCGCAGGCGAACC GGGTGACCCGGGCGAGGATGGTCAGAAAGGCGCGCCAGGTCCGA AAGGTTTTAAAGGCGATCCGGGCGAACCGGGTGCCAAGGGCGATA GAGGTCTGCCGGGTCCGCGTGGCGAAAAGGGTGAAGCGGGTCGTG CGGGTGAACCGGGTGACCCGGGCGAGGACGGTCAGAAGGGCGCG CCAGGTCCGAAAGGCTTCAAAGGTGACCCGGGTGAACCGGGCGCG AAAGGCGACCGTGGTTTACCGGGTCCGCGTGGTGAGAAGGGGGAG GCTGGTCGTGCCGGTGAACCGGGCGACCCAGGCGAGGATGGTCAG AAAGGCGCGCCTGGTCCCAAGGGCTTCAAGGGCGACCCGGGTGAA CCGGGTGCCAAAGGGGATCGCGGTTTGCCAGGTCCTCGCGGTGAA AAGGGCGAGGCTGGTCGCGCTGGTGAGCCGGGCGACCCGGGTGAA GATGGTCAAAAAGGCGCTCCGGGTCCGAAGGGTTTTAAAGGTGAT CCGGGCGAGCCGGGTGCGAAGGGCGATCGTGGCCTGCCGGGCCCA CGTGGTGAGAAAGGCGAGGCCGGTCGTGCAGGCGAACCGGGTGA CCCCGGCGAAGATGGCCAAAAGGGTGCGCCTGGCCCGAAGGGATT CAAAGGCGATCCGGGTGAGCCGGGCGCGAAAGGCGACCGCGGCC TGCCGGGTCCGCGTGGTGAGAAGGGCGAGGCAGGCCGTGCAGGTG AACCGGGTGACCCGGGTGAGGATGGTCAAAAAGGTGCTCCGGGTC CGAAGGGCTTTAAGGGCGACCCG.

[0056] 2. O segmento do gene sintetizado foi inserido em um vetor deexpressão pET-28a-Trx-His para obter um plasmídeo de expressão recombinante.

[0057] 3. O plasmídeo de expressão construído com sucesso foitransformado nas células competentes de E. coli BL21 (DE3). Os processos específicos foram os seguintes. (1) As células E. coli competentes BL21(DE3) em um refrigerador de temperatura ultrabaixa foram retiradas e colocadas no gelo; 2 μl do plasmídeo a ser transformado foi adicionado às células E. coli competentes BL21(DE3) quando meio derretidas e misturadas levemente por 2-3 vezes. (2) A mistura foi colocada no gelo por um banho de gelo de 30 min, depois submetida a choque térmico em banho-maria a 42°C por 45-90 segundos e retirada, seguida de colocada no gelo por um banho de gelo de 2 min. (3) A mistura foi transferida para uma cabine de biossegurança e adicionada de 700μl de meio de cultura líquido LB, depois cultivada a 37°C, 220 rpm por 60 min. (4) 200 μl de líquido bacteriano foram coletados e espalhados uniformemente em uma placa LB contendo sulfato de canamicina. (5) A placa foi cultivada em uma incubadora a 37°C por 15-17 h até que colônias de tamanho uniforme crescessem.

[0058] 4. 5 a 6 colônias individuais foram coletadas da placa LBtransformada para frascos de agitação contendo solução estoque de antibiótico (sulfato de canamicina) e colocadas em um agitador de temperatura constante a 220 rpm e 37°C por 7h. Em seguida, os frascos de agitação cultivados foram resfriados a 16°C e adicionados com IPTG para induzir a expressão por um período de tempo. Em seguida, foram coletadas amostras para detecção por eletroforese (conforme mostrado pelas faixas “Líquido bacteriano” nas Figuras 1 a 3), e o líquido bacteriano foi dividido em frascos de centrífuga e centrifugado a 8.000 rpm e 4°C por 10 minutos. Em seguida, as células bacterianas foram coletadas e o peso das células bacterianas foi registrado.

[0059] 5. As células bacterianas coletadas foram ressuspensas em umtampão de trabalho balanceado, e o líquido bacteriano foi resfriado a <15°C e homogeneizado por homogeneização de alta pressão duas vezes. Após a conclusão, o líquido bacteriano foi coletado (conforme mostrado pelas faixas “Homogeneização” nas Figuras 1 a 3). O líquido bacteriano homogeneizado foi distribuído em frascos de centrífuga e centrifugado a 17.000 rpm e 4°C por 30 minutos. O sobrenadante foi coletado, e o sobrenadante e o precipitado foram levados para detecção por eletroforese (conforme mostrado pelas faixas “Sobrenadante” e “Precipitado” nas Figuras 1 a 3).

[0060] 6. O colágeno tipo VII humanizado recombinante foipurificado e digerido enzimaticamente. Os processos específicos foram os seguintes. (1) Purificação grosseira: a. lavar o material da coluna com água; b. equilibrar o material da coluna com tampão de equilíbrio (200 mM de cloreto de sódio, 25 mM de Tris, 20 mM de imidazol); c. carregar a amostra: adicionar o sobrenadante centrifugado à coluna até que o líquido tenha drenado completamente, e o fluxo contínuo foi levado para teste de eletroforese (conforme mostrado pelas faixas “Fluxo Contínuo” nas Figuras 1 a 3); d. lavar proteínas impuras: adicionar 25 mL de tampão de lavagem (200 mM de cloreto de sódio, 25 mM de Tris, 20 mM de imidazol) até que o líquido fosse completamente drenado, e o fluxo contínuo de lavagem de impurezas foi levado para teste de eletroforese (conforme mostrado pelas faixas “Lavagem de impurezas” nas Figuras 1 a 3); e. coletar a proteína alvo: adicionar 20 mL de tampão de eluição (200 mM de cloreto de sódio, 25 mM de Tris, 250 mM de imidazol) e coletar o fluxo contínuo, depois detectar a concentração de proteína usando espectrofotometria no ultravioleta visível com cálculo da concentração de proteína de acordo com a seguinte fórmula (C (mg/ml) = dobra de diluição A280x x coeficiente de extinção); e conduzir uma detecção por eletroforese (conforme mostrado pelas faixas “Eluição” nas Figuras 1 a 3); f. lavar a coluna com tampão de trabalho de imidazol a 1M (conforme mostrado pelas faixas “Lavagem a 1M” nas Figuras 1 a 3). E g. lavar o material da coluna com água purificada. (2) Digestão enzimática (conforme mostrado nas faixas “Após a digestão enzimática” nas Figuras 1 a 3): adicionar a enzima TEV na razão de 20:1 da quantidade total de proteínas para a quantidade total de enzimas TEV para digestão enzimática a 16°C por 2 horas, para obter a proteína alvo, e amostrar para detecção por eletroforese. A solução da proteína digerida enzimaticamente foi colocada em uma bolsa de diálise, dialisada a 4°C por 2 horas e então transferida para um novo dialisado para diálise a 4°C durante a noite. (3) Purificação fina: a. equilibrar o material da coluna: equilibrar o material da coluna usando tampão A (20 mM de Tris, 20 mM de cloreto de sódio) com uma vazão de 10 ml/minuto; b. carregar a amostra: carregar a amostra e coletar o fluxo contínuo com uma vazão de 5 ml/minuto, obter o colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P7, C7P11 e C7P12 e realizar a detecção por eletroforese. A faixa 6 da Figura 1 mostra o peso molecular aparente do colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P7, que é geralmente consistente com o peso molecular previsto de 27,8 kDa. As faixas 3 e 4 da Figura 2 mostram o peso molecular aparente do colágeno humanizado tipo VII recombinante C7P11, que é geralmente consistente com o peso molecular previsto de 28,5 kDa. A faixa 26 da Figura 3 mostra o peso molecular aparente do colágeno humanizado VII recombinante C7P12, que é geralmente consistente com o peso molecular previsto de 27,5 kDa. Para confirmar adicionalmente a identidade dos C7P7, C7P11 e C7P12 isolados, os inventores realizaram a detecção por espectrometria de massa do colágeno humanizado recombinante tipo VII no Exemplo 3.

Exemplo 2: Detecção da atividade do colágeno humanizado recombinante tipo VII na promoção da proliferação celular

[0061] O método para detectar a atividade do colágeno na promoçãoda proliferação celular pode se referir ao padrão da indústria farmacêutica da República Popular da China YYT 1849-2022 para colágeno recombinante. O método de implementação específico foi o seguinte.

[0062] (1) O princípio do método é que: O reagente CCK8 contémWST-8 [nome químico: [sal monossódico de benzeno do ácido 2-(2-metoxi- 4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-dissulfônico)-2H-tetrazol], que é reduzido a um produto de formazana amarela altamente solúvel em água (corante de formazana) pela desidrogenase nas células sob a ação do transportador de elétrons 1-metoxi-5-metilfenazínio dimetil sulfato (1-metoxi PMS). A quantidade de formazana gerada é diretamente proporcional ao número de células vivas. Portanto, essa característica pode ser usada para realizar análises de proliferação celular e toxicidade diretamente.

[0063] (2) Agrupamento experimental: meio completo de DMEM foiusado como controle negativo, NaCl 8% foram usados como controle positivo, solução de colágeno (solução em NaCl a 8%) foi usada como amostra de teste e meio de cultura completo sem células foi usado como poço de zeragem.

[0064] (3) Preparação da amostra: o colágeno foi dissolvido no meiocompleto até a concentração mais alta, filtrado e esterilizado com uma membrana de filtro microporosa de 0,22 μm e preparado a cada concentração. NaCl foi dissolvido no meio completo até uma concentração final de 8%, filtrado e esterilizado.

[0065] (4) Plaqueamento de células: a digestão com tripsina e acontagem foram realizadas quando a confluência das células NIH 3T3 estava em torno de 90%. As células foram plaqueadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de (5-10)*103 células por poço, e os poços das bordas foram selados pela adição de 100 μL de PBS. As células foram cultivadas por 24h para adesão.

[0066] (5) Aplicação em células: o sobrenadante foi aspirado edescartado após a adesão celular, e as soluções dos respectivos grupos foram substituídas por 4 poços de replicação por grupo. A cultura foi cultivada por 48h.

[0067] (6) Detecção experimental: o meio de cultura foi descartado e100 μL (incluindo 5 μL de solução CCK8) de meio de cultura basal foram adicionados. A cultura foi incubada em uma incubadora por 1 a 2h e detectada a um comprimento de onda de 450 usando um leitor de ensaio imunoabsorvente. A fórmula para calcular a viabilidade celular foi a seguinte.

[0068] Viabilidade celular = {(As-Ab)/(Ac-Ab)} x 100%. Em que, Asera a absorbância do poço de teste de colágeno recombinante, Ab era a absorbância do poço de zeragem, e Ac era a absorbância do poço negativo.

[0069] A Figura 4 mostra um gráfico do efeito pró-proliferação docolágeno humanizado recombinante tipo VII C7P7. A Figura 5 mostra um gráfico do efeito pró-proliferação do colágeno humanizado recombinante tipo VII C7P11. A Figura 6 mostra um gráfico do efeito pró-proliferação do colágeno humanizado recombinante tipo VII C7P12. Como mostrado nas Figuras 4 a 6, a viabilidade celular do grupo de controle positivo foi zero em comparação com o grupo de controle negativo, com diferença estatisticamente significativa. C7P7 apresentou um efeito pró-proliferação significativo a 12 mg/ml, enquanto C7P11 e C7P12 não tiveram efeito promotor na proliferação celular. Inesperadamente, os inventores verificaram que C7P7 pode promover a proliferação celular em comparação com C7P11 e C7P12, conforme evidenciado pelo aumento da viabilidade celular (vide Tabela 1).Tabela 1: Viabilidade cellularExemplo 3: Detecção por espectrometria de massa do colágeno humanizado tipo VII recombinanteMétodo experimental

[0070] Após a redução com DTT e alquilação com iodoacetamida, aamostra de proteína foi digerida enzimaticamente durante a noite com tripsina. Os segmentos peptídicos obtidos após a digestão enzimática foram dessalinizados por C18ZipTip, misturados com a matriz ácido α-ciano-4- hidroxicinâmico (CHCA) e manchado em placas. Finalmente, a análise foi realizada usando o espectrômetro de massas de ionização por dessorção a laser assistido por matriz-tempo de voo MALDI-TOF/TOF UlraflextremeTM, Brucker, Alemanha (a tecnologia de impressão digital de peptídeos referida em Protein J.2016;35:212-7). A recuperação de dados foi realizada pela página MS/MS Ion Search no site local da masco. Os resultados da identificação das proteínas foram obtidos com base na espectrometria de massa primária dos segmentos peptídicos resultantes da digestão enzimática. Parâmetro: A digestão de tripsina foi detectada e dois locais de clivagem ausentes foram definidos. A alquilação da cisteína foi definida como uma modificação fixa. A oxidação da metionina foi definida como uma modificação variável. O banco de dados usado para identificação foi o NCBprot.Tabela 2: Peso molecular detectado por espectrometria de massa e peptídeos correspondentes para C7P7

[0071] GFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQ GLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGE PGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTG PKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGFPGVPGGTGPKGDRGETGSK GEQGLPGERGLRGEP (SEQ ID N° 21)A taxa de cobertura dos segmentos polipeptídicos detectados foi de 97,91% em comparação com a sequência teórica, portanto os resultados da detecção foram muito confiáveis.Tabela 3: Peso molecular detectado por espectrometria de massa e peptídeos correspondentes para C7P11

[0072] GLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAPGLTG PTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGASGKD GDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAPGLTGPTGAVGLPGPPGPS GLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGL PGPVGPKGEPGPTGAPGLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQ VGETGKPGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAP (SEQ ID N° 28)A taxa de cobertura dos segmentos polipeptídicos detectados foi de 100% em comparação com a sequência teórica, portanto os resultados da detecção foram muito confiáveis. Tabela 4: Peso molecular detectado por espectrometria de massa e peptídeos correspondentes para C7P13

[0073] GEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQ KGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGED GQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPG EDGQKGAPGPKGFKGDPGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGD PGEDGQKGAPGPKGFKGDPGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQKGAPGPK GFKGDP (SEQ ID N° 35)A taxa de cobertura dos segmentos polipeptídicos detectados foi de 93,75% em comparação com a sequência teórica, portanto os resultados da detecção foram muito confiáveis.

[0074] Os exemplos acima são modalidades preferidas do presentepedido, mas as modalidades do presente pedido não são limitadas pelos exemplos acima. Quaisquer outras alterações, modificações, substituições, combinações ou simplificações que não se afastem do espírito e dos princípios do presente pedido serão substituições equivalentes e serão abrangidas pelo escopo de proteção do presente pedido.

Claims (21)

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é SEQ ID N° 4.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um colágeno humanizado do tipo VII recombinante.

3. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, em que a sequência nucleotídica consiste na sequência nucleotídica da SEQ ID N° 7.

4. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência nucleotídica que codifica uma etiqueta de purificação.

5. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etiqueta de purificação é uma etiqueta His, uma etiqueta GST, uma etiqueta MBP, uma etiqueta SUMO ou uma etiqueta NusA.

6. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência líder.

7. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6.

8. Vetor de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um elemento de controle de expressão operavelmente ligado ao ácido nucleico.

9. Vetor de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle de expressão é um promotor, um terminador, e/ou um intensificador.

10. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6 ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que a célula hospedeira é uma célula eucariótica ou uma célula procariótica e a célula eucariótica é uma célula de levedura.

11. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a célula procariótica é uma célula de ESCHERICHIA COLI.

12. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a Escherichia coli é E. coli BL21.

13. Método para produzir o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende:(1) cultivar a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 12 sob uma condição de cultura apropriada;(2) colher as células hospedeiras e/ou o meio de cultura que compreende o polipeptídeo; e(3) purificar o polipeptídeo.

14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6, o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9 e/ou a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 12.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição é um ou mais dentre curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, materiais de stent cardiovascular, materiais de revestimento, materiais de injeção e preenchimento de tecido, materiais oftálmicos, materiais biológicos de ginecologia e obstetrícia, materiais de reparo e regeneração de nervos, materiais de tecido hepático e materiais de reparo e regeneração vascular, biomateriais de órgãos artificiais para impressão 3D, matérias-primas cosméticas, materiais auxiliares medicinais e aditivos alimentares.

16. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser na promoção da adesão celular ou promoção da proliferação celular IN VITRO ou na fabricação de um produto ou kit para promover a adesão celular ou promover a proliferação celular.

17. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de dispositivos médicos de ponta, materiais auxiliares medicinais, matérias-primas cosméticas de ponta ou aditivos alimentares.

18. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de curativos biológicos, materiais biomiméticos do corpo humano, materiais para cirurgia plástica e estética, materiais de cultura organoide, stent cardiovascular, revestimento, materiais de injeção e preenchimento de tecidos, materiais oftálmicos, materiais biológicos de ginecologia e obstetrícia, materiais para reparo e regeneração de nervos, materiais do tecido hepático e materiais para reparo e regeneração vascular, materiais biológicos de órgãos artificiais para impressão 3D.

19. Método para promover a proliferação de uma célula IN vitro, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a célula em contato com o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula animal.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a célula animal é uma célula de mamífero.