BR112024022558B1 - Polipeptídeo, polinucleotídeo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o polipeptídeo, composição, e, método in vitro para aumentar adesão celular - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, E, COMPOSIÇÃO. Um colágeno e seus do mesmo são providos. O colágeno inclui uma sequência N-terminal e uma sequência C-terminal, em que a sequência N-terminal inclui uma ou mais unidades de repetição, e a unidade de repetição inclui uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO. 15. O colágeno humanizado tipo recombinante II preparado pela presente invenção tem alta atividade na promoção da adesão celular, não produz uma resposta imune quando aplicado ao corpo humano, pode ser obtido em larga escala e espera-se que seja amplamente usado no campo de reparo de cartilagem.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício prioritário do Pedido dePatente Chinês n° 202310537499.9, protocolado em 12 de maio de 2023, intitulado “POLIPEPTÍDEO E USO DO MESMO”. O conteúdo do pedido acima mencionado é aqui incorporado por referência.

Campo Técnico

[002] A presente descrição pertence ao campo da biotecnologiasintética e se refere especificamente a materiais estruturais do corpo humano e métodos de preparação biossintética dos mesmos.

Fundamentos da Invenção

[003] O colágeno é um tipo de proteína amplamente distribuída notecido conjuntivo humano e também é a proteína mais abundante no corpo humano, respondendo por 25% a 35% da proteína total. Foi verificado que existem pelo menos 28 subtipos de colágeno no corpo humano, que estão localizados em diferentes tecidos e órgãos.

[004] O colágeno tipo II, uma proteína de alto peso molecular, éencontrado principalmente no tecido cartilaginoso, no corpo vítreo e na córnea, cuja fibra filamentosa de colágeno é entrelaçada com elastina e proteínas polissacarídicas para formar uma estrutura de rede, também conhecida como colágeno ósseo complexo. O colágeno tipo II é um componente essencial para a formação da cartilagem e do osso, para o crescimento ósseo e para a manutenção da cartilagem madura, portanto, o colágeno não desnaturado pode ser usado como um componente estrutural e funcional da cartilagem.

[005] O colágeno tipo II, como o principal componente da matriz da cartilagem articular, juntamente com componentes lubrificantes, tais como ácido hialurônico e proteoglicanos, protege a cartilagem do desgaste. Com o aumento da idade, a taxa de síntese do colágeno diminui gradualmente, a perda de colágeno se intensifica, a cartilagem articular se degenera e o atrito entre os ossos se intensifica, o que pode desencadear inflamação nas articulações. Atualmente, o método de tratamento comum para osteoartrite é o consumo de colágeno, mas sua taxa de utilização de proteína é baixa, resultando em regeneração lenta da cartilagem, o que não é benéfico para a recuperação do paciente e afeta o processo e a eficiência do tratamento. Devido à eficácia insatisfatória dos métodos de tratamento atuais, os pacientes muitas vezes precisam escolher a substituição artificial da articulação, o que não só é caro, mas também pode levar a complicações catastróficas, tais como trombose pós-operatória e infecção após a substituição, levando à amputação.

[006] No entanto, o material de colágeno usado atualmente comocartilagem é principalmente proveniente da extração de cartilagem animal. A imunogenicidade do colágeno de origem animal não pode ser eliminada, e os processos de remoção e extração de impurezas ainda são relativamente complicados; portanto, é difícil garantir a estrutura de hélice tripla do colágeno e ele não pode ser usado para produção em larga escala.

[007] Ao mesmo tempo, a resposta imune de origem animal tambémé uma razão importante que limita a aplicação de colágeno. Com o crescente crescimento da indústria de colágeno no país, o uso de vias biossintéticas para obtenção de colágeno tem se tornado cada vez mais maduro, especialmente o colágeno humanizado, que tem estado na vanguarda do mundo. Em 2021, a Administração Nacional de Produtos Médicos (National Medical Products Administration) fez uma nomenclatura e classificação do colágeno biossintético, em que o colágeno humanizado recombinante se refere à região funcional da sequência de aminoácidos total ou parcial codificada pelo tipo específico do gene do colágeno humano preparado pela tecnologia de DNA recombinante, ou a combinação das regiões funcionais contendo a função do colágeno humano.

[008] O método tradicional de produção de colágeno é usar hidróliseácida, alcalina e enzimática para processar os tecidos de origem animal e extrair os derivados de colágeno. O colágeno extraído por esses métodos perdeu sua atividade biológica original e, portanto, não pode ser aplicado no campo biomédico para desempenhar um papel real. Com o desenvolvimento da tecnologia moderna, alguns métodos de extração de remoção de impurezas e extração enzimática de cartilagem animal para obter o colágeno tipo II não desnaturado surgiram no país e no exterior. Embora o colágeno preparado por esses métodos possa ser usado para reparo de cartilagem, o tempo para remoção e extração de impurezas é longo, a pureza do produto é baixa, e a estabilidade do produto é baixa, portanto, não é benéfico para produção em larga escala. Dadas as deficiências da tecnologia existente, algumas empresas propuseram usar a Pichia pastoris como uma cepa hospedeira para preparar o colágeno tipo II para reparo de cartilagem. Entretanto, esse colágeno não é colágeno humanizado e, portanto, tem uma certa resposta imunogênica.

[009] Portanto, há uma necessidade urgente de um colágenohumanizado recombinante tipo II que possa ser injetado diretamente no corpo humano e não cause uma resposta imunogênica, para ser usado como um material estrutural do corpo humano aplicado para reparo de cartilagem.

Sumário da Invenção

[0010] Os materiais estruturais do corpo humano são principalmente proteínas estruturais, incluindo o colágeno, que têm estruturas complexas e funções precisas e são de grande importância para o reparo e a regeneração do tecido humano. No entanto, eles não são fáceis de obter usando métodos de produção convencionais. A presente descrição usa tecnologia de biologia sintética e biologia estrutural para desenvolver uma proteína funcional macromolecular que tem a estrutura de hélice tripla do colágeno humano tipo II e pode desempenhar a função do colágeno humano. Os inventores conduziram uma triagem em larga escala de regiões funcionais. A primeira foi a triagem de sequência. A sequência genética repetitiva Gly-X-Y na região helicoidal do colágeno natural tipo II contém um grande número de aminoácidos carregados. Essas cargas se ligam à célula por meio de interações, de modo que as regiões que não contêm esses importantes motivos de carga sejam excluídas. A segunda foi usar métodos de previsão de estrutura de proteínas assistidos por computador para ajudar a selecionar as potenciais regiões funcionais helicoidais que têm mais estruturas de ligações de hidrogênio entre cadeias e podem estabilizar melhor a agregação de trímeros. A terceira foi usar o método de predição baseado nas propriedades de expressão de proteínas para selecionar as regiões funcionais do colágeno humano tipo II com a maior expressão de proteínas, fácil purificação e boa estabilidade. A quarta foi otimizar os fragmentos de aminoácidos dessas regiões conectando-os diretamente por meio de n repetições (as repetições servem para garantir que o peso molecular do colágeno humanizado recombinante tipo II esteja dentro de uma determinada faixa para fácil purificação e estabilidade).

[0011] A presente descrição inclui a triagem de região funcional central, o processo de síntese e os cenários de aplicação do colágeno humanizado recombinante tipo II. A presente descrição desenvolve, pela primeira vez, um processo de triagem de região funcional e síntese de proteína para o colágeno humanizado recombinante tipo II que pode ser injetado diretamente no corpo humano e pode ser usado para reparo de cartilagem.

[0012] A presente descrição é baseada, em parte, nas seguintes verificações inesperadas dos inventores. Comparado com outros colágenos humanizados recombinantes tipo II, o colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A10, tem um nível de expressão mais alto quando expresso de forma recombinante, é mais fácil de separar e purificar e tem um excelente efeito de adesão celular em comparação com o colágeno bovino tipo I.

[0013] Em um aspecto, a presente descrição provê um colágeno ou polipeptídeo compreendendo uma pluralidade de unidades de repetição compreendendo a sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 15 (gtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak) ou a variante da mesma tendo 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com ela, em que cada unidade de repetição está diretamente conectada ou separada por um ou mais resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, a unidade de repetição pode ser uma sequência de aminoácidos obtida por mutação (substituição, inserção, deleção ou adição) de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.

[0014] Em uma modalidade, o número da unidade de repetição é de 1 a 20. Em uma modalidade, o número da unidade de repetição é de 6 a 10. Em uma modalidade, o número da unidade de repetição é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.

[0015] Em uma modalidade, o colágeno ou polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, o colágeno ou polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 10 ou a sequência de aminoácidos obtida por mutação (substituição, inserção, deleção ou adição) de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou 10, ou a variante tendo 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, quando a sequência de colágeno ou polipeptídeo é mutada, o colágeno ou polipeptídeo resultante retém as funções da presente descrição, tais como adesão celular, capacidade de reparo de cartilagem, etc.

[0016] Em um aspecto, a descrição provê um polinucleotídeo que codifica o colágeno ou polipeptídeo aqui descrito.

[0017] Em uma modalidade, o polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 29.

[0018] Em um aspecto, a descrição provê um ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo aqui descrito. Opcionalmente, o ácido nucleico também compreende os nucleotídeos que codificam uma etiqueta de purificação, tal como a etiqueta His, a etiqueta GST, a etiqueta MBP, a etiqueta SUMO ou a etiqueta NusA. Opcionalmente, o ácido nucleico compreende adicionalmente nucleotídeos que codificam uma sequência líder.

[0019] Em um aspecto, a descrição provê um vetor que compreende o polinucleotídeo aqui descrito ou o ácido nucleico aqui descrito.

[0020] Em uma modalidade, o vetor é um vetor de expressão. Em uma modalidade, o vetor compreende um elemento de controle de expressão, tal como um promotor, terminador e/ou intensificador, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo ou ácido nucleico.

[0021] Em um aspecto, a descrição provê uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo descrito aqui, o ácido nucleico descrito aqui ou o vetor descrito aqui. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, fúngica ou animal. Em uma modalidade, a bactéria é E. coli. Em uma modalidade, o fungo é uma levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae.

[0022] Em um aspecto, a descrição provê um método de produção do colágeno ou polipeptídeo aqui descrito, compreendendo:(1) cultivar a célula hospedeira aqui descrita sob condições de cultura apropriadas;(2) colher a célula hospedeira e/ou o meio de cultura contendo o colágeno ou peptídeos; e(3) purificar o colágeno ou peptídeos.

[0023] Em um aspecto, a descrição provê uma composição que compreende o colágeno ou polipeptídeo aqui descrito. Em uma modalidade, a composição é um kit. Em uma modalidade, a composição é um ou mais dentre um curativo biológico, um material biônico humano, um material de cirurgia plástica, um material de cultura organoide, um material de stent cardiovascular, um material de revestimento, um material de enchimento de injeção de tecido, um material oftálmico, um biomaterial de obstetrícia e ginecologia, um material regenerativo de reparo de nervos, um material de tecido hepático e um material de regeneração de reparo de vasos sanguíneos, um biomaterial de órgão artificial impresso em 3D, uma matéria-prima cosmética, um excipiente farmacêutico e um aditivo alimentício. Em uma modalidade, a composição é uma composição injetável ou oral.

[0024] Em uma modalidade, a composição é uma composição para reparo de cartilagem. Em uma modalidade, a composição é uma composição injetável para reparo de cartilagem.

[0025] Em um aspecto, a descrição provê um método para aumentar a adesão celular, compreendendo colocar a célula em contato com o colágeno ou polipeptídeo descrito aqui, o polinucleotídeo descrito aqui, o ácido nucleico descrito aqui, o vetor descrito aqui, a célula hospedeira descrita aqui e/ou a composição descrita aqui.

[0026] Em um aspecto, a descrição provê o uso do colágeno ou polipeptídeo descrito aqui, do polinucleotídeo descrito aqui, do ácido nucleico descrito aqui, do vetor descrito aqui, da célula hospedeira descrita aqui e/ou da composição descrita aqui na fabricação dos kits, que são usados para aumentar a adesão celular ou o reparo de cartilagem. Em um aspecto, a descrição provê o uso do colágeno ou polipeptídeo descrito aqui, do polinucleotídeo descrito aqui, do ácido nucleico descrito aqui, do vetor descrito aqui, da célula hospedeira descrita aqui e/ou da composição descrita aqui em um ou mais dentre um curativo biológico, um material biônico humano, um material de cirurgia plástica, um material de cultura organoide, um material de stent cardiovascular, um material de revestimento, um material de enchimento de injeção de tecido, um material oftálmico, um biomaterial de obstetrícia e ginecologia, um material regenerativo de reparo de nervos, um material de tecido hepático e um material de regeneração de reparo de vasos sanguíneos, um biomaterial de órgão artificial impresso em 3D, uma matéria-prima cosmética, um excipiente farmacêutico e um aditivo alimentício.

[0027] As vantagens da descrição incluem:1. A presente descrição provê a região funcional central e a sequência de aminoácidos do colágeno humanizado recombinante tipo II.

[0028] 2. A presente descrição sintetiza com sucesso o colágenohumanizado recombinante tipo II que pode ser injetado no corpo humano, pela primeira vez, para reparo de cartilagem.

[0029] 3. A composição de aminoácidos do colágeno humanizadorecombinante tipo II produzido é 100% idêntica à parte correspondente da sequência de aminoácidos do colágeno natural e não causará rejeição imunológica ou reações alérgicas quando aplicada ao corpo humano.

[0030] 4. O método de preparação desta descrição é simples e podeproduzir colágeno humanizado recombinante tipo II de alto rendimento em larga escala.

[0031] 5. Em termos de efeitos de expressão, isolamento e purificação,o colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A10, alcança os melhores resultados em comparação com outros colágenos humanizados recombinantes tipo II.

[0032] 6. O colágeno humanizado recombinante tipo II da descriçãotem melhor atividade de bioadesão, ou seja, o colágeno humanizado recombinante tipo II HC2B-A10>colágeno bovino tipo I.

Descrição dos Desenhos

[0033] Figura 1: Purificação bruta dos colágenos humanizados recombinantes tipo II, HC2B-a6 e HC2B-b5;Figura 2: Purificação bruta dos colágenos humanizados recombinantes tipo II, HC2B-b1, HC2B-a3 e HC2B-b3;Figura 3: Purificação dos colágenos humanizados recombinantes tipo II, B3Q, HC2B-A8 e HC2B-A7;Figura 4: Purificação do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A10, e purificação bruta do HC2B-B9;Figura 5: Purificação do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A9;Figura 6: Purificação bruta dos colágenos humanizados recombinantes tipo II, HC2B-B8, HC2B-B7 e HC2B-B10;Figura 7: Purificação fina dos colágenos humanizados recombinantes tipo II, HC2B-B7 e HC2B-B9;Figura 8: Detecção de atividade do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A10;Figura 9: Mapa do vetor de expressão pET-28a-Trx-His.

Descrição Detalhada da Invenção

[0034] A fim de tornar o propósito, as soluções técnicas e as vantagens da presente descrição mais claros, as soluções técnicas nos exemplos da presente descrição serão descritas de forma clara e completa abaixo em combinação com os exemplos da presente descrição. Obviamente, os exemplos descritos são exemplos parciais da presente descrição, e não todos os exemplos. Com base nos exemplos da presente descrição, todos os outros exemplos obtidos por versados comuns na técnica neste campo sem fazer qualquer trabalho criativo se enquadram no escopo de proteção da presente descrição.

[0035] O colágeno recombinante é um novo tipo de material biológico com a mesma sequência de aminoácidos ou similar ao colágeno humano, que é rastreado e preparado usando biologia estrutural de ponta, engenharia genética e outras tecnologias e usando a codificação genética da região funcional de um tipo específico de colágeno humano como um modelo.

[0036] Conforme usado aqui, “polipeptídeo” se refere a uma pluralidade de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Nesta descrição, o colágeno, o colágeno recombinante, o colágeno humanizado recombinante tipo II ou o polipeptídeo podem ser usados de forma intercambiável.

[0037] Nesta descrição, o colágeno ou polipeptídeo pode compreender uma ou mais unidades de repetição compreendendo a sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 15 ou a sequência de aminoácidos após mutação (substituição, adição, inserção ou deleção) de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos. O número da unidade de repetição pode ser de 1 a 20. Por exemplo, o número da unidade de repetição é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Em particular, as mutações podem ser substituições, tais como substituições conservativas de aminoácidos. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 é gtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak. Cada unidade de repetição pode estar diretamente ligada ou separada por um ou mais resíduos de aminoácidos.

[0038] No caso em que a sequência de colágeno ou polipeptídeo sofre mutação ou há uma sequência espaçadora, o colágeno ou polipeptídeo resultante retém as funções da presente descrição, tais como adesão celular, capacidade de reparo de cartilagem, etc.

[0039] O colágeno ou polipeptídeo da descrição pode ser sintético ou pode ser expresso de forma recombinante. No caso de expressão recombinante, o colágeno ou polipeptídeo da descrição pode ser codificado pelo polinucleotídeo. O polinucleotídeo pode ser otimizado por códon para a célula hospedeira na qual a expressão é realizada. O polinucleotídeo que codifica o colágeno ou polipeptídeo pode estar operacionalmente ligado ao elemento de controle de expressão, tal como o promotor, terminador e/ou intensificador, para constituir ácido nucleico ou cassetes de expressão. O ácido nucleico também pode compreender nucleotídeos que codificam uma etiqueta de purificação, tal como uma etiqueta His, uma etiqueta GST, uma etiqueta MBP, uma etiqueta SUMO ou uma etiqueta NusA, ou nucleotídeos que codificam uma sequência líder para facilitar a purificação ou secreção do colágeno ou polipeptídeo.

[0040] Conforme usado aqui, o termo “vetor” é um veículo de ácido nucleico no qual um polinucleotídeo pode ser inserido. Quando um vetor pode expressar a proteína codificada pelo polinucleotídeo inserido, o vetor é chamado de vetor de expressão. O vetor pode ser introduzido na célula hospedeira por transformação, transdução ou transfecção, de modo que os elementos do material genético que ele carrega sejam expressos na célula hospedeira. O vetor é bem conhecido por aqueles versados na técnica e inclui, mas não está limitado a plasmídeos; fagemídeos; cosmídeos; cromossomos artificiais, tais como cromossomos artificiais de levedura (YACs), cromossomos artificiais bacterianos (BACs) ou cromossomos artificiais derivados de P1 (PACs); bacteriófagos, tais como fago À ou fago M13 e vírus animais, etc. O vetor pode conter uma variedade de elementos para controlar a expressão, incluindo, mas não limitado a, sequências promotoras, sequências de iniciação de transcrição, sequências intensificadoras, elementos de seleção e genes repórteres. Além disso, o vetor também pode conter um local de origem de replicação. O vetor pode compreender o ácido nucleico da descrição para fácil introdução na célula para expressão. O vetor pode compreender o elemento de controle de expressão, tal como o promotor, terminador e/ou intensificador, operacionalmente ligado ao dito ácido nucleico.

[0041] Conforme usado aqui, o termo “célula hospedeira” é uma célula na qual as moléculas de ácido nucleico foram introduzidas por técnicas de biologia molecular. Essas técnicas incluem transfecção com um vetor viral, transformação com um vetor plasmídeo e introdução acelerada de DNA nu por eletroporação, lipofecção e pistola de partículas. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica ou uma célula procariótica. A célula eucariótica é, por exemplo, uma célula de levedura, uma célula animal e/ou uma célula de inseto. A célula procariótica pode ser uma célula E. coli.

[0042] A presente descrição também provê um método de produção de colágeno ou polipeptídeo, compreendendo: (1) cultivar a célula hospedeira aqui sob condições de cultura adequadas; (2) colher a célula hospedeira e/ou meio de cultura compreendendo o colágeno ou polipeptídeo; e (3) purificar o colágeno ou polipeptídeo. O método da presente descrição pode incluir a etapa de clivar enzimaticamente a etiqueta.

[0043] O colágeno ou polipeptídeo da presente descrição pode ser preparado como uma composição ou kit. A composição ou kit pode ser uma composição ou kit para enchimento e/ou expansão de tecido. A composição ou kit também pode compreender substâncias auxiliares. A composição da presente descrição pode ser um agente de reparo de cartilagem compreendendo o colágeno ou polipeptídeo aqui descrito. A composição da descrição pode ser injetável. A composição da presente descrição pode ser um material estrutural do corpo humano, por exemplo, pode ser usada para reparo de cartilagem e não causa uma resposta imune no corpo humano.

[0044] Conforme usado aqui, o grau de relacionamento entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrito pelo parâmetro “identidade de sequência”. Para os propósitos desta descrição, a identidade de sequência entre dois aminoácidos é determinada pelo Algoritmo Needleman-Wunsch implementado pelo programa Needle (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) do pacote de software EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (versão 5.0.0 ou posterior preferida). Os parâmetros usados são a penalidade por abertura de lacuna de 10, a penalidade por extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS do BLOSUM62). A saída de Needle rotulada “Identidade Mais Longa” (obtida usando a opção não simplificada) foi usada como identidade percentual e calculada da seguinte forma:(resíduos idênticos x 100)/(comprimento do alinhamento - número total de lacunas no alinhamento)

[0045] Para os propósitos desta descrição, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxinucleotídeos é determinada pelo Algoritmo Needleman-Wunsch implementado pelo programa Needle (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) do pacote de software EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al,2000, Trends Genet. 16: 276-277) (versão 5.0.0 ou posterior preferida). Os parâmetros usados são a penalidade por abertura de lacuna de 10, a penalidade por extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUC4.4). A saída de Needle rotulada “Identidade Mais Longa” (obtida usando a opção não simplificada) foi usada como identidade percentual e calculada da seguinte forma:(desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(comprimento do alinhamento - número total de lacunas no alinhamento)

[0046] Aqui, a unidade de repetição do colágeno ou polipeptídeo da presente descrição, ou o colágeno ou polipeptídeo, pode conter certas mutações. Por exemplo, uma ou mais sequências de aminoácidos dessas partes podem conter uma substituição, deleção, adição ou inserção de resíduos de aminoácidos. No contexto de mutações de aminoácidos, a “pluralidade” pode ser de 2 a 40, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39, ou qualquer faixa de valores entre eles.

[0047] Ou seja, a presente descrição pode usar variantes de unidades de repetição, desde que a variante retenha a atividade de promover a adesão celular. Em particular, as variantes podem ter uma certa porcentagem de identidade com uma sequência especificada (qualquer uma das sequências de colágeno ou polipeptídeo descritas aqui), tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade. A sequência designada pode ser qualquer sequência da descrição, tal como SEQ ID Nos: 1-16, mas é preferível que essas variantes mantenham a função pretendida, tal como aumentar a adesão celular ou o reparo de cartilagem.

Métodos da Presente Descrição

[0048] Tendo em vista o status atual da pesquisa, a presente descrição provê um método para biossintetizar colágeno humanizado recombinante tipo II, ou seja, um método para preparar materiais estruturais do corpo humano. O método pode incluir uma ou mais das seguintes etapas: (1) triagem de regiões funcionais e construção de cepas bacterianas; (2) cultura de fermentação biológica em larga escala e expressão induzida de proteínas; (3) purificação do colágeno humanizado tipo II e clivagem enzimática opcional.

[0049] A triagem de regiões funcionais e a construção de cepas bacterianas podem ser realizadas da seguinte forma: (1) realizar triagem de região funcional em larga escala para obter a região funcional do gene alvo; (2) inserir a região funcional obtida do gene alvo no vetor de expressão PET-28a-Trx-His para obter um plasmídeo de expressão recombinante; (3) transferir o plasmídeo de expressão recombinante para a célula competente de E. coli BL21 (DE3) para rastrear e obter bactérias E. coli positivas geneticamente engenheiradas.

[0050] A fermentação biológica em larga escala pode ser realizada da seguinte forma: as bactérias E. coli positivas geneticamente engenheiradas obtidas por triagem são adicionadas a um frasco de agitação contendo uma solução estoque de antibiótico e cultivadas em um agitador de temperatura constante a 220 rpm e 37 °C.

[0051] A expressão induzida da proteína pode ser realizada da seguinte forma: (1) resfriar o frasco de agitação após a cultura a 16-30°C; (2) adicionar solução mãe IPTG para induzir a expressão; (3) colocar a solução bacteriana após a indução da expressão em um frasco de centrífuga, centrifugando a 6000 rpm e 4°C por 12 min antes de coletar as bactérias.

[0052] A purificação do colágeno humanizado tipo II e a clivagem enzimática opcional podem ser realizadas da seguinte forma: (1) purificação bruta do colágeno humanizado tipo II em uma coluna de cromatografia de afinidade por Ni; (2) adição da enzima TEV para clivagem enzimática em uma determinada razão; (3) purificação fina do colágeno humanizado tipo II em uma coluna de troca iônica.

[0053] As regiões funcionais rastreadas são as seguintes: (1) a sequência de aminoácidos de HC2B-a3:gkpgddgeagkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgeagapgvkgesgsp gengspgpmgprglpgergrtgpagaagargndgqp (SEQ ID NO: 1); (2) a sequência de aminoácidos de HC2B-a6:gkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrg kpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgk pgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgkp gkagerg (SEQ ID NO: 2); (3) a sequência de aminoácidos de HC2B-b1: gepgregspgadgppgrdgaagvkgdrgetgavgapgapgppgspgpagptgkqgdrgeagaqgpm gpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgp pgpvgpsgkdgangipgpigppgprgrsgetgpa (SEQ ID NO: 3); (4) a sequência de aminoácidos de HC2B- b3:gspgpagptgkqgdrgeagaqgpmgpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqgl pgppgpsgdqgasgpagpsgpr (SEQ ID NO: 4); (5) a sequência de aminoácidos de HC2B-b5: gargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepger glkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgarg iqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepgerglkg hrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgargiqgp qgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgft glqglpgppgps (SEQ ID NO: 5); (6) a sequência de aminoácidos de B3Q: gspgpagptgkqgdrgeagaqgpmgpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqgl pgppgpsgdqgasgpagpsgprgspgpagptgkqgdrgeagaqgpmgpsgpagargiqgpqgprgd kgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgspgpagptgkqgdrgeagaqg pmgpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgpr gspgpagptgkqgdrgeagaqgpmgpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqgl pgppgpsgdqgasgpagpsgpr (SEQ ID NO: 6); (7) a sequência de aminoácidos de HC2B-A7:gpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargf pgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpg vkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgyp gldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgp qgargfpgtpglpgvkghrgypgldgak (SEQ ID NO: 7); (8) a sequência de aminoácidos de HC2B-A8:gargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvk ghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgar gfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghr gypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfp gtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgak (SEQ ID NO: 8); (9) a sequência de aminoácidos de HC2B-A9: gfgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgl dgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrg ypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvk ghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglp gvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgak (SEQ ID NO: 9); (10) a sequência de aminoácidos de HC2B -A10: gtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpgl pgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkg hrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgyp gldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldga kgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak (SEQ ID NO: 10); (11) a sequência de aminoácidos de HC2B-B7: gerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasg pagpsgprgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghrgftglqglpgppgp sgdqgasgpagpsgprgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghrgftglq glpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglk ghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgpr (SEQ ID NO: 11); (12) a sequência de aminoácidos de HC2B-B8:gerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerg lkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkgh rgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgft glqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqg lpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpa (SEQ ID NO: 12); (13) a sequência de aminoácidos de HC2B-B9: gerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqgl pgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglk ghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppg psgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgft glqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdq (SEQ ID NO: 13); (14) a sequência de aminoácidos de HC2B-B10:gerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghr gftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpg ppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkg hrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqgl pgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgpp (SEQ ID NO: 14).

[0054] A sequência de aminoácidos do colágeno humanizado recombinante tipo II preparado pela presente descrição pode ser derivada da região funcional do colágeno natural humano tipo II, incluindo esta região funcional e regiões funcionais similares, as proteínas com sequências de aminoácidos mutadas e modificadas.

[0055] O colágeno humanizado recombinante tipo II preparado pela descrição corresponde completamente à sequência de aminoácidos do colágeno humano, de modo que possa ser injetado diretamente no corpo humano para reparo de cartilagem sem produzir a resposta imunogênica.

O Colágeno ou Polipeptídeo da Descrição

[0056] A presente descrição provê o colágeno ou polipeptídeo, que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-14 ou a sequência de aminoácidos da qual o aminoácido foi mutado. Mutações podem ser substituição, adição, deleção ou inserção. Preferivelmente, a substituição pode ser uma substituição retida. O colágeno ou polipeptídeo da descrição pode ser derivado de fragmentos de peptídeo derivados do colágeno humano tipo II. O colágeno ou polipeptídeo da descrição pode compreender uma pluralidade de fragmentos de peptídeos obtidos desta maneira. Os segmentos peptídicos podem estar conectados por meio de um ligante ou diretamente para formar o colágeno ou polipeptídeo da presente descrição. O ligante pode ser um ou mais resíduos de aminoácidos. Por exemplo, o ligante pode ser um ligante flexível comumente usado na técnica.

[0057] A presente descrição provê múltiplas unidades de repetição, conforme mostrado nas sequências de aminoácidos sublinhadas dos exemplos. Em particular, a presente descrição provê a unidade de repetição da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. O colágeno ou polipeptídeo da presente descrição pode conter múltiplas unidades de repetição, tais como de 2 a 30, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29.

Exemplos

[0058] Os exemplos a seguir são providos para ilustrar a invenção. Os versados na técnica devem entender que os exemplos são apenas ilustrativos, mas não restritivos. A invenção é limitada apenas pelo escopo das reivindicações anexas.

Exemplo 1: Construção e expressão do colágeno humanizado recombinante tipo II

[0059] 1. Realização de triagem de regiões funcionais em larga escala.A primeira foi a triagem de sequência. A sequência genética repetitiva Gly-X-Y na região helicoidal do colágeno natural tipo II contém um grande número de aminoácidos carregados. Essas cargas se ligam à célula por meio de interações, de modo que as regiões que não contêm esses importantes motivos de carga sejam excluídas. A segunda foi usar métodos de previsão de estrutura de proteínas assistidos por computador para ajudar a selecionar as potenciais regiões funcionais helicoidais que têm mais estruturas de ligações de hidrogênio entre cadeias e podem estabilizar melhor a agregação de trímeros. A terceira foi usar o método de predição baseado nas propriedades de expressão de proteínas para selecionar as regiões funcionais do colágeno humano tipo II com a maior expressão de proteínas, fácil purificação e boa estabilidade. A quarta foi otimizar os fragmentos de aminoácidos dessas regiões conectando-os diretamente por meio de n repetições (as repetições servem para garantir que o peso molecular do colágeno humanizado recombinante tipo II esteja dentro de uma determinada faixa para fácil purificação e estabilidade); as seguintes regiões funcionais de genes alvo de diferentes colágenos humanizados recombinantes tipo II foram obtidas:(1) a sequência de aminoácidos de HC2B-a3: gkpgddgeagkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgeagapgvkgesgsp gengspgpmgprglpgergrtgpagaagargndgqp (SEQ ID NO:1);(2) a sequência de aminoácidos de HC2B-a6: gkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkgh rgkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrg kpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgkpgkagergppgpqgargfpgtpglpgvkghrgk pgkagerg (SEO ID NO: 2, o sublinhado é a porção de unidade de repetição);(3) a sequência de aminoácidos de HC2B-b1: gepgregspgadgppgrdgaagvkgdrgetgavgapgapgppgspgpagptgkqgdrgeagaqgpm gpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgp pgpvgpsgkdgangipgpigppgprgrsgetgpa (SEQ ID NO: 3);(4) a sequência de aminoácidos de HC2B-b3: gspgpagptgkqgdrgeagaqgpmgpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqgl pgppgpsgdqgasgpagpsgpr (SEQ ID NO: 4);(5) a sequência de aminoácidos de HC2B-b5: gargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagep gerglkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsg argiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepgerg lkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgargi qgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgargiqgpqgprgdkgeagepgerglkgh rgftglqglpgppgps (SEQ ID NO: 5, o sublinhado é a porção de unidade de repetição);(6) a sequência de aminoácidos de B3Q: gspgpagptgkqgdrgeagaqgpmgpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerGlkghrgf tglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgspgpagptgkqgdrgeagaqgpmgpsgpagargiqg pqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgspgpagptgkqgdr geagaqgpmgpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasg pagpsgprgspgpagptgkqgdrgeagaqgpmgpsgpagargiqgpqgprgdkgeagepgerglkgh rgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgpr (SEQ ID NO: 6, o sublinhado é a porção de unidade de repetição);(7) a sequência de aminoácidos de HC2B -A7 :gpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgld gakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqga rgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpgl pgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrg ypgldgakgpqgargfpgtpglpgvkghrgypgldgak (SEQ ID NO: 7, o sublinhado é a porção de unidade de repetição);(8) a sequência de aminoácidos de HC2B-A8: gargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpg vkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgak gargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvk ghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgakgar gfpgtpglpgvkghrgypgldgakgargfpgtpglpgvkghrgypgldgak (SEQ ID NO: 8, o sublinhado é a porção de unidade de repetição);(9) a sequência de aminoácidos de HC2B-A9: gfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgVkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgy pgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkg hrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpg vkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtp glpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgakgfpgtpglpgvkghrgypgldgak (SEQ ID NO: 9, o sublinhado é a porção de unidade de repetição);(10) a sequência de aminoácidos de HC2B-A10: gtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakGtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak Gtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak Gtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak Gtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak Gtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak GtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgakGtpglpgvkghrgypgldgakgtpglpgvkghrgypgldgak (SEQ ID NO: 10);(11) a sequência de aminoácidos de HC2B-B7: gerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghr-gftglqglpgppgpsgdqg asgpagpsgprgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghrgftglqglpgp pgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghrgft glqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgprger glkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagpsgpr (SEQ ID NO: 11, o sublinhado é a porção de unidade de repetição);(12) a sequência de aminoácidos de HC2B-B8: gerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpage rglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglk ghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrg ftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglq glpgppgpsgdqgasgpagerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgasgpa (SEQ ID NO: 12);(13) a sequência de aminoácidos de HC2B-B9: gerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglq glpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerg lkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgpp gpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdqgerglkghrg ftglqglpgppgpsgdqgerglkghrgftglqglpgppgpsgdq (SEQ ID NO: 13);(14) a sequência de aminoácidos de HC2B-B10: gerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgergl kghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghr gftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftgl qglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglp gppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgppgerglkghrgftglqglpgpp (SEQ ID NO: 14).

[0060] 2. A região funcional de gene sintetizado foi inserida no vetorde expressão pET-28a-Trx-His (Figura 9) para obter o plasmídeo de expressão recombinante correspondente.

[0061] 3. O plasmídeo de expressão construído com sucesso foitransformado na célula competente de E. coli BL21 (DE3). O processo específico foi o seguinte: (1) As células competentes de E. coli BL21 (DE3) foram retiradas do refrigerador de temperatura ultrabaixa e colocadas no gelo. Quando as células estavam meio derretidas, 2 μl do plasmídeo a ser transformado foram retirados e adicionados às células competentes de E. coli BL21 (DE3) e misturados levemente 2 a 3 vezes. (2) A mistura foi colocada no gelo por 30 min, depois submetida a choque térmico em banho-maria a 42°C por 45 a 90s e colocada no banho de gelo por 2 min após a remoção. (3) A mistura foi transferida para uma cabine de biossegurança, adicionada de 700 μl de meio LB líquido e então incubada a 37°C e 220 rpm por 60 min. (4) 200 μl da solução bacteriana foram retirados e espalhados uniformemente em uma placa LB contendo sulfato de canamicina (50 mg/L). (5) A placa foi incubada em uma incubadora a 37°C por 15 a 17 h até que colônias de tamanho uniforme crescessem.

[0062] 4. 5 a 6 colônias individuais foram coletadas da placa LBtransformada e colocadas em um frasco de agitação contendo solução estoque de antibiótico (ampicilina, 100 mg/L) e cultivadas em um agitador de temperatura constante a 220 rpm e 37°C por um certo período até que parecessem nebulosas. O frasco de agitação cultivado foi resfriado a 16 a 30 °C, adicionado de IPTG (0,5 mM) para induzir a expressão por um período de tempo antes que a solução bacteriana fosse dispensada em frascos de centrífuga e centrifugada a 6000 rpm e 4 °C por 12 min. As células bacterianas foram coletadas, o peso das células bacterianas foi registrado e as amostras foram retiradas para detecção por eletroforese.

[0063] 5. As bactérias coletadas foram ressuspensas em uma solução de trabalho balanceada (200 mM de cloreto de sódio, 25 mM de Tris, 20 mM de imidazol), a solução bacteriana foi resfriada a <15°C, as células homogeneizadas duas vezes ou rompidas por ultrassom. A solução bacteriana foi coletada após a conclusão. A solução bacteriana após a ruptura celular foi dispensada em frascos de centrífuga, centrifugados a 17.000 rpm e 4°C por 30 min, e o sobrenadante foi coletado.

[0064] 6. O colágeno humanizado recombinante tipo II foi purificadoe clivado enzimaticamente. O processo específico foi o seguinte: (1) Purificação bruta: a. Equilíbrio da coluna: a coluna foi equilibrada com a solução de equilíbrio (200 mM de cloreto de sódio, 25 mM de Tris, 20 mM de imidazol) a uma vazão de 10 mL/min. b. Carregamento: O sobrenadante após centrifugação foi adicionado à coluna até que o líquido fluísse a uma vazão de 5 mL/min. c. Lavagem das proteínas impuras: 100 mL de solução de lavagem (200 mM de cloreto de sódio, 25 mM de Tris, 20 mM de imidazol) foram adicionados até que o líquido fluísse a uma vazão de 10 mL/min. d. Coleta da proteína alvo: 20 mL de eluente (200 mM de cloreto de sódio, 25 mM de Tris, 250 mM de imidazol) foram adicionados, com uma vazão de 10 mL/min, o fluido de fluxo contínuo foi coletado, a concentração de proteína foi detectada por UV-Vis e calculada de acordo com a seguinte fórmula (C (mg/ml) = A280 x fator de diluição x coeficiente de extinção), e a detecção por eletroforese foi conduzida. e. A coluna foi limpa com solução de trabalho de imidazol a 1M a uma vazão de 10 mL/min. (2) Clivagem enzimática: a enzima TEV foi adicionada de acordo com a razão da quantidade total de proteína para a quantidade total de enzima TEV em 20:1, e clivada enzimaticamente a 16°C por 2 h. A solução de proteína digerida foi colocada em uma bolsa de diálise, dialisada a 4°C por 2 h e então transferida para um novo dialisado (20 mM de cloreto de sódio, 20 mM de Tris) para diálise durante a noite a 4°C. (3) Purificação fina: a. Equilíbrio da coluna: a coluna foi equilibrada com a solução A (20 mM de Tris, 20 mM de cloreto de sódio) a uma vazão de 10 ml/min. b. Carregamento: A vazão foi de 5 ml/min, a amostra foi carregada, e a amostra de fluxo contínuo foi coletada, a detecção por eletroforese foi conduzida, e a proteína foi armazenada em um ambiente de 4°C. c. Eluição: a coluna foi lavada com solução B (1 M de cloreto de sódio, 20 mM de Tris) por 5 CV. d. Lavagem da coluna.

Resultados dos Testes:

[0065] Os resultados da detecção por eletroforese envolvidos no processo de preparação de cada proteína recombinante são mostrados nas Figuras 1 a 7. A Figura 1 mostra os resultados da detecção por eletroforese dos colágenos humanizados recombinantes tipo II, HC2B-a6 e HC2B-b5, indicando que a quantidade de expressão da proteína alvo é baixa após a purificação bruta. A Figura 2 mostra os resultados da detecção por eletroforese dos colágenos humanizados recombinantes tipo II, HC2B-a3, HC2B-b1 e HC2B-b3, indicando que há muitas proteínas impuras após a purificação bruta e a purificação fina da proteína. A Figura 3 mostra os resultados da detecção por eletroforese dos colágenos humanizados recombinantes tipo II, HC2B-HC2B-A7 e HC2B-HC2B-A8, indicando que a quantidade de expressão da proteína alvo é baixa após a purificação bruta. A Figura 3 também mostra os resultados da detecção por eletroforese do colágeno humanizado recombinante tipo II, B3Q, indicando que a quantidade da proteína é baixa após purificação fina. A Figura 4 mostra os resultados da detecção por eletroforese do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A10, indicando que o nível de expressão de proteínas purificadas brutamente é relativamente alto, o efeito da digestão enzimática é melhor, e a pureza de proteínas é alta após purificação fina (painel esquerdo e central da Figura 4). As Figuras 4 e 7 também mostram os resultados da detecção por eletroforese do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-B9, indicando que o nível de expressão de proteínas purificadas brutamente é relativamente baixo, com mais bandas de impurezas, e o efeito da digestão enzimática é ruim. A Figura 5 mostra os resultados da detecção por eletroforese do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A9, indicando que o nível de expressão de proteínas purificadas brutamente é relativamente alto, com mais bandas de impurezas e menor pureza. O painel esquerdo da Figura 6 mostra os resultados da detecção por eletroforese do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-B8, indicando que o nível de expressão de proteínas purificadas brutamente é relativamente baixo, com muitas bandas de impurezas, sem purificação fina subsequente. O painel direito da Figura 6 e Figura 7 mostra os resultados da detecção por eletroforese do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-B7, indicando que o nível de expressão de proteínas purificadas brutamente é relativamente baixo, com mais bandas de impurezas, e o efeito da digestão enzimática é ruim. O painel do meio da Figura 6 mostra a detecção por eletroforese do colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-B10. Os resultados indicam que o nível de expressão de proteínas purificadas brutamente é relativamente baixo, com muitas bandas de impurezas, sem purificação fina subsequente.

[0066] Portanto, em termos de efeitos de expressão, separação e purificação, o colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A10, obteve o melhor efeito em comparação com outros colágenos humanizados recombinantes tipo II.

Exemplo 2: Detecção da atividade biológica do colágeno humanizado recombinante tipo II HC2B-A10

[0067] Os métodos de detecção da atividade do colágeno podem ser consultados em Juming Yao, Satoshi Yanagisawa, Tetsuo Asakura, Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens, J Biochem. 136, 643-649(2004). Os métodos específicos de implementação foram os seguintes: (1) a concentração das amostras de proteína a serem testadas foi detectada por absorção ultravioleta, incluindo o padrão de colágeno bovino tipo I (Sigma, n° CAT: 380002), o colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A10, com bons efeitos de purificação e digestão enzimática providos pela presente descrição (n° 015).

[0068] Especificamente, a absorção ultravioleta das amostras em 215 nm e 225 nm foi medida respectivamente, e as concentrações de proteína foram calculadas usando a fórmula empírica C (μg/mL) = 144 x (A215-A225). Observe que a detecção precisava ser realizada quando A215<1,5. O princípio deste método é que a absorção característica de ligações peptídicas é detectada sob luz ultravioleta distante, que não é afetada pelo teor de cromóforos, com poucas substâncias interferentes, e é fácil de operar, de modo que seja adequada para a detecção de colágeno humano e análogos do mesmo que não desenvolvem cor em azul brilhante de Coomassie. (Veja a referência Walker JM. The Protein Protocols Handbook, second edition. HumanaPress. 43-45). Após a concentração de proteína ser detectada, a concentração de todas as proteínas a serem testadas foi ajustada para 0,5 mg/mL com PBS.

[0069] (2)100 μL de várias soluções de proteína e solução PBS embranco como controle foram adicionados à placa de 96 poços e deixados em temperatura ambiente por 60 min.

[0070] (3)105 células 3T3 em bom estado de cultura foramadicionadas a cada poço e incubadas a 37°C por 60 min.

[0071] (4) Cada poço foi lavado 4 vezes com PBS.

[0072] (5) A absorbância em OD492 nm foi detectada usando um kitde detecção de LDH (Roche, 04744926001). A taxa de adesão celular pode ser calculada com base no valor do controle em branco. A fórmula de cálculo poço de tests - poço em brancofoi a seguinte: taxa de adesão celular A taxa de adesão celular pode refletir a atividade do colágeno. Quanto maior a atividade da proteína, melhor ela pode prover às células um ambiente externo de alta qualidade em um curto espaço de tempo, auxiliando na adesão das células.

[0073] Os resultados foram mostrados na Figura 8. A partir da comparação, pode-se observar que o colágeno humanizado recombinante tipo II da presente descrição apresentou melhor atividade de bioadesão em comparação com o colágeno bovino tipo I (B col I), ou seja, o colágeno humanizado recombinante tipo II HC2B-A10 > o colágeno bovino tipo I. Surpreendentemente, os presentes inventores demonstraram que, para HC2B-A10, oito sequências de repetição poderiam garantir que o peso molecular do colágeno humanizado recombinante tipo II fosse estável e fácil de purificar, e tinham excelente atividade de bioadesão.Exemplo 3: Detecção por espectrometria de massa do colágeno humanizado recombinante tipo II HC2B-A10Tabela 1: Método experimental

[0074] O colágeno humanizado recombinante tipo II, HC2B-A10, com bons efeitos de purificação e digestão enzimática providos pela presente descrição foi submetido à detecção por espectrometria de massa, e o processo específico foi o seguinte:as amostras de proteína foram reduzidas com DTT e alquiladas com iodoacetamida, seguido pela adição de tripsina para digestão enzimática durante a noite. Os fragmentos peptídicos obtidos após a digestão enzimática foram dessalinizados por C18ZipTip, misturados com a matriz ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) e plaqueados. Por fim, o espectrômetro de massas de ionização por dessorção a laser assistido por matriz-tempo de voo MALDI-TOF/TOF UlraflextremeTM, Brucker, Alemanha, foi usado para análise (veja Protein J. 2016;35:212-7 para tecnologia de impressão digital de peptídeos).

[0075] A recuperação de dados foi realizada pela página MS/MS Ion Search do site local da Masco. Os resultados da identificação de proteínas foram obtidos com base na espectrometria de massa primária dos fragmentos peptídicos produzidos após a digestão enzimática. Parâmetros de detecção: Digestão enzimática de tripsina, com dois locais de clivagem perdidos. A alquilação da cisteína foi definida como uma modificação fixa. A oxidação da metionina foi uma modificação variável. O banco de dados usado para identificação foi o NCBprot.Tabela 2: Peso molecular e peptídeos correspondentes detectados por espectrometria de massa de HC2B-A10

[0076] A taxa de cobertura da região funcional de peptídeo detectada foi de 100%GTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGTPGLPGVKGHRGYPG LDGAKGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGTPGLPGVKGHRGYPGLDGA KGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGTP GLPGVKGHRGYPGLDGAKGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGTPGLPG VKGHRGYPGLDGAKGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGTPGLPGVKG HRGYPGLDGAKGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGTPGLPGVKGHRG YPGLDGAKGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGTPGLPGVKGHRGYPGL DGAKGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAK (SEQ ID NO: 30)

[0077] A sequência de DNA de HC2B-a3 (SEQ ID NO: 16):GGTAAACCAGGAGATGATGGAGAAGCAGGAAAACC AGGAAAAGCAGGAGAAAGAGGACCGCCTGGACCGCAAGGAGCAC GTGGATTTCCAGGAACCCCGGGACTGCCGGGTGTGAAAGGTCATA GAGGATATCCGGGACTGGATGGAGCAAAAGGAGAAGCAGGGGCA CCGGGAGTTAAAGGTGAGAGCGGAAGCCCGGGAGAAAATGGAAG CCCTGGTCCGATGGGTCCGAGAGGGCTGCCGGGTGAAAGAGGGCG TACCGGTCCGGCAGGAGCAGCAGGTGCAAGAGGAAATGATGGAC AGCCG

[0078] A sequência de DNA de HC2B-a6 (SEQ ID NO: 17):GGAAAACCCGGGAAGGCCGGTGAGCGCGGTCCACCG GGTCCGCAGGGCGCGCGTGGGTTCCCGGGCACCCCGGGTCTGCCG GGTGTTAAAGGTCATCGTGGCAAGCCGGGCAAGGCTGGCGAGCGC GGTCCGCCAGGTCCGCAAGGTGCGAGAGGCTTTCCGGGCACTCCG GGTTTGCCGGGTGTCAAAGGTCACCGTGGTAAACCGGGCAAGGCG GGTGAGCGTGGCCCACCGGGTCCGCAGGGTGCGCGTGGTTTTCCG GGCACGCCGGGTTTGCCGGGCGTTAAAGGCCACCGCGGCAAACCG GGCAAGGCGGGTGAACGTGGCCCACCGGGTCCGCAAGGTGCACGT GGCTTCCCGGGCACCCCGGGTCTGCCTGGCGTGAAAGGTCACCGT GGCAAGCCGGGCAAAGCTGGTGAACGTGGTCCGCCCGGTCCGCAG GGCGCGCGTGGCTTTCCGGGAACCCCGGGCCTGCCGGGCGTTAAG GGTCATCGTGGCAAACCGGGCAAGGCTGGTGAGCGCGGGCCACCG GGTCCTCAAGGTGCCCGTGGCTTCCCGGGCACCCCGGGTCTGCCGG GTGTGAAGGGTCACCGCGGTAAACCGGGCAAGGCAGGCGAACGC GG

[0079] A sequência de DNA de HC2B-b1 (SEQ ID NO: 18):GTGAACCAGGTCGTGAAGGTAGCCCAGGTGCAGATG GACCACCAGGTCGTGATGGTGCAGCAGGAGTGAAAGGAGATCGTG GTGAAACCGGTGCAGTAGGTGCACCTGGTGCGCCAGGTCCGCCAG GTAGCCCTGGTCCAGCCGGTCCTACCGGAAAACAAGGGGATAGAG GAGAAGCAGGAGCACAGGGTCCGATGGGTCCGTCAGGTCCGGCGG GTGCACGTGGTATTCAGGGTCCGCAGGGTCCGCGTGGTGATAAAG GTGAAGCAGGTGAACCGGGGGAAAGAGGATTAAAAGGGCATCGT GGTTTTACGGGTCTGCAGGGTCTGCCTGGTCCGCCTGGTCCGAGCG GTGATCAGGGTGCAAGCGGTCCGGCAGGTCCGAGCGGACCTCGTG GACCTCCGGGTCCTGTGGGTCCTAGTGGTAAGGATGGGGCAAATG GTATTCCTGGTCCTATTGGTCCGCCGGGTCCGCGTGGGAGATCAGG TGAAACCGGACCGGCA

[0080] A sequência de DNA de HC2B-b3 (SEQ ID NO: 19):GGTAGCCCAGGTCCAGCAGGTCCGACAGGTAAACAAGGAGATCGTGGTGAAGCAGGAGCACAAGGACCAATGGGTCCAAG CGGTCCGGCAGGTGCAAGAGGTATTCAAGGGCCGCAAGGGCCACG CGGTGATAAAGGGGAAGCAGGTGAACCAGGTGAGAGAGGGTTAA AAGGACATCGTGGATTTACAGGACTGCAGGGTTTACCAGGTCCGC CGGGACCGAGCGGAGATCAAGGTGCAAGCGGTCCGGCGGGTCCG AGTGGTCCTCGT

[0081] A sequência de DNA de HC2B-b5 (SEQ ID NO: 20):GGAGCTAGGGGTATCCAGGGTCCGCAGGGCCCGCGGGGAGATAAAGGGGAAGCGGGTGAACCGGGTGAACGTGGCTTGAA GGGTCATCGTGGCTTCACCGGCCTGCAGGGCTTGCCGGGTCCGCCG GGTCCGTCCGGTGCCCGTGGCATCCAGGGACCGCAAGGACCGCGT GGAGACAAAGGTGAAGCGGGTGAACCGGGTGAGCGCGGCCTCAA GGGCCACCGCGGCTTCACCGGTTTGCAAGGCCTGCCGGGTCCGCC GGGTCCGTCGGGCGCGCGTGGTATTCAAGGCCCGCAAGGTCCACG CGGCGACAAAGGCGAAGCGGGTGAGCCGGGCGAACGCGGCCTGA AAGGTCACCGCGGTTTTACGGGTCTGCAGGGCCTGCCGGGTCCAC CGGGTCCGAGCGGTGCTCGCGGCATCCAGGGCCCGCAAGGTCCGC GTGGTGATAAGGGTGAGGCGGGTGAGCCGGGAGAACGTGGTCTGA AGGGTCATAGAGGCTTCACCGGTCTGCAAGGTCTGCCGGGTCCAC CGGGCCCGAGCGGCGCTAGGGGCATTCAGGGCCCGCAGGGGCCGC GTGGTGATAAGGGCGAGGCCGGTGAGCCGGGCGAACGTGGTTTAA AAGGTCATCGCGGCTTCACGGGCCTCCAAGGTCTGCCTGGCCCACC GGGTCCGAGCGGCGCGCGTGGCATTCAAGGCCCACAGGGTCCTCG TGGCGACAAAGGCGAGGCAGGCGAGCCGGGTGAGCGCGGTCTGA AAGGGCACCGTGGTTTTACCGGTTTGCAAGGCCTGCCGGGCCCAC CGGGCCCGTCCGGTGCACGTGGCATTCAGGGTCCGCAGGGTCCGCGTGGCGACAAGGGCGAAGCTGGTGAGCCGGGTGAGCGCGGCCTTA AGGGTCACCGTGGCTTTACCGGTTTACAAGGTTTGCCGGGCCCTCC GGGTCCAAGCGGTGCACGTGGTATCCAAGGCCCACAGGGTCCGCG TGGGGATAAAGGCGAAGCGGGTGAACCGGGCGAGCGCGGGCTGA AGGGTCACCGTGGCTTTACTGGCCTGCAGGGTCTGCCGGGTCCACC GGGTCCGTCT

[0082] A sequência de DNA de B3Q (SEQ ID NO: 21):GGATCACCCGGGCCGGCGGGCCCGACCGGTAAACAGGGTGACCGCGGTGAGGCGGGTGCGCAGGGGCCGATGGGTCCGAGC GGTCCGGCTGGTGCGCGTGGTATCCAGGGACCGCAGGGCCCACGC GGTGATAAAGGCGAAGCAGGCGAACCGGGTGAGCGCGGTTTGAA GGGCCACCGTGGTTTTACCGGTCTGCAGGGCCTGCCGGGCCCGCC GGGTCCGTCAGGCGATCAGGGTGCTAGCGGTCCGGCTGGCCCGTC CGGCCCGCGCGGTAGCCCGGGCCCAGCTGGCCCGACTGGTAAACA GGGCGACCGTGGCGAGGCCGGTGCCCAAGGCCCTATGGGCCCGAG CGGTCCGGCAGGCGCGCGGGGCATCCAGGGTCCGCAAGGACCAAG AGGCGACAAGGGTGAGGCAGGCGAGCCTGGCGAACGTGGCCTGA AGGGTCACCGCGGTTTTACCGGTCTCCAAGGTCTGCCTGGTCCACC GGGTCCGTCTGGAGATCAAGGCGCCAGCGGCCCCGCGGGTCCCTC CGGTCCGCGTGGCAGCCCGGGTCCGGCAGGACCAACGGGTAAGCA GGGTGATAGAGGCGAAGCCGGTGCGCAGGGCCCGATGGGTCCTTC GGGTCCAGCGGGGGCGCGTGGCATTCAAGGTCCGCAGGGCCCGCG TGGTGACAAAGGTGAGGCGGGCGAACCGGGCGAGCGCGGCTTGA AGGGTCATCGTGGATTCACCGGTTTGCAAGGCCTGCCGGGCCCCCC GGGCCCGAGCGGTGACCAAGGAGCTAGCGGGCCGGCTGGTCCGTC GGGCCCGCGTGGCAGTCCGGGTCCGGCGGGCCCAACGGGCAAGCA AGGAGATCGTGGTGAGGCGGGTGCGCAAGGTCCGATGGGTCCGTC TGGTCCGGCGGGTGCACGCGGTATTCAAGGTCCGCAGGGGCCGCG TGGTGATAAAGGAGAAGCAGGCGAACCGGGTGAACGTGGTCTGA AAGGTCATCGTGGCTTCACCGGCCTGCAGGGTTTACCAGGTCCACC GGGTCCGTCTGGCGACCAGGGTGCCAGCGGTCCGGCGGGCCCGTC CGGACCGCGTTAA

[0083] A sequência de DNA de HC2B-A7 (SEQ ID NO: 22):GGACCCCAAGGGGCGCGTGGTTTTCCGGGCACCCCGGGCCTGCCGGGCGTGAAGGGTCACCGCGGTTATCCGGGGCTGGAT GGCGCGAAGGGTCCGCAAGGTGCTCGCGGTTTCCCGGGAACCCCG GGCCTGCCGGGCGTTAAAGGTCATCGTGGTTATCCGGGTCTGGATG GTGCGAAGGGCCCACAGGGTGCGCGTGGTTTCCCGGGCACCCCTG GGCTCCCGGGTGTGAAAGGTCACAGAGGTTACCCGGGCCTGGATG GTGCCAAAGGTCCGCAAGGTGCGCGTGGTTTTCCGGGCACGCCGG GCTTGCCGGGTGTTAAAGGTCACCGTGGTTATCCGGGTCTGGACGG CGCAAAGGGTCCTCAGGGTGCACGCGGCTTCCCGGGTACGCCGGG CCTTCCGGGCGTGAAGGGCCACCGCGGTTATCCGGGTTTGGACGG TGCCAAGGGTCCGCAGGGTGCGCGTGGATTCCCGGGAACCCCAGG CCTGCCAGGTGTGAAGGGCCACCGTGGCTACCCGGGCTTGGACGG TGCTAAAGGACCGCAGGGCGCACGTGGCTTTCCGGGTACCCCGGG CCTGCCTGGCGTCAAGGGCCATCGTGGTTACCCGGGCCTGGATGGT GCAAAAGGCCCACAGGGTGCCCGTGGTTTCCCGGGTACTCCGGGC CTGCCGGGCGTAAAAGGCCATCGCGGTTACCCGGGTTTGGATGGC GCTAAAGGCCCACAAGGTGCTAGAGGGTTCCCTGGCACCCCGGGT CTGCCGGGCGTTAAAGGCCATCGTGGTTACCCGGGCTTGGACGGC GCGAAGGGTCCGCAAGGCGCGCGTGGTTTTCCGGGTACCCCGGGT CTGCCAGGCGTTAAGGGTCACCGCGGTTACCCGGGTTTAGACGGT GCGAAA

[0084] A sequência de DNA de HC2B-A8 (SEQ ID NO: 23):GGTGCTAGGGGATTCCCGGGAACCCCGGGTCTGCCAGGCGTGAAAGGTCACCGCGGTTACCCGGGCCTCGACGGCGCGAAG GGTGCCCGTGGTTTTCCGGGAACCCCGGGCTTGCCAGGTGTCAAG GGCCATCGTGGTTACCCGGGTCTCGATGGTGCAAAGGGTGCGAGA GGCTTCCCGGGCACCCCGGGCCTGCCAGGGGTGAAAGGCCACAGA GGCTATCCTGGCTTGGATGGTGCCAAGGGTGCACGTGGATTCCCG GGCACTCCGGGTCTGCCGGGCGTGAAGGGCCACCGCGGTTATCCG GGCCTGGACGGTGCTAAAGGCGCGCGTGGTTTTCCGGGTACGCCG GGCTTGCCAGGTGTTAAGGGCCACCGTGGCTACCCGGGGCTGGAT GGTGCCAAAGGTGCTCGCGGTTTCCCGGGAACCCCGGGTCTGCCT GGCGTGAAGGGTCATCGTGGTTACCCGGGCTTGGACGGCGCTAAG GGTGCGCGTGGTTTTCCGGGCACCCCGGGTCTGCCGGGGGTGAAA GGTCACCGCGGTTATCCCGGTCTGGATGGTGCGAAGGGTGCGCGT GGCTTCCCGGGCACCCCGGGCCTGCCGGGTGTTAAAGGTCATCGT GGTTACCCGGGCCTGGATGGTGCCAAGGGCGCTCGCGGTTTTCCG GGCACGCCAGGTTTACCGGGGGTCAAAGGCCATCGTGGCTATCCG GGTTTAGATGGCGCGAAAGGCGCACGCGGATTCCCGGGAACCCCG GGCCTGCCTGGCGTTAAAGGCCACCGCGGTTACCCGGGCCTTGAC GGCGCGAAAGGCGCGCGTGGTTTTCCGGGCACCCCGGGTCTGCCG GGTGTTAAAGGTCACCGTGGCTATCCGGGTCTGGACGGTGCAAAA GGTGCACGTGGTTTCCCGGGGACTCCGGGCCTGCCGGGTGTTAAGGGC CATCGTGGTTACCCGGGTTTGGACGGTGCGAAG

[0085] A sequência de DNA de HC2B-A9 (SEQ ID NO: 24):GGATTTCCCGGGACTCCAGGTCTGCCCGGCGTGAAGGGCCACCGCGGTTATCCGGGCTTGGACGGTGCGAAAGGCTTCCCG GGCACGCCAGGCTTACCTGGTGTGAAGGGCCATCGTGGTTACCCG GGGCTGGATGGTGCGAAGGGTTTTCCGGGCACCCCGGGTCTGCCG GGCGTAAAGGGCCACCGCGGTTATCCGGGCCTGGACGGTGCAAAA GGTTTTCCGGGCACCCCGGGCCTGCCGGGTGTGAAGGGCCACCGC GGTTACCCGGGTTTGGACGGTGCCAAGGGATTCCCAGGTACGCCG GGTCTGCCGGGGGTGAAGGGCCATAGAGGCTACCCGGGCTTGGAT GGTGCGAAAGGTTTCCCGGGAACCCCTGGTCTGCCGGGCGTTAAG GGCCACCGTGGTTATCCGGGTCTGGATGGCGCGAAAGGTTTTCCG GGAACCCCAGGTCTGCCGGGCGTTAAAGGTCATCGTGGTTACCCG GGGCTCGATGGTGCCAAAGGTTTTCCGGGCACCCCGGGTCTGCCG GGCGTCAAAGGTCACCGCGGTTATCCGGGTCTGGATGGTGCGAAA GGCTTCCCGGGAACCCCGGGCCTGCCTGGCGTGAAAGGCCATCGT GGTTATCCGGGTCTGGATGGTGCTAAAGGATTCCCGGGAACCCCG GGCCTGCCGGGCGTTAAGGGTCACCGTGGTTACCCGGGCCTGGAT GGCGCTAAGGGTTTCCCGGGTACGCCCGGCCTGCCGGGCGTCAAA GGTCATCGTGGTTACCCGGGTTTAGACGGCGCAAAAGGTTTCCCG GGAACCCCGGGTCTGCCGGGTGTTAAGGGCCATCGTGGCTATCCG GGCTTGGACGGTGCAAAGGGTTTTCCTGGTACTCCAGGCTTGCCCG GCGTTAAGGGCCACCGTGGTTACCCGGGTTTGGACGGCGCTAAAG GCTTTCCGGGAACCCCGGGTCTTCCGGGCGTGAAAGGTCACCGTG GTTACCCGGGTCTGGACGGCGCGAAG

[0086] A sequência de DNA de HC2B-A10 (SEQ ID NO: 25):GGAACACCCGGGCTGCCGGGTGTTAAGGGCCATCGTGGCTACCCGGGTTTGGACGGTGCGAAAGGCACCCCTGGCCTGCCG GGTGTCAAAGGCCATCGTGGTTATCCGGGTCTCGACGGTGCGAAG GGTACCCCAGGACTGCCGGGTGTTAAAGGTCACCGCGGTTACCCG GGTCTGGACGGCGCAAAAGGTACTCCAGGCCTGCCGGGCGTGAAG GGTCATCGTGGTTACCCGGGCCTGGACGGCGCGAAGGGCACCCCG GGCTTACCGGGCGTGAAAGGCCATCGTGGTTATCCGGGGTTGGAT GGCGCAAAGGGTACCCCGGGTCTGCCTGGTGTTAAGGGCCACCGC GGTTATCCGGGCCTGGATGGTGCGAAAGGTACGCCGGGATTGCCG GGTGTGAAGGGTCATCGTGGTTACCCGGGTCTGGATGGTGCCAAA GGCACGCCAGGCCTTCCGGGCGTCAAGGGCCACCGCGGTTACCCG GGCCTGGATGGTGCGAAAGGTACCCCGGGTTTGCCTGGTGTTAAG GGCCACCGCGGTTATCCTGGTTTGGACGGCGCGAAAGGAACCCCG GGCCTGCCGGGTGTTAAAGGCCATCGTGGCTACCCGGGTCTGGAC GGCGCTAAAGGCACTCCGGGTCTGCCGGGCGTGAAGGGCCACCGT GGTTATCCGGGTTTAGACGGCGCGAAAGGCACCCCAGGCCTGCCG GGTGTCAAGGGTCACCGCGGTTACCCGGGTCTGGATGGTGCCAAG GGCACCCCGGGCTTGCCGGGCGTGAAAGGACATCGTGGTTACCCG GGCCTGGATGGTGCTAAGGGCACGCCAGGTCTTCCGGGTGTGAAA GGTCACCGTGGTTATCCGGGTCTGGACGGTGCAAAGGGAACCCCG GGGCTGCCGGGCGTAAAAGGCCACAGAGGTTATCCGGGTCTTGAT GGTGCGAAGGGCACCCCGGGCCTGCCGGGCGTTAAAGGTCACCGT GGTTACCCGGGTTTGGACGGCGCTAAA

[0087] A sequência de DNA de HC2B-B7 (SEQ ID NO: 26):GGAGAAAGGGGGTTGAAGGGACACCGCGGTTTTACTGGTTTGCAAGGCCTGCCGGGCCCTCCGGGTCCGTCTGGCGATCAG GGTGCAAGCGGCCCGGCGGGTCCGTCGGGCCCGCGTGGTGAGCGC GGTCTTAAGGGCCATCGTGGTTTCACCGGTTTACAAGGTCTGCCGG GCCCGCCGGGTCCGAGCGGTGATCAAGGGGCCTCCGGTCCGGCTG GCCCGTCCGGCCCAAGAGGCGAACGTGGTCTGAAAGGTCATCGTG GATTCACCGGACTGCAGGGTCTGCCTGGTCCGCCTGGTCCGTCAGG CGACCAAGGTGCGAGCGGTCCGGCGGGTCCGTCCGGTCCGCGTGG TGAACGTGGTCTGAAAGGCCACCGCGGCTTCACCGGTTTGCAAGG CCTGCCAGGCCCACCGGGTCCGTCTGGCGACCAGGGAGCCAGCGG TCCGGCTGGCCCATCTGGCCCACGCGGCGAGCGCGGTCTGAAAGG CCACCGTGGCTTTACGGGCTTGCAGGGTCTCCCGGGCCCACCGGGC CCGAGCGGTGATCAGGGTGCCAGCGGACCGGCAGGCCCCTCTGGT CCGCGTGGTGAACGTGGCCTGAAAGGTCATCGTGGTTTTACCGGTT TACAGGGCCTGCCAGGTCCCCCGGGTCCGTCCGGCGACCAGGGCG CAAGCGGTCCGGCTGGCCCGAGCGGTCCGCGTGGCGAGCGCGGCC TTAAGGGCCACAGAGGCTTCACGGGTCTGCAAGGTTTGCCGGGTC CGCCTGGCCCGTCGGGCGATCAGGGCGCGAGCGGCCCGGCGGGTC CGAGCGGTCCGCGTGGCGAGCGTGGTCTGAAGGGTCACCGCGGTT TTACCGGTCTGCAAGGTCTGCCGGGTCCGCCTGGCCCGAGCGGCG ACCAGGGAGCGAGCGGTCCGGCGGGTCCGAGTGGTCCGCGT

[0088] A sequência de DNA de HC2B-B8 (SEQ ID NO: 27):GGGGAAAGGGGACTCAAAGGTCACCGCGGTTTCACG GGCCTTCAAGGTCTGCCGGGTCCTCCGGGTCCGAGCGGCGACCAA GGTGCGTCTGGCCCAGCGGGTGAGCGTGGTTTAAAAGGCCACCGC GGTTTCACCGGCCTGCAGGGTTTACCGGGTCCGCCTGGCCCGAGCG GTGATCAAGGTGCAAGCGGCCCGGCAGGCGAACGCGGTCTGAAAGGCCATAGAGGTTTTACCGGCCTGCAGGGCTTG CCGGGCCCGCCGGGCCCGAGTGGCGATCAAGGTGCTTCCGGCCCG GCGGGTGAACGTGGCCTGAAGGGCCATCGTGGCTTTACCGGTCTG CAGGGCCTGCCAGGTCCGCCGGGCCCGTCTGGCGACCAGGGTGCG AGCGGTCCAGCCGGTGAGCGCGGCTTGAAGGGCCACCGCGGCTTT ACGGGTTTGCAAGGTCTGCCTGGTCCGCCGGGCCCGTCAGGCGAT CAAGGGGCGAGCGGCCCGGCGGGTGAACGTGGTCTGAAAGGTCAT CGTGGATTCACCGGCCTGCAGGGTCTGCCGGGCCCGCCCGGCCCGTCCGGTGACCAGGGTGCTTCCGGTCCGGC TGGTGAGCGCGGTCTTAAGGGACACCGTGGCTTCACCGGTCTGCA GGGCTTGCCGGGTCCTCCGGGGCCGAGCGGCGACCAGGGTGCGTC CGGCCCGGCGGGTGAACGTGGTCTGAAGGGCCACCGTGGTTTTAC CGGCTTGCAAGGTCTGCCGGGTCCACCGGGTCCGTCTGGCGATCA GGGAGCCAGCGGTCCGGCAGGCGAGCGTGGTTTGAAGGGTCACCG TGGATTCACCGGCCTGCAGGGGCTGCCGGGCCCGCCGGGTCCGTC GGGCGATCAGGGAGCGAGCGGTCCGGCAGGTGAGCGTGGTCTGAA AGGCCATCGTGGCTTCACTGGTTTGCAAGGCCTGCCTGGCCCACCG GGTCCGAGCGGTGACCAGGGTGCCAGCGGTCCGGCT

[0089] A sequência de DNA de HC2B-B9 (SEQ ID NO: 28):GGAGAAAGGGGGCTTAAGGGCCATCGTGGCTTCACGGGTTTGCAGGGCCTGCCGGGCCCACCGGGTCCGAGCGGCGATCAA GGCGAGCGGGGCCTGAAAGGTCATCGTGGCTTTACCGGTTTGCAG GGCCTGCCGGGCCCACCGGGACCGAGCGGTGATCAGGGGGAGCGT GGTCTGAAAGGTCATCGTGGTTTTACCGGTCTGCAGGGTTTGCCGG GTCCTCCGGGTCCGTCTGGCGACCAAGGTGAGCGTGGTCTGAAAG GTCATCGTGGTTTCACCGGTTTACAAGGCCTGCCGGGCCCACCGGG TCCGAGCGGTGACCAAGGCGAGCGTGGCCTGAAAGGCCACCGCGG TTTCACCGGTCTTCAGGGTCTGCCGGGCCCACCGGGTCCCAGCGGT GACCAGGGTGAACGCGGTCTGAAGGGTCACAGAGGCTTCACCGGT CTCCAAGGCTTACCGGGTCCGCCGGGCCCGAGCGGTGATCAGGGC GAACGTGGTCTGAAGGGCCACCGTGGCTTTACGGGTCTGCAAGGC CTGCCGGGTCCGCCGGGTCCGTCGGGCGACCAGGGTGAGCGCGGT TTGAAGGGCCACCGTGGATTCACCGGCCTGCAGGGCCTGCCGGGA CCGCCTGGTCCGTCAGGTGATCAGGGTGAGCGCGGTCTCAAGGGT CATCGTGGTTTTACCGGTTTACAAGGTTTGCCGGGTCCGCCTGGCC CGTCTGGTGATCAAGGCGAACGTGGTCTGAAAGGCCACCGCGGCT TCACTGGTCTGCAGGGCTTGCCGGGCCCACCGGGTCCGTCCGGCG ATCAAGGCGAACGTGGTCTGAAGGGTCACCGCGGATTCACGGGCC TGCAGGGCCTGCCGGGTCCGCCAGGTCCGTCCGGCGACCAGGGCG AACGCGGGCTGAAAGGTCACCGTGGCTTTACCGGTTTGCAAGGAC TGCCGGGTCCGCCGGGCCCGAGCGGCGACCAG

[0090] A sequência de DNA de HC2B-B10 (SEQ ID NO: 29):GGAGAAAGGGGGCTGAAGGGTCACCGTGGTTTTACCGGTTTGCAAGGTTTGCCGGGTCCGCCGGGTGAGCGCGGCCTGAAG GGTCATCGTGGCTTCACCGGCCTGCAAGGCCTGCCGGGTCCGCCG GGTGAGCGTGGTCTCAAGGGTCATCGTGGCTTTACCGGTTTACAGG GTCTGCCGGGCCCACCGGGCGAGCGCGGTCTGAAAGGCCATCGTG GATTCACCGGCCTGCAGGGCTTGCCGGGTCCACCGGGCGAAAGAG GCTTAAAAGGTCACCGTGGTTTTACGGGTCTGCAAGGTCTGCCGGG TCCGCCGGGTGAACGTGGCCTTAAGGGTCACCGCGGCTTCACTGGT CTGCAGGGTTTGCCGGGTCCGCCTGGTGAAAGGGGTCTGAAAGGC CATCGTGGTTTCACCGGTCTGCAGGGCCTGCCGGGCCCACCGGGTG AGAGAGGCTTGAAGGGTCACCGTGGTTTTACGGGCCTGCAGGGTC TGCCGGGCCCGCCGGGTGAGCGCGGTCTTAAGGGCCACCGTGGAT TCACCGGCCTTCAAGGTCTGCCGGGTCCGCCGGGGGAGCGTGGCC TGAAAGGTCATCGCGGCTTCACCGGTTTGCAAGGTTTGCCAGGCCC ACCGGGCGAACGTGGCCTGAAAGGGCACCGTGGTTTTACTGGTTT GCAGGGCCTGCCGGGCCCGCCGGGCGAGCGCGGTTTGAAGGGCCA CCGTGGTTTCACGGGCCTGCAAGGTCTGCCGGGCCCTCCGGGAGA ACGCGGTCTGAAAGGTCACCGTGGCTTCACCGGCCTGCAGGGTCT ACCGGGTCCACCGGGCGAGCGCGGACTGAAAGGTCATCGCGGCTT CACCGGTCTGCAGGGCCTGCCGGGTCCGCCGGGTGAACGTGGCCT GAAAGGCCACCGCGGTTTTACCGGTTTACAAGGCTTGCCGGGTCC GCCGGGTGAACGTGGCTTGAAGGGCCATCGTGGCTTTACCGGTCTT CAGGGGCTGCCGGGCCCGCCT

Claims (17)

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é SEQ ID NO: 10 e o polipeptídeo é um colágeno humanizado recombinante tipo II.

2. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 1, em que é a sequência de nucleotídeos conforme mostrada na SEQ ID NO: 25.

3. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 2 e nucleotídeos que codificam uma etiqueta de purificação.

4. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etiqueta de purificação é uma etiqueta His, uma etiqueta GST, uma etiqueta MBP, uma etiqueta SUMO ou uma etiqueta NusA.

5. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda nucleotídeos que codificam uma sequência líder.

6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 2 ou o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5.

7. Vetor de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de expressão.

8. Vetor de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um elemento de controle de expressão operacionalmente ligado ao polinucleotídeo ou ao ácido nucleico.

9. Vetor de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle de expressão é um promotor, um terminador e/ou um intensificador.

10. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 2, o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5 ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que a célula hospedeira é uma bactéria ou um fungo.

11. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a bactéria é E. coli; e/ou o fungo é levedura.

12. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

13. Método para produzir o polipeptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende:(1) cultivar uma célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 12 sob uma condição de cultura adequada;(2) colher as células hospedeiras e/ou o meio de cultura contendo o polipeptídeo; e(3) purificar o polipeptídeo.

14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 1.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de ser a composição para reparo de cartilagem.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de ser a composição injetável para reparo de cartilagem.

17. Método in vitro para aumentar adesão celular, caracterizado pelo fato de que compreende colocar as células em contato com o polipeptídeo como definido na reivindicação 1, em que o método é um método para fins não terapêuticos ou para fins não diagnósticos.